El presente estudio tuvo por objetivo inmunolocalizar la distribución de las células enteroendocrinas L, productoras del péptido similar al glucagón (GLP-1), en el intestino de alpacas. Una incretina de gran importancia debido a su función reguladora de la glucemia. Se utilizaron 36 crías de alpaca de 0-45 días de edad y adultos, distribuidos en 7 grupos etáreos. 0 días= <24h, 1-7 días, 8-15 días, 16-21 días, 27-34 días, 35-45 días y adultos. Las muestras intestinales fueron procesadas por inmunohistoquímica usando el anticuerpo monoclonal antiGLP-1. Las células positivas fueron contadas en 15 ejes cripta-vellosidad de cada porción intestinal en cada animal. Los resultados evidencian, respecto de los grupos etáreos, que en el dia 0, el yeyuno es la porción que contiene mayor número de células L (productoras de GLP-1); mientras que, en los otros grupos son yeyuno e íleon. Respecto a la ubicación, se determina en duodeno un aumento significativo (p<0.05) de células L desde los 8 días en adelante; en yeyuno el mayor número de células se encuentra a los 0 días; en íleon el mayor número celular se encuentra desde los 8 a 45 días; y en el colon el mayor número lo encontramos en los adultos. Se concluye que las células L en alpacas se encuentran presentes desde el nacimiento mayoritariamente en yeyuno e íleon.

Introducción. La distrofia miotónica tipo 1 (DM1) es un desorden sistémico autosómico dominante ocasionado por la expansión anormal del triplete CTG en la región 3’ UTR del gen DMPK (19q13.3). El diagnóstico definitivo de la DM1 se realiza mediante métodos moleculares, siendo el southern blot el estándar de oro. En el Perú, hasta el momento, ninguna institución pública o privada realiza el diagnóstico molecular de DM1. Objetivo. Implementar una metodología basada en la combinación de las técnicas de PCR y TP-PCR para el diagnóstico molecular de la distrofia miotónica tipo 1 en el Centro de Investigación Básica en Neurogenética (CIBN) en el Instituto Nacional de Ciencias Neurológicas (INCN). Métodos. Utilizando 6 muestras de ADN con genotipo conocido se estandarizó el protocolo de PCR convencional para genotificación de alelos normales así como el protocolo TP-PCR para la detección del alelo expandido del gen DMPK. Con el protocolo optimizado, se genotipificaron 72 muestras de ADN de individuos con diagnóstico clínico de DM1 atendidos en el CIBN del INCN. Resultados. Este estudio implementó una metodología basada en la combinación de las técnicas de PCR y TP-PCR para el diagnóstico molecular de la distrofia miotónica tipo 1, así como la genotipificación de la región polimórfica del microsatélite CTG del gen DMPK en pacientes con diagnóstico clínico de DM1 del CIBN-INCN. Se confirmó el diagnóstico de DM1 en 66 casos (91.6%). Cuarenta y cuatro casos (66.7%) eran originarios de Lima. La edad de inicio de los síntomas fue de 25.8±13.4 años. Conclusión: La estandarización del protocolo combinado de PCR y TP-PCR permitió la genotipificación del gen DMPK. Se confirmó el diagnóstico de DM1 en 66 de 72 pacientes estudiados.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los virus siempre necesitarán de la maquinaria metabólica de la célula infectada para replicar su material genético, produciendo numerosas copias del virus original. En dicho proceso, algunos virus poseen la capacidad de producir un efecto citopático denominado lisis celular. Dentro de los virus que producen este efecto se encuentran los virus Herpes, descritos en insectos, reptiles, anfibios y moluscos; como también en casi todas las especies de aves y mamíferos que se han investigado. Uno de los virus de interés veterinario es el Herpes Canino Tipo 1 (CaHV1), debido a que su persistencia en un criadero canino provoca pérdidas económicas considerables, que incluso pueden significar el cierre de este tipo de empresas. El CaHV1 provoca una alta cantidad de cuadros clínicos, en especial en cachorros menores de cuatro semanas, en donde se ha descrito una mortalidad cercana al 90% de la camada. Si bien en Chile su detección y caracterización biológica fue descrita hace algunos años, obteniéndose un aislado nativo denominado RP5, lamentablemente aún no existe un método diagnóstico rápido. Bajo este contexto, el objetivo de este estudio fue la detección simultánea de dos fragmentos del gen de la glicoproteína B del CaHV1 en un mismo PCR (variante múltiplex) a partir del aislado RP5. Así, al determinar las temperaturas y tiempos óptimos para las etapas de alineamiento y elongación, se pudo implementar una herramienta de diagnóstico molecular que podría ser utilizada y comparada con otros protocolos de PCR, que actualmente se están desarrollando en otras memorias de Título en la Unidad de Virología de nuestra Facultad

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La diferencia fundamental entre un virus y los microorganismos reside en la forma de generar progenie, pues los virus no siguen la estrategia de formar nuevas partículas mediante fisión binaria. Su proceso de replicación es particular, pues considera la unión a la célula blanco, la exposición del genoma viral, la replicación del genoma, la producción de proteínas virales, el ensamble de la partícula viral y la salida al exterior de la célula. En esta última etapa, algunos virus destruyen la membrana celular produciendo un daño irreparable que lleva a la muerte celular, fenómeno denominado citolisis y que puede ser observado a través del microscopio óptico, lo cual permite un acercamiento al diagnóstico de su presencia. El virus herpes es uno de los que presentan esta capacidad citolítica y ha sido descrito en insectos, reptiles, anfibios y moluscos; también en prácticamente todas las especies de aves y mamíferos que se han investigado. Dentro de la medicina veterinaria se han descrito varios virus herpes de importancia, dentro de los cuales se encuentra el Virus Herpes Canino tipo 1 (CaHV1), debido principalmente al cuadro que ocasiona al infectar cachorros, pudiendo provocar la pérdida de camadas completas y en reproductores, ya que quedan como portadores de por vida. Lo anterior, se traduce finalmente en cuantiosas pérdidas económicas para los planteles, sobretodo si se trata de animales de alto valor genético. Debido a esto, es indispensable poder realizar un diagnóstico temprano. En este estudio, se aportó tanto a la caracterización genómica de un aislado nacional del virus CaHV1 -denominado RP5, detectado y caracterizado biológicamente en el año 2005- como también a la medicina veterinaria de pequeños animales con un método diagnóstico específico, sensible y de rápido resultado. Para ésto, se realizó la detección del gen de la glicoproteína C del CaHV1 mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) utilizando un par de partidores diseñados in silico. Con la utilización de un termociclador de gradiente de temperaturas se estableció la temperatura de alineamiento (55ºC) mediante la observación nítida e inequívoca de un fragmento de DNA de aproximadamente 200 pb. Estos fragmentos fueron secuenciados y se estableció un porcentaje de identidad nucleotídica de 95% respecto del dato oficial del GenBank. Este alto valor de identidad indica que el fragmento amplificado corresponde al fragmento del gen gC y constituye una evidencia mas que confirma que el aislado nacional utilizado como fuente viral, corresponde a CaHV1

O diabetes melito tipo 1 é uma doença crônica e progressiva, com elevado risco de morbidade e mortalidade relacionadas a complicações agudas e crônicas, as quais podem ser reduzidas através de controle glicêmico adequado. Novas tecnologias para otimizar o manejo do diabetes vêm sendo estudadas, mas podem adicionar ainda mais demandas a um cuidado já repleto de exigências específicas. A adolescência parece ser um período essencialmente crítico, onde alterações fisiológicas somam-se à má adesão e a questões psicossociais. Ampla compreensão, por parte da equipe de saúde responsável pelo cuidado destes pacientes, é fundamental para um bom controle da doença. Considerando os potenciais benefícios de tecnologias no manejo do diabetes, estudo transversal avaliou características de 120 crianças e adolescentes interessados no uso de monitores contínuos de glicemia (continuous glucose monitoring, CGM), em comparação a amostra geral de 238 crianças e adolescentes com diabetes tipo 1. O grupo motivado a iniciar CGM apresentou melhor adesão ao tratamento, melhor controle glicêmico, mais frequente verificação da glicemia capilar, menor conflito familiar e maior qualidade de vida. A baixa aceitação do uso de CGM neste estudo (28%) sugere que demandas adicionais podem ser um fator limitante para o uso de tecnologias em diabetes. Para avaliar as principais dificuldades encontradas por profissionais de saúde cuidando de adolescentes com diabetes tipo 1, questionário eletrônico foi enviado a 418 endocrinologistas de todas as regiões dos Estados Unidos da América. A maioria dos respondedores (58%) relatou não ter acesso a profissionais capacitados para o manejo de transtornos de saúde mental. Mesmo após controlar para experiência profissional e atuação em centros não acadêmicos, estes profissionais mais frequentemente relataram, em seus pacientes, barreiras como depressão, abuso de substâncias e distúrbios alimentares. Estes achados reforçam a necessidade de capacitação das equipes de saúde para um melhor cuidado de pacientes com diabetes tipo 1. A identificação de barreiras clínicas e psicossociais potencialmente modificáveis e preditoras de deterioração glicêmica fornece oportunidades para otimização dos cuidados de saúde voltados a crianças e adolescentes com diabetes tipo 1.

O transplante de ilhotas, como tratamento do diabetes mellitus tipo 1 (DM1) “lábil”, tem progredido consideravelmente ao longo dos últimos 12 anos. Nesse período, aproximadamente 750 pacientes foram transplantados em diversos centros, com resultados promissores. No entanto, é evidenciada uma grande disparidade entre os centros de transplantes em relação ao sucesso do isolamento e aos desfechos póstransplante. Alguns fatores podem explicar estas disparidades, como características do doador, qualidade do isolamento e o local da infusão das ilhotas. O isolamento das ilhotas é a fase mais complexa de todo o processo, devendo ser totalmente padronizada. O isolamento é feito com uma enzima de digestão, com auxílio físico e mecânico. A enzima Liberase HI era a enzima de escolha para a digestão do pâncreas, pois proporcionava uma boa quantidade e qualidade de ilhotas. No entanto, esta foi retirada do mercado em 2007, pois havia o risco de transmissão de encefalopatia espongiforme. Novas enzimas têm sido utilizadas e estão sendo testadas para a digestão do pâncreas; entretanto, não existe um consenso de qual enzima de digestão é mais eficiente no isolamento de ilhotas humanas.Devido à implantação do Laboratório de Biologia das Ilhotas Pancreáticas Humanas no Hospital de Clínicas de Porto Alegre e a necessidade da definição da enzima mais eficiente a ser utilizada no isolamento das ilhotas, consideramos adequada a realização de uma meta-análise sobre o tema. Esta metaanálise será útil para a tomada de decisão de outros Centros de isolamento e transplante de ilhotas pancreáticas. Para realizar a meta-análise foi feita a busca dos artigos nos sites Embase, Cochrane e PubMed. Dos 755 artigos encontrados, 16 artigos preencheram os critérios de elegibilidade e foram incluídos na meta-análise do tipo comparação de tratamentos múltiplos (MTC). Nossos resultados revelaram que as enzimas Vitacyte e Liberase MTF foram associadas a um pequeno aumento no rendimento das ilhotas [equivalentes de ilhotas (IEQ) /g pâncreas] quando comparadas com a Sevac [diferença média padronizada (95% intervalo de credibilidade) = -2.11 (- 4.09 a -0.29) e -2.20 (-4.26 a -0.31), respectivamente]. Contudo, as demais comparações de enzimas não mostraram nenhuma diferença significativa em relação ao rendimento de ilhotas. Além disso, nos desfechos pureza e viabilidade não foi verificado diferenças significativas entre nenhuma das enzimas de digestão analisadas. Assim, a nossa metaanálise MTC sugere que as enzimas de digestão disponíveis para o isolamento de ilhotas possuem eficiência semelhante em relação a rendimento de ilhotas, pureza e viabilidade. / Islet transplantation, as a treatment for brittle type 1 diabetes mellitus (DM1), has progressed considerably over the last 12 years. In this period, approximately 750 patients were transplanted in different centers, with promising results. However, a large disparity is observed among transplantation centers regarding the success of isolation and post-transplant outcomes. Some factors may explain these disparities, such as donor‘s characteristics, quality of the isolation and local of islet infusion. Islet isolation is the most complex phase of all process, and must be completely standardized. Isolation is performed using a digestion enzyme, with physical and mechanical aid. The Liberase HI enzyme was the enzyme of choice for pancreas digestion because it provided a good quantity and quality of islets. Nevertheless, this enzyme was withdrawn from the market in 2007 because there was a risk of transmission of bovine spongiform encephalopathy. New enzymes have been used and tested for pancreas digestion; however, there is no consensus about which is the digestion enzyme more efficient in human islet isolation. Due to the implementation of the Laboratory of Biology of Human Pancreatic Islets at Hospital de Clínicas de Porto Alegre and to the necessity to define the most efficient enzyme for being used in islet isolation, we consider appropriate to conduct a meta-analysis on the issue. This meta-analysis will be helpful for decision-making in other Centers of pancreatic islet transplantation. To carry out the meta-analysis we performed a comprehensive search for all entries in Pubmed, Embase and Cochrane libraries. Of 755 articles retrieved, 16 articles fulfilled the eligibility criteria and were included in a mixed-treatment comparison (MTC) meta-analysis. Our results revealed that Vitacyte and Liberase MTF were associated with a small increase in islet yield (islet equivalent number/g pancreas) when compared with Sevac enzyme [standardized mean difference (95% credible interval) = -2.11 (-4.09 to -0.29) and -2.20 (-4.26 to -0.31), respectively]. However, all other enzyme comparisons did not show any significant difference regarding islet yield. Moreover, percentages of purity and viability were not significantly different among any of the analyzed digestion enzymes. Thus, our MTC meta-analysis suggests that the digestion enzymes currently being used for islet isolation works with similar efficiency regarding islet yield, purity and viability.

A nefropatia diabética (ND) acomete cerca de 10 a 40% dos pacientes com diabete melito tipo 2 (DM2), e estes pacientes constituem a maioria dos casos de insuficiência renal crônica terminal por diabete melito. O aumento da excreção urinária de albumina (EUA) - microalbuminúria - é um importante marcador de risco cardiovascular e da lesão renal. O tratamento da microalbuminúria baseia-se na obtenção do melhor controle metabólico e pressórico possível e no uso de agentes inibidores da enzima conversora de angiotensina. O tratamento da dislipidemia ainda é contraditório. Entre as alternativas terapêuticas, a dieta hipoprotéica tem mostrado, embora com alguma controvérsia, resultados benéficos sobre a progressão da ND, porém a adesão é limitada e a sua segurança a longo prazo ainda não está definida. Em recente estudo em nosso meio foi demonstrado o efeito benéfico de uma dieta à base de carne de galinha sobre o perfil lipídico e EUA em pacientes DM2 microalbuminúricos. O presente estudo teve por objetivo analisar o papel dos componentes das dietas com diferentes fontes protéicas na redução do colesterol sérico em pacientes com DM2 com e sem ND. Foram estudados 30 pacientes (7 mulheres; idade de 57,9 ± 9,8 anos), sendo 14 normoalbuminúricos, com EUA < 20μ/min e 16 com ND, isto é, 10 microalbuminúricos (EUA 20 a 200μg/min) e 6 macroalbuminúricos (EUA > 200μg/min). O delineamento do estudo foi do tipo randomizado, cruzado, controlado, durante o qual os pacientes foram submetidos a três dietas, por um período de 4 semanas cada uma, com um igual período de "washout" entre as dietas. As dietas foram: dieta usual (OU) onde a carne vermelha era predominante; dieta de galinha (DG), onde só esta carne era permitida e dieta hipoprotéica (DH) onde as fontes de proteína eram leite e derivados e vegetais. As dietas prescritas foram isoenergéticas, com cerca de 30% de lipídeos sobre o valor energético total (VET). A DU e DG continham cerca de 1,20 a 1,50 g de proteína/kg de peso/dia e a OH continha de 0,50 a 0,80 g de proteína/kg de peso/dia. A adesão às dietas foi medida a cada 2 semanas, através de história alimentar que incluiu pesagens dos alimentos e entrevistas, e que foi validada pela medida da perda nitrogenada de 24 h. Para cálculo dos nutrientes que compõem as dietas foi utilizado o Programa Nutribase'98 Clinical Nutritional Manager (Cybersoft, Inc. Phoenix, AZ USA), cujo banco de dados é baseado na tabela americana de alimentos, com adaptação para alimentos do nosso meio. Ao final de cada dieta, foram avaliados: colesterol total ( col-total) e triglicerídeos (método enzimático); LOL (fórmula de Friedewald); HOL total e frações 2 e 3 (dupla precipitação com cloreto de manganês, heparina e sulfato de dextran); colesterol não-HDL (col não-HOL) (col-total- colesteroi-HDL) e apolipoproteína 8 (Apo 8) (imunoturbidimetria). Nos pacientes com ND, os níveis de col-total e col não-HDL foram mais baixos após OG (181 ± 41; 136 ± 42 mg/dl) e após OH (181 ± 31; 140 ± 34 mg/dl) em relação à OU (210 ± 37; 159 ± 34 mg/dl, P=O,OOS; P=O, 02). A ingestão de lipídeos totais, ácidos graxos saturados (AGS) e monoinsaturados foi significativamente menor na OG (0,86 ± 0,30; 0,23 ± O, 1 O; 0,27 ±O, 10 g/kg) e OH (0,82 ± 0,29; 0,21 ±O, 10; 0,26 ±O, 10 g/kg) em relação à OU (0,97 ± 0,93; 0,28 ±O, 10; 0,32 ±O, 11; P=O,OOS; P=0,003; P=0,0046), porém a quantidade de colesterol ingerida só foi significativamente menor na DH (0,64 ± 0,44 g/kg; P<0,0001) em relação à OU (3,21 ± 1,12 g/kg) e DG (3,04 ± 1,02 g/kg). A razão P/S foi significativamente maior nas DG (1 ,49 ± 0,56) e OH (1,68 ± 0,82) em relação à OU (1,14 ± 0,48; P=0,002). Foi observada uma correlação significativa entre a ingestão protéica (g/kg) proveniente da carne vermelha na DU e os níveis séricos de col-total (rs=0,583; P<0,05), colesterol-LDL (r5=0,65; P<0,05), col não-HDL (rs=0,517; P<0,05) e Apo 8 (r5=0,58 P<0,05) somente nos pacientes com ND, porém a mesma não ocorreu nos pacientes normoalbuminúricos. Conclui-se que tanto uma dieta normoprotéica à base de carne de galinha quanto uma DH lactovegetariana têm o mesmo impacto na redução dos níveis séricos de col-total e col não-HDL dos pacientes com DM2 com micro e macroalbuminúria e esse efeito provavelmente é devido à redução da ingestão de AGS da dieta com conseqüente aumento da relação ácidos graxos poliinsaturados/saturados. A dieta de galinha, portanto, pode ser uma alternativa terapêutica com efeitos benéficos sobre os lipídeos séricos, na progressão da nefropatia diabética e da aterosclerose nestes pacientes. / Approximately 10-40% of type 2 diabetes mellitus (DM2) patients develop diabetic nephropathy (DN), and these patients constitute the majority of the cases of end-stage renal disease. The raise in urinary albumin excretion rate (UAER) - microalbuminuria - is an important marker of cardiovascular and renal disease. Treatment is based on reaching the best metabolic and blood pressure contrai and using of angiotensin-converting enzyme inhibitors. Treatment of dislipidemia remains controversial. Other alternativas for treating DN are the low-protein diets but unfortunately, compliance to these diets is poor and its long-term safety has not been established. Recently it was reported that a diet based on chicken as the only source of meat improved the serum lipid profile and reduced UAER in DM2 patients with microalbuminuria. The aim of this study was to analyse the role of dietary nutrients from diets with different protein sources related to the reduction on cholesterol leveis in patients with DM2 with and without DN. A cross-over clinicai trial was carried out with 30 DM2 subjects (7 femate; age=57.9 ± 9.8 years), including 14 normoalbuminuric (UAER < 20μg/min) and 16 with DN, where 10 were microalbuminuric (UAER 20 - 200μg/min) and 6 were macroalbuminuric (UAER > 200μg/min) subjects. Patients followed, in a random arder, their usual diet (UD), a chicken-based diet (CO) - in which red meat was replaced by chicken - and a low-protein diet (LPD), where milk and vegetable were the only protein source. Ali diets were isoenergetic and had a similar fat content (30% of the total energy). There was a 4-week washout period between diets. The average protein content in UD and CO was 1.3-1.5 g protein/kg/day, whereas the proteín content in LPD was 0.5-0.8 g protein/kg/day. A 24-h urinary nitrogen measurement and 2 days of weigh diet records in biweekly interviews confirmed compliance with the diet. To analyse the nutrient content of each diet the Software Clinicai Nutribase'98 Clinical Nutritional Manager (Cybersoft, Inc. Phoenix, AZ USA) was used. This program is based on the U.S. Department of Agricultura food table and supplemented with information from manufactorers with particular food from our region. At the end of each diet, patients underwent a clinicai and metabolic control evaluation, as well as measurements of total cholesterol, triglycerides (enzymatic method); LDL-cholesterol (Friedwald equation); HDL-cholesterol and HDL2 and HDL3 (double precipitation with manganese chloride, heparin, and dextran suphate), non-HDL cholesterol (total cholesterol - HDL-cholesterol) and apolipoprotein B (Apo B) (immunoturbidimetry). In patients with micro- and macroalbuminuria, total and non-HDL cholesterollevels were lower after CO (181 ± 41; 136 ± 42 mg/dl) and after LPD (181 ± 31; 140 ± 34 mg/dl) than after UD (210 ± 37; 159 ± 34 mg/dl, P=O,OOS; P=0,02). Total fat, saturated (SFA) and monounsaturated fatty acids intake was lower on the CD (0,86 ± 0,30; 0,23 ±O,1O; 0,27 ± 0,10 g/kg) and on the LPD (0,82 ± 0,29; 0,21 ± O,1O; 0,26 ± O,1O g/kg) than on the UD (0,97 ± 0,93; 0,28 ± 0,10; 0,32 ± 0,11; P=O,OOS; P=0,003; P=0,0046 ANOVA). However, cholesterol intake was significantly lower only on the LPD (0,64 ± 0,44 g/kg; P<0,0001 ANOVA) comparing to UD (3,21 ± 1,12 g/kg) and LPD (3,04 ± 1,02 g/kg). PIS ratio was higher on the CD (1,49 ± 0,56) and LPD (1,68 ± 0,82) than on the UD (1,14 ± 0,48; P=0,002). In patients with DN significant correlations were observed between meat-protein intake on the UD and serum leveis of total cholesterol (rs=0,583; P<0,05), LDL-cholesterol (rs=0,65; P<0,05), non-HDL cholesterol (rs=0,517; P<0,05) and Apo B (rs=0,58 P<0,05). These significant correlations were not observed in normoalbuminuric patients. In conclusion, either a normoproteic diet with chicken as the only source of meat or a LPD based on milk and vegetables as protein source have the same effect on the reduction of both total cholesterol and non-HDL cholesterollevels in DM2 patients with micro- and macroalbuminuria. This effect is probably due to the reduction on SFA intake and consequently increase on PIS ratio. The CO could be an alternative treatment for DN with beneficiai effects on the lipid pro•file, since it may reduce the progression of DN and atherosclerosis in these patients.

Introdução A disfunção endotelial é uma alteração presente no processo aterosclerótico. Entretanto, não está claro se a associação do diabete com a dislipidemia configura um estado mais agressivo ao endotélio vascular do que cada um destes fatores de risco isoladamente. As investigações que têm sido realizadas avaliando esta questão em geral têm utilizado estudos invasivos comparando a resposta do endotélio à infusão de acetilcolina e nitratos, de difícil aplicabilidade clínica. Outros estudos têm envolvido o uso de marcadores não-invasivos de disfunção endotelial, como a dosagem da Endotelina-1 (Et -1) e do F ator de von Willebrand (F v W), em grupos isolados - diabéticos ou dislipidêmicos- sem compará-los, e em amostras com potenciais fatores de confusão, como a presença de hipertensão, obesidade, fumo e uso de insulina. Objetivos Este trabalho teve por objetivo avaliar se pacientes com diabete tipo 2 portadores de dislipidemia apresentam maior disfunção endotelial, caracterizada por níveis mais elevados de Et-1 e FvW, quando comparados a pacientes dislipidêmicos e a controles normais. Pacientes e Métodos Realizamos um estudo transversal controlado, em que os fatores avaliados são o diabete melito tipo 2 e a dislipidemia, sendo o desfecho a disfunção endotelial, representada por concentrações mais elevadas do FvW e da Et-1. Foram comparados três grupos: indivíduos dislipidêmicos com diabete melito tipo 2 sem uso de insulina, pacientes não diabéticos com dislipidemia e indivíduos sadios. Todos eram não fumantes e normoalbuminúricos, com índice de massa corporal (IMC) inferior a 32. Aceitaram participar do trabalho através de consentimento informado por escrito, e o projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Os indivíduos foram submetidos a um questionário padrão avaliando fármacos em uso, tempo de duração do diabete e história familiar, história de retinopatia, questionário Rose para avaliação de cardiopatia isquêmica e doença vascular periférica, questionário para avaliação de neuropatia e exame físico que avaliou peso, altura e cálculo do IMC, pressão arterial, pulsos, reflexos tendinosos e sensibilidade vibratória. Aqueles que não se sabiam diabéticos realizaram teste oral de tolerância à glicose, sendo excluídos os que apresentavam tolerância diminuída à glicose. Todos submeteram-se a avaliação laboratorial que constou de medida da glicemia, glicohemoglobina, colesterol e frações, triglicérides, uréia, creatinina, insulina, peptídeo C, fibrinogênio, e excreção urinária da albumina (EUA)/creatinina na urina, em urina estéril. Os indivíduos eram normotensos, sem perda de função renal, evento vascular recente ou doenças concomitantes, sem uso de fármacos hipolipemiantes, bloqueadores do cálcio ou da enzima de conversão da angiotensina. O sangue foi centrifugado e o plasma mantido estocado a -70 °C, com análise posterior, em tempo único, da Endotelina-1 e do Fator de von Willebrand (ELISA) , com examinadores sob mascaramento. Resultados Foram incluídos 75 indivíduos, divididos nos três grupos: a)35 pacientes com dislipidemia e diabete melito tipo 2 (idade 57±7 anos, colesterol total (CT)225 mg/dl, LDL-colesterol (LDL-C) 150±46 mg/dl; HDL colesterol (HDL-C) 44 mg/dl; triglicérides (TG) 179 mg/dl e IMC=28,4±3,6) ; b)21 pacientes com dislipidemia (idade 52±7 anos, CT 247 mg/dl; HDL-C 47 mg/dl, LDL-C 200±43 mg/dl; TG 128 mg/dl e IMC=27 ,2±3 ,2); c) 19 controles normais (idade 45±4 anos; CT 167 mg/dl; LDL 98±30 mg/dl; HDL-C 48 mg/dl; TG 75 mg/dl e IMC=24,2±2,2). Os pacientes com dislipidemia e diabete melito tipo 2 apresentaram níveis de FvW de 185,9%, enquanto os dislipidêmicos apresentaram níveis de 169,2% e os controles de 129,6%. Esta diferença foi significativa (Kruskall-Wallis, p=0,02) entre diabéticos e controles. Não houve diferença entre os dislipidêmicos e controles normais, nem entre os diabéticos e os dislipidêmicos não diabéticos. Quanto à Endotelina- 1, os diabéticos apresentaram níveis de 1,61 pg/ml, enquanto os dislipidêmicos tiveram 0,91 pg/ml e os controles 0,68 pg/ml. Esta diferença foi significativa tanto comparada a dislipidêmicos como contra controles normais (Kruskall-Wallis, p=0,00008). Não houve diferença entre dislipidêmicos e controles normais na correção post-hoc. Uma vez que houve diferença entre os grupos com relação ao índice de massa corporal, idade, pressão arterial sistólica, peptídeo C, triglicérides e fibrinogênio, foi realizada regressão logística, para controle das variáveis de confusão. A análise multivariada mostrou que apenas o peptídeo C e os triglicérides representaram risco significativo (p=O,O I e p=0,03, respectivamente) para os níveis de Endotelina-1 entre os grupos. Já para os níveis do Fator de von Willebrand, nenhuma variável alcançou significância. Conclusão A avalição não-invasiva da função endotelial através da medida do FvW, mostrou diferença apenas entre diabéticos e controles. Não houve diferença significativa entre os niveis da Et-1 e FvW dos dislipidêmicos em relação aos controles normais. Nossos dados demonstram que os pacientes com diabete melito tipo 2 associado à dislipidemia têm maior grau de disfunção endotelial, representada por niveis mais elevados de Et-1, quando comparados a dislipidêmicos e a controles normais. Estes resultados se mantêm mesmo quando controlados para a idade, índice de massa corporal e fibrinogênio. Os triglicérides e o peptídeo C representam fator de risco para a diferença nos niveis da Endotelina-1 entre os grupos, mas não para o Fator de von Willebrand. / Bacl{ground Endothelial dysfunction is an important feature of atherosclerosis. However, it is unclear whether the association o f the diabetic state and dyslipidaemia configures a more agressive threat to the vascular endothelium as compared to each state individually. There are no data using non-invasive studies assessing these different populations with comparable risk factors for atherosclerosis, without confounding factors, such as insulin use, smoking, obesity or high blood pressure. Objcctives We undertook a cross-sectional study to address the question whether type 2 diabetics with dyslipidemia have more pronounced endothelial dysfunction, assessed by higher leveis of Endothelin-1 (Et-1) and von Willebrand Factor (vWF), as compared to dyslipidemic non-diabetic patients and normal subjects. Patients and methods Seventy-five nonsmokers, normotensive and normoalbuminuric subjects, divided in three groups were studied: dyslipidemic type 2 diabetics, non-diabetics with dyslipidemia and normal controls. All gave informed written consent, and the study was aproved by the lnstitutional Review Board of Hospital de Clínicas de Porto Alegre. All subjects filled a standard questionnaire to evaluate drugs in use, known duration of diabetes and family history , a WHO questioiUlaire to assess cardiovascular status and a standard questionnaire to assess symptoms of neuropathy. Ali subjects underwent physical examination. Peripheral pulses and reflexes were evaluated. OGTT were cione to exclucie diabetes anci impaireci glucose tolerance. BMI ~ 32, insulin anci vastatin users were exclucieci. Laboratory tests were performeci, incluciing fasting glucose, C-pepticie, insulin, fibrinogen, total cholesterol and fractions, creatinin, HbAlc and urinary measurement of albumin excretion/urinary creatinine on a ranciom sterile specimen. Blooci was centrifugateci anci plasma frozen at -70°C to posterior simulta.neous analysis by blinded examinators for Et-1 and vWF (ELISA). Results Seventy~five subjects were included, and they were divided in three groups: a) type-2 ciiabetics with ciyslipidemia (n=35, age 57±7, total cholesterol (T chol) 225 mg/cil, LDL 150±46 mg/cil, HDL 44 mg/cil, tryglicericies 179 mg/cil, BMI=28,4±3,6); b) ciyslipiciemic patients (n=21, age 52±7 years, T chol 247 mg/cil, LDL 200±43 mg/cil, HDL 47 mg/cil, tryglicericies 128 mg/dl, BMI=27,2±3,2); c) normal contrais (n= 19, age 45±4 years, T c h oi 167 mg/cil, LDL 98±30 mg/cil, HDL 48 mg/cil tryg1icericies 75 mg/cil, BMI=24,2±2,2). All subjects were normotensive, non-smokers and normoalbuminurics. Diabetics had higher leveis of vWF (185.9%; 168.2%; 129.6%)) as compareci with controls(p=O. 02). On the other hand, they had also more pronounceci ciifferences assesseci by leveis ofET-1 ( 1.61 ; 0.91 ; 0.68 pg/ml)) as compareci to both other groups (p=0,0008). These values are mantained after multivariate analysis and control for age, BMI, and fibrinogen leveis. However, C-peptide (p=O,O I) and tryglicerides (p=0,03) were important for endothelin-1 values. Conclusions Diabetics had higher vWF leveis as compared to normal controls. We fOtmd no difference on Et-1 and vWF leveis between dyslipidemic and contrais. Our data suggests that the association between the diabetic millieu and dyslipidaemia represents a higher threat to the vascular endotheliurn when compared to each state individually, as assessed by non-invasive evaluation measuring Et-1.

La diabetes de tipo 1 (T1D) es una enfermedad compleja caracterizada por la desaparición selectiva de las células beta pancreáticas, responsables de la producción de insulina, debido a un proceso autodestructivo mediado por el propio sistema inmunitario. La cepa murina NOD es el modelo animal más ampliamente utilizado en el estudio de la T1D, ya que estos animales desarrollan, de forma espontánea, una forma de diabetes autoinmunitaria similar a la que se observa en humanos. Aunque se conoce que los linfocitos T son las células responsables de la destrucción directa de la masa celular beta, otros tipos celulares del sistema inmunitario también están implicados en el origen y desarrollo de esta respuesta autoinmunitaria. Entre ellos se encuentran los linfocitos B, los cuales también migran, junto con los linfocitos T, a los islotes pancreáticos durante el desarrollo de la diabetes. Nuestra hipótesis es que la población de linfocitos B que forma parte del infiltrado leucocitario en los islotes pancreáticos puede presentar cualidades funcionales distintivas, que aporten la capacidad de regular in situ la actividad de los linfocitos T autorreactivos. El primer objetivo planteado en este estudio ha sido la caracterización fenotípica y funcional de los linfocitos B infiltrantes en islotes pancreáticos, en diferentes modelos murinos de susceptibilidad/resistencia a la diabetes. Así, se ha observado que la migración de los linfocitos B al entorno intrainsular es más destacada en hembras, especialmente en la etapa pre-diabética. Esta población de linfocitos B infiltrantes muestra un fenotipo correspondiente a células maduras, pero la disminución significativa en superfície de la molécula CD19, que forma parte del complejo correceptor del BCR, sugiere un estado funcional reprimido. Los resultados obtenidos tras la estimulación in vitro de estas células indican que dentro del ambiente del infiltrado existen unas condiciones que mantienen este fenotipo reprimido, pero que estas células son especialmente sensibles a la estimulación vía CD40. Estos datos sugieren que estos linfocitos, aunque no presentan cambio de isotipo en su BCR y por tanto no provienen de una reacción de centro germinal, parecen haber estado en contacto previamente con su antígeno. No obstante, a nivel de producción de citoquinas (IL-4, IL-10, IFN?) y de capacidad estimuladora de la proliferación de linfocitos T, no see han detectado diferencias funcionales de estos linfocitos B infiltrantes de islotes, respecto a linfocitos B de poblaciones periféricas. El segundo objerivo de este estudio ha consistido en la identificación del antígeno reconocido predominantemente por esta población de linfocitos B infiltrantes. En un estudio previo, realizado por nuestro grupo, se habían generado hibridomas productores de anticuerpos, a partir de linfocitos B infiltrantes de islotes, y se había demostrado que la mayoría de estos anticuerpos monoclonales reconocían antígenos expresados en las fibras nerviosas que inervan el páncreas. En este estudio, a partir del aislamiento y posterior identificación molecular del antígeno reconocido por 21 anticuerpos monoclonales con el mismo patrón de reconocimiento pero de diferente origen clonal, se ha demostrado que la periferina es la proteína reconocida por todos ellos. Este antígeno neuroendocrino es una proteína de citoesqueleto que se expresa mayoritariamente en las fibras nerviosas periféricas, aunque también, en niveles menores, en las células del islote pancreático. Estos datos apoyan la hipótesis de que el ataque autoinmunirario que se desarrolla en los afectados por T1D, no es exclusivamente dirigido contra las células beta pancreáticas, y que la desestabilización del sistema nervioso pancreático puede ser un factor implicado en el desarrollo de la enfermedad. / Type 1 diabetes (T1D) is a complex autoimmune disease characterized by selective destruction of pancreatic beta cells by the patient's own immune system.Currently, one of the best animal models of type 1 diabetes is the nonobese diabetic (NOD) mouse. NOD mice spontaneously develop a form of diabetes that closely resembles human type 1 diabetes.Islet-infiltrating T-cells are major effectors of beta-cell damage in T1D, however, other cellular elements of the immune system also play a critical role in the initiation and/or progression of T1D. Among these, B-cells are also recruited to pancreatic islets, during disease development. We hypothesize that islet-infiltrating B-cells may have distinctive functional traits, enabling them to regulate autoreactive T-cell activity in situ. The aim of the present study was the phenotypical and functional characterization of islet-infiltrating B cells, in T1D susceptible/resistant T1D murine models. Thus, it was observed that B-cell recruitment into pancreatic islets is higher in female mice, specially just before diabetes onset. Although they are mature B-cells, they interestingly show an abnormal down-regulation of surface CD19 expression, showing a possible hiporesponsive status of these cells, given the relevance of CD19 in regulating BCR activation. Islet-infiltrating B-cells develop a pronounced costimulator phenotype after in vitro stimulation with anti-CD40, thus revealing to be somehow repressed while in the islets. These results suggest that these B-cells, although not presenting immunoglobin class switch recombination, seem to be antigen-experienced. On the other hand, cytokine expression profile (IL-4, IFN?, IL-10) and T-cell activator quality of islet-infiltrating B-cells have been shown to be similar to that from their splenic counterparts.On the other hand, the second objective of this study was the identification of the autoantigen predominantly targeted by islet-infiltrating B-cells. In a previous study in our laboratory, antibody-producing hybridomas were generated from islet-infiltrating C-cells, and it was shown that most of them targeted peripheral nervous elements. In the present study, the isolation and subsequent molecular characterization of the antigen recognized by 21 of these monoclonal antibodies, proved that peripherin is the protein targeted by them all. This neuroendocrine autoantigen is a cytoskeleton protein mainly expressed by peripheral nervous cells, but it is also expressed, although at lower levels, by islet beta-cells. These data support the hypothesis that T1D autoimmune attack is not exclusively focused on pancreatic beta-cells, and that pancreatic nervous system damage may be involved in disease development.

A nefropatia diabética (ND) acomete cerca de 10 a 40% dos pacientes com diabete melito tipo 2 (DM2), e estes pacientes constituem a maioria dos casos de insuficiência renal crônica terminal por diabete melito. O aumento da excreção urinária de albumina (EUA) - microalbuminúria - é um importante marcador de risco cardiovascular e da lesão renal. O tratamento da microalbuminúria baseia-se na obtenção do melhor controle metabólico e pressórico possível e no uso de agentes inibidores da enzima conversora de angiotensina. O tratamento da dislipidemia ainda é contraditório. Entre as alternativas terapêuticas, a dieta hipoprotéica tem mostrado, embora com alguma controvérsia, resultados benéficos sobre a progressão da ND, porém a adesão é limitada e a sua segurança a longo prazo ainda não está definida. Em recente estudo em nosso meio foi demonstrado o efeito benéfico de uma dieta à base de carne de galinha sobre o perfil lipídico e EUA em pacientes DM2 microalbuminúricos. O presente estudo teve por objetivo analisar o papel dos componentes das dietas com diferentes fontes protéicas na redução do colesterol sérico em pacientes com DM2 com e sem ND. Foram estudados 30 pacientes (7 mulheres; idade de 57,9 ± 9,8 anos), sendo 14 normoalbuminúricos, com EUA < 20μ/min e 16 com ND, isto é, 10 microalbuminúricos (EUA 20 a 200μg/min) e 6 macroalbuminúricos (EUA > 200μg/min). O delineamento do estudo foi do tipo randomizado, cruzado, controlado, durante o qual os pacientes foram submetidos a três dietas, por um período de 4 semanas cada uma, com um igual período de "washout" entre as dietas. As dietas foram: dieta usual (OU) onde a carne vermelha era predominante; dieta de galinha (DG), onde só esta carne era permitida e dieta hipoprotéica (DH) onde as fontes de proteína eram leite e derivados e vegetais. As dietas prescritas foram isoenergéticas, com cerca de 30% de lipídeos sobre o valor energético total (VET). A DU e DG continham cerca de 1,20 a 1,50 g de proteína/kg de peso/dia e a OH continha de 0,50 a 0,80 g de proteína/kg de peso/dia. A adesão às dietas foi medida a cada 2 semanas, através de história alimentar que incluiu pesagens dos alimentos e entrevistas, e que foi validada pela medida da perda nitrogenada de 24 h. Para cálculo dos nutrientes que compõem as dietas foi utilizado o Programa Nutribase'98 Clinical Nutritional Manager (Cybersoft, Inc. Phoenix, AZ USA), cujo banco de dados é baseado na tabela americana de alimentos, com adaptação para alimentos do nosso meio. Ao final de cada dieta, foram avaliados: colesterol total ( col-total) e triglicerídeos (método enzimático); LOL (fórmula de Friedewald); HOL total e frações 2 e 3 (dupla precipitação com cloreto de manganês, heparina e sulfato de dextran); colesterol não-HDL (col não-HOL) (col-total- colesteroi-HDL) e apolipoproteína 8 (Apo 8) (imunoturbidimetria). Nos pacientes com ND, os níveis de col-total e col não-HDL foram mais baixos após OG (181 ± 41; 136 ± 42 mg/dl) e após OH (181 ± 31; 140 ± 34 mg/dl) em relação à OU (210 ± 37; 159 ± 34 mg/dl, P=O,OOS; P=O, 02). A ingestão de lipídeos totais, ácidos graxos saturados (AGS) e monoinsaturados foi significativamente menor na OG (0,86 ± 0,30; 0,23 ± O, 1 O; 0,27 ±O, 10 g/kg) e OH (0,82 ± 0,29; 0,21 ±O, 10; 0,26 ±O, 10 g/kg) em relação à OU (0,97 ± 0,93; 0,28 ±O, 10; 0,32 ±O, 11; P=O,OOS; P=0,003; P=0,0046), porém a quantidade de colesterol ingerida só foi significativamente menor na DH (0,64 ± 0,44 g/kg; P<0,0001) em relação à OU (3,21 ± 1,12 g/kg) e DG (3,04 ± 1,02 g/kg). A razão P/S foi significativamente maior nas DG (1 ,49 ± 0,56) e OH (1,68 ± 0,82) em relação à OU (1,14 ± 0,48; P=0,002). Foi observada uma correlação significativa entre a ingestão protéica (g/kg) proveniente da carne vermelha na DU e os níveis séricos de col-total (rs=0,583; P<0,05), colesterol-LDL (r5=0,65; P<0,05), col não-HDL (rs=0,517; P<0,05) e Apo 8 (r5=0,58 P<0,05) somente nos pacientes com ND, porém a mesma não ocorreu nos pacientes normoalbuminúricos. Conclui-se que tanto uma dieta normoprotéica à base de carne de galinha quanto uma DH lactovegetariana têm o mesmo impacto na redução dos níveis séricos de col-total e col não-HDL dos pacientes com DM2 com micro e macroalbuminúria e esse efeito provavelmente é devido à redução da ingestão de AGS da dieta com conseqüente aumento da relação ácidos graxos poliinsaturados/saturados. A dieta de galinha, portanto, pode ser uma alternativa terapêutica com efeitos benéficos sobre os lipídeos séricos, na progressão da nefropatia diabética e da aterosclerose nestes pacientes. / Approximately 10-40% of type 2 diabetes mellitus (DM2) patients develop diabetic nephropathy (DN), and these patients constitute the majority of the cases of end-stage renal disease. The raise in urinary albumin excretion rate (UAER) - microalbuminuria - is an important marker of cardiovascular and renal disease. Treatment is based on reaching the best metabolic and blood pressure contrai and using of angiotensin-converting enzyme inhibitors. Treatment of dislipidemia remains controversial. Other alternativas for treating DN are the low-protein diets but unfortunately, compliance to these diets is poor and its long-term safety has not been established. Recently it was reported that a diet based on chicken as the only source of meat improved the serum lipid profile and reduced UAER in DM2 patients with microalbuminuria. The aim of this study was to analyse the role of dietary nutrients from diets with different protein sources related to the reduction on cholesterol leveis in patients with DM2 with and without DN. A cross-over clinicai trial was carried out with 30 DM2 subjects (7 femate; age=57.9 ± 9.8 years), including 14 normoalbuminuric (UAER < 20μg/min) and 16 with DN, where 10 were microalbuminuric (UAER 20 - 200μg/min) and 6 were macroalbuminuric (UAER > 200μg/min) subjects. Patients followed, in a random arder, their usual diet (UD), a chicken-based diet (CO) - in which red meat was replaced by chicken - and a low-protein diet (LPD), where milk and vegetable were the only protein source. Ali diets were isoenergetic and had a similar fat content (30% of the total energy). There was a 4-week washout period between diets. The average protein content in UD and CO was 1.3-1.5 g protein/kg/day, whereas the proteín content in LPD was 0.5-0.8 g protein/kg/day. A 24-h urinary nitrogen measurement and 2 days of weigh diet records in biweekly interviews confirmed compliance with the diet. To analyse the nutrient content of each diet the Software Clinicai Nutribase'98 Clinical Nutritional Manager (Cybersoft, Inc. Phoenix, AZ USA) was used. This program is based on the U.S. Department of Agricultura food table and supplemented with information from manufactorers with particular food from our region. At the end of each diet, patients underwent a clinicai and metabolic control evaluation, as well as measurements of total cholesterol, triglycerides (enzymatic method); LDL-cholesterol (Friedwald equation); HDL-cholesterol and HDL2 and HDL3 (double precipitation with manganese chloride, heparin, and dextran suphate), non-HDL cholesterol (total cholesterol - HDL-cholesterol) and apolipoprotein B (Apo B) (immunoturbidimetry). In patients with micro- and macroalbuminuria, total and non-HDL cholesterollevels were lower after CO (181 ± 41; 136 ± 42 mg/dl) and after LPD (181 ± 31; 140 ± 34 mg/dl) than after UD (210 ± 37; 159 ± 34 mg/dl, P=O,OOS; P=0,02). Total fat, saturated (SFA) and monounsaturated fatty acids intake was lower on the CD (0,86 ± 0,30; 0,23 ±O,1O; 0,27 ± 0,10 g/kg) and on the LPD (0,82 ± 0,29; 0,21 ± O,1O; 0,26 ± O,1O g/kg) than on the UD (0,97 ± 0,93; 0,28 ± 0,10; 0,32 ± 0,11; P=O,OOS; P=0,003; P=0,0046 ANOVA). However, cholesterol intake was significantly lower only on the LPD (0,64 ± 0,44 g/kg; P<0,0001 ANOVA) comparing to UD (3,21 ± 1,12 g/kg) and LPD (3,04 ± 1,02 g/kg). PIS ratio was higher on the CD (1,49 ± 0,56) and LPD (1,68 ± 0,82) than on the UD (1,14 ± 0,48; P=0,002). In patients with DN significant correlations were observed between meat-protein intake on the UD and serum leveis of total cholesterol (rs=0,583; P<0,05), LDL-cholesterol (rs=0,65; P<0,05), non-HDL cholesterol (rs=0,517; P<0,05) and Apo B (rs=0,58 P<0,05). These significant correlations were not observed in normoalbuminuric patients. In conclusion, either a normoproteic diet with chicken as the only source of meat or a LPD based on milk and vegetables as protein source have the same effect on the reduction of both total cholesterol and non-HDL cholesterollevels in DM2 patients with micro- and macroalbuminuria. This effect is probably due to the reduction on SFA intake and consequently increase on PIS ratio. The CO could be an alternative treatment for DN with beneficiai effects on the lipid pro•file, since it may reduce the progression of DN and atherosclerosis in these patients.