INTRODUÇÃO: A toxoplasmose é uma infecção que ocorre em todo o mundo, mas tem a sua maior incidência em áreas tropicais. Trata-se de uma infecção comum na América Central e do Sul, especialmente em locais de clima moderado, mas também está associada a condições socioeconômicas e de má higiene. Apresenta um impacto significativo na Saúde pública, principalmente em decorrência do risco de transmissão vertical da doença para o feto. A infecção congênita ainda ocorre apesar da disponibilidade de exames para o diagnóstico e da terapêutica na gestante. Resulta, na maioria dos casos, da aquisição da infecção primária na gestação. OBJETIVOS: O objetivo deste estudo foi estimar a incidência anual da toxoplasmose congênita nos nascimentos ocorridos na Região Metropolitana de São Paulo, no período de 1984 a 2006, usando dados de soroprevalência de uma amostra representativa desta população, através da modelação matemática. MÉTODOS: Uma análise sorológica retrospectiva anti-toxoplasma da cidade de Caieiras, Região Metropolitana de São Paulo, em 1990, foi realizada para analisar a função de soroprevalência dependente da idade. Foram utilizadas 250 amostras de soros para análise de soroprevalência em idades de 1 a 40 anos e 199 soros amostras para a soroprevalência em crianças de 0 a 15 meses, e decaimento dos anticorpos de origem materna. Além disso, avaliou-se a força de infecção e a média de idade de aquisição da primeira infecção. O aumento na proporção de indivíduos imunes a cada intervalo de idade foi usado para calcular a proporção de novas infecções. Para a avaliação dos riscos de aquisição da toxoplasmose, foi tomado o número total de nascimentos ocorridos em um determinado ano como o número de gestantes por ano. RESULTADOS: A soropositividade para as mulheres em idade fértil foi 64,9% e 67,7% para os recém-nascidos. A idade média de aquisição da toxoplasmose nesta comunidade foi 10,74 anos e a estimativa da meia-vida dos anticorpos de origem materna nestas crianças foi 2,32 meses. A estimativa anual da incidência de toxoplasmose congênita variou de 9,5 a 10,6 por 1000 nascimentos, no período de estudo. CONCLUSÕES: A soroprevalência da toxoplasmose permitiu estimar a incidência de toxoplasmose congênita na Região Metropolitana de São Paulo, usando modelagem matemática que pode fornecer estimativas coerentes sobre a magnitude do problema / INTRODUCTION: Toxoplasmosis is an infection that occurs worldwide, but has its incidence higher in tropical areas. It is a common infection in Central and South America, especially in places of moderate climate, but too associated with poor socioeconomic conditions and hygiene. It has a significant impact from the public health perspective, mainly due to the risk of disease transmission through pregnancy. Congenital infection still occurs, despite the availability of diagnostic examinations and widespread therapy in pregnant women. It is the result, in most cases, of primary infection of a pregnant woman. OBJECTIVES: Our purpose is to estimate annual incidence of toxoplasmosis in births occurred in Sao Paulo Metropolitan Region from 1984 to 2006, using seroprevalence data of a representative population sample, through mathematical modelling. METHODS: Retrospective anti-toxoplasma serology analysis from Caieiras City, Sao Paulo Metropolitan Region, in 1990, was conducted in order to fit age-dependent continuous seroprevalence function. It was used 250 sera samples to analyze seroprevalence in ages from 1 to 40 years and 199 sera samples to discuss the seroprevalence in children from 0 to 15 months and the decay of maternal antibodies. As well it was studied strength of infection and the average age of acquisition of the first infection. The increase in proportion of immune individuals at each age interval was used to calculate the proportion of new infections. To estimate risk to acquire toxoplasmosis, it was taken the total number of deliveries in a given year as the number of pregnant women per year. RESULTS: The seropositivity for women of childbearing age was 64.9% and for newborns 67.7%.The average age of acquisition of toxoplasmosis in this community was 10.74 years and estimate for the half-life of maternal antibodies in children was 2.32 months. The estimated annual incidence of congenital toxoplasmosis varied from 9.5 to 10.6 per 1000 births in the period of study. CONCLUSIONS: Toxoplasmosis seroprevalence model allowed a good estimation of the incidence of congenital disease in Sao Paulo Metropolitan Region

Resumo: Considerando a grande importância da toxoplasmose animal sobretudo em decorrência dos animais infectados servirem de fonte direta ou indireta de infecção ao homem, avaliou-se a freqüência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em bovinos leiteiros, complementando o estudo com amostras colhidas de caninos e humanos de convívio rural. Foram colhidas amostras de sangue de 200 fêmeas leiteiras bovinas, 61 cães e 116 humanos, pertencentes a 50 propriedades da região sudoeste do Estado do Mato Grosso. Os soros foram submetidos à reação de imunoflorescência indireta (IgG-RIFI), utilizando-se comomponto de corte as duluições de 1:64, 1:40 e 1:40 para bovinos, cães e humanos, respectivamente. Anticorpos para T. gondii foram encontrados em 71,00% dos bovinos (n=1420); 88,52% dos cães (n=54) e 97,41% dos humanos (n=113). As amostras de humanos também foram avaliadas para IgM, que mostrou 33,62% de soropositividade. Após essa triagem sorológica, as amostras positivas exceto de humanos, foram processadas até obtenção de título final. A associação dos riscos relacionados à toxoplasmose (IgG)como, consumo de leite cru, produção de derivados de origem animal, abate de animais e contato com felinos e/ou ouros animais, não influenciou na distribuição dos sororreagentes (P>=0,05). Contudo, em relação à presença de IgM detectou-se associação entre soropositividade e o abate de animais para o consumo próprio (P<=0,05). Os resultados demonstraram a elevada prevalência da infecção toxoplasmática na população estudada e o alto risco da carne como via de transmissão para o homem, quando manipulada ou ingerida crua ou mal cozida. / Abstract: To determine the prevalence of anti-Toxoplasma gondii antibodies, 200 samples of blood serum from female dairy cattle belonging to 50 farms in the southwest of the state of Mato Grosso were analyzed by indirect immunofluorescent antibody test (IFAT>=40) for anti-T. Gondii. From these, 1420 (71,00%) of the cattle serum, 54 (88,52%) of the dog serum and 113 (97,41%) of the serum human were positive for the infection, at a diluition of 1:64 or more for cattle, 1:40 or more for dog and 1:40 for human. The samples human were also evaluated for IgM, wich showed 33,62% of seropositivity. No significant differences were observed to infection toxoplasmic (IgG) in terms consuption of raw milk, produce derivaties of animal origin, slaughtering of animals and contact with felines or other animals. However, for IgM was determined association between seropositivity and the slaughter of animals for personal consumption. Infection toxoplasmic has a high prevalence on the studied population. The results suggest that the handle or eat raw/rare cooked meat may be importants ways of transmiting toxoplasmosis to humans in this region. / Orientador: Gilson Pereira de Oliveira / Coorientador: Gilson Hélio Toniollo / Coorientador: Alvimar José da Costa / Banca: Katia Denise Saraiva Bresciani / Banca: Rosangela Zacarias Machado / Coorientador: Alvimar, José da Costa / Mestre

As zoonoses urbanas, doenças que afetam muitos indivíduos em países tropicais, especialmente crianças, são infecções que podem ser adquiridas pelo homem através do contato com animais de estimação, pela ingestão de carne ou água contaminada. Para sua prevenção, é fundamental a educação para medidas de higiene e profilaxia com relação ao manuseio dos alimentos, animais de estimação e higiene pessoal. Isto poderia ser feito através de ensino intensivo, ministrado por profissionais treinados durante o primeiro ciclo do Ensino Fundamental. No presente trabalho, estudamos este tipo de ensino e a prevalência destas doenças, usando a toxoplasmose como modelo, em 164 alunos do primeiro ciclo do ensino fundamental da Escola Estadual Antonio de Pádua Vieira, com coleta de saliva. Foi desenvolvido ELISA de alta sensibilidade em saliva concentrada por etanol. Após 12 (doze) meses, a fixação do conteúdo foi avaliada por questionário. Havia uma prevalência de 50% de contato com Toxoplasma gondii nessa população, mostrando a relevância do problema. As crianças sob intervenção mostraram fixação do conhecimento, para ambas as fontes principais de contaminação mostrando a importância da intervenção, em comparação com crianças sem intervenção. As crianças sem toxoplasmose mostraram uma melhor eficiência na fixação da informação. Nossos dados sugerem que intervenções curtas têm um grande efeito de fixação de informações em escolares e que a saliva pode ser um material para a detecção de contato com a toxoplasmose. / Urban zoonoses affect large proportion of the population in tropical countries, specially school children. Those infections could be acquired by contact with pets, or ingestion of water or meat contaminated by agents. Education in preventive hygiene measures, as adequate cleaning and cooking are essential in this age group. Intensive teaching during short interventions by trained personal could be effective. Here, we study this type of educational intervention, using toxoplasmosis as a model, in 164 school children in the first years of elementary grades in a public São Paulo school, E.E.P.G. Antonio de Pádua Vieira, with saliva sampling. We had standardize a specific anti T. gondii IgG assay in etanol concentrade saliva. After 12 months, the knowledge of this population was tested by questionnaire. There are a 50% prevalence of contact with T.gondii during the intervention, showing the importance of zoonosis in this group. After one year, most children who assisted the intervention recalled correctly the main transmission ways of the zoonosis, showing fixation by short intervention, as compared to non-intervened shoolchildren of the same age group. Children who had no contact with T.gondii show higher recall proportion. Our data suggest that shorts interventions are effective in the knowledge fixation in schoolchildren and that saliva, a non invasive sampling, could be an alternative material for detection of contact with toxoplasmosis.

Toxoplasma gondii é o agente etiológico da toxoplasmose, podendo causar diferentes formas da doença, entre elas, a toxoplasmose congênita cuja frequência varia significativamente de acordo com o país estudado. Na França, foi estimada em 1-3 casos/1.000 nativivos, enquanto nos EUA cerca de 1/10.000, porém não existem estimativas da prevalência de infecção congênita no Brasil. Toxoplasma gondii possui três linhagens clonais conhecidas como genótipos I, II e III que se relacionam aos três tipos descritos de acordo com a classificação da patogenicidade do parasita em camundongos, estando os três tipos associados a infecções humanas de maior patogenicidade, menor patogenicidade e patogenicidade intermediária, respectivamente. Os três genótipos já foram identificados na América do Norte e Europa, sendo o genótipo II predominante em infecções congênitas. O presente estudo teve como objetivo determinar a freqüência dos genótipos I, II e III de T. gondii em 85 amostras de líquido amniótico de gestantes brasileiras com toxoplasmose confirmada e adquirida durante a gestação, todas oriundas de São Paulo. Para tal, foi utilizada a técnica de multiplexnested- PCR-RFLP com amplificação simultânea de quatro fragmentos pertencentes a três genes do parasita: 3-SAG2, 5-SAG2, SAG3 e GRA6 Das 85 amostras iniciais, 76 foram positivas pelo sistema de multiplexnested- PCR (92,7%), tendo sido possível analisar o maior número de amostras no sistema que amplifica a região do gene SAG3 (69,7%), seguido do sistema 3-SAG2 (44,7%), do sistema 5-SAG2 (40,8%), e finalmente do sistema GRA6 (25%). Nas 76 amostras submetidas à genotipagem foram encontrados: 1,3% (1 amostra) do genótipo I; 71,1% (54 amostras) do genótipo II; 6,6% (5 amostras) do genótipo III; e 21% (16 amostras) para as quais não foi possível definir o genótipo parasitário após clivagem enzimática, tendo sido as mesmas submetidas ao sequenciamento. Das 16 amostras, duas não puderam seqüenciadas por falta de DNA remanescente e das 14 analisadas: duas foram definidas como tipo III, apresentando 100% de homologia com o protótipo VEG, e duas foram definidas como tipo II apresentando 100% de homologia com o protótipo ME49. Em 10 amostras foram observadas misturas de duas ou mais bases, em uma ou mais posições nucleotídicas da sequência de DNA do fragmento amplificado, sendo identificadas como recombinantes. Além disso, seis amostras identificadas pela técnica de multiplex-nested-PCR-RFLP como tipo II foram selecionadas aleatoriamente para a confirmação dos resultados e, em quatro das seis amostras, foi observada mistura de bases em outras posições nucleotídicas do fragmento amplificado, regiões estas não analisadas pela RFLP. A técnica de multiplex-nested-PCR seguida de RFLP mostrou-se útil, porém apresenta limitações no que se refere à genotipagem de amostras de líquido amniótico, uma vez que, após sequenciamento, foram reveladas várias recombinações genéticas nos fragmentos amplificados que haviam sido previamente identificados como tipo II. Sendo assim, sugerimos que, a genotipagem de T. gondii, diretamente de amostras biológicas ou após isolamento do parasita deva ser realizada pela amplificação de múltiplos genes de T. gondii e sequenciamento de todos os fragmentos amplificados / Toxoplasma gondii is the etiologic agent of toxoplasmosis and may cause different forms of the disease, including congenital toxoplasmosis whose frequency varies significantly according to the country. In France, it was estimated in 1-3 cases/1,000 live births, while in the U.S. it is 1/10.000. The prevalence of congenital infection in Brazil is unknown. Toxoplasma gondii has three clonal lineages known as genotypes I, II and III which are related to the three types described according to the pathogenicity in mice, associated with human infections of high pathogenicity, low pathogenicity and intermediate pathogenicity, respectively. The three genotypes have been identified in North America and Europe, and the genotype II is the predominant one in congenital infections. This study aimed at determining the frequency of genotypes I, II and III of T. gondii in 85 amniotic fluid samples from pregnant women living in Sao Paulo, Brazil who presented with seroconversion to Toxoplasma gondii during gestation. The multiplex-nested- PCR-RFLP was performed using four different markers: 3\'-SAG2, 5\'-SAG2, SAG3 and GRA6. Eighty-five samples were initially included, but only 76 were positive in the multiplex-nested-PCR (92.7%). It was possible to examine the larger number of samples by the SAG3 gene system (69.7%), followed by 3\'-SAG2 gene (44.7%), 5\'-SAG2 gene (40.8%), and finally GRA6 gene (25%). From the 76 samples that were genotyped by the multiplexnested- PCR-RFLP, 1.3% (1 sample) was genotype I; 71.1% (54 samples) were genotype II; 6,6% (5 samples) were genotype III, and 21% (16 samples) could not be identified by RFLP and were therefore sequenced. Sequencing analysis revealed: two genotype II samples, presenting with 100% of homology with the ME49 prototype, and two were genotype III showing 100% of homology with the VEG prototype. Ten samples presented with mixture of two or more nucleotide bases in one or more nucleotide positions of the total amplified DNA sequence, so they were classified as recombinant. In addition, six samples identified by the multiplex-nested-PCR-RFLP as type II were randomly selected to confirm the results, and in four of the six samples, we observed a mixture of nucleotide bases in positions that were not analyzed by the RFLP. The technique of multiplex-nested-PCR-RFLP has proved to be useful, however, it is limited when amniotic fluid samples genotyping is concerned because after sequencing, several genetic recombinations were evidenced in samples that had been previously identified as genotype II. Therefore, we suggest that the genotyping of T. gondii, directly from biological samples or after isolation of the parasite should be performed using different targets to amplify multiple T. gondii genes followed by sequencing of all amplified fragments

Submitted by Fabíola Silva (fabiola.silva@famerp.br) on 2016-10-03T18:10:48Z No. of bitstreams: 1 karinadeoliveirayounan_dissert.pdf: 994368 bytes, checksum: d0380b444a2b69e0b3248499e6a74c26 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-03T18:10:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 karinadeoliveirayounan_dissert.pdf: 994368 bytes, checksum: d0380b444a2b69e0b3248499e6a74c26 (MD5) Previous issue date: 2014-08-22 / Introduction: The parasite Toxoplasma gondii infects a high percentage of individuals worldwide and disturbances resulting from this infection contribute to the aggravations of health conditions and may affect the intellectual development of children and adults. It has been suggested that the D antigen (Rh0) a glycoprotein that is the biochemical basis Rh but is absent in the nervous tissue, influence the motor response in the presence of T. gondii infection. Objectives: This study aims to evaluate the motor response and the reaction time for visual stimulus in the presence and in the absence of infection by the parasite T. gondii in individuals with good visual acuity, Rh positive and Rh negative. Methods: 212 volunteers from both sexes underwent visual acuity testing and measurement of average response time to visual stimulus (ART) by using a specific software. The collected blood samples were used to identify the erythrocyte RH phenotypes (positive and negative) and antibodies of IgG class anti-T. gondii (presence or absence). Average response times were compared according to sex, presence (reagents) and absence (non-reagent) infection and erythrocyte Rh phenotypes (positive and negative). The t test for comparison of average and the values of Odds Ratio (OR) and 95% confidence interval were calculated using the GraphPad Instat (version 6.3) software. The p-value equal to or less than 0.05 was considered significant. Results: The differences between the average age of reagents individuals (n = 134) and non-reagent (n = 38) to T. gondii were considered statistically significant (54.1 ± 18.7 vs 34.4 ± 18.9; p = 0.0001). The Rh phenotype positive (n = 189) was present in 89% of individuals, while the Rh-negative (n = 23) in 11%. The ART of reagents individuals for T. gondii was lower in males (0.672 ± 0.303) than in females (0.819 ± 0.270) (p = 0.0036). This same difference was observed between the non-reagent (0.475 ± 0.140 vs 0.791 ± 0.323), respectively (p <0.0001). Infected men (0.658 ± 0.282) had higher ART xi than uninfected men (0.488 ± 0.129) for T. gondii, both Rh positive (p = 0.0004). Women, infected or not, did not differ for ART even when compared by phenotype (positive or negative) Rh. Conclusions: Rh positive men infected with T. gondii have a higher ART than uninfected Rh positive men. Infected women do not differ in ART compared to women uninfected by T. gondii. / Introdução: O parasito Toxoplasma gondii infecta elevado percentual de indivíduos em todo o mundo e os distúrbios resultantes da infecção contribuem para os agravos da saúde e podem acometer o desenvolvimento intelectual de crianças e adultos. Tem sido proposto que o antígeno D (Rh0), uma glicoproteína que constitui a base bioquímica sistema Rh mas que se encontra ausente no tecido nervoso, influencia a resposta motora na presença de infecção por T. gondii. Objetivos: O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta motora e o tempo de reação a estímulos visuais na presença e na ausência de infecção pelo parasito T.gondii em indivíduos com boa acuidade visual, Rh positivos e Rh negativos. Métodos: foram analisados 212 indivíduos voluntários, de ambos os sexos, submetidos a exame de acuidade visual e teste de medição de tempo médio de reação a estímulos visuais (TMR) com o uso de um software específico. As amostras de sangue coletadas foram utilizadas na identificação dos fenótipos eritrocitários Rh (positivo e negativo) e dos anticorpos da classe IgG, anti-T. gondii (presença ou ausência). Os tempos médios de reação foram comparados de acordo com o sexo, presença (reagentes) e ausência (não reagentes) de infecção e fenótipos eritrocitários Rh (positivo e negativo). O teste t para comparação das médias e os valores de Odds Ratio (OR) e do intervalo de confiança a 95% foram calculados com o uso do software GraphPad Instat (versão 3.06). O valor p igual ou menor que 0,05 foi considerado significante. Resultados: As diferenças entre as médias de idade de indivíduos reagentes (n=134) e não reagentes (n=78) ao T. gondii foram consideradas estatisticamente significante (54,1 ± 18,7 vs 34,4 ± 18,9; p=0,0001). O fenótipo Rh positivo (n=189) esteve presente em 89% dos indivíduos, enquanto o Rh negativo (n=23) em 11%. O TMR dos indivíduos reagentes para o T. gondii foi menor no sexo masculino (0.672 ± 0.303) que no feminino (0.819 ± 0.270) (p=0,0036). Esta mesma diferença foi observada entre os não reagentes (0.475 ± 0.140 vs 0.791 ± 0.323), respectivamente (p<0,0001). Homens infectados (0.658 ± 0.282) apresentam TMR maiores que homens não infectados (0.488 ± 0.129) por T. gondii, ambos Rh positivo (p=0,0004). Mulheres, infectadas ou não, não diferiram quanto ao TMR mesmo quando comparadas pelo fenótipo Rh (positivo ou negativo). Conclusões: Homens Rh positivos infectados por T. gondii apresentam TMR maior que homens Rh positivos não infectados. Mulheres infectadas não diferem quanto ao TMR em comparação a mulheres não infectadas por T. gondii.

Submitted by Carvalho Dias João Paulo (joao.dias@famerp.br) on 2018-04-09T14:42:14Z No. of bitstreams: 1 fernandohenriqueamurata_dissert.pdf: 1552059 bytes, checksum: 21664cbdf1320b051bb618047511b2eb (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-09T14:42:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fernandohenriqueamurata_dissert.pdf: 1552059 bytes, checksum: 21664cbdf1320b051bb618047511b2eb (MD5) Previous issue date: 2016-04-13 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP / Introduction: T. gondii infection is high in Brazil and could lead to the development of serious sequelae such as ocular and neurological injuries, especially when it occurs during pregnancy for the risk of congenital transmission, and in immunocompromised patients. Clinical diagnosis is often difficult because the majority of affected people do not develop symptoms, therefore the use of serological and molecular methods are essential to support the diagnosis. Thus the use of sensitive and specific tests for the diagnosis of this condition is necessary. Objectives: To investigate and characterize the infection by T. gondii in their serological and molecular aspects in the northwest region of São Paulo. Methods: Peripheral blood samples were collected from patients treated in the Outpatient Clinic of High Risk Pregnancy and Fetal Medicine, and Retinopathy to analyze the serological methods (ELISA and ELFA) and molecular (cnPCR, Nested PCR and qPCR). Amniotic fluid samples were collected from pregnant women with suspect toxoplasmosis to perform the cnPCR. The results were compared using the Kappa index and calculated the sensitivity (S), specificity (SP), positive predictive value (PPV) and negative (NPV). Results: For the group of pregnant women, serological tests showed good agreement when applied to the Kappa index, G1: IgG = 0.83, IgM = 1.0; G2: IgG = 1.0, IgM = 0.78. When compared to IgM class antibodies by ELISA and ELFA had S = 75.5%, E = 100.0%, PPV = 100.0%, NPV = 87.8% and S = 79.2%, and = 100.0%, PPV = 100.0%, NPV = 89.5%, respectively. When compared to IgG showed S = 100.0%, E = 46.8%, PPV = 51.5%, NPV = 100.0% and 100.0% S = E = 38.3%, PPV = 47 7% NPV = 100.0%, respectively, and molecular methods performed by PCRs cnPCR (JW62 / 63), nested PCR, cnPCR (B22 / 23) and qPCR showed 0.0% S = E = 100, 0%, PPV = 0.0%, NPV = 63.9%, S = 5.7%, E = 100.0%, PPV = 100.0%, NPV = 65.3%, S = 7.5 % E = 98.9%, PPV = 80.0%, NPV = 65.5% and S = 1.9%, E = 100.0%, PPV = 100.0%, NPV = 64.4%, respectively. For the group of patients treated in the Retinopathy Clinic, serological tests for detection of anti-T. gondii IgG antibodies showed good agreement when applied to the Kappa index, G1: IgG = 0.97, IgM = 0.49; G2: = 0.85 IgG, IgM = 0.74. When compared to IgM class antibodies by ELISA and ELFA had S = 6.1% and = 96.8%, PPV = 62.5%, NPV = 53.7% and S = 3.7%, and = 98.9%, PPV = 75.0%, NPV = 53.7% respectively. When compared to IgG showed S = 96.3%, E = 34.6%, PPV = 56.6%, NPV = 91.4% and S = 95.1%, E = 35.7%, PPV = 56 , 7%, NPV = 89.2%, respectively, and the molecular methods performed by PCRs cnPCR (JW62 / 63), Nested, cnPCR (B22 / 23) and qPCR showed S = 1.8% and = 99.5 %, PPV = 75.0%, NPV = 53.3%, S = 2.4%, and 99.5%, PPV = 80.0%, NPV = 53.5%, S = 6.1% E = 98.4%, PPV = 76.7%, NPV = 54.2% and S = 8.5% and = 98.4%, PPV = 82.3%, NPV = 54.8%, respectively. For the group of neonates of 50 samples tested, 45 (90.0%) were positive for IgG 1 (2.0%) for IgM, 3 (6.0%) for IgA and 13 (26.0%) in cnPCR. Conclusion: The commercial serological tests for identifying anti- T. gondii IgG and IgM antibodies by ELISA and ELFA showed concordant results, and the molecular conventional PCR tests (cnPCR), Nested PCR and real-time PCR (qPCR) were discordant. / Introdução: A infecção por T. gondii é elevada no Brasil, podendo levar ao desenvolvimento de sequelas graves como lesões oculares e neurológicas, principalmente quando ocorre durante a gestação com risco de transmissão congênita, e em pacientes imunocomprometidos. A maioria dos indivíduos acometidos não desenvolvem sintomas, tornando o diagnóstico clínico difícil, sendo assim necessária a utilização de testes que auxiliem no diagnóstico, como o uso dos métodos sorológicos e moleculares. Desta forma, é essencial a utilização de testes sensíveis e específicos para o correto diagnóstico da doença. Objetivos: Investigar e caracterizar a infecção por T. gondii em seus aspectos sorológicos e moleculares em pacientes da região noroeste do Estado de São Paulo. Casuística e métodos: Foram coletadas amostras de sangue periférico de gestantes, neonatos e pacientes com doenças oculares sugestivas e não sugestivas de toxoplasmose, atendidos nos Ambulatórios de Gestação de Alto Risco e Medicina Fetal, e Retinopatia para realização dos métodos sorológicos (ELISA e ELFA) e moleculares (cnPCR, Nested PCR e qPCR). Foram coletadas também amostras de líquido amniótico para realização da cnPCR das gestantes com suspeita clínica de toxoplasmose. Os resultados foram comparados pelo índice Kappa, e calculados os valores de sensibilidade (S), especificidade (E), valor preditivo positivo (VPP) e negativo (VPN). Resultados: Para o grupo de gestantes analisadas, os testes sorológicos apresentaram concordância quando aplicados ao Kappa, G1: IgG = 0,83, IgM = 1,0; G2: IgG = 1,0, IgM = 0,78 . Quando comparados a pesquisa de anticorpos da classe IgM por ELISA e ELFA apresentaram S=75,5%, E=100,0%, VPP=100,0%, VPN=87,8% e S=79,2%, E=100,0%, VPP=100,0%, VPN=89,5%, respectivamente. Quando comparados com IgG apresentaram S=100,0%, E=46,8%, VPP=51,5%, VPN=100,0% e S=100,0%, E=38,3%, VPP=47,7%, VPN=100,0%, respectivamente, e para os métodos moleculares realizados pelas PCRs cnPCR (JW62/63), Nested PCR, cnPCR (B22/23) e qPCR apresentaram S=0,0%, E=100,0%, VPP=0,0%, VPN=63,9%, S=5,7%, E=100,0%, VPP=100,0%, VPN=65,3%, S=7,5%, E=98,9%, VPP=80,0%, VPN=65,5% e S=1,9%, E=100,0%, VPP=100,0%, VPN=64,4%, respectivamente. Para o grupo de pacientes atendidos no ambulatório de Oftalmologia, os testes sorológicos para pesquisa de anticorpos anti-T.gondii da classe IgG apresentaram boa concordância quando aplicados ao índice Kappa, G1: IgG = 0,97, IgM = 0,49; G2: IgG = 0,85, IgM = 0,74. Quando comparados à pesquisa de anticorpos da classe IgM por ELISA e ELFA, apresentaram S=6,1%, E=96,8%, VPP=62,5%, VPN=53,7% e S=3,7%, E=98,9%, VPP=75,0%, VPN=53,7%, respectivamente. Quando comparados com IgG apresentaram S=96,3%, E=34,6%, VPP=56,6%, VPN=91,4% e S=95,1%, E=35,7%, VPP=56,7%, VPN=89,2%, respectivamente, e para os métodos moleculares realizados pelas PCRs cnPCR (JW62/63), Nested, cnPCR (B22/23) e qPCR, apresentaram S=1,8%, E=99,5%, VPP=75,0%, VPN=53,3%, S=2,4%, E=99,5%, VPP=80,0%, VPN=53,5%, S=6,1%, E=98,4%, VPP=76,7%, VPN=54,2% e S=8,5%, E=98,4%, VPP=82,3%, VPN=54,8%, respectivamente. Para o grupo de neonatos, das 50 amostras analisadas, 45 (90,0%) foram positivas para IgG, 1 (2,0%) para IgM, 3 (6,0%) para IgA e 13 (26,0%) no cnPCR. Conclusão: Os testes sorológicos comerciais na identificação de anticorpos anti-T.gondii das classes IgG e IgM por ELISA e ELFA apresentaram resultados concordantes, e os testes moleculares PCR convencional (cnPCR), PCR Nested e PCR em tempo real (qPCR) apresentaram resultados discordantes.

INTRODUÇÃO: A toxoplasmose é uma infecção que ocorre em todo o mundo, mas tem a sua maior incidência em áreas tropicais. Trata-se de uma infecção comum na América Central e do Sul, especialmente em locais de clima moderado, mas também está associada a condições socioeconômicas e de má higiene. Apresenta um impacto significativo na Saúde pública, principalmente em decorrência do risco de transmissão vertical da doença para o feto. A infecção congênita ainda ocorre apesar da disponibilidade de exames para o diagnóstico e da terapêutica na gestante. Resulta, na maioria dos casos, da aquisição da infecção primária na gestação. OBJETIVOS: O objetivo deste estudo foi estimar a incidência anual da toxoplasmose congênita nos nascimentos ocorridos na Região Metropolitana de São Paulo, no período de 1984 a 2006, usando dados de soroprevalência de uma amostra representativa desta população, através da modelação matemática. MÉTODOS: Uma análise sorológica retrospectiva anti-toxoplasma da cidade de Caieiras, Região Metropolitana de São Paulo, em 1990, foi realizada para analisar a função de soroprevalência dependente da idade. Foram utilizadas 250 amostras de soros para análise de soroprevalência em idades de 1 a 40 anos e 199 soros amostras para a soroprevalência em crianças de 0 a 15 meses, e decaimento dos anticorpos de origem materna. Além disso, avaliou-se a força de infecção e a média de idade de aquisição da primeira infecção. O aumento na proporção de indivíduos imunes a cada intervalo de idade foi usado para calcular a proporção de novas infecções. Para a avaliação dos riscos de aquisição da toxoplasmose, foi tomado o número total de nascimentos ocorridos em um determinado ano como o número de gestantes por ano. RESULTADOS: A soropositividade para as mulheres em idade fértil foi 64,9% e 67,7% para os recém-nascidos. A idade média de aquisição da toxoplasmose nesta comunidade foi 10,74 anos e a estimativa da meia-vida dos anticorpos de origem materna nestas crianças foi 2,32 meses. A estimativa anual da incidência de toxoplasmose congênita variou de 9,5 a 10,6 por 1000 nascimentos, no período de estudo. CONCLUSÕES: A soroprevalência da toxoplasmose permitiu estimar a incidência de toxoplasmose congênita na Região Metropolitana de São Paulo, usando modelagem matemática que pode fornecer estimativas coerentes sobre a magnitude do problema / INTRODUCTION: Toxoplasmosis is an infection that occurs worldwide, but has its incidence higher in tropical areas. It is a common infection in Central and South America, especially in places of moderate climate, but too associated with poor socioeconomic conditions and hygiene. It has a significant impact from the public health perspective, mainly due to the risk of disease transmission through pregnancy. Congenital infection still occurs, despite the availability of diagnostic examinations and widespread therapy in pregnant women. It is the result, in most cases, of primary infection of a pregnant woman. OBJECTIVES: Our purpose is to estimate annual incidence of toxoplasmosis in births occurred in Sao Paulo Metropolitan Region from 1984 to 2006, using seroprevalence data of a representative population sample, through mathematical modelling. METHODS: Retrospective anti-toxoplasma serology analysis from Caieiras City, Sao Paulo Metropolitan Region, in 1990, was conducted in order to fit age-dependent continuous seroprevalence function. It was used 250 sera samples to analyze seroprevalence in ages from 1 to 40 years and 199 sera samples to discuss the seroprevalence in children from 0 to 15 months and the decay of maternal antibodies. As well it was studied strength of infection and the average age of acquisition of the first infection. The increase in proportion of immune individuals at each age interval was used to calculate the proportion of new infections. To estimate risk to acquire toxoplasmosis, it was taken the total number of deliveries in a given year as the number of pregnant women per year. RESULTS: The seropositivity for women of childbearing age was 64.9% and for newborns 67.7%.The average age of acquisition of toxoplasmosis in this community was 10.74 years and estimate for the half-life of maternal antibodies in children was 2.32 months. The estimated annual incidence of congenital toxoplasmosis varied from 9.5 to 10.6 per 1000 births in the period of study. CONCLUSIONS: Toxoplasmosis seroprevalence model allowed a good estimation of the incidence of congenital disease in Sao Paulo Metropolitan Region

Toxoplasma gondii é o agente etiológico da toxoplasmose, podendo causar diferentes formas da doença, entre elas, a toxoplasmose congênita cuja frequência varia significativamente de acordo com o país estudado. Na França, foi estimada em 1-3 casos/1.000 nativivos, enquanto nos EUA cerca de 1/10.000, porém não existem estimativas da prevalência de infecção congênita no Brasil. Toxoplasma gondii possui três linhagens clonais conhecidas como genótipos I, II e III que se relacionam aos três tipos descritos de acordo com a classificação da patogenicidade do parasita em camundongos, estando os três tipos associados a infecções humanas de maior patogenicidade, menor patogenicidade e patogenicidade intermediária, respectivamente. Os três genótipos já foram identificados na América do Norte e Europa, sendo o genótipo II predominante em infecções congênitas. O presente estudo teve como objetivo determinar a freqüência dos genótipos I, II e III de T. gondii em 85 amostras de líquido amniótico de gestantes brasileiras com toxoplasmose confirmada e adquirida durante a gestação, todas oriundas de São Paulo. Para tal, foi utilizada a técnica de multiplexnested- PCR-RFLP com amplificação simultânea de quatro fragmentos pertencentes a três genes do parasita: 3-SAG2, 5-SAG2, SAG3 e GRA6 Das 85 amostras iniciais, 76 foram positivas pelo sistema de multiplexnested- PCR (92,7%), tendo sido possível analisar o maior número de amostras no sistema que amplifica a região do gene SAG3 (69,7%), seguido do sistema 3-SAG2 (44,7%), do sistema 5-SAG2 (40,8%), e finalmente do sistema GRA6 (25%). Nas 76 amostras submetidas à genotipagem foram encontrados: 1,3% (1 amostra) do genótipo I; 71,1% (54 amostras) do genótipo II; 6,6% (5 amostras) do genótipo III; e 21% (16 amostras) para as quais não foi possível definir o genótipo parasitário após clivagem enzimática, tendo sido as mesmas submetidas ao sequenciamento. Das 16 amostras, duas não puderam seqüenciadas por falta de DNA remanescente e das 14 analisadas: duas foram definidas como tipo III, apresentando 100% de homologia com o protótipo VEG, e duas foram definidas como tipo II apresentando 100% de homologia com o protótipo ME49. Em 10 amostras foram observadas misturas de duas ou mais bases, em uma ou mais posições nucleotídicas da sequência de DNA do fragmento amplificado, sendo identificadas como recombinantes. Além disso, seis amostras identificadas pela técnica de multiplex-nested-PCR-RFLP como tipo II foram selecionadas aleatoriamente para a confirmação dos resultados e, em quatro das seis amostras, foi observada mistura de bases em outras posições nucleotídicas do fragmento amplificado, regiões estas não analisadas pela RFLP. A técnica de multiplex-nested-PCR seguida de RFLP mostrou-se útil, porém apresenta limitações no que se refere à genotipagem de amostras de líquido amniótico, uma vez que, após sequenciamento, foram reveladas várias recombinações genéticas nos fragmentos amplificados que haviam sido previamente identificados como tipo II. Sendo assim, sugerimos que, a genotipagem de T. gondii, diretamente de amostras biológicas ou após isolamento do parasita deva ser realizada pela amplificação de múltiplos genes de T. gondii e sequenciamento de todos os fragmentos amplificados / Toxoplasma gondii is the etiologic agent of toxoplasmosis and may cause different forms of the disease, including congenital toxoplasmosis whose frequency varies significantly according to the country. In France, it was estimated in 1-3 cases/1,000 live births, while in the U.S. it is 1/10.000. The prevalence of congenital infection in Brazil is unknown. Toxoplasma gondii has three clonal lineages known as genotypes I, II and III which are related to the three types described according to the pathogenicity in mice, associated with human infections of high pathogenicity, low pathogenicity and intermediate pathogenicity, respectively. The three genotypes have been identified in North America and Europe, and the genotype II is the predominant one in congenital infections. This study aimed at determining the frequency of genotypes I, II and III of T. gondii in 85 amniotic fluid samples from pregnant women living in Sao Paulo, Brazil who presented with seroconversion to Toxoplasma gondii during gestation. The multiplex-nested- PCR-RFLP was performed using four different markers: 3\'-SAG2, 5\'-SAG2, SAG3 and GRA6. Eighty-five samples were initially included, but only 76 were positive in the multiplex-nested-PCR (92.7%). It was possible to examine the larger number of samples by the SAG3 gene system (69.7%), followed by 3\'-SAG2 gene (44.7%), 5\'-SAG2 gene (40.8%), and finally GRA6 gene (25%). From the 76 samples that were genotyped by the multiplexnested- PCR-RFLP, 1.3% (1 sample) was genotype I; 71.1% (54 samples) were genotype II; 6,6% (5 samples) were genotype III, and 21% (16 samples) could not be identified by RFLP and were therefore sequenced. Sequencing analysis revealed: two genotype II samples, presenting with 100% of homology with the ME49 prototype, and two were genotype III showing 100% of homology with the VEG prototype. Ten samples presented with mixture of two or more nucleotide bases in one or more nucleotide positions of the total amplified DNA sequence, so they were classified as recombinant. In addition, six samples identified by the multiplex-nested-PCR-RFLP as type II were randomly selected to confirm the results, and in four of the six samples, we observed a mixture of nucleotide bases in positions that were not analyzed by the RFLP. The technique of multiplex-nested-PCR-RFLP has proved to be useful, however, it is limited when amniotic fluid samples genotyping is concerned because after sequencing, several genetic recombinations were evidenced in samples that had been previously identified as genotype II. Therefore, we suggest that the genotyping of T. gondii, directly from biological samples or after isolation of the parasite should be performed using different targets to amplify multiple T. gondii genes followed by sequencing of all amplified fragments

Poucos estudos quantificam o risco relativo da saúde humana na transmissão spillover de doenças zoonóticas de populações de animais silvestres, estudos cruciais na compreensão da história natural das zoonoses. Coccídios, em particular os da família Sarcocystidae, são importantes agentes transmissíveis na interface homens - animais domésticos e silvestres. O diagnóstico da coccidiose é prejudicado pela limitada disponibilidade de amostras resultantes de populações animais de espécies em risco de extinção. O objetivo deste estudo foi detectar através da amplificação do locus ITS-1, protozoários das subfamílias Sarcocystinae e Toxoplasmatinae em amostras teciduais de Puma yagouaroundi, Leopardus geoffroyi, L. tigrinus, L. wiedii, L. colocolo e L. pardalis, depositados em coleções biológicas do Rio Grande do Sul, Brasil. Um objetivo adicional foi a obtenção de informações que permitissem avaliar o papel epidemiológico dos protozoários no ciclo silvestre dos parasitas e seu possível impacto sobre as populações de animais silvestres e na saúde pública. Noventa pequenos felídeos neotropicais de vida livre, representando seis espécies, foram amostrados. Destes, 31 felídeos (34,4%), de todas as seis espécies, foram positivos para Toxoplasma gondii e DNA foi detectado em 63 das 433 (14,6%) amostras de tecidos primários coletados a partir de língua (28,6%), cérebro (18,6%), músculo esquelético (17,1%), musculatura ocular (13,6%), globo ocular (13,6%), coração (11,1%), diafragma (5,4%) e humor vítreo (4,5%). Doze amostras primárias positivas ao T. gondii foram genotipadas com os marcadores moleculares SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22- 8, c29-2, L358, PK1, Apico e CS3 e a técnica multilocus PCR-RFLP, a amostra Py#36m foi totalmente caracterizada como do tipo I com alelo II no BTUB e um novo genótipo atípico Py#21M, ambos isolados de Puma yagouaroundi e nunca descrito no Brasil. Nove outras amostras tiveram caracterização parcial. Treze dos 90 felídeos foram positivos para Sarcocystis spp. (14,4%) e outros 18 felídeos, representando cinco espécies albergaram S. felis-like [Py (#75m, #83m, #35m, #20li, #55li), Lg (#80m, #70m, #88m, #71li, #67mOi), Lt (#19m, #48m, #89m, #84m), Lw (#12, #73d) e Lc (#82m, #76m)]. Um único felino de L. pardalis foi negativo. DNA do parasita foi detectado em 11,8% dos tecidos examinados (51/433): musculatura esquelética (26,5%), língua (23,2%), musculatura ocular (13,6%), diafragma (10,7%), cérebro (2,3%), coração (1,6%) e globo ocular (4,5%), nenhuma das 44 amostras de humor vítreo foi positiva. Esta é a primeira detecção e caracterização genética de T. gondii e de S. felislike em felídeos silvestres brasileiros de vida livre, demonstrando a presença destes agentes no ciclo silvestre e, a potencial transmissibilidade ao homem e a outros animais domésticos e silvestres. O uso de amostras de tecidos de animais silvestres depositados em coleções biológicas para estudos epidemiológicos de doenças monstraram serem de grande utilidade. / Few studies have quantified the relative risk of human health from spillover of zoonotic diseases from populations of wild animals; these studies are crucial for understanding the natural history of zoonoses. Coccidia, particularly from the family Sarcocystidae, are important transmissible agents at the interface of man and domestic and wild animals. The diagnosis of Coccidiosis is hampered by the limited availability of samples resulting from protection of natural populations of the species at risk of extinction. The aim of this study was to detected, by amplification of ITS-1 locus, protozoa from the subfamilies Sarcocystinae and Toxoplasmatinae in tissue samples from Puma yagouaroundi, Leopardus geoffroyi, L. tigrinus, L. wiedii, L. colocolo and L. pardalis, deposited in biological collections of the State of Rio Grande do Sul, Brazil. An additional aim was to obtain information that would enable assessment of the epidemiological role of the protozoa in the sylvatic cycle of the parasite, and its possible impact on wildlife populations and public health. Ninety free-living small wild felines, representing 6 species, were sampled. Of these, 31 felids (34.4%) of all six species were positive for T. gondii and DNA was detected in 63 of 433 (14.6%) primary tissue samples collected from the tongue (28.6%), brain (18.6%), skeletal muscle (17.1%), ocular muscles (13.6%), eye (13.6%), heart (11.1%), diaphragm (5.4%) and vitreous humor (4.5%). Twelve primary samples positive for T. gondii were genotyped with molecular markers SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, and apical CS3. Using the multilocus PCR-RFLP technique, sample Py#36m was fully genotyped as Type I with allele II in locus BTUB, and a new atypical Py#21M, both isolates from Puma yagouaroundi and never described in Brazil. Nine other samples had a partial characterization. Thirteen of the 90 felids were positive for Sarcocystis spp. (14.4%) and another 18 felids, representing 5 species, harbored S. felis-like organisms [Py (#75m, #83m, #35m, #20li, #55li), Lg (#80m, #70m, #88m, #71li, #67mOi), Lt (#19m, #48m, #89m, #84m), Lw (#12, #73d) and Lc (#82m, #76m)]. A single felid of L. pardalis was negative. Parasite DNA was detected in 11.8% (51/433) of the tissues examined: muscle skeletal (26.5%), tongue (23.2%), ocular muscles (13.6%), diaphragm (10.7 %), brain (2.3%), heart (1.6%) and eye (4.5%); none of the 44 samples of vitreous humor was positive. This is the first description of the detection and genetic characterization of T. gondii and S. felis-like in free-living Brazilians wild felids, demonstrating the presence of these agents in the sylvatic cycle, and the potential transmition to humans and other domestic and wild animals. The use of tissue samples from wild animals deposited in biological collections for epidemiological studies of diseases demonstrated to be of great utility.

Les molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité de classe I (CMH I) contrôlent la plasticité synaptique dans le système nerveux central (SNC) et plusieurs travaux expérimentaux suggèrent des interactions antigène-dépendantes entre des neurones infectés par des virus et les lymphocytes T CD8. Cependant, le rôle de la présentation des antigènes par le CMH I des neurones sur la physiopathologie de l'infection par Toxoplasma gondii (T. gondii) n'a pas encore été clarifié. Après la dissémination aigue sous forme de tachyzoites, T. gondii se convertit en bradyzoites, forme persistante dans les neurones du SNC. Chez les individus immunocompétents, la toxoplasmose latente est associée à des variations des fonctions cognitives ainsi qu'à des pathologies neuropsychiatriques. Les sujets dont le système immunitaire est dysfonctionnel peuvent développer une encéphalite létale causée par T. gondii, qui est caractérisée par une réplication du parasite, une infiltration massive et des agrégats leucocytaires et l'activation des cellules gliales. Les lymphocytes T (LT) CD8 et le CMH I sont des facteurs-clés contrôlant la résistance à l'encéphalite. Utiliser les LT CD8 pour éliminer les kystes chez des sujets à risque est une piste thérapeutique intéressante en raison de l'absence d'approches pharmacologiques ciblant les bradyzoites. A ce jour, les mécanismes et la pertinence fonctionnelle de la présentation des antigènes dérivés de T. gondii par les neurones restent à déterminer, ainsi que la contribution des différents stades parasitaires au contrôle de l'infection. L'utilisation de nouveaux parasites exprimant un antigène immunodominant uniquement au stade tachyzoite a permis de montrer que la reconnaissance par les LT CD8 d'antigènes issus des tachyzoites est suffisante pour une protection efficace contre l'encéphalite.[...] / In the Central Nervous System (CNS), Major Histocompatibility Complex class I (MHC I) molecules regulate synaptic plasticity and evidence suggests antigen-specific interactions between virus-infected neurons and CD8 T cells. Yet, little is known about the impact of neuronal MHC I presentation on the pathophysiology of infection by the neurotropic Toxoplasma gondii (T. gondii) parasite. Following acute dissemination as tachyzoites, T. gondii converts into bradyzoites that persist inside cysts within neurons of the CNS. In immunocompetent hosts, latent toxoplasmosis is associated with cognitive changes and neuropsychiatric disorders. Hosts with sub-optimal immune responses may develop a lethal T. gondii Encephalitis (TE), characterized by parasite replication, granuloma-like structures with massive immune cell influx and glial cell activation. CD8 T cells and MHC I are key determinants of TE resistance. Harnessing CD8 T cells in at-risk individuals may turn helpful in the future as we are currently lacking an effective pharmacological approach to eradicate bradyzoites. Yet the mechanisms and functional relevance of neuronal MHC I presentation of T. gondii remain unexplored, as well as which stage of the parasite contributes to efficient control of the infection. Using new T. gondii parasites with restricted expression of the immunodominant antigen at the tachyzoite stage, this work showed that CD8 T cell recognition of tachyzoite antigens at early stages of brain invasion is enough to protect from TE. Interestingly, by comparing situations of toxoplasmosis with varying TE severity and by pioneering antigen presentation assays with T. gondii-infected primary neurons, we revealed that TE susceptibility may be underlied by sub-optimal MHC I presentation of tachyzoites antigens by neurons. At last, we describe a mouse model that allows conditional deletion of a MHC I allele that is essential for TE resistance (H-2Ld). [...]