Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste majeur de l'Homme capable de mettre en jeu tout un ensemble de mécanismes pour résister aux antibiotiques. Parmi eux, le système d'efflux actif MexXY(OprM) s'oppose, lorsqu'il est surproduit, à l'accumulation intracellulaire de différents composés dont certains, comme les aminosides et les fluoroquinolones, sont largement utilisés dans le traitement des infections à P. aeruginosa. Chez les souches cliniques, la surproduction de la pompe MexXY résulte de mutations soit dans le gène répresseur de l'opéron mexXY, mexZ (mutants agrZ) soit dans des loci génétiques encore inconnus (mutants agrUI). Au cours de ce travail, nous avons carcatérisés deux types de mutants agr W dérivés de la souche de référence PAO 1. Les premiers, agr WI, présentent une augmentation de la résistance aux antibiotiques substrats de la pompe Mex.XY comparable à celle observée chez les mutants agrZ tandis que les seconds, agrW2, sont en plus résistants aux carbapénèmes et aux peptides cationiques ( colistine ). Par une approche de séquençage à haut débit des génomes, nous avons identifié chez les mutants agrWI une mutation dans deux des quatre allèles codant pour la sous-unité ribosomale 23S et chez les mutants agrW2 une mutation dans le régulateur de réponse d'un système à deux composants dénommé ParR. A l'aide d'expériences de RT-qPCR, d'inactivation et de complémentation génique deux voies distinctes d'activation de MexXY/OprM ont été identifiées. Parallèlement, la comparaison des transcriptomes globaux des mutants agrWI, agrW2 avec celui de la souche PAOl nous a permis de mieux comprendre dans quel processus cellulaire s'intègre la pompe Mex.XY /OprM. / Pseudomonas aeruginosa is a nosocomial pathogen naturally resistant to many antibiotics thanks to numerous resistant mechanisms. Among them, overproduction of the MexXY/OprM efflux system leads to decrease significantly the susceptibility of P. aeruginosa to aminoglycosides and fluoroquinolones. In clinical strains, upregulation of this pump often results from mutations occurrinJ in mexZ ( agrZ mutants), the local repressor gene of the mexXY operon. Analysis of MexXY­overproducing mutants selected in vitro from the reference strain PAO 1 led to identification of two new classes of mutants (agrWmutants) harboring an intact mexZ gene. The first, named agrWI mutants, shows an increase resistance to Mex.XY substrates similar to that observed in agrZ mutants while the second, dubbed agrW2, are more resistant to carbapenems and cationic peptides (colistin) in addition to aminoglycosides and fluoroquinolones. Whole-genome sequencing experiments revealed in agrWI mutants a mutation in two of the four alleles encoding the 23S ribosomal subunit and in agr W2 mutants, a mutation in the response regulator of a two-component system called ParR. By using RT-qPCR, inactivation and complementation experiments, two distinct activation pathway of the MexXY /OprM efflux system have been identified. Meanwhile, transcriptomic profiles of agrWJ and agrW2 mutants compared with the PAOl reference strain has allowed us to better understand the physiologie function of the MexXY/OprM efflux pump

Les systèmes à deux composants jouent un rôle prépondérant dans l'adaptation des bactéries à leur environnement. L'objectif de ce travail de thèse était d'identifier et de caractériser des systèmes à deux composants chez la bactérie phytostimulatrice Azospirillum nécessaires à l'adaptation à la rhizosphère de sa plante-hôte. L'analyse de la distribution génomique des gènes appartenant à la famille des systèmes à deux composants dans les génomes d'Azospirillum disponibles a révélé l'existence d'un grand nombre de gènes codant des hisitidine kinases hybrides, et une analyse plus approfondie a montré une organisation multidomaines complexe de cette famille de protéines. Afin de comprendre leur rôle chez Azospirillum, nous avons, dans un premier temps, sélectionné et inactivé quatre gènes codant des histidine kinases hybrides présentant une architecture multidomaines complexe. A l'aide d'une approche multidisciplinaire combinant génétique, biochimie et phylogénie, nous avons mis en évidence pour la première fois chez Azospirillum, un système atypique à trois-composants nommé PreSKR contrôlant un grand nombre de processus impliqués dans la survie et la colonisation de la rhizosphère, qui agirait en modulant le taux intracellulaire de c-di-GMP. Dans un second temps, nous nous sommes focalisés sur une histidine kinase hybride exprimée au contact de la plante hôte ; cette protéine, appelée RsiK, s'avère être impliquée dans la perception de surfaces et la régulation de la formation de biofilms. L'analyse du régulon par RNA-seq a révèlé que 78 gènes étaient contrôlés par ce système. La prévalence de la famille des histidine kinases hybrides chez Azospirillum couplée à l'approche fonctionnelle réalisée sur deux d'entre elle souligne l'importance des phosphorelais encore largement méconnus chez les bactéries rhizosphériques / Bacterial two-component systems play an important role in the ability of bacteria to adapt to various environments. The aim of this thesis was to identify and characterize two-component systems involved in the adaptation of the phytostimulatory bacteria Azospirillum to its host plant. Analysis of the genomic distribution of genes encoding two-component systems across Azospirillum available genomes revealed the existence of a high number of genes encoding hybrid histidine kinases, and further analyses highlighted a complex multi-domain organization of this family of proteins. In order to understand their role in Azospirillum, as a first step we selected and inactivated four genes encoding complex hybrid histidines kinases. Using a multidisciplinary approach which combines genetics, biochemistry and phylogeny, we brought to light for the first time in Azospirillum, an atypical three-component system named PreSKR which controls a wide variety of processes involved in survival and rhizosphere colonization likely by modulating c-di-GMP levels. As a second step, we focused on a gene encoding a hybrid histidine kinase named RsiK which is induced in contact with its host plant. RsiK is involved in surface sensing and biofilm formation regulation. Transcriptomic analysis of rsiK regulon by RNA-seq showed that 78 genes were under the control of this system. The prevalence of genes encoding hybrid histidine kinase family in Azospirillum, coupled with the functional characterization of two of them, highlight the importance of phosphorelays, still largely unrecognized in rhizospheric bacteria

Bacillus cereus sensu stricto (ss) est un pathogène alimentaire majeur représentant la 2e cause de toxiinfectionalimentaire en France en 2012. Cette espèce fait partie du groupe Bacillus cereus sensu lato (sl)constitué d’espèces ubiquitaires génétiquement très proches et incluant d’autres pathogènes comme B.anthracis, B. thuringensis et B. cytotoxicus. Les souches de B. cereus sl sont d’autre part réparties en septgroupes phylogénétiques présentant des gammes de température de croissance variées et caractérisés partrois thermotypes principaux: thermotolérants, mésophiles, psychrotolérants. L’adaptation au froid dessouches B. cereus ss est un mécanisme clé car il conditionne sa capacité à se développer dans les alimentsréfrigéré pour atteindre des doses qui peuvent être dangereuse pour les consommateurs. Le but de cetteétude a été d’étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’adaptation au froid de la diversité desouches représentant B. cereus sl.Nous avons mis en évidence que les gènes codant pour le système à deux composants CasK/R sontsurexprimés à basse température. CasK/R s’est révélé être un système générique d’adaptation de B. cereussl au froid, car son rôle a été mis en évidence lors de l’étude de quatre souches de thermotypes différents etleurs mutants isogéniques ΔcasK/R respectifs. Une étude transcriptomique réalisée sur une souche ATCC14579 et son mutant ΔcasK/R a révélé que seize des gènes différentiellement exprimés en début de phaseexponentielle et en phase stationnaire, à basse température, codent pour des protéines impliquées dans lemétabolisme des acides gras. Nous avons mis en évidence le rôle de CasK /R dans la modification de lacomposition en acides gras membranaires via une augmentation de la proportion en acides gras insaturéslors de la croissance de B. cereus au froid. Par ailleurs, le gène codant pour la désaturase DesA,principalement responsable des insaturations des acides gras à basse température est régulée positivementpar CasK/R au froid.Nous avons également démontré que les gènes casK/R sont organisés en opéron avec un gène codant pourun régulateur RpiR-like. De manière originale, cet opéron est négativement régulé par CasK/R à bassetempérature en phase stationnaire. Le promoteur individuel du rpiR est réprimé à basse température maisaussi à température optimale de croissance, ce qui suggère un rôle de CasK/R, même à températureoptimale / Bacillus cereus sensu stricto (ss) is a major foodborne pathogen representing the second cause of foodpoisoning in France in 2012. This species belongs to Bacillus cereus sensu lato (sl) consisting of ubiquitousspecies genetically close-related and including other pathogens such as B. anthracis, B. thuringiensis and B.cytotoxicus. The strains of B. cereus sl are divided into seven phylogenetic groups with various growthtemperature ranges and characterized by three main thermotypes: thermotolerant, mesophilic,psychrotolerant. The B. cereus ss cold adaptation is a key mechanism because it determines B. cereusability to grow in refrigerated foods and achieve doses that can be dangerous to consumers. The aim of thisstudy was to study the molecular mechanisms involved in the cold adaptation of strains representing B.cereus sl diversity.We demonstrated that the genes encoding the two component system CasK/R are overexpressed at lowtemperature. CasK/R was found to be a generic mechanism for B. cereus sl cold adaptation as its role washighlighted in the study of four strains with different thermotypes and their respective isogenic mutantsΔcasK/R. A transcriptomic study on a B. cereus ATCC 14579 strain and its ΔcasK/R mutant strain revealedthat sixteen of the genes differentially expressed in both early log phase and stationary phase at lowtemperature encode proteins involved in the fatty acids metabolism. We showed the role of CasK/R in themodification of the membrane fatty acid composition via an increase of the proportion of unsaturated fattyacids during growth of B. cereus at low temperature. Furthermore, the gene encoding the desaturase DesA,mainly responsible of the fatty acids unsaturation at a low temperature is upregulated by CasK/R at lowtemperature.We also demonstrated that casK/R genes were organized in operon with a gene encoding a RpiR-likeregulator. Interstingly,, this operon is negatively regulated by CasK/R at low temperature in the stationaryphase. The individual rpiR promoter is repressed by CasK/R at low temperature but also optimal growthtemperature, suggesting also a role for CasK/R at optimal temperature

Chez les bactéries, l’undécaprényl-phosphate (C55-P) est utilisé comme transporteur lipidique de sous-unités glycanes à travers la membrane plasmique. Après la synthèse de son précurseur (C55-PP) par UppS, ce dernier doit être déphosphorylé. Le transfert final des sous-unités glycanes sur une molécule acceptrice du côté périplasmique libère également du C55-PP qui va être déphosphorylé pour être recyclé. Quatre C55-PP phosphatases membranaires ont été identifiées chez E. coli : trois enzymes appartenant à la famille des PAP2 (PgpB, YbjG et LpxT) et une protéine appartenant à une nouvelle famille de phosphatases (BacA). Au cours de cette étude, nous avons caractérisé les propriétés biochimiques et la topologie membranaire de BacA. Les conditions optimales de son activité (pH, détergent, cations, température) ont été déterminées et une étroite spécificité de substrats, avec une préférence pour le C55-PP, a été observée. Trois résidus essentiels à son activité, Glu21, Ser27 et Arg174, ont été identifiés par mutagénèse, nous permettant de proposer un mécanisme catalytique basé sur l’attaque nucléophile du C55-PP par un résidu sérine. La topologie membranaire de BacA, déterminée expérimentalement à l’aide de fusions de protéines, n’a validé aucun des modèles in silico précédemment proposés. Ainsi, BacA comprend 7 segments transmembranaires et présente deux larges boucles périplasmiques portant les résidus hautement conservés du site actif. Nos résultats démontrent que toutes les C55-PP phosphatases d’E. coli identifiées à ce jour (BacA et PAP2) catalysent la déphosphorylation du C55-PP du même côté de la membrane plasmique (côté périplasmique), nous interrogeant sur l’identité de l’enzyme catalysant la déphosphorylation du C55-PP synthétisé de novo. LpxT est une PAP2 qui possède une activité kinase assurant le transfert du phosphate β du C55-PP sur une molécule de lipide A, pour former du lipide A-1-PP. Nous avons cartographié par mutagénèse dirigée le site actif de LpxT et mis en évidence l’importance d’une triade catalytique caractéristique des PAP2 (His150, His190, Asp194) et d’autres résidus spécifiques à LpxT et ses proches homologues. L’activité de LpxT est inhibée par un petit peptide, PmrR, dont l’expression est sous contrôle du système à deux composants PmrA-PmrB. Notre étude a montré que cette inhibition intervenait via une interaction directe entre ces deux partenaires. Nous montrons que l’induction du système PmrA-PmrB conduit à une résistance à la polymyxine B (peptide antimicrobien cationique) et à une sensibilité au déoxycholate (composant majeur de la bile) et que la modification catalysée par LpxT produit un effet opposé. La résistance à la polymyxine B est corrélée à la force des signaux induisant le système PmrA-PmrB, mais également le système PhoP-PhoQ et nous avons clairement identifié les signaux nécessaires à cette résistance chez E. coli. / In bacteria, the undecaprenyl-phosphate (C55-P) is used as a lipid carrier of glycans subunits across the plasma membrane. After synthesis of its precursor (C55-PP) by UppS, this latter must be dephosphorylated. The transfer of the glycans subunit onto a final acceptor molecule at the periplasmic side also releases C55-PP that will be dephosphorylated to be recycled. Four C55-PP membrane phosphatases have been identified in E. coli : three enzymes belonging to the PAP2 family (PgpB, YbjG and LpxT) and a protein belonging to a new family of phosphatases (BacA).In this study, we characterized the biochemical properties and membrane topology of BacA. The optimal conditions for its activity (pH, detergent, cation, temperature) were determined and narrow substrate specificity, with a preference for the C55-PP, was observed. Three essential residues to its activity, Glu21, Ser27 and Arg174 were identified by mutagenesis, allowing us to propose a catalytic mechanism based on the nucleophilic attack of the C55-PP by a serine residue. The membrane topology of BacA determined experimentally using protein fusions did not validated previous in silico models. Thus, BacA has 7 transmembrane segments and contains in particular two large periplasmic loops carrying the highly-conserved active site residues. Our results demonstrate that all C55-PP phosphatases of E. coli identified to date (BacA and PAP2) catalyze the dephosphorylation of C55-PP on the same side of the plasma membrane (periplasmic side), questioning us about the identity of the enzyme catalyzing the dephosphorylation of C55-PP synthesized de novo. LpxT is a PAP2 enzyme with a specific kinase activity, transferring the β-phosphate group of C55-PP on a molecule of lipid A, to generate lipid A-1-PP. We mapped, by directed mutagenesis, the active site of LpxT and highlighted the importance of a catalytic triad characteristic to the PAP2 enzymes (His150, His190, Asp194) and other specific residues of LpxT and its closer homologues. The activity of LpxT is inhibited by a small membrane peptide, called PmrR, whose expression is under the control of the two-component system PmrA-PmrB. Our study showed that this inhibition occurred via a direct interaction between these two partners. We showed that the induction of PmrA-PmrB system leads to resistance to the polymyxin B (cationic antimicrobial peptide) and sensitivity to deoxycholate (component major bile) and that the modification catalyzed LpxT produces an opposite effect. The robustness of the resistance to the polymyxin B is connected to the force of the signals inducing PmrA-PmrB system, but also the system PhoP-PhoQ and we clearly identified the signals needed to this resistance in E. coli.

Legionella pneumophila est un pathogène intracellulaire, agent de la Légionellose, et dont le réservoir dans l’environnement est constitué d’amibes aquatiques comme Acanthamoeba castellani. Mes objectifs de thèse étaient l’identification de mécanismes moléculaires contrôlant la virulence et la multi-résistance chez L. pneumophila, et en particulier l’exploration du rôle des protéines « GGDEF/EAL ». Les domaines GGDEF et EAL sont retrouvés dans des enzymes permettant respectivement de synthétiser (diguanylate cyclase, DGC) ou dégrader (phosphodiestérase, PDE) le di-GMP cyclique, un second messager spécifique des bactéries, qui participe au contrôle de fonctions clés comme la virulence ou la mobilité. L. pneumophila Lens possède 22 gènes codant des protéines GGDEF/EAL, et dont la plupart sont exprimés lorsqu’elle est dans sa phase virulente. L’activité enzymatique des 22 protéines « GGDEF/EAL » a été analysée in vitro : sur 10 protéines purifiées, 6 sont des DGC, dont 2 présentes une double activité DGC/PDE. L’inactivation de 5 gènes des 22 gènes et la surexpression de 2 autres entrainent une baisse de la virulence vis-à-vis d’A. castellanii. De plus, nous avons montré que l’activité DGC d’au moins 2 de ces protéines est requise lors du cycle infectieux. Enfin, nous avons décrit un système à deux composants original comprenant l’histidine kinase (HK) Lpl0330, capable de s’autophosphoryler sur un nouveau domaine HisKA, retrouvé dans 64 autres HK potentielles, et Lpl0329, le premier régulateur de réponse à double activité enzymatique caractérisé, dont la phosphorylation conduit à moduler le taux de di‐GMPc en favorisant une de ses deux activités (Levet-Paulo et al., 2011). / Legionella pneumophila is an intracellular pathogen found in aquatic environments where it replicates in protozoan hosts. My objectives were to identify molecular mechanisms that control virulence and multidrug resistance in L. pneumophila, and especially to explore the role of proteins “GGDEF/EAL” in virulence. GGDEF and EAL domains are found in enzymes able to synthesize (diguanylate cyclase, DGC) or degrade (phosphodiesterase, PDE) c-di-GMP, respectively. C-di-GMP is a bacterial second messenger which plays a key role in regulating main functions including motility, and virulence. L. pneumophila Lens contains 22 genes encoding GGDEF/EAL proteins and most of them are expressed simultaneously with genes encoding virulence factors. The enzymatic activities of the 22 GGDEF/EAL proteins of L. pneumophila Lens were assayed in vitro. Among the 10 proteins purified, 6 showed a DGC activity and 2 contained both activities. The role of the GGDEF/EAL proteins of L. pneumophila Lens on virulence was investigated. Inactivation of 5 genes and overexpression of 2 other genes led to a significant decrease in virulence. Moreover, DGC activity of at least two of these proteins is required for bacterial virulence. Finally, an original two-component system was identified comprising Lpl0330, a histidine kinase able to autophosphorylate on a new HisKA domain, and Lpl 0329, a protein with dual in vitro DGC/PDE activity. Phosphorylation of Lpl0329 led to a decrease in its DGC activity only, giving the first example of a bifunctional enzyme which modulates synthesis and turnover of c-di-GMP in response to phosphorylation (Levet-Paulo et al., 2011).

Nos travaux ont cherché à mieux comprendre les mécanismes à l’origine de la virulence de Staphylococcus lugdunensis, espèce au pouvoir pathogène proche de celui de Staphylococcus aureus. Nous avons procédé à la première caractérisation fonctionnelle chez cette espèce d’un système à deux composants, LytSR. Ce système s’est révélé impliqué dans le contrôle de processus métaboliques majeurs et dans la virulence. Il est en effet impliqué dans la formation de biofilm, probablement en lien avec le contrôle exercé sur la mort cellulaire. LytSR est de plus impliqué dans la pathogenèse des infections à S. lugdunensis, comme démontré dans le modèle d’infection du nématode Caenorhabditis elegans. Pour mieux caractériser et suivre la diffusion de clones prédominants chez cette espèce, nous avons dans un deuxième volet développé trois nouvelles méthodes de typage (MLVA, TRST et fbl-typing), reposant sur le polymorphisme de séquences répétées en tandem. Ces méthodes se sont révélées très discriminantes, permettant la définition de nouveaux génotypes chez cette espèce clonale. Ces outils sont à ce titre très prometteurs pour des études micro- comme macro-épidémiologiques chez S. lugdunensis, le fbl-typing apparaissant à bien des égards comme l’outil utilisable en première ligne (http://fbl-typing.univ-rouen.fr/). Enfin, nous avons montré que la variabilité de la liaison de S. lugdunensis au fibrinogène in vitro peut être en partie expliquée par des variations génétiques de fbl. / Our work has sought to better understand mechanisms involved in Staphylococcus lugdunensis virulence, a species whose pathogenicity is close to that of Staphylococcus aureus. We performed the first functional characterization of a two-component regulatory system, LytSR, in this species. This system has been shown to be involved in the control of major metabolic processes and in virulence. It is indeed involved in biofilm formation, probably in connection with the control of cell death. LytSR is furthermore implicated in the pathogenesis of S. lugdunensis infections, as demonstrated in the infection model of the nematode Caenorhabditis elegans. To better characterize and monitor the diffusion of predominant clones in this species, we have in a second part developed three new typing methods (MLVA, TRST and fbl-typing), based on the polymorphism of variable number of tandem repeats. These methods were highly discriminant, allowing the definition of new genotypes in this clonal species. These tools are very promising for micro- and macro-epidemiological studies in S. lugdunensis, fbl-typing appearing in many ways as the frontline tool (http://fbl-typing.univ-rouen.fr/). Finally, we have shown that the variability of the binding of S. lugdunensis to fibrinogen in vitro can be partly explained by some fbl genetic variations.

Bacillus subtilis est la bactérie modèle des bactéries Gram-positif à bas pourcentage en GC et possède un intérêt marqué en biotechnologie. Par ailleurs, la phosphorylation des protéines est un mécanisme de régulation essentiel chez les bactéries qui reste encore largement à explorer. B. subtilis possède plusieurs ser/thr kinases potentielles (PrkA, YbdM, YabT et PrkC, qui a été déjà largement caractérisée), mais très peu de substrats de ces kinases ont été mis en évidence. Récemment, des études phosphoprotéomiques ont permis d’identifier de nombreux peptides phosphorylés sur des sérines ou des thréonines chez B. subtilis, incluant: a) deux régulateurs globaux de la phase de transition, DegS et AbrB et b) RecA, qui joue un rôle essentiel dans la réparation des cassures double-brin de l’ADN et la recombinaison. Des tests de phosphorylation in vitro nous ont permis d’identifier les ser/thr kinases capables de phosphoryler DegS, RecA et AbrB. La phosphorylation de DegS sur son résidu sérine 76 par la kinase YbdM influence, in vitro et in vivo, son activité kinase vis à vis de son substrat DegU. L’expression chez B. subtilis d’un allèle codant la protéine DegS-S76D (la sérine étant remplacée par un aspartate phosphomimétique) perturbe l’ensemble des processi cellulaires régulés par le système à deux composants DegS/DegU. Ces résultats suggèrent un lien entre la phosphorylation de DegS sur sa sérine 78 et le niveau de phosphorylation de son substrat DegU, cette modification post-traductionnelle représentant un degré supplémentaire de régulation pour ce système à deux composants. Au cours du démarrage de la sporulation, B. subtilis exprime une ser/thr kinase atypique, YabT, qui localise au septum et est activée grâce à la liaison de séquences ADN non spécifiques. YabT activée phosphoryle RecA sur sa sérine 2, ce qui induit la formation de foci RecA. Dans une souche exprimant une protéine RecA non phosphorylable (RecA-S2A) ou inactivée pour yabT, la formation de spores en présence de lésions de l’ADN est diminuée. Ces résultats suggèrent une homologie fonctionnelle au cours du développement entre la phosphorylation de RecA chez B. subtilis et la phosphorylation de son homologue eukaryote Rad51, qui permet leur recrutement sur des lésions de l’ADN. Nous proposons donc que la phosphorylation de RecA serve de signal pour promouvoir la formation de foci au cours de la sporulation. In vitro, le régulateur transcriptionnel AbrB est phosphorylé par les kinases YabT, YbdM et PrkC, L’utilisation de protéines mutées AbrB-S86A (non phosphorylable) et AbrB-S86D (forme phosphomimétique) nous a permis de montrer que la phosphorylation d’AbrB diminue son affinité pour l’ADN cible. L’expression chez B. subtilis des protéines AbrB-S86A et –S86D perturbe des phénomènes mis en place au cours de la phase stationnaire comme la production d’exoprotéases, la compétence et la sporulation via la dérégulation des gènes et opérons AbrB-dépendants correspondants. Nous proposons donc que la phosphorylation d’AbrB par les Hanks-kinases constitue un mécanisme de contrôle supplémentaire nécessaire à l’inactivation de ce régulateur transcriptionnel, qui peut être activateur ou répresseur, pendant la phase de transition. / Bacillus subtilis is the model organism for low GC Gram-positive bacteria and is of great biotechnological interest. Protein phosphorylation is an important regulatory mechanism in bacteria and it has not been extensively studied yet. Recent site-specific phosphoproteomic studies identified a large number of novel serine/threonine phosphorylation sites in B. subtilis, including a) two transition phase global gene regulators DegS and AbrB and b) RecA, that plays a major role in double-strand break repair and DNA recombination. .B. subtilis disposes of several putative Ser/Thr kinases like PrkA, YbdM, YabT and a characterizd kinase PrkC, but very few physiological substrates for these have been defined so far. In vitro phosphorylation assays were used to identify which of these kinases were able to phosphorylate DegS, RecA and AbrB. DegS phosphorylation on serine 76 by the kinase YbdM influenced its activity towards DegU both in vitro and in vivo, and expression of DegS S76D( on replacing serine to aspartate) in B. subtilis perturbed cellular processes regulated by the DegS/DegU two component system. This suggests a link between DegS phosphorylation at serine 76 and the level of DegU phosphorylation, establishing this post-translational modification as an additional trigger for this two-component system. At the onset of sporulation, B. subtilis expresses an unusual serine/threonine kinase YabT, which exhibits a septal localization and is activated by non-sequence-specific DNA binding. Activated YabT phosphorylates RecA at the residue serine 2, which in turn promotes the formation of RecA foci at the onset of spore development. On the other hand, non-phosphorylatable RecA or inactivated YabT lead to reduced spore formation in the presence of DNA lesions . This suggests a functional similarity between B. subtilis developmental stage dependent RecA phosphorylation and its eukaryal homologous Rad51 phosphorylation, which leads to its recruitment to the lesion sites. We therefore proposed that RecA phosphorylation serves as an additional signal mechanism that promotes focus formation during spore development. AbrB is phosphorylated by YabT, YbdM and PrkC in vitro and AbrB phosphorylation leads to reduced affinity for its target DNA and abolished binding cooperativity in vitro and in vivo. Expression of the phosphomimetic AbrB-S86D or of the non-phosphorylatable AbrB-S86A mutant protein in B. subtilis disturbed some stationary phase phenomena such as exoprotease production, competence and the onset of sporulation, probably by deregulation of AbrB-target genes and operons. We therefore, proposed that AbrB phosphorylation as an additional regulatory mechanism needed to switch off this ambiactive gene regulator during the transition phase.

Les antibiotiques sont des molécules incontournables dans le traitement des infections bactériennes. L’émergence et la dissémination de la résistance aux antibiotiques chez la pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa, ont amené l’Organisation Mondiale de la Santé à déclarer indispensable le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre cette bactérie. Bien que certaines alternatives aient été envisagées, la préservation de l’activité d’antibiotiques majeurs tels que les aminosides et la colistine est primordiale. La caractérisation des mécanismes de résistance à ces médicaments est nécessaire pour la mise au point de nouvelles molécules et mieux prendre en charge les patients. Dans ce contexte, nous montrons que des mutations dans le gène fusA1 (codant le facteur d’élongation EF-G1A) et dans l’opéron pmrAB (système à deux composants PmrAB) entrainent une augmentation de la résistance aux aminosides chez des mutants isolés au laboratoire et des souches issues de patients, atteints ou non, de mucoviscidose. Certaines substitutions d’acide aminé dans EF-G1A accroissent les niveaux de résistance de 2 à 16 fois aux quatre sous-classes d’aminosides. Par ailleurs, des changements d’acide aminé dans le système à deux composants PmrAB activent l’expression des gènes PA4773-PA4774-PA4775, et la production de norspermidine et de spermidine. La synthèse de ces polyamines va de pair avec une baisse de 4 à 16 fois de la sensibilité aux aminosides à noyan 2-désoxystreptamine bisubstitué en 4,6 (gentamicine, amikacine et tobramycine). De plus, il apparaît que la résistance des mutants pmrB à la colistine est en partie dépendante de la pompe d’efflux MexXY(OprM), un système impliqué dans la résistance naturelle, adaptative ou acquise aux aminosides. Enfin, nous montrons que les mutants pmrB surproduisent des alcaloïdes contenant un motif azétidine, par une voie de synthèse non-ribosomale et dépendante du quorum sensing. Ces alcaloïdes diminuent la virulence de P. aeruginosa dans le modèle Galleria mellonella. / Antibiotics are invaluable drugs to combat bacterial infections. Emergence and spread of antibiotic resistance in the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa have led the World Health Organization to consider as a crucial priority the development of new therapeutic approaches to fight this bacterium. In addition to other alternatives, preservation of activity of major antibiotics such as aminoglycosides and colistin is primordial. Consequently, characterization of the resistance mechanisms to these drugs is a prerequisite to design novel molecules, and improve patient care. In this context, we show that mutations in gene fusA1 (encoding elongation factor EF-G1A) and in operon pmrAB (two-component system PmrAB) lead to an increased resistance to aminoglycosides in in vitro-selected mutants and strains isolated from cystic fibrosis (CF) and non-CF patients. Certain amino acid substitutions in EF-G1A confer a 2- to 16-fold increased resistance to the four aminoglycoside subclasses. On the other hand, amino acid variations in two-component system PmrAB activate the expression of genes PA4773-PA4774-PA4775, and production of norspermidine and spermidine. This upregulated polyamine biosynthesis is associated with a 4- to 16-fold decreased susceptibility to 4,6-di-substituted deoxystreptamine aminoglycosides (gentamicin, amikacin and tobramycin). Moreover, our work reveals that the acquired resistance of pmrB mutants to colistin partially depends upon pump MexXY(OprM), a system that otherwise mediates intrinsic, adaptive and acquired resistance to aminoglycosides. Finally, we show that pmrB mutants overproduce azetidine-containing alkaloids by a quorum-sensing-regulated, nonribosomal peptide synthetase pathway. These alkaloids impair the virulence of P. aeruginosa in a Galleria mellonella infection model.