Une activité germinale persiste après la naissance dans des niches spécialisées du cerveau des mammifères, à savoir le gyrus denté de l'hippocampe et la zone sous-ventriculaire (SVZ) bordant le ventricule latéral. Les cellules souches neurales (NSC) de la SVZ postnatale se différencient en progéniteurs transitoires qui vont générer des neuroblastes migrant à travers la voie de migration rostrale vers le bulbe olfactif, où ils se différencient en neurones. La SVZ génère également des progéniteurs gliaux qui se dispersent dans le parenchyme voisin. Les travaux récents auxquels j'ai participé soulignent la nature hétérogène de la SVZ postnatale, composée de différents microdomaines générant des lignées neurales distinctes. Les objectifs de mon travail de thèse ont permis de : 1) développer de nouveaux moyens pour explorer l'hétérogénéité de la SVZ; et 2) d'identifier et d'étudier le rôle d'un facteur de transcription exprimé par une sous population des NSCs de la SVZ. Objectif 1: La SVZ est une région hautement complexe et irrégulière dans laquelle une forte activité germinale persiste après la naissance. Le caractère hétérogène de la SVZ est évident et des études récentes ont généré une très grande base de données de transcrits, qui sont différentiellement exprimés entre les microdomaines. Cependant, un outil approprié pour l'analyse rapide du niveau d'expression d'une protéine d'intérêt, le long des axes rostro-caudal et dorso-ventral de la SVZ est toujours manquant et nécessaire. Par conséquent, j'ai développé "FlashMap", un logiciel semi-automatique qui permet une analyse rapide des niveaux d'expression de protéines dans le SVZ, basé sur des mesures de densité optique après immunohistochimie. "FlashMap" génère des cartes thermiques facilement lisibles en deux dimensions, qui peuvent être superposées avec précision aux reconstructions tridimensionnelles du système ventriculaire pour une visualisation spatiale fine et rapide. Cette nouvelle approche accélérera la recherche sur la régionalisation de la SVZ, en permettant l'identification de marqueurs (e.g. facteurs de transcription) exprimés dans des régions discrètes de la SVZ. Objectif 2: J'ai utilisé des approches de transcriptomique et de « fate mapping » des NSCs pour étudier la relation entre l'expression régionale de facteurs de transcription et leur différenciation dans des lignées neurales distinctes. Mes résultats supportent un amorçage précoce des NSCs à produire différents types cellulaires en fonction de leur localisation spatiale dans la SVZ. Nos données identifient Hopx comme un marqueur d'une sous population de NSCs qui génère principalement des astrocytes. De façon intéressante, la manipulation de l'expression de Hopx montre des effets mineurs sur l'astrogénèse, mais entraîne des changements marqués quant au nombre de NSCs et de leur descendance. Dans son ensemble, Mes résultats mettent en évidence à la fois une hétérogénéité spatiale des NSCs postnatales ainsi que leur amorçage précoce à produire des types cellulaires distincts / Germinal activity persists in the postnatal mammalian brain in specialized niches, namely the dentate gyrus of the hippocampus and the subventricular zone (SVZ) surrounding the lateral ventricle. Neural stem cells (NSCs) of the postnatal SVZ differentiate into transient amplifying progenitors that will generate neuroblasts migrating through the rostral migratory stream, into the olfactory bulb, where they differentiate into neurons. The SVZ additionally generates glial progenitors that invade the nearby parenchyma. Recent work to which I have participated, highlights the heterogeneous nature of the postnatal SVZ in respect to different microdomains generating distinct neural lineages. The objectives of my PhD work were twice: 1) to develop new means to explore the heterogeneity of the SVZ; and 2) to identify transcription factors expressed by subpopulations of NSCs of the SVZ and acting in their differential specification. Objective 1: The SVZ is a highly complex and irregular region of ongoing postnatal germinal activity. The heterogeneous character of the SVZ is evident and recent studies generated enormous datasets of transcripts, which are differentially expressed between divergent microdomains. However, an appropriate tool for fast analysis of the protein level along the full rostro-caudal and dorso-ventral extend of the SVZ is still missing. Therefore, I developed “FlashMap”, a semi-automatic software that allows rapid analysis of protein levels in the full SVZ, based on optical density measurements after immunohistochemistry. “FlashMap” generates easy readable heatmaps in two dimensions, which can be accurately superimposed on three-dimensional reconstructions of the ventricular system for rapid spatial visualization and analysis. This new approach will fasten research onto SVZ regionalization, by guiding the identification of markers, such as transcription factors expressed in specific SVZ microdomains. Objective 2: I used transcriptomic as well as fate mapping approaches to investigate the relation between regional expression of transcription factors by NSCs and their acquisition of distinct neural lineage fates. Our results support an early priming of NSCs to produce defined cell types depending of their spatial location in the SVZ and identify Hopx as a marker of a subpopulation biased to generate astrocytes. Interestingly, manipulation of Hopx expression showed minor effects on astrogenesis, but resulted in marked changes in the number of NSCs and of their progenies. Taken together, our results highlight transcriptional and spatial heterogeneity of postnatal NSCs, as well as their early priming toward specific lineages and suggest a role for Hopx in the evolution of SVZ germinal activity

La neurogenèse est présente, dans le cerveau adulte, dans la zone sous-ventriculaire (ZSV) encadrant les ventricules latéraux et dans le gyrus dentelé (GD) de l’hippocampe, permettant l’apprentissage, la mémoire et la fonction olfactive. Ces micro-environnements possèdent des signaux contrôlant l’auto-renouvellement des cellules souches neurales (CSN), leur prolifération, leur destin et leur différenciation. Or, lors du vieillissement, les capacités régénératives et homéostatiques et la neurogenèse déclinent. Les patients atteints de la maladie d’Alzheimer (MA), comme le modèle animal reproduisant cette maladie (3xTg-AD), montrent une accélération des phénotypes liés au vieillissement dont une diminution de la neurogenèse. Notre hypothèse est que la découverte des mécanismes affectant la neurogenèse, lors du vieillissement et de la MA, pourrait fournir de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir le déclin cognitif. Les études sur l’âge d’apparition et les mécanismes altérant la neurogenèse dans la MA sont contrastées et nous ont guidé vers deux études. L’examen des changements dans les étapes de la neurogenèse lors du vieillissement et du développement de la neuropathologie. Nous avons étudié la ZSV, les bulbes olfactifs et le GD de souris femelles de 11 et 18 mois, et l’apparition des deux pathologies associées à la MA : les plaques amyloïdes et les enchevêtrements neurofibrillaires. Nous avons découvert que les souris 3xTg-AD possèdent moins de cellules en prolifération, de progéniteurs et de neuroblastes, induisant une diminution de l’intégration de nouvelles cellules dans le GD et les bulbes olfactifs. Notons que le taux de neurogenèse chez ces souris de 11 mois est similaire à celui des souris de phénotype sauvage de 18 mois, indiquant une accélération des changements liés au vieillissement dans la MA. Dans la ZSV, nous avons aussi démontré une accumulation de gouttelettes lipidiques, suggérant des changements dans l’organisation et le métabolisme de la niche. Enfin, nous avons démontré que le déficit de la neurogenèse apparait lors des premières étapes de la MA, avant l’apparition des plaques amyloïdes et des enchevêtrements neurofibrillaires. A l’examen des mécanismes inhibant la neurogenèse lors de la MA, nous voyons que chez des souris de 5 mois, le déficit de la neurogenèse dans la ZSV et le GD est corrélé avec l’accumulation de lipides, qui coïncide avec l’apparition du déclin cognitif. Nous avons aussi découvert que dans le cerveau humain de patients atteints de la MA et dans les 3xTg-AD, des gouttelettes lipidiques s’accumulaient dans les cellules épendymaires, représentant le principal soutien des CSN de la niche. Ces lipides sont des triglycérides enrichis en acide oléique qui proviennent de la niche et pas d’une défaillance du système périphérique. De plus, l’infusion locale d’acide oléique chez des souris de phénotype sauvage permet de reproduire l’accumulation de triglycérides dans les cellules épendymaires, comme dans la MA. Ces gouttelettes induisent un dérèglement de la voie de signalisation Akt-FoxO3 dans les CSN, menant à l’inhibition de leur activation in vitro et in vivo. Ces résultats permettent une meilleure compréhension de la régulation de la neurogenèse par le métabolisme lipidique. Nous avons démontré un nouveau mécanisme par lequel l’accumulation des lipides dans la ZSV induit une inhibition des capacités de prolifération et de régénération des CSN lors de la MA. Les travaux futurs permettront de comprendre comment et pourquoi le métabolisme lipidique du cerveau est altéré dans la MA, ce qui pourrait offrir de nouvelles voies thérapeutiques pour la prévention et la régénération. / In the adult brain, neurogenesis continues in the subventricular zone (SVZ) surrounding the lateral ventricles and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus where it plays a critical role in learning, memory, and olfactory function. Within these microenvironments, combinatorial signals control neural stem cell (NSC) self-renewal, proliferation, fate determination and differentiation. Unfortunately, during aging, neurogenesis declines along with many other homeostatic and regenerative capabilities. Furthermore, Alzheimer’s disease (AD) patients and many AD models show an acceleration of several aging related phenotypes including neurogenesis. We hypothesize that uncovering how neurogenesis is affected during aging and in AD will provide novel targets for prevention of cognitive decline. However, conflicting findings including the age of onset and the mechanisms altering neurogenesis in AD propelled us to perform the two following studies. First, we examined the various steps of neurogenesis and how they change as a result of aging, neuropathology development, and neurogenic niches. We studied neurogenesis in the SVZ, olfactory bulb, and DG of 11- and 18-month-old female mice and simultaneously measured the stages of the two major AD-associated pathologies, amyloid plaques and neurofibrillary tangles. We found that, 3xTg-AD mice had fewer proliferating cells, neural progenitors and neuroblasts, resulting in decreased numbers of adult-born cells added to the dentate granule cell layer and the olfactory bulbs. Interestingly, the levels of neurogenesis in 11-month-old 3xTg mice were similar to those in 18-month-old WT mice, indicating an acceleration of aging-related changes in neurogenesis. Interestingly, we found that the deficits in neurogenesis appear at early stages of AD-associated pathologies, before the appearance of the hallmark Aβ plaques and neurofibrillary tangles. Instead, we found a pronounced accumulation of large lipid droplets, suggestive of significant organizational and metabolic changes (Chapter 2). Second, we examined the mechanisms inhibiting neurogenesis in AD. Studying young 5-month-old mice, we found that deficits in SVZ and DG neurogenesis still correlated with extensive lipid accumulation coinciding with the onset of cognitive decline. Importantly, we found that postmortem AD brains and 3xTg-AD mice accumulate neutral lipids within ependymal cells, the main support cell of the SVZ niche. Using novel mass spectrometry techniques, we identified these lipids as oleic acid-enriched triglycerides. Moreover, analysis of plasma, cerebrospinal fluid, and microdissected SVZs showed that these lipids originate from niche-derived rather than peripheral lipid metabolism defects. Remarkably, locally increasing oleic acid in wild-type mice was sufficient to recapitulate the AD-associated ependymal triglyceride phenotype and led to a de-regulation of the Akt-FoxO3 NSC preservation pathway, and inhibition of NSC activation in vitro and in vivo (Chapter 3). Together, this work suggests a novel mechanism of cognitive defects. Specifically, lipid accumulation within SVZ niche cells during early adulthood inhibits the proliferative and regenerative capacity of NSCs in AD. Future work aimed at understanding how and why brain lipid metabolism is altered in AD could provide therapeutic targets for preventative and regenerative strategies for those suffering from AD.

Les cellules souches neurales (CSNs) se situent dans des régions spécifiques du système nerveux central qui sont appelées niches. Ces cellules sont capables de se répliquer ou se différentier en cellules neurales spécialisées (neurones, astrocytes et oligodendrocytes). C’est grâce à cette propriété de différentiation que les CSNs sont étudiées comme thérapie chez les patients atteints d’une maladie neurodégénérative. En effet, elles pourraient remplacer les cellules neurales altérées et ainsi restaurer les fonctions neurologiques. De nombreuses approches ont été développées afin de stimuler la différentiation des CSNs, dont la plus prometteuse est la différentiation des cellules endogènes directement au sein de leurs niches. Actuellement, il n’existe pas de molécule active ou de système thérapeutique qui cible les CSNs endogènes et qui induit leur différentiation simultanément. Le but de ce travail est de fournir un système de délivrance de molécules bioactives capable de cibler les CSNs endogènes et d'induire leur différenciation in situ. Nous avons développé et caractérisé des nanoparticules lipidiques (LNC), un système de délivrance très versatile. NFL-TBS.40-63, un peptide ciblant les CSNs, a été adsorbé à la surface des LNC afin de les diriger contre les CSNs endogènes. Nous avons observé que ces NFL-LNC ne ciblaient que les CSNs du cerveau et pas de la moelle. Afin d’étudier les interactions spécifiques entre les nanoparticules et les CSNs, nous avons caractérisé et comparé les propriétés de leur membrane plasmique. Enfin, nous avons encapsulé de l’acide rétinoïque, une molécule connue pour stimuler la différentiation des CSNs, dans les LNC-NFL et étudié leur impact sur la différentiation de CSNs in vitro et in vivo. Ce travail contribue au développement de thérapies efficaces et sures pour le traitement de maladies neurodégénératives à travers la différentiation de CSNs endogènes. / Neural stem cells (NSCs) are located in specific regions of the central nervous system called niches. Those cells are able to self-renew and to differentiate into specialized neuronal cells (neurons, astrocytes and oligodendrocytes). Due to this differentiation property, NSCs are studied to replace neuronal cells and restore neurological functions in patients affected by neurodegenerative diseases. Several therapeutic approaches have been developed and endogenous NSC stimulation is one of the most promising. Currently, there is no active molecule or therapeutic system targeting endogenous CSNs and inducing their differentiation at the same time. The aim of the work was to provide a drug delivery system able both to target endogenous CSNs and to induce their differentiation in situ. Here, we developed and characterized lipidic nanoparticles (LNC) targeting endogenous NSCs. A peptide called NFL-TBS.40-63, known for its affinity towards NSCs, was adsorbed at the surface of LNC. We observed that NFL-LNC specifically targeted NSC from the brain and not from the spinal cord in vitro and in vivo. To explain this specificity, we characterized and compared NFL-LNC interactions with the plasmatic membrane of both cell types. Finally, we demonstrated that by loading retinoic acid in NFL-LNC we were able to induce brain NSC differentiation in vitro and in vivo. This work contributes to the development of efficient and safe therapies for the treatment of neurodegenerative disease via the differentiation of endogenous NSCs.

The canonical Wnt/β-catenin signalling pathway plays an important role in proliferation and differentiation of neural progenitors during embryogenesis as well as postnatally. In the present study, the effect of the Wnt signalling pathway on the differentiation potential of neonatal and adult neural stem cells (NS/PCs) isolated from subventricular zone (SVZ) of lateral ventricles and their membrane properties were studied eight days after the onset of in vitro differentiation. To manipulate Wnt signalling at different cellular levels, three transgenic mouse strains were used, which enabled inhibition or activation of the pathway using the Cre- loxP system. We showed that the activation of the Wnt signalling pathway leads to higher expression of β-catenin in both postnatal as well as adult NS/PCs, while Wnt signalling inhibition results in the opposite effect. To follow the fate of NS/PCs, the patch-clamp technique, immunocytochemistry, and Western blot were employed. After eight days of NS/PCs differentiation we identified three electrophysiologically and immunocytochemically distinct cell types of which incidence was significantly affected by the canonical Wnt signalling pathway, only in differentiated neonatal NS/PCs. Activation of this pathway suppressed gliogenesis, and promoted neurogenesis,...

La neurogenèse est maintenue dans le cerveau adulte dans des régions restreintes du cerveau appelées niches neurogéniques. L’une des niches principales est la zone ventriculaire/sous-ventriculaire (V-SVZ) dans laquelle résident des cellules souches neurales (NSCs). Les NSCs sont à l’origine de la formation des nouveaux neurones en donnant naissance aux progéniteurs puis aux neuroblastes. Les études récentes sur la neurogenèse ont mis en évidence l’existence des NSCs quiescentes (qNSCs, aussi appelées cellules B1) et des NSCs actives (aNSCs). Le modèle actuel de la neurogenèse adulte place les qNSCs B1 en amont des aNSCs. L’hypothèse étant que cette population dormante constitue une « réserve », afin de maintenir les aNSCs tout au long de la vie. Les techniques actuelles ne permettent pas de cibler les qNSCs spécifiquement in vivo et donc, d’analyser leurs propriétés biologiques, leurs mécanismes d’activation ainsi que leur relation avec les aNSCs. Cette compréhension est nécessaire pour la mise au point de stratégies thérapeutiques pouvant utiliser le potentiel des cellules souches pour restaurer la neurogenèse dans les contextes de vieillissement et de maladies neurodégénératives. Afin de caractériser les qNSCs de la V-SVZ, nous avons utilisé l’électroporation de plasmides dans un modèle de souris rapportrice Rosa26-stop-EYFP. Dans celle-ci, la séquence codant pour la protéine EYFP précédée par un codon STOP floxé, est inséré au locus Rosa26. L’excision du codon STOP par une recombinase permet l’expression du rapporteur dans les cellules électroporées ainsi que leur descendance. Cette technique nous a permis de cibler spécifiquement une population d’astrocytes en contact avec le ventricule et d’étudier leur contribution à la neurogenèse adulte. À la différence des approches virales et transgéniques, l’électroporation peut cibler les cellules quiescentes et l’expression du plasmide est limité aux cellules en contact avec le ventricule. Grâce à cette technique nous avons mis en évidence des éléments surprenants : i) cette population est majoritairement quiescente et ne contribuent à la neurogenèse que de manière minimale, ii) cette population ne participe pas à la régénération de la niche in vivo, iii) elles ne génèrent pas les aNSCs à l’origine des neurosphères in vitro et iv) son activité neurogénique peut être augmentée en exprimant le gène pro-neural Mash1. Ensuite, nous nous sommes intéressés au rôle de la signalisation EGFR dans la régulation de l’activité des cellules souches/progéniteurs neuraux (NSPCs). Dans cette seconde étude, nous montrons que i) la signalisation EGFR est réduite avec l’âge, ii) PI3K/AKT, MEK/ERK et mTOR régulent différemment la prolifération, la différenciation et la survie des NSPCs et iii) l’activation d’EGFR dans les qNSCs permet d’augmenter la neurogenèse sous ventriculaire à 3 mois, mais pas à 6 mois ou dans un modèle de la maladie d’Alzheimer. Nos données suggèrent donc que les qNSCs représentent une population hétérogène et/ou présentant 2 voies neurogéniques distinctes. De plus, nous avons montré que les voies de signalisation associées à EGFR exercent un contrôle différentiel sur l’activité des NSPCs. Enfin, nos résultats indiquent que les facteurs présents dans la niche sous-ventriculaire lors du vieillissement inhibent de manière dominante l’activation des NSCs. / Neurogenesis is maintained in restricted regions of the adult brain called neurogenic niches. One of the main neurogenic niches is the ventricular-subventricular zone (V-SVZ) in which neural stem cells (NSCs) reside. NSCs produce neurons through the generation of transit amplifying progenitors and neuroblasts. Recent studies on adult neurogenesis revealed the existence of quiescent NSCs (qNSCs, also called B1) and activated NSCs (aNSCs). The current model of adult neurogenesis places qNSCs (B1) upstream of aNSCs in the lineage. The hypothesis is that the qNSC population constitutes a “reserve” pool to maintain aNSC pool throughout life. So far, the techniques used do not allow specific targeting of the qNSCs in vivo. Therefore, it is not possible to analyze their biological properties, activation mechanisms and relationship with aNSCs. This understanding is also necessary to establish therapeutic strategies that could utilize the potential of stem cells to restore neurogenesis in contexts of aging and neurodegenerative diseases. In order to characterize qNSCs in the ventricular zone, we took advantage of plasmid electroporation in a reporter mouse model, Rosa26-stop-EYFP. In this model, the sequence coding for EYFP preceded by a floxed STOP codon is inserted at the Rosa26 locus. Excision of the STOP codon by a recombinase enables expression of the reporter in electroporated cells and their progeny. This technique enabled the specific targeting of a ventricle-contacting astrocytes population and to study their contribution to adult neurogenesis. Unlike transgenic or viral approaches, electroporation can target quiescent cells and the expression of the plasmid is restricted to the ventricle-contacted cells. Using this approach, we made surprising observations: i) this population is mostly quiescent and only minimally contributes to adult neurogenesis, ii) this population does not participate in niche regeneration in vivo and iv) their neurogenic output can be increased by expressing the pro-neural gene Mash1. Next, we investigated the role of EGFR signaling in the regulation neural stem and progenitor cells (NSPCs) activity. In this second study, we show that i) EGFR signaling decreases during aging, ii) PI3K/AKT, MEK/ERK and mTOR exert different regulation proliferation, differentiation and survival of NSPCs and iii) activation of EGFR in the qNSCs increases V-SVZ neurogenesis in 3-months-old animals but not in 6-months-old or Alzheimer’s disease model animals. Our data suggests that the NSC population is heterogeneous, with variable neurogenic output from the different sub-populations, as well as different activation modalities. We also showed that EGFR-associated signalling pathways differentially regulate NSPCs activity. Finally, our results indicate that the factors present in the V-SVZ niche during aging dominantly inhibit activation of NSCs.