Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La Paratuberculosis o Enfermedad de Johne es una enteritis granulomatosa crónica de los rumiantes, causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, comunmente conocido como Mycobacterium paratuberculosis. Esta enfermedad se caracteriza por poseer un período de incubación de más de dos años, infectándose el animal en los primeros meses de vida, principalmente en el período neonatal. La gran mayoría de los animales infectados la cursan en forma subclínica, lo que dificulta inmensamente su diagnóstico, debido a la baja sensibilidad de los métodos existentes. El objetivo de este trabajo fue comparar y relacionar dos métodos diagnósticos, uno bacteriológico y otro serológico, en animales de predios infectados de la Región Metropolitana, con el fin de aportar con información para la implementación de un adecuado método de control de esta enfermedad en el país. Es así como se recolectó muestras de sangre y de deposiciones de 136 animales sintomáticos y asintomáticos procedentes de 2 rebaños lecheros infectados. Las muestras de suero fueron sometidas a una prueba de ELISA comercial y las muestras de deposiciones fueron cultivadas en medio de cultivo Herrold modificado con yema de huevo con y sin Micobactina J. Las muestras de deposiciones fueron procesadas previamente utilizando como decontaminante fecal el cloruro de hexadecilpiridinium y luego se realizó una incubación con los antibióticos, vancomicina, amphotericina B y ácido nalidíxico según el protocolo descrito por Whitlock y Rosenberger (1990). El 10,29% de las muestras de deposiciones resultaron positivas al cultivo, siendo confirmadas como tal, por su lento crecimiento sólo en el medio con Micobactina J (a partir de la octava semana) y mediante la técnica de tinción de Ziehl Neelsen. El diagnóstico serológico mediante la prueba de ELISA detectó un 83,8% de animales positivos. En este estudio hubo un alto porcentaje de muestras de cultivo contaminadas con hongos (44,85%), lo que resultó en una falta de asociación entre la prueba del cultivo fecal y la prueba de ELISA. El análisis estadístico mostró que no existe asociación entre las técnicas empleadas (P < 0,0001; kappa = 0,029). La alta tasa de contaminación de los cultivos se debió principalmente a que en algunas muestras se utilizó tubos, que en vez de tapa rosca, poseían un tapón de algodón cardé y que estaban además sellados con cinta “Parafilm”. El 90% de las muestras contaminadas correspondió a este tipo de tubos. Además un grado alto de contaminación siempre es esperable, debido a que se trabaja con material fecal. Para mejorar la técnica, se sugiere probar el método propuesto por Stabel (1997), quien propone el uso de antibióticos (vancomicina y ácido nalidíxico) en el medio de cultivo

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La Brucelosis bovina es una enfermedad que ha llevado a los distintos países a establecer estrategias de control y prevención de la enfermedad. En Chile las estrategias establecidas por el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) son vigilancia, saneamiento y prevención en el ganado bovino. Esta última medida consiste en la vacunación con B. abortus cepa RB51. La ventaja de esta cepa es que no produce interferencia diagnóstica con pruebas que utilizan el lipopolisacárido liso (s-LPS) como antígeno. El presente estudio caracterizó la respuesta inmune humoral y celular generada en el ganado bovino vacunado con esta cepa. Para esto se contó con un grupo de 25 terneras las cuales fueron vacunadas con 1- 3 x 1010 UFC de B. abortus RB51, entre la edad de 4 y 8 meses. Estas fueron mantenidas y manejadas en su rebaño durante el período de estudio en el cual se realizaron cuatro muestreos los días 0, 30, 180 y 360 post vacunación, recolectando dos muestras de sangre de cada animal una con y otra sin anticoagulante (heparina de sodio). Las muestras obtenidas fueron procesadas en cinco pruebas diagnósticas distintas y éstas son: rosa de bengala, ELISA indirecto, ELISA competencia las cuales detectan la respuesta inmune humoral al s-LPS de Brucella. También se usaron la prueba de ELISA citosol de RB51 que detecta la respuesta inmune humoral frente a proteínas del citosol de RB51 y finalmente la prueba de IFN bovino, que detecta la respuesta inmune celular frente a RB51. Los resultados obtenidos, demostraron que la cepa RB51 no induce anticuerpos contra el s-LPS de Brucella tal como era esperado, pero sí induce anticuerpos frente a proteínas citosólicas de cepa RB51. Durante el período de estudio, sólo una vaquilla arrojó resultados positivos a estas pruebas y esto se debió probablemente al resultado de una infección natural como consecuencia de la presencia de brucelosis en el rebaño. Los resultados obtenidos frente a la prueba de IFN bovino demostraron que cepa RB51 induce respuesta inmune celular, detectable mediante la presencia de esta citoquina que fue liberada al plasma bovino por los linfocitos estimulados con el citosol de RB51. La evolución del porcentaje de animales negativos a las pruebas que usan s-LPS como antígeno fue estable ya que, exceptuando la vaquilla positiva antes mencionada, todos los animales permanecieron negativos a los cuatro muestreos. La prueba de ELISA citosol de RB51muestra un evidente aumento en el porcentaje de animales positivos entre el primer y segundo muestreo, para luego permanecer constante en los muestreos siguientes, esto debido a los anticuerpos generados como respuesta post vacunatoria a las proteínas de RB51, que decaen con el tiempo. Finalmente la prueba de IFN bovino muestra un aumento del porcentaje de animales positivos entre el primero y segundo muestreo y luego decrece en forma constante, hasta el último muestreo / Financiamiento: IFS B/1800-2

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Se utilizaron 59 biopsias de mastocitoma cutáneo (MCT), provenientes de caninos entre 2 a 15 años de edad, sin distinción de sexo ni raza, procedentes de casos de archivo del Laboratorio de Anatomía Patológica de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile, en el período comprendido entre los años 2004-2005. De cada biopsia se obtuvieron muestras de 4 µm de grosor para efectuar las técnicas histológicas en microscopía óptica. Las características histopatológicas de las muestras de MCT y su grado de diferenciación se determinaron con la ayuda de 2 tinciones: i) hematoxilina - eosina (H/E) y ii) azul de toluidina (A/T) (metacromasia). Con esta última, además, fue posible determinar el área citoplasmática promedio, con gránulos de reacción metacromática para cada grado de diferenciación neoplásica. Se analizó la actividad proliferativa y apoptótica en los 3 grados del MCT mediante la detección inmunohistoquímica del antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) y a través del método TUNEL respectivamente. De acuerdo a las características histopatológicas observadas en las muestras teñidas con H/E se mantuvo la clasificación original, ya que concordaron con los criterios de la clasificación descrita por Patnaik et al. (1984). La técnica de metacromasia permitió reconocer los gránulos metacromáticos característicos de los mastocitos diferenciados y confirmar el diagnóstico inicial en las biopsias GI, GIII y 21 tumores GII. Los restantes MCT GII (23) fueron reclasificados hacia el GI y GIII. En la medición de área metacromática los resultados obtenidos mostraron un valor promedio que disminuía hacia el MCT GIII con diferencias estadísticamente significativas presentes sólo entre el GIII y los otros grados (p ≤ 0,05). Los resultados obtenidos con PCNA mostraron un área promedio inmunomarcada que aumentaba hacia el MCT GIII. Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas entre los grados (p > 0,05). Mediante el método TUNEL, los resultados revelaron que el promedio de área inmunomarcada fue menor en MCT GI y aumentó hacia el GII y GIII. Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas entre los grados (p > 0,05). Los hallazgos evidencian una concordancia entre el grado de malignidad tumoral y el incremento de la población de células neoplásicas en proliferación que supera a las células apoptóticas, así como también, demuestran el menor grado de diferenciación celular a través de la pérdida de gránulos metacromáticos de los mastocitos en el MCT GIII, corroborando el hecho de que en esta neoplasia, están alteradas ambas vías, la proliferativa y la apoptótica

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En Chile, el virus herpes canino (CaHV-1) se ha detectado mediante técnicas clásicas de virología como aislamiento en cultivos celulares y posterior citólisis de las células afectadas, mediante inmunofluorescencia, por la presencia de cuerpos de inclusión o mediante estudios de cinética viral, lo cual ha permitido completar el análisis biológico de un aislado nacional denominado RP5. En contraste, en el presente trabajo se realizó la detección molecular del gen UL37 de CaHV-1, gen que codifica para la proteína UL37, presente en el tegumento del virus y que participa del ciclo replicativo viral. Para tal efecto, se utilizaron 6 inóculos virales obtenidos de sobrenadantes de cultivos celulares de la línea MDCK infectados con RP5. Para el PCR se utilizaron los partidores CHV-1: 5’-AAGAGCTCGTGTTAGTGAAAAT 3´ y CHV-2: 5’-TAAACCCGCTGGA TGATAC- 3’ (Erles et al., 2004). La visualización del amplicón se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 %. La electroforesis se llevó a cabo a 90 volts por 90 minutos. Como marcador de tamaño molecular se utilizó un estándar que contiene fragmentos de ADN entre 100 y 1000 pb. Luego de la electroforesis, el gel se incubó en bromuro de etidio (0,5 μg/ml), posteriormente lavado, colocado en un transiluminador de luz ultravioleta y finalmente fotografiado. Todos los sobrenadantes de cultivos celulares utilizados resultaron positivos al PCR descrito, observándose una banda de alrededor de 500 pb, lo cual concuerda con lo descrito en la literatura al utilizar esta metodología. Para tener una aproximación de la sensibilidad de la técnica empleada, se realizaron diluciones al décimo (10-1-10-8) del inóculo viral RP5 (DICT50 = 1,58 x 106/mL) y se determinó la dilución a la cual el PCR descrito no detectó el gen de la proteína UL37. Así, siete de las ocho diluciones resultaron positivas al PCR, observándose una banda de alrededor de 500 pb. Lo anterior indica que este método permitiría detectar hasta 0,00079 DICT50, lo que comparado con las 100DICT50 que se requieren para lograr la infección en células, sugiere una alta sensibilidad asociada al PCR. El producto amplificado fue purificado, secuenciado y se determinó el porcentaje de identidad nucleotidica respecto a un fragmento del gen de la UL37 de virus herpes canino (GenBank accession number AY582738). Así, se determinó que entre la secuencia del GenBank y la secuencia de consenso del amplificado nacional existe un 94% de identidad nucleotídica. Adicionalmente, se comparó la secuencia obtenida con las de otras seis secuencias del gen UL37 presentes en cepas de herpes virus existentes en el Genbank y no se estableció un porcentaje de identidad mayor al obtenido respecto de las secuencias comparadas, lo cual sugiere que la secuencia obtenida en esta memoria de título pertenece al CaHV1. Así, podemos concluir que esta metodología permite la detección de un amplicón de ADN con características compatibles con las descritas para el gen de la proteína UL37 del CaHV-1 mediante una herramienta molecular que cumple con las características del diagnóstico actual: rápido, sensible, específico y de bajo costo. Lo anterior, sin duda, permitirá contribuir para resolver un problema existente en los planteles reproductores caninos, al tener la posibilidad de ofrecer la detección del CaHV1 en pequeños animales como mascotas de compañía, un área de sostenido crecimiento

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El virus herpes felino es uno de los principales agentes etiológicos involucrados en el Complejo Viral Felino. Posee distribución mundial y afecta a gatos domésticos provocando lesiones tanto oculares como del tracto respiratorio superior. Su casuística en Chile es común, pese a ello su diagnóstico es sólo clínico, a diferencia de otros países donde se utilizan diversas técnicas para ello, siendo la reacción en cadena a la polimerasa (PCR) la más recomendada y con mejores resultados. El objetivo de este estudio fue implementar un método diagnóstico molecular en Chile, para ello se seleccionaron gatos menores de un año con signología clínica sugerente de la infección con herpes felino, para la detección del gen de la proteína Timidin Kinasa del virus, altamente específico y conservado, mediante la técnica de PCR anidado y posterior determinación del porcentaje de identidad nucleotídica del amplificado obtenido respecto de la base de datos genómica GenBank®. Como resultado se obtuvo una tasa de detección del 100% de las muestras y el control positivo, y una identidad nucleotídica de un 92 % comparado con la base de datos genómica del GenBank® (número de acceso E12463.1), probando que los amplificados corresponden al virus herpes felino. De esta forma se logra implementar un método diagnóstico efectivo para ser utilizado en complementación al diagnóstico clínico

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / En la actualidad los avances científicos y tecnológicos permiten realizar pruebas diagnósticas cada vez más sensibles y sencillas. Sin embargo el aislamiento viral sigue siendo la prueba más importante y utilizada cuando se inicia un estudio en virología. Para ello es necesario contar en el laboratorio con células que permitan la penetración y posterior multiplicación de las partículas virales. Si bien existe una amplia variedad de líneas celulares, es fundamental conocer cuáles son las líneas celulares específicas para un determinado virus que permitan llevar a cabo los objetivos antes mencionados. En el caso del Virus Herpes Canino tipo 1, denominado actualmente como CaHV1 (Davison et al., 2009), se ha descrito sólo una línea susceptible, por lo que conocer la existencia de otras líneas útiles para su investigación es de gran relevancia, permitiendo un manejo más robusto en el estudio de este virus. El objetivo de este trabajo fue probar la factibilidad de emplear otras líneas celulares que permitieran trabajar en el laboratorio con el CaHV1. Se trabajó con 6 líneas celulares de uso habitual en el laboratorio de cultivos celulares del Instituto de Salud Pública (ISP): MDCK, Hep-2, L20b, MNA, Vero, RD, las cuales fueron sometidas a subcultivos y a un inóculo de origen nacional del CaHV1, buscando efecto citopático de lisis celular. Se observó efecto citopático de lisis celular característico del CaHV1 en la línea de origen canino MDCK, situación confirmatoria de los resultados obtenidos en investigaciones anteriores. Los cambios en las líneas celulares: Hep-2, RD, Vero, MNA observados durante el periodo post-infección, no pudieron ser cualitativamente identificados como característicos de efecto citopático de lisis celular provocada por CaHV1, de tal modo que los resultados experimentales demostrarían que la línea celular MDCK, por el momento, es la única viable para el diagnóstico del CaHV1 en el laboratorio

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / El objetivo de este proyecto fue comparar cuatro métodos de estimación del volumen vesical mediante ultrasonografía en perros, para definir el más exacto. Se evaluaron 21 individuos, en los cuales se utilizaron dos volúmenes de infusión conocidos de suero fisiológico, 3 y 6 ml/Kg. de peso vivo. Ecográficamente se obtuvieron imágenes longitudinales y transversales de cada volumen para cada animal. Luego se analizaron las imágenes para obtener los datos necesarios para los cuatro métodos en estudio (largo, ancho, profundidad longitudinal y profundidad transversal). A continuación se realizó un análisis estadístico con el fin de determinar la exactitud de dichos métodos. Pero al analizar los datos se vio que existía gran variabilidad en el peso de los pacientes, y por ende, en los volúmenes, entonces se compararon los resultados luego de una corrección por peso. Obtenidos los resultados, se llegó a la conclusión de que el método F4 de Eves (1987) fue el único concordante, el más exacto y sin diferencias estadísticamente significativas respecto de los volúmenes reales; incluso después de la corrección por peso. Por ende, podría ser utilizado en la práctica clínica para estimar el volumen vesical en los perros

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Los felinos domésticos son susceptibles a afecciones de variada etiología y la principal enfermedad respiratoria que los afecta es el denominado Complejo Respiratorio Felino (CRF), de etiología multifactorial y de distribución mundial, produce lesiones que sólo se tratan de forma sintomática y que, además, pueden dejar secuelas inhabilitantes para el animal. Entre los agentes virales asociados al CRF se encuentra el Virus Herpes Felino (VHF-1), un patógeno común en la clínica de animales de compañía y que al no existir un tratamiento definitivo y certero para esta enfermedad, hace necesario contar con un diagnóstico eficaz que permita detectarlo precozmente y así evitar su propagación. En consideración a lo anterior, esta Memoria de Titulo corresponde a un tercer estudio en paralelo a fin de establecer un protocolo para el diagnóstico molecular de VHF-1, mediante la detección del gen de la proteína UL37 utilizando la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) convencional. Con el antecedente de que el gen del virus herpes canino tiene una similitud de un 90% con el gen del virus herpes felino, esta técnica podría detectar ambos virus. Sin embargo, pese a tener alta similitud genómica los resultados de la prueba mediante esta técnica fueron negativos, estableciéndose la alta especificidad que tiene el virus con cada especie hospedadora

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Se analizaron muestras serológicas de 69 equinos de tiro urbano, provenientes de cinco comunas de la Región Metropolitana de Chile, con el objetivo de determinar la frecuencia de reacciones positivas a Leptospira interrogans y Leptospira borgpetersenii, determinar las comunas que presentan mayor frecuencia y determinar los serovares más frecuentes. Las muestras fueron sometidas a la prueba de microaglutinación en placa (microMAT) con una dilución inicial de 1:100 frente a cuatro serovares de la especie Leptospira interrogans y dos serovares de la especie Leptospira borgpetersenii. La vivienda de cada ejemplar fue georreferenciada según reacción positiva o negativa. La frecuencia de sueros que presentaron reacción positiva para todos los equinos testeados fue 33,33%. Se obtuvo una mayor frecuencia en la comuna de Huechuraba (100%), seguida de La Pintana (40%), San Bernardo (31,82%) y Quilicura (17,65%). La comuna de Recoleta no presentó equinos positivos. Los serovares detectados con mayor frecuencia fueron ballum (38,46%) y canicola (26,92%), seguidos de icterohaemorrhagiae (11,54%), autumnalis (11,54%) y pomona (7,69%). La menor frecuencia de presentación fue para hardjo (3,85%). Se obtuvieron títulos de 1:100 hasta 1:1600. Ningún ejemplar presentaba signos clínicos al momento de la toma de muestra. Estos resultados confirman que los equinos de tiro urbano analizados en este estudio están expuestos a la infección por Leptospira interrogans y Leptospira borgpetersenii. Caninos y roedores podrían constituir importantes fuentes de transmisión. Las reacciones positivas a la microMAT demuestran contacto con el agente patógeno y no respuestas cruzadas frente a la vacuna. / U-Inicia 121017019102049

Toxoplasma gondii es un parásito zoonótico de amplia distribución geográfica, y es causante de cuadros clínicos severos en humanos. Es importante conocer la patología cerebral en la toxoplasmosis, en particular la inflamación producida debido a las graves secuelas observadas en personas inmunosuprimidas y a los potenciales efectos neurológicos en personas con infección aguda o crónica. El objetivo del presente trabajo fue evaluar las diferencias de los procesos inflamatorios de la toxoplasmosis aguda, crónica y reactivada utilizando un modelo murino con toxoplasmosis cerebral. Se infectaron ratones Swiss-Webster con la cepa Me49 de T. gondii por vía oral, por un tiempo de 18 días (fase aguda), 120 días (fase crónica) y 165 días con un tratamiento inmunosupresor utilizando ciclofosfamida para inducir la reactivación de la infección. Para evaluar la eficacia del esquema de inmunosupresión, se evaluó su efecto en la competencia inmunológica, donde se evidenció una disminución significativa del número total de leucocitos (p=0.043) y un descenso en la producción de anticuerpos anti-T. gondii en los ratones inmunosuprimidos. Por otro lado, el análisis histológico reveló que tanto los ratones en fase aguda como los de fase crónica presentaron una mayor frecuencia de lesiones inflamatorias y un mayor ratio de microglia activada, a diferencia de los ratones inmunosuprimidos que mostraron resultados opuestos. Los resultados sugieren que la carga parasitaria varía de acuerdo al tiempo de infección y estado inmune del hospedero, siendo este último un factor importante para el desarrollo de una fuerte respuesta inflamatoria con una alta participación microglial. / Tesis