Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les neurones dopaminergiques (DAergiques) de l’aire tegmentaire ventrale (ATV) et de la substance noire compacte (SNc) sont impliqués dans de nombreuses fonctions physiologiques telles que la motivation, la récompense, l’apprentissage ou encore le contrôle du mouvement volontaire. Ces neurones sont également connus pour être perturbés dans plusieurs grandes maladies du cerveau telles que la schizophrénie, les maladies associées aux drogues d’abus ou dans la maladie de Parkinson. Des études in vivo ont démontré que la structure des terminaisons axonales DAergiques pouvait être de type « synaptique » et « non-synaptique ». Ces terminaisons dites « non-synaptiques », dépourvues de toute apposition avec un domaine membranaire postsynaptique, semblent représenter la grande majorité des terminaisons axonales établies par les neurones DAergiques. De façon intéressante, certaines des terminaisons synaptiques ont quant à elles, la capacité de co-libérer du glutamate ou du GABA. D’une façon générale, la formation et le maintien des synapses fait intervenir des protéines d’adhésion cellulaire dont les plus courantes sont les neurexines (Nrxn) et les neuroligines (Nlgn). Au niveau présynaptique, ces molécules d’adhésion interagissent avec des protéines de la zone active qui sont impliquées dans la régulation de l’exocytose. Parmi elles, on retrouve RIM1/2, Piccolo/Bassoon, ELKS ou encore Munc-13. Du côté postsynaptique, ces protéines d’adhésion cellulaire interagissent directement avec les protéines d’échafaudages telles que PSD95 ou Géphyrine. Mes travaux de doctorat ont consisté dans un premier temps à caractériser de façon exhaustive les terminaisons axonales établies par les neurones DAergiques. La proportion et la structure moléculaire des terminaisons synaptiques et non-synaptiques ont ainsi été évaluées. Dans un premier article, via l’utilisation d’un système in vitro, nous avons démontré qu’une minorité des terminaisons DAergiques (20%) était de nature synaptique, une proportion totalement différente lorsque comparée avec les neurones glutamatergique ou GABAergiques, dont les terminaisons synaptiques sont très fortement majoritaires (80%). De façon intéressante, la protéine de ZA Bassoon a été retrouvée majoritairement au sein des terminaisons synaptiques suggérant une différence de structure avec les terminaisons non-synaptiques. Finalement, au niveau du mécanisme de formation des synapses, nous avons mis en évidence que la surexpression de la protéine présynaptique Nrxn-1SS4- dans les neurones DAergiques permet d’augmenter la proportion de terminaisons synaptiques alors que la surexpression de la Nlgn-1AB est, quant à elle, capable d’induire une différentiation présynaptique DAergique. Dans un second article, nous avons voulu investiguer plus en détails le rôle des Nrxn dans la synaptogénèse DAergique. Pour ce faire, nous avons pris avantage d’un modèle animal totalement inédit mais absolument fascinant où nous avons évalué l’impact d’une délétion conditionnelle de l’ensemble des Nrxn sur la connectivité DAergique. Dans cette étude nous avons démontré que la densité de synapses excitatrices et inhibitrices établies par les neurones DAergiques n’était pas affectée chez les souris DAT::NrxnsKO et ce en comparaison des animaux de souche sauvage. Dans un deuxième temps, via des enregistrements électrophysiologiques, nous avons évalué la neurotransmission excitatrice et inhibitrice établie par les neurones DAergiques. Les résultats n’ont pas révélé de changement dans la neurotransmission excitatrice mais ont curieusement révélé un renforcement de l’activité synaptique inhibitrice chez les animaux Nrxn DAT::NrxnsKO et ce par rapport aux animaux du groupe contrôle. Finalement, via la mise en place de tests comportementaux, nous avons pu observer que les animaux DAT::NrxnsKO avaient une capacité d’apprentissage et de locomotion identique aux animaux de souche sauvage, cependant, une stimulation pharmacologique du système DAergique par l’amphétamine a révélé d’une diminution significative de la locomotion chez les souris DAT::NrxnsKO, pouvant refléter une baisse de la neurotransmission DAergique en condition non physiologique. Ces travaux de doctorat amènent pour la première fois une nouvelle vision sur la capacité des neurones DAergiques à établir une arborisation axonale majoritairement non-synaptique. Cette thèse démontre que les neurones DA du mésencéphale ont un programme intrinsèque de développement de leur arborisation axonale qui est différent des neurones GABAergiques du striatum et glutamatergiques du cortex. Aussi, au travers de ces travaux, nous montrons clairement que des protéines aussi fondamentales que les Nrxn et les Nlgn ont un impact limité dans la formation, le maintien et le fonctionnement des synapses établies par les neurones DAergiques. / Dopamine (DA) neurons from the substantia nigra compacta (SNc) and ventral tegmental area (VTA) are key players of the neuronal circuitry regulating movement initiation, reward and learning. Their functioning and survival are also perturbed in diseases such as schizophrenia, drug abuse and Parkinson’s. The axonal connectivity of DA neurons is particularly intriguing due to the hyperdense nature of the axonal arbor of these neurons, containing a very large number of neurotransmitter release sites. Ultrastructural examination of the axon terminals established by DA neurons failed to identify a tight pre- and postsynaptic coupling at most of release sites, giving rise to the concept of non-synaptic terminals and “diffuse” or volume transmission. Furthermore, it is now well established that a subset of terminals established by DA terminals has the capacity to release other neurotransmitters such a glutamate and GABA. A large literature implicates trans-synaptic proteins including neurexins (Nrxns) and neuroligins (Nlgns) in the development of synaptic contacts. In the presynaptic compartment, these cell adhesion molecules interact with active zone proteins like RIM1/2, Bassoon, ELKS and Munc-13 involved in regulating exocytosis. In the postsynaptic compartment, these cell adhesion molecules closely interact with scaffolding proteins like PSD95 or Gephyrin. In this thesis work, we first performed an exhaustive characterization of axon terminals established by DA neurons in primary co-culture system. We evaluated the proportion and the molecular structure of synaptic and non-synaptic terminals established by VTA and SNc DA neurons. In our first article, using and efficient in vitro system, we demonstrated that DA neurons develop a small proportion of synaptic terminals that is strikingly lower compared to glutamatergic and GABAergic neurons. Interestingly, we discovered that the active zone protein Bassoon is mainly expressed in DA terminals that are in contact or in close proximity to a target cell, and less expressed in non-synaptic DA terminals. Finally, we found that overexpression of Nrxn-1SS4- in DA neurons leads to an increase in the proportion of synapses whereas, overexpression of Nlgn-1A+B is able to trigger a DA presynaptic differentiation of DA neurons, suggesting a key role for these transsynaptic proteins in synapse formation by DA neurons. In a second article, we studied more globally the role of Nrxns proteins in the formation of synapses by DA neurons. We took advantage of a recently introduced triple conditional Nrxn mouse line to selectively delete Nrxns in DA neurons and examine the impact of this gene inactivation on the connectivity of DA neurons. In this part we demonstrated that the density of excitatory and inhibitory synapses density established by DA neurons is not affected by the deletion of all Nrxns, in comparison to the wild type group and does not impair the basic development and axonal connectivity of DA neurons at least, in vitro. In a second set of experiments, using patch-clamp recordings, we evaluated the function of excitatory and inhibitory synapses established by DA neurons in the striatum. GABA and glutamate synaptic currents evoked in the striatal medium spiny neurons by optogenetic stimulation of DA neuron axons revealed that glutamate release was unchanged, but identified a strong tendency for enhanced GABA co-release. Furthermore, using fast scan cyclic voltammetry, we found that the loss of Nrxns was associated with impaired DA transmission in the brain of adult mice, revealed by a reduced rate of DA reuptake after electrically-evoked DA release and with impaired amphetamine-induced locomotion. With this thesis, we bring a new perspective on the capacity of DA neurons to develop an axonal arborization that is mainly non-synaptic. With this work, we provide strong evidence arguing that mesencephalic DA neurons are endowed with an intrinsic developmental program leading them to develop an axonal connectivity that is very different from striatal GABA neurons or cortical glutamate neurons. Ours findings suggest that although Nrxns and Nlgns are unlikely to be the main determinants of on the formation of synapses by DA neurons, that are likely to act as key regulators of DA and GABA signaling by these.

Lors de cette étude, nous avons d’abord localisé les récepteurs CB1 et CB2 sur les structures neuronales. Nous avons montré que les récepteurs CB1 et CB2 sont présents sur les dendrites et les axones et les filopodes. Dans le même ordre d’idée, nous avons localisé le récepteur DCC sur les structures neuronales. Celui-ci est aussi présent sur les dendrites, les axones et les filopodes. Ces résultats suggèrent que le récepteur DCC serait impliqué non seulement dans le processus de synaptogenèse médié par le récepteur CB1, comme cela a été montré dans le laboratoire du professeur Bouchard, mais aussi dans celui, éventuellement, médié par le récepteur CB2. Nous avons ensuite évalué l’effet des ligands du récepteur CB2. Nous n’avons détecté aucun effet clair des agonistes inverses (AM630 et JTE907) et des agonistes (JWH015 et JWH133) quant à la médiation du processus de synaptogenèse en terme de variation de la densité des filopodes et des points de contacts synaptiques. Nous avons obtenu des résultats variables. Ceux-ci furent non reproductibles. Nous avons obtenu des résultats différents des résultats originaux lorsque nous avons requantifié visuellement les mêmes photos à deux reprises Nous avons développé une méthode informatisée de quantification qui nous a permis d’obtenir des résultats reproductibles. Cependant, nous n’avons toujours pas détecté d’effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Ces résultats préliminaires ne nous permettent ni d’infirmer, ni de confirmer d’éventuels effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Une étude exhaustive serait nécessaire pour le déterminer. / During this study we first localised the receptors CB1 and CB2 on neuronal structures. We have shown that those receptors expressed on dendrites and filopodia. Likewise and based on Bouchard’s previous laboratory results showing an implication of the netrin-1 receptor, Deleted in Colorectal Cancer (DCC), on the synaptogenesis process mediated by the receptor CB1 we localized the receptor DCC on neuronal structures. We have shown that the receptor DCC is expressed on dendrites, axons and filopodia. These results suggest an implication of the receptor DDC in a synaptogenesis process that would be mediated by the receptor CB2. We then evaluated the effects triggered by the receptor CB2’s ligands on the synaptogenesis process. We found no evidences of any effects on synaptogenesis mediated by the receptor CB2 inverse agonists (AM630 and JTE907) and agonists (JWH015 and JWH133) in term of filopodia density and synaptic contacts density variations. We witnessed highly variable results that were irreproducible. Visual quantifications of filopodia and synaptic contacts density were variable as we quantified two times the same set of photos. We have therefore developed a computer based quantification method by which we were able to obtained reproducible results. Nevertheless we found no evidence of any implication of the receptor CB2 on the synaptogenesis process. These preliminary results do not allow us neither to rule out nor to confirm eventual CB2 receptor effects on synaptogenesis. An exhaustive study is required to access possible CB2 receptors effect on synaptogenesis.

Le domaine de la microscopie de fluorescence a connu une réelle révolution ces dernières années, permettant d'atteindre des résolutions nanométriques, bien en dessous de la limite de diffraction prédite par Abbe il y a plus d’un siècle. Les techniques basées sur la localisation de molécules individuelles telles que le PALM (Photo-Activation Light Microscopy) ou le (d)STORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) permettent la reconstruction d’images d’échantillons biologiques en 2 et 3 dimensions, avec des résolutions quasi-moléculaires. Néanmoins, même si ces techniques nécessitent une instrumentation relativement simple, elles requièrent des traitements informatiques conséquents, limitant leur utilisation en routine. En effet, plusieurs dizaines de milliers d’images brutes contenant plus d’un million de molécules doivent être acquises et analysées pour reconstruire une seule image. La plupart des outils disponibles nécessitent une analyse post-acquisition, alourdissant considérablement le processus d’acquisition. Par ailleurs la quantification de l’organisation, de la dynamique mais aussi de la stœchiométrie des complexes moléculaires à des échelles nanométriques peut constituer une clé déterminante pour élucider l’origine de certaines maladies. Ces nouvelles techniques offrent de telles capacités, mais les méthodes d’analyse pour y parvenir restent à développer. Afin d’accompagner cette nouvelle vague de microscopie de localisation et de la rendre utilisable en routine par des expérimentateurs non experts, il est primordial de développer des méthodes de localisation et d’analyse efficaces, simples d’emploi et quantitatives. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons développé dans un premier temps une nouvelle technique de localisation et reconstruction en temps réel basée sur la décomposition en ondelettes et l‘utilisation des cartes GPU pour la microscopie de super-résolution en 2 et 3 dimensions. Dans un second temps, nous avons mis au point une méthode quantitative basée sur la visualisation et la photophysique des fluorophores organiques pour la mesure de la stœchiométrie des récepteurs AMPA dans les synapses à l’échelle nanométrique. / The field of fluorescence microscopy has witnessed a real revolution these last few years, allowing nanometric spatial resolutions, well below the diffraction limit predicted by Abe more than a century ago. Single molecule-based super-resolution techniques such as PALM (Photo-Activation Light Microscopy) or (d)STORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) allow the image reconstruction of biological samples in 2 and 3 dimensions, with close to molecular resolution. However, while they require a quite straightforward instrumentation, they need heavy computation, limiting their use in routine. In practice, few tens of thousands of raw images with more than one million molecules must be acquired and analyzed to reconstruct a single super-resolution image. Most of the available tools require post-acquisition processing, making the acquisition protocol much heavier. In addition, the quantification of the organization, dynamics but also the stoichiometry of biomolecular complexes at nanometer scales can be a key determinant to elucidate the origin of certain diseases. Novel localization microscopy techniques offer such capabilities, but dedicated analysis methods still have to be developed. In order to democratize this new generation of localization microscopy techniques and make them usable in routine by non-experts, it is essential to develop simple and easy to use localization and quantitative analysis methods. During this PhD thesis, we first developed a new technique for real-time localization and reconstruction based on wavelet decomposition and the use of GPU cards for super-resolution microscopy in 2 and 3 dimensions. Second, we have proposed a quantitative method based on the visualization and the photophysics of organic fluorophores for measuring the stoichiometry of AMPA receptors in synapses at the molecular scale.

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1), ou maladie de Steinert, est une maladie qui touche plusieurs tissus, dont le système nerveux central (SNC). L’atteinte neurologique est variable et inclut des troubles de la fonction exécutive, des changements de comportement et une hypersomnolence dans la forme adulte, ainsi qu’une déficience intellectuelle marquée dans la forme congénitale. Dans leur ensemble, les symptômes neurologiques ont un fort impact sur le parcours académique, professionnel et les interactions sociales. Aujourd’hui aucune thérapie n’existe pour cette maladie. La DM1 est due à une expansion anormale d’un triplet CTG non-codant dans le gène DMPK. Les ARN messagers DMPK, porteurs de l’expansion, s’accumulent dans le noyau des cellules (sous forme de foci) et perturbent la localisation et la fonction de protéines de liaison à l’ARN, notamment des familles MBNL et CELF, ce qui entraîne des défauts d’épissage alternatif, d’expression, de polyadenylation et de localisation d’autres ARN cibles. Malgré le progrès récent dans la compréhension des mécanismes de la maladie, les aspects cellulaires et moléculaires de l’atteinte neurologique restent méconnus: nous ne connaissons ni la contribution de chaque type cellulaire du cerveau, ni les voies moléculaires spécifiquement dérégulées dans chaque type cellulaire. L’objectif de ma thèse a été de répondre à ces deux questions importantes en utilisant un modèle de souris transgéniques et des cellules primaires dérivées de celui-ci. Pour mon projet, j’ai utilisé les souris DMSXL générées par mon laboratoire. Ces souris reproduisent des caractéristiques importantes de la DM1, notamment l’accumulation des ARN toxiques et la dérégulation de l’épissage alternatif dans plusieurs tissus. L’impacte fonctionnel des transcrits DMPK toxiques dans le SNC des souris DMSXL se traduit par des problèmes comportementaux et cognitifs et par des défauts de la plasticité synaptique. Afin d’identifier les mécanismes moléculaires associés à ces anomalies, une étude protéomique globale a montré une dérégulation de protéines neuronales et astrocytaires dans le cerveau des souris DMSXL. De plus, l’étude de la distribution des foci d’ARN dans les cerveaux des souris et des patients a montré un contenu plus élevé dans les astrocytes par rapport aux neurones. Ensemble, ces résultats suggèrent une contribution à la fois neuronale et gliale dans la neuropathogenèse de la DM1. L’étude protéomique globale des cerveaux des souris DMSXL, a aussi montré des défauts de protéines synaptiques spécifiques des neurones, que nous avons par la suite validés dans le cerveau des patients. SYN1 est hyperphosphorylée d’une façon CELF-dépendante et RAB3A est surexprimé en réponse à l’inactivation de MBNL1. Les protéines MBNL et CELF régulent l’épissage alternatif d’un groupe de transcrits au cours du développement, et leur dérégulation dans la DM1 entraîne l’expression anormale d’isoformes d’épissage embryonnaires dans le tissu adulte. Dans ce contexte, j’ai étudié si les défauts des protéines RAB3A et SYN1 sont associés à une dérégulation d’épissage, et si les anomalies des protéines synaptiques identifiées dans la DM1 reproduisent des évènements embryonnaires de la régulation de RAB3A et SYN1. Mes résultats indiquent que les défauts de ces protéines dans les cerveaux adultes ne sont pas dus à une altération de l’épissage alternatif des transcrits et ne recréent pas des évènements embryonnaires. La neuropathogenèse de la DM1 va, donc, au delà de la dérégulation de l’épissage et d’autres voies moléculaires restent à explorer dans les cerveaux DM1. Afin d’identifier des sous-populations cellulaires susceptibles à l’accumulation des ARN toxiques, nous avons étudié la distribution des foci dans plusieurs régions cérébrales. (...) / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a severe disorder that affects many tissues, including the central nervous system (CNS). The degree of brain impairment ranges from executive dysfunction, attention deficits, low processing speed, behavioural changes and hypersomnia in the adult form, to pronounced intellectual disability in the congenital cases. The neurological manifestations have a tremendous impact on the academic, professional, social and emotional aspects of daily life. Today there is no cure for this devastating condition. DM1 is caused by the abnormal expansion of a CTG trinucleotide repeat in the 3’UTR of the DMPK gene. Expanded DMPK transcripts accumulate in RNA aggregates (or foci) in the nucleus of DM1 cells, disrupting the activity of important RNA-binding proteins, like the MBNL and CELF families, and leading to abnormalities in alternative splicing, gene expression, RNA polyadenylation, localisation and translation. In spite of recent progress, fundamental gaps in our understanding of the molecular and cellular mechanisms behind the neurological manifestations still exist: we do not know the contribution of each cell type of the CNS to brain dysfunction, or the molecular pathways specifically deregulated in response to the CTG expansion. The aim of my PhD project has been to gain insight into these two important questions using a relevant transgenic mouse model of DM1 and cell cultures derived thereof. In my studies I used the DMSXL mice, previously generated in my host laboratory. The DMSXL mice express expanded DMPK mRNA with more than 1,000 CTG repeats. They recreate relevant DM1 features, such as RNA foci and missplicing in multiple tissues. The functional impact of expanded DMPK transcripts in the CNS of DMSXL mice translates into behavioural and cognitive abnormalities and defective synaptic plasticity. To identify the molecular mechanisms behind these abnormalities, a global proteomics analysis revealed changes in both neuron-specific and glial-specific proteins in DMSXL brain. We also investigated RNA foci in DMSXL and human DM1 brains and found non-homogenous distribution between cell types, with a higher foci content in astrocytes relative to neurons. Together these results suggest that both neuronal and glial defects contribute to DM1 neuropathogenesis. The global proteomics analysis of DMSXL brains also identified abnormalities in neuronal synaptic proteins that we have validated in human brain samples. SYN1 is hyperphosphorilated in a CELF-dependent manner while RAB3A is upregulated in association with MBNL1 depletion. CELF and MBNL proteins regulate the alternative splicing of a subset of transcripts throughout development, and their deregulation in DM1 leads to abnormal expression of fetal splicing isoforms in adult DM1 brains. In this context, I have studied if RAB3A and SYN1 deregulations observed in adult brains are associated with splicing abnormalities or if they recreated embryonic expression and phosphorylation events. My results indicate that the synaptic proteins abnormalities observed in adult DMSXL brains are not caused by defective alternative splicing and do not recreate embryonic events. Thus, DM1 neuropathogenesis goes beyond missplicing and other molecular pathways must be explored in DM1 brains. To better understand the cellular sub-populations susceptible of accumulating toxic RNA foci we have studied foci distribution in different brain regions. We identified pronounced accumulation of toxic RNAs in Bergman astrocytes of DMSXL mice cerebellum and DM1 patients, associated with neuronal hyperactivity of Purkinje cells. A quantitative proteomics analysis revealed a significant downregulation of GLT1 – a glial glutamate transporter expressed by the Bergmann cell in the cerebellum. I have confirmed the GLT1 downregulation in other brain regions of mouse and human brain. (...)

Lors de cette étude, nous avons d’abord localisé les récepteurs CB1 et CB2 sur les structures neuronales. Nous avons montré que les récepteurs CB1 et CB2 sont présents sur les dendrites et les axones et les filopodes. Dans le même ordre d’idée, nous avons localisé le récepteur DCC sur les structures neuronales. Celui-ci est aussi présent sur les dendrites, les axones et les filopodes. Ces résultats suggèrent que le récepteur DCC serait impliqué non seulement dans le processus de synaptogenèse médié par le récepteur CB1, comme cela a été montré dans le laboratoire du professeur Bouchard, mais aussi dans celui, éventuellement, médié par le récepteur CB2. Nous avons ensuite évalué l’effet des ligands du récepteur CB2. Nous n’avons détecté aucun effet clair des agonistes inverses (AM630 et JTE907) et des agonistes (JWH015 et JWH133) quant à la médiation du processus de synaptogenèse en terme de variation de la densité des filopodes et des points de contacts synaptiques. Nous avons obtenu des résultats variables. Ceux-ci furent non reproductibles. Nous avons obtenu des résultats différents des résultats originaux lorsque nous avons requantifié visuellement les mêmes photos à deux reprises Nous avons développé une méthode informatisée de quantification qui nous a permis d’obtenir des résultats reproductibles. Cependant, nous n’avons toujours pas détecté d’effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Ces résultats préliminaires ne nous permettent ni d’infirmer, ni de confirmer d’éventuels effets sur la synaptogenèse médiés par le récepteur CB2. Une étude exhaustive serait nécessaire pour le déterminer. / During this study we first localised the receptors CB1 and CB2 on neuronal structures. We have shown that those receptors expressed on dendrites and filopodia. Likewise and based on Bouchard’s previous laboratory results showing an implication of the netrin-1 receptor, Deleted in Colorectal Cancer (DCC), on the synaptogenesis process mediated by the receptor CB1 we localized the receptor DCC on neuronal structures. We have shown that the receptor DCC is expressed on dendrites, axons and filopodia. These results suggest an implication of the receptor DDC in a synaptogenesis process that would be mediated by the receptor CB2. We then evaluated the effects triggered by the receptor CB2’s ligands on the synaptogenesis process. We found no evidences of any effects on synaptogenesis mediated by the receptor CB2 inverse agonists (AM630 and JTE907) and agonists (JWH015 and JWH133) in term of filopodia density and synaptic contacts density variations. We witnessed highly variable results that were irreproducible. Visual quantifications of filopodia and synaptic contacts density were variable as we quantified two times the same set of photos. We have therefore developed a computer based quantification method by which we were able to obtained reproducible results. Nevertheless we found no evidence of any implication of the receptor CB2 on the synaptogenesis process. These preliminary results do not allow us neither to rule out nor to confirm eventual CB2 receptor effects on synaptogenesis. An exhaustive study is required to access possible CB2 receptors effect on synaptogenesis.

La maladie de Parkinson (PD) et la démence à corps de Lewy (DLB) sont les deuxième et troisième maladies neurodégénératives les plus communes et font partie d’une classe de maladies appelées synucléinopathies. Les synucléinopathies sont associées à une pathologie liée à l’α-synucléine (α-syn) laquelle se caractérise par une accumulation de cette protéine dans les neurones, formant ainsi les corps de Lewy. L’α-syn pathologique se retrouve aussi sous forme d’oligomères et de fibrilles, qui sont toxiques pour les neurones et leurs synapses. L’une des premières anomalies observables chez les patients atteints de synucléinopathies est la dysfonction synaptique, souvent combinée à une perte de synapses. Il a été rapporté que les oligomères d’α-syn retrouvés au niveau des synapses précèdent la formation de corps de Lewy dans les neurones et leur transmission semble être associée à la progression des symptômes. Pourtant, les mécanismes moléculaires sous-jacents la dysfonction synaptique causée par l’α-syn restent inconnus. D’autre part, le fonctionnement normal des synapses est fortement régulé par une famille de protéines appelées organisateurs synaptiques. Les organisateurs synaptiques, incluant la protéine neurexine, sont des molécules d’adhésion cellulaire qui régulent la synaptogenèse, la plasticité, la libération des neurotransmetteurs et les fonctions cognitives. De plus, nous avons préliminairement montré que l’α-syn interagit avec l’isoforme β des neurexines (NRXs) (β-NRXs). Mon projet avait donc pour but de caractériser l’interaction α-syn/β-NRX et d’évaluer comment celle-ci contribue à la pathologie liée à l’α-syn. Nous avons émis l’hypothèse que cette interaction affecte la fonction synaptogénique liée aux NRXs et son trafic. Dans un premier temps, pour tester notre hypothèse, l’interaction α-syn/β-NRX a été évaluée grâce à des analyses de liaison à la surface cellulaire. Il a été constaté que les oligomères d’α-syn se lient fortement à NRX1,2β de manière dépendante du domaine riche en histidine (HRD), caractéristique de l’isoforme β, et cela sans perturber sa liaison à ses ligands endogènes postsynaptiques, neuroligine 1 (NLG1) et « leucine rich repeat transmembrane neuronal 2 » (LRRTM2). De plus, à travers des essais d’internalisation, nous avons observé que les oligomères d’α-syn altèrent le trafic de NRX1β en augmentant son internalisation de façon dépendante au HRD et altèrent également la différenciation NRX-dépendante de la synapse en synapse inhibitrice. Par conséquent, nous suggérons que cette internalisation accrue pourrait affecter la fonction synaptogénique associée aux NRXs. Ce travail contribue à une meilleure compréhension sur la façon dont l’α-syn provoque un dysfonctionnement synaptique, fournissant de nouvelles perspectives moléculaires et pharmacologiques sur les synucléinopathies. / Parkinson’s disease (PD) and dementia with Lewy bodies (DLB) are the second and the third most common neurodegenerative disorders and are part of a class of diseases called synucleinopathies. Synucleinopathies are associated with an α-synuclein (α-syn) pathology which shows an accumulation of α-syn in neurons, forming Lewy bodies. This pathological α-syn can form oligomers and fibrils, which are toxic for neurons and their synapses. One of the first changes to occur in patients’ brain with synucleinopathies is synaptic dysfunction often combined with synapse loss. Synaptic α-syn oligomers were revealed to precede the formation of Lewy bodies, and their transmission to other neurons to correlate with the progression of the symptoms. Yet, the molecular mechanisms underlying how α-syn leads to synaptic dysfunction are unknown. Synaptic function is highly regulated by a protein family called synaptic organizers. Synaptic organizers are cell adhesion molecules that regulate synaptogenesis, plasticity, neurotransmitter release, synaptic plasticity and cognitive functions. Of this family, we have found that α-syn interacts with the β-isoforms of the neurexins (NRXs) family members (β-NRXs). My project aimed to characterize α-syn/β-NRX interaction and to evaluate how this interaction contributes to α-syn pathology. We hypothesized that this interaction affects NRX trafficking and its synaptic function. Firstly, to test our hypothesis, the α-syn/β-NRX interaction was characterized by performing cell surface binding assays. I found that α-syn oligomers strongly bind to NRX1,2β in a histidine rich domain (HRD)-dependent manner, without disrupting NRX binding to its postsynaptic binding partners, neuroligin 1 (NLG1) and leucine rich repeat transmembrane neuronal 2 (LRRTM2). Moreover, using internalization assays, we discovered that α-syn oligomers impair NRX trafficking by increasing NRX1β internalization in an HRD-dependent manner and impair NRX-dependent inhibitory presynaptic differentiation. Thereby, we suggest that this increased internalization affects the inhibitory synaptogenic function of NRX-based synaptic organizing complexes. This work contributes to a better understanding of how α-syn causes synaptic dysfunction, providing promising new molecular mechanisms and pharmacological insights into synucleinopathies.

La décharge des cellules de Purkinje (CP), neurone de sortie du cortex cérébelleux, joue un rôle majeur dans le contrôle moteur. Les CP reçoivent des entrées excitatrices provenant des cellules des grains (CG), lesquelles génèrent également une inhibition antérograde sur les CP via l’activation d’interneurones de la couche moléculaire (IN). Lors de ma thèse, j’ai étudié l’influence simultanée de la balance excitation-inhibition (E/I) et des plasticités à court terme aux synapses CG-IN-CP sur la décharge des CP, par des techniques d’électrophysiologie, d’optogénétique et de simulation. Ces travaux démontrent l’existence d’une hétérogénéité d’E/I dans le cortex cérébelleux ainsi qu’une grande diversité de modulation des CP en réponse à la stimulation de CG. Le nombre de stimulation des CG influence fortement la direction et l’intensité de la modulation observée. Enfin, la combinaison de plasticités à court terme et d’E/I génère dans la décharge des CP des motifs de réponses complexes mais reproductibles, ayant sans doute un rôle essentiel dans l’encodage sensoriel. / Rate and temporal coding in Purkinje cells (PC), the sole output of the cerebellar cortex, play a major role in motor control. PC receives excitatory inputs from granule cells (GC) which also provide feedforward inhibition on PC through the activation of molecular layer interneurons (MLI). In this thesis, I studied the influence of the combined action of excitation/inhibition (E/I) balance and short-term plasticity of GC-MLI-PC synapses on PC discharge, by using electrophysiological recordings, optogenetic stimulation and modelling. This work demonstrates that E/I balances are not equalized in the cerebellar cortex and showed a wide distribution of PC discharge modulation in response to GC inputs, from an increase to a shut down of the discharge. The number of stims in GC bursts strongly controls the strength and sign of PC modulation. Lastly, the interplay between short-term plasticity and E/I balance implements complex but reproducible output patterns of PC responses to GC inputs that should play a key role in stimulus encoding by the cerebellar cortex.