Made available in DSpace on 2016-01-26T18:55:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sergio Vilhegas.pdf: 700648 bytes, checksum: 61199638be80e4484e7e0b1e44be0387 (MD5) Previous issue date: 2013-09-23 / The aim of this study was to evaluate the analgesic effects of botulinum toxin as an adjunct in the control of postoperative pain in dogs. In a blinded study, sixteen dogs undergoing mastectomy were randomly assigned to two groups of 08 animals each and received 7U kg-1 of botulinum toxin diluted in 10mL of saline and administered 1mL in each breast, subcutaneously (TXB) or 1mL of saline administered in each breast (Control), subcutaneously. After twenty four hours, pre-anesthetic medication was intramuscular (IM) acepromazine (0.03mg kg-1) in combination with morphine (0.3mg kg-1). Anesthesia was induced with intravenously (IV) propofol (4 to 5mg kg-1) and maintained with isoflurane. The analgesic intra-operative support was provided by IV continuous rate morphine (0.1mg kg-1h-1). Heart rate, respiratory rate, systolic arterial blood pressure, oxicapnografy and end-tidal concentration of isoflurane were evaluated during the surgery. Postoperative analgesia was assessed during the first 72 hours after the tracheal extubation using a Visual Analog Scale (VAS) and Glasgow Modified Scale (GMS). Rescue analgesia with morphine (0.5mg kg-1 IM) was performed if the evaluation score exceeded 50% of VAS and/or 30% of GMS during the postoperative period. The pain scores were lower in TXB group than in Control group from 8 to 60 hours and from 12 to 60 hours post-extubation, according to VAS and GMS scales, respectively. Postoperative rescue analgesia was lower in the TXB group (2 of 8 dogs), when compared with Control group (7 of 8 dogs). Cardiopulmonary established was detected in both treatment groups. Preemptive botulinum toxin administration is a satisfactory alternative to post-operative management in dogs undergoing mastectomy. / Este estudo teve como objetivo avaliar a administração da toxina botulínica como adjuvante do controle da dor pós-operatória de cães. Em delineamento cego, dezesseis cadelas, encaminhadas para mastectomia radical foram distribuídas aleatoriamente em dois tratamentos: TXB (n=8) administração de 7U kg-1 de toxina botulínica, diluída em 10 mL de solução salina, sendo administrado 1mL em cada mama, por via subcutânea (SC); Controle (n=8) administração de 10 mL de solução salina (1mL em cada mama, SC). Vinte e quatro horas após, os animais foram encaminhados para cirurgia, sendo tranquilizados com acepromazina (0,03mg kg-1) associada à morfina (0,3mg kg-1), por via intramuscular (IM). Transcorridos vinte minutos, iniciou-se a infusão contínua intravenosa (IV) de morfina (0,1mg kg-1 h-1) que foi mantida durante toda a cirurgia. A indução anestésica foi realizada com propofol (4-5mg kg-1, IV), seguindo-se a manutenção da anestesia com isofluorano. Parâmetros avaliados: frequência cardíaca e respiratória, pressão arterial sistólica, oxicapnografia e concentração final expirada de isofluorano. No pós-operatório o grau de analgesia foi mensurado durante 72 horas após a extubação traqueal, utilizando-se a Escala Analógica Visual (EAV) e Escala de Glasgow Modificada (EGM). Analgesia de resgate foi feita com morfina (0,5mg kg-1 IM) em casos do escore de dor ser superior a 50% da EAV e/ou 33% da EGM. Os escores de dor foram inferiores no tratamento TXB de 8 a 60 horas na EAV e de 12 a 60 horas na EGM. A necessidade de suplementação analgésica foi inferior no gruo TXB (2 de 8 animais) em relação ao grupo Controle (7 de 8 animais). Estabilidade cardiorrespiratória foi observada em ambos os tratamentos. A administração preemptiva de toxina botulínica representa uma alternativa viável para o controle da dor pós-mastectomia em cadelas.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:53:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sergio Vilhegas.pdf: 700648 bytes, checksum: 61199638be80e4484e7e0b1e44be0387 (MD5) Previous issue date: 2013-09-23 / The aim of this study was to evaluate the analgesic effects of botulinum toxin as an adjunct in the control of postoperative pain in dogs. In a blinded study, sixteen dogs undergoing mastectomy were randomly assigned to two groups of 08 animals each and received 7U kg-1 of botulinum toxin diluted in 10mL of saline and administered 1mL in each breast, subcutaneously (TXB) or 1mL of saline administered in each breast (Control), subcutaneously. After twenty four hours, pre-anesthetic medication was intramuscular (IM) acepromazine (0.03mg kg-1) in combination with morphine (0.3mg kg-1). Anesthesia was induced with intravenously (IV) propofol (4 to 5mg kg-1) and maintained with isoflurane. The analgesic intra-operative support was provided by IV continuous rate morphine (0.1mg kg-1h-1). Heart rate, respiratory rate, systolic arterial blood pressure, oxicapnografy and end-tidal concentration of isoflurane were evaluated during the surgery. Postoperative analgesia was assessed during the first 72 hours after the tracheal extubation using a Visual Analog Scale (VAS) and Glasgow Modified Scale (GMS). Rescue analgesia with morphine (0.5mg kg-1 IM) was performed if the evaluation score exceeded 50% of VAS and/or 30% of GMS during the postoperative period. The pain scores were lower in TXB group than in Control group from 8 to 60 hours and from 12 to 60 hours post-extubation, according to VAS and GMS scales, respectively. Postoperative rescue analgesia was lower in the TXB group (2 of 8 dogs), when compared with Control group (7 of 8 dogs). Cardiopulmonary established was detected in both treatment groups. Preemptive botulinum toxin administration is a satisfactory alternative to post-operative management in dogs undergoing mastectomy. / Este estudo teve como objetivo avaliar a administração da toxina botulínica como adjuvante do controle da dor pós-operatória de cães. Em delineamento cego, dezesseis cadelas, encaminhadas para mastectomia radical foram distribuídas aleatoriamente em dois tratamentos: TXB (n=8) administração de 7U kg-1 de toxina botulínica, diluída em 10 mL de solução salina, sendo administrado 1mL em cada mama, por via subcutânea (SC); Controle (n=8) administração de 10 mL de solução salina (1mL em cada mama, SC). Vinte e quatro horas após, os animais foram encaminhados para cirurgia, sendo tranquilizados com acepromazina (0,03mg kg-1) associada à morfina (0,3mg kg-1), por via intramuscular (IM). Transcorridos vinte minutos, iniciou-se a infusão contínua intravenosa (IV) de morfina (0,1mg kg-1 h-1) que foi mantida durante toda a cirurgia. A indução anestésica foi realizada com propofol (4-5mg kg-1, IV), seguindo-se a manutenção da anestesia com isofluorano. Parâmetros avaliados: frequência cardíaca e respiratória, pressão arterial sistólica, oxicapnografia e concentração final expirada de isofluorano. No pós-operatório o grau de analgesia foi mensurado durante 72 horas após a extubação traqueal, utilizando-se a Escala Analógica Visual (EAV) e Escala de Glasgow Modificada (EGM). Analgesia de resgate foi feita com morfina (0,5mg kg-1 IM) em casos do escore de dor ser superior a 50% da EAV e/ou 33% da EGM. Os escores de dor foram inferiores no tratamento TXB de 8 a 60 horas na EAV e de 12 a 60 horas na EGM. A necessidade de suplementação analgésica foi inferior no gruo TXB (2 de 8 animais) em relação ao grupo Controle (7 de 8 animais). Estabilidade cardiorrespiratória foi observada em ambos os tratamentos. A administração preemptiva de toxina botulínica representa uma alternativa viável para o controle da dor pós-mastectomia em cadelas.

Introdução: Os autores estudaram o efeito da toxina botulinica tipo A (BontA) na viabilidade de retalhos cutâneos em ratos saudáveis, expostos à fumaça de cigarro e diabéticos. Material e métodos: Foram avaliados 90 ratos Wistar machos com peso variando entre 170 a 469 g (média 282,56 g). Esses animais foram divididos em seis grupos: saudáveis com aplicação de solução fisiológica (SF) (C1), saudáveis com aplicação de Toxina botulínica tipo A (BontA) (C2), expostos à fumaça de cigarro com aplicação de SF (T1), expostos à fumaça de cigarro com aplicação de BontA (T2), diabéticos com aplicação de SF (D1) e diabéticos com aplicação de BontA (D2). Os ratos pertencentes ao grupo exposição à fumaça de cigarro foram expostos por um período de 28 dias duas vezes ao dia ininterruptamente. O Diabete foi induzido pela injeção, intravenosa de estreptozotocina (55 mg/Kg) 56 dias antes do início dos procedimentos. Sete dias antes da realização do retalho cutâneo foi injetado ao longo do retalho, BontA (20u) ou SF 0,9%, de acordo com o subgrupo ao qual o animal foi alocado. Foi realizado procedimento para obtenção de retalho cutâneo dorsal (3x10 cm) e no sétimo pósoperatório os retalhos foram fotografados e a seguir realizada eutanásia. As fotografias foram digitalizadas e analisadas pelo programa Image J®, através do qual foi aferido área viável e área total. Através do programa Excel® foi calculado a razão da área viável/área total dos retalhos dorsais dos animais. A seguir foi coletado amostra de tecido com dimensões de 0,4x5 cm, para análise das arteríolas (lúmen, diâmetro, espessura média da parede arteriolar e razão do lúmen/espessura média), segundo método de estereologia. Resultados: A razão de área viável/área total apresentou diferença significativa no grupo controle tratado com BontA, (C2 x C1; 0,9 ± 0,1 vs 0,67 ± 0,15, p= 0,001). O mesmo comportamento foi observado no grupo diabete que recebeu a aplicação de BontA (D2 x D1 groups; 0,97±0,2 vs 0,61±0,24, p=0,018). O grupo exposto à fumaça de cigarro não apresentou diferença estatística. À estereologia, não houve diferença da avaliação miscrocópica dos grupos controle e expostos à fumaça de cigarro. O grupo diabete mostrou diferença estatística nos animais que receberam a aplicação de BontA em relação os que receberam SF, lúmen (p=0,004), diâmetro (p=0,05), razão lúmen/espessura média (p=0,003). Conclusão: a toxina botulínica tipo A aumentou a viabilidade do retalho cutâneo dorsal em ratos sadios e diabéticos no sétimo pós-operatório. Houve aumento do lúmen, diâmetro, razão do lúmen/ espessura média dos retalhos cutâneos dos animais diabéticos / Background: Botulinum toxin A (BoNTA) might be effective in reducing skin flap necrosis. This study investigated BoNTA influence on skin flap viability in healthy, tobacco-exposed and diabetic rats. Methods: Ninety male Wistar rats (170 a 469 g) were randomly divided into six groups: control+saline solution (C1), control+BoNTA (C2), tobacco-exposed+saline solution (T1), tobacco-exposed+BoNTA (T2) diabetes+saline solution (D1) and diabetes+BoNTA (D2). A dorsal random skin flap (3 × 10 cm) was performed on each rat. Total flap and necrosis areas were measured through macroscopic evaluation using ImageJ® software. Survival area /total area ratio was calculated. After euthanasia skin flap samples were collected for stereological assessment. Lumen, diameter, wall thickness, and lumen/wall thickness ratio of all arterioles along the panniculus carnosus were measured. Results: Survival flap area/total flap area ratio increased in control group with BoNTA injection compared with control animals injected with saline solution (C2 x C1 groups; 0.9 ± 0.1 vs 0.67 ± 0.15, p= 0.001). A similar result was found in the diabetic group injected with BontA when compared with the diabetic group injected with saline solution (D2 x D1 groups; 0.97±0.2 vs 0.61±0.24, p=0.018). We did not observe any difference in skin flap viability in the tobacco-exposed groups (T1 x T2 groups; 0.64± 0.21 vs 0.74±0.24, p=0.871)). Lumen(p=0.004), diameter(p=0.05) and lumen/wall thickness ratio (p=0.003) were increased in diabetic BoNTA-treated animals compared with diabetic animals injected with saline solution. This effect was not observed in control groups or in the tobacco-exposed groups. Conclusion: BoNTA increased skin flap viability in control and diabetic rats on the seventh postoperative day and resulted in increased lumen, diameter, and lumen/wall thickness ratio in the diabetic animals

Este projeto teve como objetivo geral continuar a avaliar a adequação de anfifílicos que se agregam em solução aquosa formando bicamadas, para recobrir superfícies de sílica. Em paralelo, foi objetivada a reconstituição do reconhecimento receptor-ligante, tendo como modelo o monosialogangliosídio GM1 e a enterotoxina do vibrião da cólera. Os resultados obtidos poderão se mostrar de grande valor em aplicações práticas que envolvem a construção de sistemas de detecção e quantificação de substâncias ou moléculas específicas. A adsorção e estabilidade de bicamadas contendo fosfatidilcolina (PC) ou misturas de brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB) e dipalmitoilfosfatidilcolna (DPPC) sobre a superfície de nanopartículas de sílica foi estudada através de isotermas de adsorção por dosagem do fosfato inorgânico, análises de sedimentação por imagens fotográficas e medidas dos diâmetros médios (Dz) e potenciais-zeta (ζ) de partículas por espectroscopia de correlação de fótons. Foram avaliadas as afinidades entre as bicamadas e a superfície das nanopartículas e a estabilidade do sistema em função da força iônica, do pH e da concentração adicionada de lipídio. A afinidade das bicamadas pela superfície da sílica apresentou uma correlação com as forças de van der Waals e as pontes de hidrogênio que se formam entre os grupos químicos do anfifílico e aqueles de superfície da sílica. A formação de uma única bicamada lipídica de PC sobre a sílica foi detectada, o que levou à estabilidade coloidal do sistema particulado. As bicamadas mistas de DPPC/DODAB por sua vez apresentaram uma afinidade decrescente pela sílica com a elevação da porcentagem de DODAB na bicamada. Os dados de isoterma e de ζ das partículas sugerem uma separação física entre o DPPC e o DODAB. O conjunto otimizado partícula de sílica/bicamada de PC (partícula biomimética) foi assim utilizado para promover a incorporação do GM1 micelar nas bicamadas, medida por fluorescência com a utilização da sonda GM1 pireno, seguida do reconhecimento e ligação da toxina da cólera (CT) ao complexo formado. A transferência do GM1 das micelas para as partículas se mostrou dependente da disponibilidade de bicamadas adsorvidas nestas e da ausência de bicamadas não-adsorvidas, livres em dispersão. Para avaliar a ligação da toxina da cólera às partículas biomiméticas foram calculadas isotermas de adsorção a partir da dosagem de proteína não ligada que resta no sobrenadante. A ligação específica da CT na presença de bicamadas de PC e GM1 foi de 67% em massa do total da proteína adicionada, revelando uma ligação positiva entre receptor e ligante. A estequiometria revela que a proporção molar PC: GM1: CT é de 300: 5: 1 respectivamente. A proporção de 1 CT: 5 GM1 está de acordo com a literatura onde experimentos de difração de raios-X mostram a estrutura tridimensional do pentâmero CTB5 ligado a cinco unidades de pentasacarídeo do GM1. / The general objective of this project was to continue evaluating the suitability of amphiphiles that aggregate in aqueous solution forming bilayers, to cover surfaces of silica. A secondary objective pursued was to promote the reconstitution of the receptor-ligand function, having as a model the monosialoganglioside GM1 and the enterotoxin of the choleric vibrio. The results may prove to be valuable in pure research or practical applications for sensing and detection of biomolecules. The adsorption and stability of phosphatidylcholine (PC) bilayers or mixtures of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) over surfaces of silica nanoparticles were evaluated through adsorption isotherms by inorganic phosphate dosage, sedimentation analysis by means of photographic images and measurements of hydrodynamic diameter (Dz) and zeta-potentials (ζ) of particles by photon correlation spectroscopy. The affinity between the bilayers and the nanoparticles surfaces and the general system stability were evaluated as a function of ionic strength, pH and added lipid concentration. The affinity showed a correlation with the van der Waals and the hydrogen bridges forces that form between the chemical groups of the amphiphile and the silica surface. The formation of a single lipid PC bilayer over the silica was detected, leading to the colloidal stability of the particulate system. Mixed bilayers of DPPC/DODAB on the other hand showed a decreasing affinity for silica with an increasing DODAB percentage in the bilayer. Data from isotherms and ζ of particles suggests a physical separation of the DPPC and DODAB. The optimized array of silica particle/PC bilayer (biomimetic particles) was thus used to promote the incorporation of micellar GM1 into the bilayers, measured by fluorescence with a GM1 pirene probe, followed by the cholera toxin (CT) binding to the resulting array. GM1 transfer from micelles to particles showed dependence on the adsorbed bilayers availability and on the absence of non-adsorbed bilayers, free in the bulk solution. To evaluate CT binding to biomimetic particles adsorption isotherms were calculated from the dosage of unbound protein remaining in the supernatant. Specific binding of CT in the presence of PC and GM1 bilayer was 67% mass of total protein added, indicating a positive binding between receptor and ligand. Stoichiometry revealed that the molar proportion PC: GM1: CT is 300: 5: 1 respectively. The proportion of 1 CT: 5 GM1 is in good agreement with data in the literature where X-ray diffraction tests show the 3-dimensional structure of the CTB5 pentamer bound to five units of the pentasaccharide GM1.

Clostridium perfringens causa enterite necrótica aviária devido à produção de toxinas que lesam o intestino. Neste estudo, de 94 amostras nove apresentaram C. perfringens, totalizando 22 isolados. Todos exceto um isolado, possuíram os genes nanI (95%) e/ou nanJ (81%), e 19/22, mostraram atividade neuraminidase em hemácias de frango. A atividade hemaglutinante foi observada em poucos isolados (26%). Todos os isolados foram plc positivos (toxina α), sendo classificados como tipo A. Sete isolados (31,8%) abrigaram o gene tpeL que codifica a toxina TpeL. Isolados tpeL+ mostraram efeito citotóxico característico da ação desta toxina. Alguns isolados mostraram capacidade de aderir e invadir células Vero. A maioria dos isolados foi resistente à sulfaquinoxalina (100%), cefalexina (95%) e eritromicina (95%) e sensíveis (100%) à cefoxitina, amoxicilina, enrofloxacina, amoxicilina-ácido clavulânico, penicilina-estreptomicina, cloranfenicol e metronidazol. Todos os isolados foram agrupados geneticamente em sete clusters, apresentando se como um grupo heterogêneo. / Clostridium perfringens cause avian necrotic enteritis due to production of toxins that damage the intestine. In this study, nine out of 94 samples had C. perfringens, totaling 22 isolates. All the isolates with exception of one, possessed the genes nanI (95 %) and/or nanJ (81 %), and 19/22 showed neuraminidase activity in chicken erythrocytes. The hemagglutinating activity was observed in a few isolates (26 %). All isolates were plc positive (toxin α) being classified as type A. Seven isolates (31.8%) harbored tpeL gene encoding the toxin TpeL. TpeL + isolates showed characteristic cytotoxic effect of the action of this toxin. Some isolates showed ability to adhere and invade Hep-2 cells. Most of the isolates were resistant sulphaquinoxaline (100%), cephalexin (95%) and erythromycin (95%) and sensitivity (100%) to cefoxitin, amoxicillin, enrofloxacin, amoxicillin - clavulanic acid, penicillin -streptomycin, chloramphenicol and metronidazole. All isolates were genetically grouped into seven clusters, presenting itself as a heterogeneous group.

INTRODUÇÃO: A paralisia facial de longa duração cursa com déficit funcional e estético, responsáveis por distúrbios psicológicos e prejuízo na qualidade de vida. Mesmo técnicas cirúrgicas modernas de reanimação conseguem restabelecer apenas parcialmente a movimentação emocional e a simetria entre as hemifaces. A toxina botulínica tipo A provoca paralisia muscular flácida reversível, corrigindo desequilíbrios entre músculos agonistas hipoativos e antagonistas relativamente hiperativos. Não há na literatura séries padronizadas com mais de 10 pacientes com paralisia facial tratados por meio da aplicação de toxina botulínica no lado são a fim de obter maior simetria na dinâmica facial na região da boca. MÉTODOS: Este estudo prospectivo teve como objetivo avaliar o efeito do tratamento adjuvante com toxina botulínica no lado são de 25 pacientes com paralisia facial de longa duração, previamente tratados cirurgicamente. O tempo de seguimento foi de 6 meses. Foram métodos de avaliação escala clínica padronizada, grau de satisfação do paciente, Índices de Função Física (IFF) e de Bem-Estar Social (IBES) e eletromiografia de superfície. A dose total de toxina botulínica variou de 15 a 69 U, média 37,9 ± 5,4 U. Dezesseis pacientes apresentaram efeitos adversos com duração média de 14,1 ± 7,3 dias, incluindo dificuldade para articular palavras, beber, mastigar e se adaptar à redução do sorriso. RESULTADOS: 1) Houve redução significante da assimetria entre as hemifaces, de 48,4% após 1 mês e 16,8% aos 6 meses. O ganho de simetria após 1 mês ocorreu em decorrência da diminuição do movimento do lado são, combinada à melhora da avaliação do lado paralisado. Aos 6 meses, com a perda do efeito clínico da toxina botulínica, a nota do lado são voltou a ser semelhante à do pré-tratamento. A redução de assimetria nessa fase ocorreu devido à melhora significante do lado paralisado em relação ao pré-tratamento. 2) A avaliação subjetiva do paciente em relação à simetria apresentou aumento significante, 1 mês e 6 meses em relação ao pré-tratamento. 3) Houve aumento do IFF ao longo do tempo, porém não significante. O IBES apresentou aumento significante aos 6 meses, comparado ao pré-tratamento. 4) Um mês após a aplicação, o efeito da toxina botulínica levou à diminuição significante do potencial de ação do lado não-paralisado. Após 6 meses, o valor voltou a ser semelhante ao do pré-tratamento. CONCLUSÕES: O tratamento proposto permitiu, com técnica minimamente invasiva, obter melhor simetria facial estática, evidenciada pela posição do ângulo da boca, do filtro labial, dos sulcos nasogenianos, do nariz e do supercílio, e melhor simetria dinâmica, principalmente ao sorrir, falar, na exposição dos dentes e na movimentação facial como um todo. Mesmo após a perda do efeito clínico da droga aos 6 meses, houve 18% de melhora da avaliação clínica do lado paralisado em relação ao pré-tratamento, e melhora dos índices de satisfação e qualidade de vida dos pacientes. / INTRODUCTION: Long-standing facial paralysis presents with functional and aesthetic deficits, which are responsible for psychological disturbances and life quality impairment. Even after modern facial reanimation surgical techniques, the emotional movement and the symmetry of the hemifaces is only partially restablished. Botulinum toxin type A causes reversible flacid muscle paralysis, thus correcting imbalances among hypoactive agonists and relatively hyperactive antagonists. There are no standardized series in the literature with more than 10 facial paralysis patients treated with botulinum toxin injection in the non-paralysed side in the mouth area, with the objective of obtaining better dynamic facial symmetry. METHODS: This prospective study had the objective of evaluate, with 6 months follow-up, the effects of the adjuvant treatment using botulinum toxin in the healthy hemiface of 25 patients with long-standing facial paralysis, previously treated surgically. The methods of evaluation were a standardized clinical scale, the patients degree of satisfaction, the Physical Function and Social/well-being Function subscales of the Facial Disability Index and surface electromyography. Total botulinum toxin dose varied from 15 to 69 U, mean 37,9 ± 5,4 U. Sixteen patients presented adverse effects with mean duration time 14,1 ± 7,3 days, including difficulty in speaking, drinking, eating and adapting to the reduced smile. RESULTS: 1) There was significant reduction of facial asymmetry, of 48,4% at 1 month and of 16,8% at 6 months post-treatment. The better symmetry 1 month post-treatment was consequent to reduced movement on the non-paralysed side combined to better evaluation on the paralysed side. At 6 months, the non-paralysed side had similar grading than that of pre-treatment, showing absence of clinical effect of the toxin. At this time, the asymmetry reduction was due to significant increase in the evaluation of the paralysed side in relation to the pre-treatment. 2) Patients satisfaction with facial symmetry showed significant increase, 1 month and 6 months post-treatment. 3) The Physical Function Index increased, but not significantly. The Social/well-being Function Index showed significant increase at 6 months compared to pre-treatment. 4) There was significant decrease in the action potential of the non-paralysed side one month post-injection of the botulinum toxin. After 6 months, the value returned to baseline. CONCLUSIONS: The proposed treatment allowed, with minimally invasive technique, better facial symmetry at rest, evidenced by better mouth, nose and brow position, and on facial movement as a whole, especially when smiling, speaking or exposing teeth. Even after the loss of the clinical effect of the drug at 6 months, there was an 18% increase in the clinical evaluation of the paralysed side in relation to pre-treatment, and increase in the satisfaction and quality of life indexes.

Este trabalho tem como finalidade obter condições de recuperar e purificar a pró-toxina épsilon e uma protease produzida pelo Clostridium perfringens através do uso da técnica de extração líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas (SDFA) para utilização na produção de vacinas. A aplicação do sistema de duas fases aquosas é proposta como alternativa para a purificação, pois permite a separação e análise de partículas biológicas. Esta técnica é aconselhável para purificação em larga escala pela possibilidade de partição seletiva com altos rendimentos, além de apresentar uma boa relação custo-benefício. Foram construídas as curvas binodais que foram utilizadas para análise da composição dos sistemas de duas fases aquosas formados por polietileno glicol e citrato de sódio, como também a extração e recuperação da pró-toxina épsilon e da protease produzidas por Clostridium perfringens. As curvas binodais foram construídas utilizando PEG 400, 550, 1000, 1500, 3350 e 8000 em diferentes valores de pH (6,0; 6,5; 7,0; 7,5 e 8,0) e água para formação do sistema. Também foram construídas curvas na presença de caldo clarificado em substituição à água. Foi avaliada ainda a estabilidade da pró-toxina épsilon, antes da extração, e da protease antes e após a extração, frente às variações de pH e temperatura. Um planejamento experimental ('2pot.8-3') foi usado para avaliar a influência das variáveis concentração e massa molar do PEG, concentração de citrato, pH, concentração de NaCl, fator de diluição do extrato, temperatura e massa total do sistema na extração da pró-toxina épsilon. A partição de uma protease presente no meio fermentado de C. perfringens foi estudada através do uso de três planejamentos experimentais completos (dois do tipo '2pot.4' e um do tipo '2pot.3') que avaliaram a influência das variáveis concentração e massa molar do PEG, concentração de citrato e pH. Três variáveis-resposta foram obtidas (aumento de pureza, coeficiente de partição e recuperação da enzima). Os resultados atingidos foram: coeficiente de partição de 0,57, aumento de pureza de 4,2 com uma recuperação de 131% da atividade enzimática na fase superior do sistema. O sistema de extração que proporcionou as melhores condições de extração foi constituído por: PEG 10000 (g/mol) e concentração de 22% (m/m), concentração de citrato de 8% (m/m) e pH 8,5. A protease permaneceu estável (durante 48 h), mesmo após a extração, nas temperaturas de 5°C e 25°C e nos valores de pH de 6,0 a 9,0. / The purpose of this work is to obtain best conditions of recovery and purification of proteins (epsilon prototoxin and a protease) produced by Clostridium perfringens through the use of the liquid-liquid extraction by aqueous two-phases systems (ATPS). The application of these systems is proposed as alternative for protein purification, because it allows the separation and analysis of biological particles. This technique is advisable process purification applied to large scale since it provides a selective partition with high yields, and good cost-benefit ratio. The binodal curves were constructed and used to determine the system composition based on polyethylene glicol and citrate concentrations. The binodal curves were built by using PEG 400, 550, 1000, 1500, 3350 and 8000 g/mol at different pH values (6.0; 6.5; 7.0; 7.5 and 8.0). The curves were, initially, built in the presence of water and, later, with clarified fermented broth. The differences in the curve profiles (water versus broth) helped to explain the phase separation behaviour. The stability, as a function of pH and temperature, of the epsilon prototoxin was evaluated before the extraction, while the stability of the protease was evaluated before and after the extraction. An experimental design ('2pot.8-3') was used to evaluate the influence of the following variables on epsilon prototoxin extraction: concentration and molar mass of PEG, citrate concentration and NaCl concentrations, pH, dilution factor of the extract, temperature and total mass of the system. However, the partition of the protease was studied through the use of the three full different experimental designs (two of the type '2pot.4', and one of the type '2pot.3') that evaluated the influence of the following variables: concentration and molar mass of PEG, citrate concentration and pH. Three parameter responses were obtained: purification factor; coefficient partition; and recovery yield of the enzyme. The results were satisfactory: partition coefficient = 0.57, purification factor = 4.2; yield = 131%. The extraction conditions which provided the best results were: molar mass of PEG 10000 (g/mol); concentration of PEG of 22% (w/w); concentration of citrate of 8% (w/w); and pH 8.5. The protease was stable (during 48h), even after the extraction, in the temperatures of 5°C and 25°C, and at pH values of from 6.0 to 9.0.

As serino-proteases autotransportadoras de Enterobacteriaceae (SPATE) constituem uma família de proteases secretadas pelo sistema de secreção do tipo V, cujos genes foram estudados em Escherichia coli intestinal e extra-intestinal. Sat é uma SPATE citotóxica de 107 kDa, cujo gene foi identificado pela primeira vez em UPEC isolada da urina de um paciente com pielonefrite. A maioria dos estudos envolvendo Sat foram realizados em células renais e da bexiga, embora seu gene seja encontrado em DAEC, EAEC e, mais recentemente, em amostras bacterianas isoladas de septicemia neonatal e meningite. Os objetivos deste trabalho foram: i) purificar Sat; ii) determinar a ação da Sat purificada em diferentes tipos celulares e iii) caracterizar o papel de Sat na infecção in vitro por EAEC. Desta foram, a presença de Sat nos sobrenadantes do cultivo das cepas EAEC CV323 e DEC/Sat, isoladas de diarreia, foi confirmada por LC-MS/MS. Sat foi purificada da cultura de DEC/Sat+ e utilizada para a obtenção de anticorpos anti-Sat em coelho. O efeito citotóxico de Sat purificada foi investigado em células derivadas do endotélio (HUVEC) e do sistema urinário (Y1, LLC-PK1 e HEK-293) e gastrointestinal (Caco-2). Os parâmetros citotóxicos analisados foram: o descolamento celular e alterações na morfologia, permeabilidade e metabolismo mitocondrial das células. Para investigar o papel de Sat na infecção por EAEC, células Y-1 foram infectadas com EAEC CV323 e DEC/Sat+ na presença ou ausência de PMSF (inibidor de serino-protease) e anticorpos anti-Sat. Os parâmetros de citotoxicidade analisados nas culturas infectadas foram descolamento celular e alteração na morfologia. Os resultados demonstraram que: i) Sat é secretada por EAEC CV323 e DEC/Sat+ e, em ambas as cepas, há duas mutações em resíduos de aminoácidos que não interferiram na atividade enzimática; ii) as células do endotélio são mais sensíveis à Sat do que as células derivadas do trato urinário, sendo a linhagem gastrointestinal a mais resistente; iii) Sat secretada por EAEC CV323 durante a infecção induziu intenso dano celular, o qual, em presença de anticorpos anti-Sat e PMSF foi reduzido em cerca de 80 a 90%, respectivamente. Este é o primeiro trabalho que demonstra a expressão de Sat pela EAEC e a ação da toxina em células endoteliais sugerindo que o papel de Sat possa ser mais amplo na patogenia do que o proposto até o momento. / The serine protease autotransporters of Enterobacteriaceae (SPATEs) constitute a family of proteases secreted by the type V secretion system whose genes have been studied in intestinal and extra intestinal Escherichia coli. Sat is a 107 kDa cytotoxic SPATE and its gene was first identified in UPEC isolated from the urine of a patient with pyelonephritis. Most studies involving Sat were performed in renal and bladder cells, although the gene encoding Sat is encountered in other strains of E. coli such as DAEC, EAEC and more recently, in bacterial samples isolated from neonatal septicemia and meningitis. The objectives of this work were: i) purify Sat; ii) to determine the action of Sat in different types of cells and iii) to characterize in vitro the role of Sat in EAEC infection. Accordingly, the presence of Sat in the culture supernatant of EAEC CV323 and DEC/Sat+ derived from diarrhea was confirmed by LCMS/MS. Sat was purified from the culture of DEC/Sat+ and utilized to produce rabbit antibodies anti-Sat. The cytotoxic effect of Sat was investigated in cells derived from the endothelium (HUVEC) and the urinary (Y1, LLC-PK1, HEK-293) and gastrointestinal (Caco-2) systems. The cytotoxic parameters analyzed were cellular detachment and alterations in the morphology, permeability and mitochondrial metabolism of the cells. To investigate the role of Sat in EAEC infection, Y-1 cells were incubated with EAEC CV323 and DEC/Sat+ in the presence or absence of PMSF (a serine protease inhibitor) and rabbit antibodies anti-Sat. The parameters analyzed were cellular detachment and alteration in the morphology of the cells. The results demonstrated that: i) Sat is secreted by EAEC CV323 and DEC/Sat + and in both strains there are two mutations in amino acid residues that did not interfere with enzymatic activity; ii) endothelium cells are more sensitive to the Sat effect than the cells derived from urinary tract system, being the gastrointestinal cell lineage the most resistant one; iii) Sat secreted by EAEC CV323 during infection induced intense cellular damage which in the presence of anti-Sat antibodies and PMSF was reduced in about 80 to 90%, respectively. This is the first work demonstrating the expression of Sat by EAEC and the action of the toxin on endothelial cells suggesting that the role of Sat may be broader in pathogenesis than has been proposed so far.

Orientador: Sergio Antonio de Bortoli / Resumo: O cultivo intensivo de Brassicaceae favorece o aparecimento de algumas pragas como Plutella xylostella (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera: Plutellidae), a traça-das-crucíferas, cujos danos podem comprometer seriamente a produção. Esse inseto-praga pode ser controlado tanto com inseticidas sintéticos, como com biológicos, sendo, no entanto, usualmente utilizados os sintéticos em seu combate. A traça-das-crucíferas foi a primeira espécie de inseto a ser constatada resistência a inseticidas biológicos, com o uso indiscriminado de inseticidas sintéticos para o seu controle contribuindo também para a seleção de indivíduos tolerantes ou resistentes, além de causar a mortalidade de organismos não alvos. Sendo assim, este trabalho teve por objetivo avaliar a atividade inseticida e os efeitos subletais de duas toxinas lepidóptero-ativas de Bacillus thuringiensis, Cry1Ca e Cry2Ac, em três populações de traças-das-crucíferas, sendo uma delas suscetível (PC) e duas consideradas resistentes (Bt e NO-QA) a toxinas de B. thuringienis, em condições de laboratório. Foram realizados bioensaios de suscetibilidade com as três populações e as toxinas Cry1Ca e Cry2Ac, estimando-se a concentração letal (CL50) e os seus efeitos subletais. A toxina Cry2Ac não causou mortalidade nas lagartas das três populações, então os testes subletais foram realizados apenas com a toxina Cry1Ca que provocou mortalidade. Os parâmetros biológicos avaliados foram: período e peso pupal, sobrevivência larval e pupal, longevi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Intensive brassics cultivation favors appearing of some pests as Plutella xylostella (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera: Plutellidae), diamondback moth (DBM), whose damage can seriously compromise production. This insect-pest can be controlled either synthetic insecticides as biological insecticides, but synthetics are usually used to combat. Diamondback moth was the first insect species to be verified resistance to biological insecticides, with indiscriminate use of synthetic insecticides for its control, also contributing to selection of tolerant or resistant individuals, as well as causing mortality on non-target organisms. Therefore, the objective of this work was to evaluate insecticide activity and sublethal effects of two lepidopteran-active toxins of Bacillus thuringiensis, Cry1Ca and Cry2Ac, on three DBM populations, one of them susceptible (PC) and two considered as resistant (Bt and NO-QA) to B. thuringiens toxins under laboratory conditions. Susceptibility bioassays were performed on the three populations and toxins Cry1Ca and Cry2Ac, estimating lethal concentration (LC50) and its sublethal effects. Cry2Ac toxin did not cause mortality on the caterpillars from the three populations, so the sublethal tests were performed only with Cry1Ca toxin. The biological parameters evaluated were: pupal period and weight, caterpillar and pupal survival, male and female longevity and fecundity. The populations showed susceptibilities to Cry1Ca toxin, with statistically equal behavio... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Este trabalho tem como finalidade obter condições de recuperar e purificar a pró-toxina épsilon e uma protease produzida pelo Clostridium perfringens através do uso da técnica de extração líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas (SDFA) para utilização na produção de vacinas. A aplicação do sistema de duas fases aquosas é proposta como alternativa para a purificação, pois permite a separação e análise de partículas biológicas. Esta técnica é aconselhável para purificação em larga escala pela possibilidade de partição seletiva com altos rendimentos, além de apresentar uma boa relação custo-benefício. Foram construídas as curvas binodais que foram utilizadas para análise da composição dos sistemas de duas fases aquosas formados por polietileno glicol e citrato de sódio, como também a extração e recuperação da pró-toxina épsilon e da protease produzidas por Clostridium perfringens. As curvas binodais foram construídas utilizando PEG 400, 550, 1000, 1500, 3350 e 8000 em diferentes valores de pH (6,0; 6,5; 7,0; 7,5 e 8,0) e água para formação do sistema. Também foram construídas curvas na presença de caldo clarificado em substituição à água. Foi avaliada ainda a estabilidade da pró-toxina épsilon, antes da extração, e da protease antes e após a extração, frente às variações de pH e temperatura. Um planejamento experimental ('2pot.8-3') foi usado para avaliar a influência das variáveis concentração e massa molar do PEG, concentração de citrato, pH, concentração de NaCl, fator de diluição do extrato, temperatura e massa total do sistema na extração da pró-toxina épsilon. A partição de uma protease presente no meio fermentado de C. perfringens foi estudada através do uso de três planejamentos experimentais completos (dois do tipo '2pot.4' e um do tipo '2pot.3') que avaliaram a influência das variáveis concentração e massa molar do PEG, concentração de citrato e pH. Três variáveis-resposta foram obtidas (aumento de pureza, coeficiente de partição e recuperação da enzima). Os resultados atingidos foram: coeficiente de partição de 0,57, aumento de pureza de 4,2 com uma recuperação de 131% da atividade enzimática na fase superior do sistema. O sistema de extração que proporcionou as melhores condições de extração foi constituído por: PEG 10000 (g/mol) e concentração de 22% (m/m), concentração de citrato de 8% (m/m) e pH 8,5. A protease permaneceu estável (durante 48 h), mesmo após a extração, nas temperaturas de 5°C e 25°C e nos valores de pH de 6,0 a 9,0. / The purpose of this work is to obtain best conditions of recovery and purification of proteins (epsilon prototoxin and a protease) produced by Clostridium perfringens through the use of the liquid-liquid extraction by aqueous two-phases systems (ATPS). The application of these systems is proposed as alternative for protein purification, because it allows the separation and analysis of biological particles. This technique is advisable process purification applied to large scale since it provides a selective partition with high yields, and good cost-benefit ratio. The binodal curves were constructed and used to determine the system composition based on polyethylene glicol and citrate concentrations. The binodal curves were built by using PEG 400, 550, 1000, 1500, 3350 and 8000 g/mol at different pH values (6.0; 6.5; 7.0; 7.5 and 8.0). The curves were, initially, built in the presence of water and, later, with clarified fermented broth. The differences in the curve profiles (water versus broth) helped to explain the phase separation behaviour. The stability, as a function of pH and temperature, of the epsilon prototoxin was evaluated before the extraction, while the stability of the protease was evaluated before and after the extraction. An experimental design ('2pot.8-3') was used to evaluate the influence of the following variables on epsilon prototoxin extraction: concentration and molar mass of PEG, citrate concentration and NaCl concentrations, pH, dilution factor of the extract, temperature and total mass of the system. However, the partition of the protease was studied through the use of the three full different experimental designs (two of the type '2pot.4', and one of the type '2pot.3') that evaluated the influence of the following variables: concentration and molar mass of PEG, citrate concentration and pH. Three parameter responses were obtained: purification factor; coefficient partition; and recovery yield of the enzyme. The results were satisfactory: partition coefficient = 0.57, purification factor = 4.2; yield = 131%. The extraction conditions which provided the best results were: molar mass of PEG 10000 (g/mol); concentration of PEG of 22% (w/w); concentration of citrate of 8% (w/w); and pH 8.5. The protease was stable (during 48h), even after the extraction, in the temperatures of 5°C and 25°C, and at pH values of from 6.0 to 9.0.