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Les protéines Hsp70 appartiennent à une famille de chaperons moléculaires très conservés qui jouent un rôle essentiel dans le contrôle qualité des protéines et qui protègent les cellules contre diverses agressions de l'environnement. Pour fonctionner comme un chaperon moléculaire, les protéines Hsp70 agissent de concert avec plusieurs co-chaperons et co-facteurs nécessaires au fonctionnement de son cycle ATPasique. Nos travaux montrent que les bactéries du genre Mycobacterium codent pour une nouvelle famille de protéines atypiques apparentées à Hsp70 dont l'architecture s'articule autour d'un domaine ATPase putatif à l'extrémité N-terminale, similaire au domaine de la superfamille Hsp70-actine, d’un segment transmembranaire (TMD) putatif et d'une longue région riche en proline/thréonine (P/T) en sa partie C-terminale. Le but de ce travail de thèse était d’étudier la fonction et la localisation cellulaire des protéines de type Hsp70 chez les mycobactéries. Nous avons d’abord constaté que la protéine Hsp70-Like de M. smegmatis (Msmg_Hsp70-Like) se localisait en foci distincts à la membrane des cellules et que son expression induisait un phénotype d’agrégation cellulaire. Afin d’éclaircir le rôle des domaines putatifs TMD et P/T, nous avons construit un ensemble de mutants dans lesquels ces éléments structurels ont été supprimés. Nous avons constaté que le domaine TMD putatif était important pour la localisation de Hsp70-Like, pour la formation des foci à la membrane et pour le phénotype d'agrégation des cellules. En revanche, le domaine riche en P/T n’a aucun effet sur ces phénotypes. In vitro, le domaine ATPase putatif de Msmg_Hsp70-Like a été purifié et des essais de cristallisation sont en cours. Des expériences supplémentaires restent cependant nécessaires pour évaluer la fonction de cette nouvelle famille de protéines. / Hsp70 belongs to a highly conserved family of molecular chaperone proteins that unambiguously plays essential roles in protein quality control, protecting cells against various environmental insults. To function as a bona fide molecular chaperone, Hsp70 acts in concert with several co-chaperones and nucleotide exchange factors to complete its ATP-dependent chaperone cycle. Our work shows that bacteria from the genus Mycobacterium encode new atypical Hsp70-Like proteins that share a common architecture: a putative ATPase domain at the N-terminus similar to members of the Hsp70-actin superfamily, a single putative transmembrane domain (TMD) in the middle of the protein and a long proline/threonine (P/T) - rich region at the C-terminal. The aim of this thesis work was to shed light on the function and the cellular localization of Hsp70-like proteins in mycobacteria. We first found that Msmg Hsp70-Like protein localizes to discrete foci within cells and that its expression induces a cell aggregation phenotype. To shed light on the role of the putative TMD and P/T- rich domains in Hsp70-Like, we engineered a set of mutants in which these structural elements were deleted. We found that the central putative TMD was important for the cell envelop localization of Hsp70-Like, for the formation of foci and for cell aggregation. In contrast, the P/T-rich had no effect on these phenomena. In vitro the putative ATPase domain of Msmg Hsp70-Like was purified and crystallization trials were performed. Further research is needed to assess the function of this novel family of proteins.

L'engagement des cellules vers un destin donné, ou détermination cellulaire, est un processus clé du développement. Quels sont les mécanismes qui sous-tendent la détermination cellulaire ? Pour aborder cette question, nous utilisons le lignage des soies mécanosensorielles de la drosophile. Dans ce lignage, la diversité des cellules résulte de l'activation différentielle de la voie Notch ainsi que la ségrégation asymétrique de déterminants cellulaire à chaque division. Cependant, comment la répétition d’un même mécanisme peut-elle être à l’origine des destins cellulaires différents ? D'autres facteurs doivent être impliqués dans ce processus. Afin des les identifier, mon intérêt s’est porté sur les facteurs de transcription de la superfamille Snail, connus pour être impliqués dans la détermination cellulaire au cours du développement de la drosophile.Deux membres de cette superfamille, Escargot (Esg) et Scratch (Scrt) sont exprimés dans le lignage des soies, en particulier dans les cellules neurales et leurs précurseurs. Des analyses de perte et de gain de fonction indiquent qu’Esg et Scrt, agissant de manière redondante, sont nécessaires pour le maintien de l'identité du précurseur secondaire neural. Des tests d’interaction génétique ont montré que ces facteurs agissent en interaction avec la voie Notch, probablement via la répression de l’expression des gènes cibles de la voie. De plus, Esg, mais pas Scrt, a un rôle supplémentaire lors de la formation du lignage des soies. La perte de fonction de ce facteur provoque un défaut de l’arborisation et de la croissance axonales. En outre, l'expression des gènes impliqués dans la différenciation neuronale, tels que Elav et Prospero, est altérée dans ce contexte, suggérant qu’Esg contrôle la différenciation neuronale en régulant l'expression de gènes clés de l’identité neuronale.Ensemble, mes résultats ont montré qu’Esg et Scrt participent à la mise en place de la diversité cellulaire dans le lignage des soies de la drosophile. / The commitment of cells to a given fate, or cell fate determination, is a key process in development. Cell type diversity arises from variations in this process. What are the mechanisms underlying cell determination and how is cell diversity achieved? In order to approach these questions, we use the Drosophila mechanosensory bristle lineage. In this lineage, cell diversity arises from the differential activation of the Notch pathway as well as the asymmetric segregation of cell fate determinants at each division. However, how does the repetition of the same mechanism trigger different cell fates? Other factors might be involved in cell fate commitment. In order to identify such factors, I focused my interest on the transcription factor of the Snail superfamily, known to be involved in cell determination during Drosophila development.Two members of this superfamily, escargot (esg) and scratch (scrt) are expressed in the bristle lineage, specifically in the inner neural cells and their precursor cells. Loss and gain of function analysis indicate that Esg and Scrt, acting redundantly, are necessary for the maintenance of the neural secondary precursor cell identity. A genetics interaction test showed that this role is achieved in interaction with the Notch pathway, probably through the repression of Notch target genes expression. Moreover, Esg, but not Scrt, has an additional role during the inner bristle cell formation. Loss of function of this factor induces a defect in neuronal differentiation, specifically axon growth and patterning. Moreover, the expression of genes involved in neuronal differentiation, such as elav and prospero, is impaired in this context. Altogether, these data suggests that Esg is involved in neuronal differentiation by regulating the expression of key neuronal genes.Together, my results showed that Esg and Scrt participate to the establishment of cell diversity in Drosophila bristle cell lineage.

J'ai mis au point une méthodologie pour annoter les superfamilles d'enzymes, en décrire l'histoire et les replacer dans l'évolution de leurs voies métaboliques. J'en ai étudié trois : (1) les amidohydrolases cycliques, dont les DHOases (dihydroorotases, biosynthèse des pyrimidines), pour lesquelles j'ai proposé une nouvelle classification. L'arbre phylogénétique inclut les dihydropyrimidinases (DHPases) et allantoïnases (ALNases) qui ont des réactions similaires dans d'autres voies (dégradation des pyrimidines et des purines respectivement). (2) L'étude de la superfamille des DHODases (qui suivent les DHOases) montre une phylogénie semblable aux DHOases, avec également des enzymes d'autres voies, dont les DHPDases (qui suivent les DHPases). De cette observation est né le concept de module réactionnel, qui correspond à la conservation de l'enchaînement de réactions semblables dans différentes voies métaboliques. Cela a été utilisé lors de (3) l'étude des carbamoyltransférases (TCases) qui incluent les ATCases (précédant les DHOases). J'ai d'abord montré l'existence d'une nouvelle TCase potentiellement impliquée dans la dégradation des purines et lui ai proposé un nouveau rôle en utilisant le concept de module réactionnel (enchaînement avec l'ALNase). Dans ces trois grandes familles j'ai aussi mis en évidence trois groupes de paralogues non identifiés qui se retrouvent pourtant dans un même contexte génétique appelé " Yge " et qui formeraient donc un module réactionnel constitutif d'une nouvelle voie hypothétique. Appliqué à diverses voies, le concept de modules réactionnels refléterait donc les voies métaboliques ancestrales dont ils seraient les éléments de base.

J'ai mis au point une méthodologie pour annoter les superfamilles d'enzymes, en décrire l'histoire et les replacer dans l'évolution de leurs voies métaboliques. J'en ai étudié trois : (1) les amidohydrolases cycliques, dont les DHOases (dihydroorotases, biosynthèse des pyrimidines), pour lesquelles j'ai proposé une nouvelle classification. L'arbre phylogénétique inclut les dihydropyrimidinases (DHPases) et allantoïnases (ALNases) qui ont des réactions similaires dans d'autres voies (dégradation des pyrimidines et des purines respectivement). (2) L'étude de la superfamille des DHODases (qui suivent les DHOases) montre une phylogénie semblable aux DHOases, avec également des enzymes d'autres voies, dont les DHPDases (qui suivent les DHPases). De cette observation est né le concept de module réactionnel, qui correspond à la conservation de l’enchaînement de réactions semblables dans différentes voies métaboliques. Cela a été utilisé lors de (3) l'étude des carbamoyltransférases (TCases) qui incluent les ATCases (précédant les DHOases). J'ai d'abord montré l'existence d'une nouvelle TCase potentiellement impliquée dans la dégradation des purines et lui ai proposé un nouveau rôle en utilisant le concept de module réactionnel (enchaînement avec l'ALNase). Dans ces trois grandes familles j'ai aussi mis en évidence trois groupes de paralogues non identifiés qui se retrouvent pourtant dans un même contexte génétique appelé « Yge » et qui formeraient donc un module réactionnel constitutif d'une nouvelle voie hypothétique. Appliqué à diverses voies, le concept de modules réactionnels refléterait donc les voies métaboliques ancestrales dont ils seraient les éléments de base. / I designed a methodology to annotate enzyme superfamilies, explain their history and describe them in the context of metabolic pathways evolution. Three superfamilies were studied: (1) cyclic amidohydrolases, including DHOases (dihydroorotases, third step of the pyrimidines biosynthesis), for which I proposed a new classification. The phylogenetic tree also includes dihydropyrimidinases (DHPases) and allantoinases (ALNases) which catalyze similar reactions in other pathways (pyrimidine and purine degradation, respectively). (2) The DHODases superfamily (after DHOases) show a similar phylogeny as DHOases, including enzymes from other pathways, DHPDases in particular (after DHPases). This led to the concept of reaction module, i.e. a conserved series of similar reactions in different metabolic pathways. This was used to study (3) the carbamoyltransferases (TCases) which include ATCases (before DHOases). I first isolated a new kind of TCase, potentially involved in the purine degradation, and I proposed a new role for it in the light of reaction modules (linked with ALNase). In those three superfamilies I also found three groups of unidentified paralogs that were remarkably part of the same genetic context called “Yge” which would be a reaction module part of an unidentified pathway. The concept of reactions modules may then reflect the ancestral metabolic pathways for which they would be basic elements.

Mon projet de thèse s'inscrit dans un vaste projet de caractérisation de protéines nouvellement identifiées dont l'expression est sélective à certaines régions du cerveau. Cette expression sélective pouvant être liée aux phénomènes de dégénérescence neuronale qui caractérisent les maladies neurodégénératives, ces protéines constituent donc des biomarqueurs potentiels. Une étude structurale et physico-chimique a été effectuée sur une dizaine de protéines, dont la protéine CRYM murine (mCRYM) qui fait parti de la famille des Cytosolic- 3,3',5-triiodo-L-thyronine(T3)-Binding Protein car elle régule la concentration en hormone thyroïdienne T3 libre dans la cellule. mCRYM appartient également à la famille des µ-crystallines et à la superfamille des µ-crystallines/Ornithines Cyclodésaminases. Les protéines présentant des homologies pour ces trois familles sont la plupart différentes par leur fonction (enzymatique ou structurale), leur localisation tissulaire et leurs caractéristiques physico-chimiques. Cette diversité est due au recrutement de gènes de la superfamille des crystallines pour diverses fonctions métaboliques tout en conservant le taxon spécifique des crystallines. Je suis parvenue à résoudre sa structure cristallographique complexée au NADP(H) et à l'hormone thyroïdienne T3 à une résolution de 1,75 Å. La protéine mCRYM est un exemple intéressant d'évolution par son appartenance à différentes familles de protéines et, à ce jour, aucune activité enzymatique n'a été identifiée. Sa caractérisation structurale et thermodynamique a donc permis de mettre en évidence les différences et les similitudes avec ses homologues enzymatiques et d'émettre des hypothèses quant à son évolution moléculaire. Ces résultats soulèvent de nouvelles questions concernant son rôle physiologique : mCRYM est-elle une enzyme ou une protéine structurale ? Comment intervient le couple redox NADPH/NADP+ pour réguler l'action génomique et/ou non génomique de l'hormone T3 ? L'hormone T3 est-il le seul ligand physiologique de CRYM dans le cerveau ?

Le cancer colorectal (CCR) est la troisième maladie maligne la plus fréquente et la deuxième cause de décès par cancer. La famille des récepteurs tyrosine kinases transmembranaires ErbB a été identifiée comme l'un des principaux moteurs du développement et de la progression du CCR et l'un de ses membres les plus connus, le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR / ERBB1 / Her1), considéré comme l'une des cibles les plus importantes en traitement CRC. Deux autres membres de la famille ErbB, les récepteurs Her2 et Her3, apparaissent également comme de nouvelles cibles importantes pour le CRC en raison de la mutation somatique, de l’amplification génique ou de la résistance aux traitements anti-EGFR. La protéine transmembranaire, Fas (TNFRSF6 / CD95), est un membre de la superfamille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale (TNFRSF). Il peut transmettre des signaux multiples qui mènent à des destins de cellules complètement différents. Selon les contextes cellulaires, Fas initie la mort cellulaire par apoptose, essentielle pour arrêter les réponses immunitaires chroniques et prévenir l'auto-immunité et le cancer, ou pour stimuler la survie, la prolifération et la motilité des cellules, ce qui favorise l'auto-immunité, la croissance cancéreuse et les métastases. Avec des preuves de plus en plus nombreuses de la signalisation pro-survie médiée par Fas, les activités de promotion du cancer chez les patients atteints de cancer sont maintenant reconnues comme étant significatives et cliniquement pertinentes. Bien que cette polyvalence de signalisation ait été particulièrement bien démontrée dans le cancer du côlon, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les voies de survie sont encore largement inconnus. Dans ce contexte, l'objectif principal de mon doctorat Le projet visait à étudier l’importance du crosstalks entre les membres de la famille Fas et ErbB et, plus particulièrement, à déterminer si la signalisation Fas pouvait influencer la signalisation de l’EGFR favorisant le cancer.Plus précisément, je décris comment l’état de phosphorylation de la tyrosine Fas influence fortement la signalisation de la voie EGFR dans les cellules colorectales. Mes données démontrent que Fas dans son état prosurvival, phosphorylé à Y291 (pY291-Fas), interagit en effet avec EGFR et que cette interaction intensifie significativement la signalisation de l'EGFR dans les cellules cancéreuses colorectales anti-EGFR via la voie Yes-1 / STAT3. Le pY291-Fas s'accumule dans le noyau lors du traitement par EGF et favorise la localisation nucléaire du phospho-EGFR et du phospho-STAT3, l'expression de la cycline D1, l'activation des voies Akt et MAPK médiées par STAT3 et enfin la prolifération et la migration cellulaires. De plus, je découvre également le rôle potentiel que Her3 pourrait jouer avec Fas dans la libération des cellules cancéreuses colorectales de l'inhibition anti-EGFR.Tous ensemble mon doctorat des études permet de mieux comprendre le rôle des voies de survie de Fas dans la signalisation ErBb dans le CRC. Fait important, en démontrant un lien entre l'émergence d'une résistance aux traitements anti-ErbB et le signal de Fas pro-survie, mon travail justifie le développement d'une thérapie ciblée Fas / phospho-Fas comme nouvelle option thérapeutique pour surmonter les anti-EGFR, chez les patients présentant une résistance anti-EGFR secondaire. / Colorectal cancer (CRC) is the third most common malignant disease and the second most frequent cause of cancer-related death. The ErbB family of transmembrane receptor tyrosine kinases has been identified as a major driver of the development and progression of CRC and one its best-known member, the epidermal growth factor receptor (EGFR /ERBB1/Her1), considered one of the most important targets in CRC treatment. Two others members of the ErbB family, the receptors Her2 and Her3, also emerge as important new targets for CRC due to the somatic mutation, gene amplification or resistance to the anti-EGFR therapies. The transmembrane protein, Fas (TNFRSF6/CD95), is a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF). It can transmit multiple signals that lead to completely different cell fates. Depending on cellular contexts, Fas either initiates cell death by apoptosis, which is essential for shutting down chronic immune responses and preventing autoimmunity and cancer, or stimulates cell survival, proliferation, and motility, which can promote autoimmunity, cancer growth, and metastasis. With increasing evidence of Fas-mediated pro-survival signaling, the cancer-promoting activities of Fas are now recognized as significant and clinically relevant. While this signaling versatility has been particularly well demonstrated in colon cancer, the molecular mechanisms underlying the survivals pathways are still largely unknown. In this context, the main aim of my Ph.D. project was to study the importance of the crosstalks between Fas and the ErbB family members and more specifically to determine whether the Fas signaling could influence the cancer-promoting signaling of EGFR.More precisely, I describe how the Fas tyrosine phosphorylation status strongly influences the signaling of the EGFR pathway in colorectal cells. My data demonstrate that Fas in its prosurvival state, phosphorylated at Y291 (pY291-Fas), indeed interacts with EGFR and that this interaction significantly intensifies EGFR signaling in anti-EGFR-resistant colorectal cancer cells via the Yes-1/STAT3-mediated pathway. The pY291-Fas accumulates in the nucleus upon EGF treatment and promotes the nuclear localization of phospho-EGFR and phospho-STAT3, the expression of cyclin D1, the activation of STAT3-mediated Akt and MAPK pathways, and finally the cell proliferation and migration. Additionally, I also uncover the potential role that Her3, may play along with Fas, in the colorectal cancer cell escape from anti-EGFR inhibition. All together my Ph.D. studies provide a better understanding of the role of the Fas survival pathways in the ErBb signaling in CRC. Importantly, by demonstrating a connection between the emergence of resistance to anti-ErbB therapies and the Fas pro-survival signal, my work provides a rationale for the development of Fas/phospho-Fas targeted therapy as a new therapeutic option for overcoming anti-EGFR, in patients with secondary anti-EGFR resistance.