Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-15T13:19:44Z No. of bitstreams: 2 Dissertacao Manasses_vFinal_posBanca.pdf: 1881133 bytes, checksum: af2bbe291155bec9db92c52ab52f2f43 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T13:19:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao Manasses_vFinal_posBanca.pdf: 1881133 bytes, checksum: af2bbe291155bec9db92c52ab52f2f43 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / CNPq; FINEP; CAPES / O presente trabalho, pioneiro em abordar especificamente o tema aquaporinas em transcriptomas de cana-de-açúcar, permitiu detectar representantes das quatro subfamílias de aquaporinas descritas em vegetais superiores (PIP, TIP, SIP e NIP), apresentando 43 isoformas distintas, oriundas de quatro bibliotecas SuperSAGE de raízes de genótipos tolerantes e sensíveis à seca. As subfamílias de aquaporinas com maiores níveis de transcritos em cana-de-açúcar foram PIP e TIP. Já as subfamílias SIP e NIP, além de menos abundantes, foram também menos responsivas ao estresse de supressão de rega (24 h). Ao menos 10 potenciais alvos distintos de isoformas de aquaporinas e suas respectivas unitags foram considerados promissores para estudos futuros, com potencial para desenvolvimento de marcadores moleculares para uso no melhoramento genético. Desses, quatro mostraram respostas exclusivas e diferencialmente significativas e divergentes entre os bulks de genótipos tolerantes e sensíveis quando comparado nas condições de estresse e controle. Tomando por base a expressão dessas isoformas nos genótipos tolerantes, a maioria foi reprimida sob estresse (SoPIP2-4, SoPIP2-6, OsPIP2-4), com exceção da SsPIP1-1 (induzida). Foi também proposto um protocolo para validar a expressão das unitags via RTqPCR, bem como pares de primers (5) funcionais como genes de referência, além de dois outros propostos para aquaporinas, tendo-se validado os dados de SuperSAGE para os alvos SsPIP1-1 e SoPIP1-3/PIP1-4, com genótipos pertencentes aos bulks tolerante ou sensível ao estresse.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo64_1.pdf: 5203988 bytes, checksum: 2716f553a36cd79192020095b593be96 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Danos provocados por estresses bióticos e/ou abióticos são fatores limitantes na produção do feijão-caupi (Vigna unguiculata), favorecendo a redução no crescimento e na produtividade desta cultura. Uma alternativa a estes fatores limitantes é o uso de cultivares com características genéticas competitivas e eficientes contribuindo para alcançar um padrão de agricultura mais sustentável e com melhores condições de produção. Assim, pesquisas que possibilitem compreender funções específicas de genes preditos de plantas e seus perfis de expressão em resposta a uma dada condição, são de extrema importância. Com base nisso, uma das metas do projeto NordEST (http://www.vigna.ufpe.br) consistiu na análise funcional de genes de feijão-caupi associados a estes tipos de estresses. Neste âmbito, o presente trabalho teve como objetivo analisar o perfil de expressão diferencial de genes através da técnica de SuperSAGE a partir de transcritos de folhas de feijão-caupi submetidas a injúria mecânica (biblioteca C2) e ao estresse causado pelo vírus do mosaico severo do feijãocaupi (CPSMV) (biblioteca BRM), com o intuito de obter um melhor entendimento com relação à resposta específica a este tipo de estresse, comparativamente a um controle negativo (ausência de injúria; biblioteca C1). As tags que apresentaram 100% de identidade com sequências de EST do banco privado de Vigna (banco NordEST), foram analisadas quanto à sua expressão diferencial e os transcritos que tiveram seus genes superexpressados e/ou reprimidos, dentro dos parâmetros requeridos (escore ≥42) foram anotados em categorias funcionais, de acordo com os termos de ontologia gênica (Gene Ontology) relativos a processos biológicos, função molecular e componente celular. Os resultados demonstraram que muitas sequências, tanto das bibliotecas submetidas à injúria, quanto as bibliotecas inoculadas com CPSMV estão relacionadas à categorias associadas a estresse, seguido de categorias relacionadas ao processos de tradução, ligação de proteínas, regulação da transcrição, redução de oxidação, transporte, proteólise, entre outros. Estas categorias estão relacionadas a rotas metabólicas importantes na resposta a estresses bióticos, indicando que estas tags representam um potencial real para descobertas de novos genes responsivos à injúria ou à resistência ao CPSMV, talvez ainda não descritos e/ou caracterizados

As quinases dependentes de ciclinas são proteínas que podem ser divididas de acordo com a sua atuação no ciclo celular ou no controle transcricional, elas se tornam ativas em determinadas etapas do ciclo celular dependendo do seu grau de fosforilação e de sua ligação com ciclinas e proteínas inibitórias, e exercem sua função fosforilando outras proteínas envolvidas no ciclo de divisão celular e transcrição influenciando suas atividades, garantindo que cada processo do ciclo ocorra em uma sequência ordenada. A CDK13 faz parte da família de proteínas quinases dependentes de ciclina, pode se ligar a ciclinas do tipo L ou K, regula os eventos de \"splicing\" alternativo, e interage com a proteína Tat do vírus HIV atuando como um possível fator de restrição, sendo que sua superexpressão diminui a produção de algumas proteínas virais suprimindo a produção do vírus. O DNA referente à CDK13 é replicado em células cancerosas, principalmente dos tipos hepático e cólon e reto, sendo um alvo para inibidores para tratamento de câncer. A fim de contribuir para o estudo dessa proteína, o projeto tem como objetivo expressá-la utilizando métodos de tecnologia de DNA recombinante. A sequência de DNA referente à CDK13 foi amplificada pela reação em cadeia da polimerase, após sua purificação, foi inserida no vetor pCR-Blunt e clonada em células de E. coli DH5α competentes. Porém, o DNA não foi liberado pela reação com as enzimas de restrição BamHI e NdeI. As bactérias Rosetta(DE3) transformadas com um plasmídeo sintético e crescidas em meio de auto-indução expressaram a CDK13. Após lise celular e purificação em coluna de Ni2+, a proteína foi detectada por Western Blot. Já as bactérias Rosetta(DE3) transformadas com o plasmídeo sintético modificado (o qual compreende a região do DNA que expressa o bolsão de ligação da CDK13), e induzidas em meio LB expressaram a CDK13, porém não foi possível purificá-la em coluna de afinidade ao Ni2+. / The cyclin-dependent kinases are proteins that can be classified by their function in the cell cycle or transcriptional control. They are activated in particular steps of the cell cycle depending on their phosphorylation degree, cyclin binding and inhibitory proteins. They act phosphorylating other proteins involved in the cell cycle and transcriptional control, influencing in their activities, ensuring that each step of the cell cycle occur in an ordered sequence. The CDK13 is one of the cyclin-dependent kinases family member, it can bind to L or K cyclins, regulates the alternative splicing and interact with HIV Tat protein, acting as a possible restriction factor, its overexpression decreases the production of some viral proteins, and suppresses the virus production. The DNA corresponding to CDK13 is replicated in cancer cells, mainly of hepatic and colon rectal types; therefore it is a target for inhibitors for cancer therapy. In order to contribute for the studies of this protein, the goal of the project is to express it using methods of recombinant DNA technology. The DNA sequence corresponding to CDK13 was amplified by polymerase chain reaction, after its purification, it was inserted to pCR-Blunt vector and cloned into E. coli DH5α competent cells. However, the DNA wasn\'t released by the BamHI and NdeI restriction enzymes. The Rosetta(DE3) cells transformed with a synthetic plasmid pET28a::CDK13 and grown in auto-induction media expressed the CDK13. After cell lysis and purification by Ni2+ affinity colum, the protein was identified by Western Blot. However, the Rosetta(DE3) cells transformed with the modified synthetic plasmid (that comprehends the DNA region which expresses the binding pocket region) induced in LB media, expressed the CDK13. Yet, it wasn\'t possible to purify the protein in the Ni2+ affinity column.

As quinases dependentes de ciclinas são proteínas que podem ser divididas de acordo com a sua atuação no ciclo celular ou no controle transcricional, elas se tornam ativas em determinadas etapas do ciclo celular dependendo do seu grau de fosforilação e de sua ligação com ciclinas e proteínas inibitórias, e exercem sua função fosforilando outras proteínas envolvidas no ciclo de divisão celular e transcrição influenciando suas atividades, garantindo que cada processo do ciclo ocorra em uma sequência ordenada. A CDK13 faz parte da família de proteínas quinases dependentes de ciclina, pode se ligar a ciclinas do tipo L ou K, regula os eventos de \"splicing\" alternativo, e interage com a proteína Tat do vírus HIV atuando como um possível fator de restrição, sendo que sua superexpressão diminui a produção de algumas proteínas virais suprimindo a produção do vírus. O DNA referente à CDK13 é replicado em células cancerosas, principalmente dos tipos hepático e cólon e reto, sendo um alvo para inibidores para tratamento de câncer. A fim de contribuir para o estudo dessa proteína, o projeto tem como objetivo expressá-la utilizando métodos de tecnologia de DNA recombinante. A sequência de DNA referente à CDK13 foi amplificada pela reação em cadeia da polimerase, após sua purificação, foi inserida no vetor pCR-Blunt e clonada em células de E. coli DH5α competentes. Porém, o DNA não foi liberado pela reação com as enzimas de restrição BamHI e NdeI. As bactérias Rosetta(DE3) transformadas com um plasmídeo sintético e crescidas em meio de auto-indução expressaram a CDK13. Após lise celular e purificação em coluna de Ni2+, a proteína foi detectada por Western Blot. Já as bactérias Rosetta(DE3) transformadas com o plasmídeo sintético modificado (o qual compreende a região do DNA que expressa o bolsão de ligação da CDK13), e induzidas em meio LB expressaram a CDK13, porém não foi possível purificá-la em coluna de afinidade ao Ni2+. / The cyclin-dependent kinases are proteins that can be classified by their function in the cell cycle or transcriptional control. They are activated in particular steps of the cell cycle depending on their phosphorylation degree, cyclin binding and inhibitory proteins. They act phosphorylating other proteins involved in the cell cycle and transcriptional control, influencing in their activities, ensuring that each step of the cell cycle occur in an ordered sequence. The CDK13 is one of the cyclin-dependent kinases family member, it can bind to L or K cyclins, regulates the alternative splicing and interact with HIV Tat protein, acting as a possible restriction factor, its overexpression decreases the production of some viral proteins, and suppresses the virus production. The DNA corresponding to CDK13 is replicated in cancer cells, mainly of hepatic and colon rectal types; therefore it is a target for inhibitors for cancer therapy. In order to contribute for the studies of this protein, the goal of the project is to express it using methods of recombinant DNA technology. The DNA sequence corresponding to CDK13 was amplified by polymerase chain reaction, after its purification, it was inserted to pCR-Blunt vector and cloned into E. coli DH5α competent cells. However, the DNA wasn\'t released by the BamHI and NdeI restriction enzymes. The Rosetta(DE3) cells transformed with a synthetic plasmid pET28a::CDK13 and grown in auto-induction media expressed the CDK13. After cell lysis and purification by Ni2+ affinity colum, the protein was identified by Western Blot. However, the Rosetta(DE3) cells transformed with the modified synthetic plasmid (that comprehends the DNA region which expresses the binding pocket region) induced in LB media, expressed the CDK13. Yet, it wasn\'t possible to purify the protein in the Ni2+ affinity column.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Luis Felipe Souza (luis_felas@globo.com) on 2008-11-11T16:40:20Z No. of bitstreams: 1 Tese_2007_AldoHenriqueTavares.pdf: 1295574 bytes, checksum: 446210cb07388071f933c7a4666cca6a (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-01-15T13:44:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_2007_AldoHenriqueTavares.pdf: 1295574 bytes, checksum: 446210cb07388071f933c7a4666cca6a (MD5) / Made available in DSpace on 2009-01-15T13:44:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_2007_AldoHenriqueTavares.pdf: 1295574 bytes, checksum: 446210cb07388071f933c7a4666cca6a (MD5) / Paracoccidioides brasiliensis, um fungo termo-dimórfico, é o agente etiológico da mais prevalente micose sistêmica da América Latina, a paracoccidioidomicose. A forma de levedura de P. brasiliensis atua como um patógeno intracelular facultativo, sendo capaz de sobreviver e replicar no interior de macrófagos e neutrófilos não ativados. Essa habilidade tem sido considerada crucial para o desenvolvimento da doença. Dessa maneira, o P. brasiliensis deve ter desenvolvido mecanismos que o permitiu adaptar-se ao ambiente hostil imposto por células fagocíticas. A fim de testarmos essa hipótese avaliamos a resposta transcricional de P. brasiliensis ao microambiente de macrófagos peritoneais murinos por meio da utilização da metodologia de microarranjo. Dos 1152 genes analisados, identificamos 152 genes que foram diferencialmente expressos no interior dos macrófagos. Esses genes estavam relacionados principalmente a limitação de glicose e aminoácidos, construção de parede celular e estresse oxidativo. Em geral, nossos resultados sugerem uma plasticidade transcricional de P. brasiliensis em resposta ao ambiente hostil dos macrófagos, o que auxiliaria a adaptação e conseqüente sobrevivência desse patógeno no hospedeiro. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis, a thermal dimorphic fungus, is the etiologic agent of the most common systemic mycosis in Latin America, paracoccidioidomycosis. The yeast form of P. brasiliensis acts as a facultative intracellular pathogen being able to survive and replicate within the phagosome of nonactivated murine and human macrophages. This ability has been proposed to be crucial to the development of disease. Thus, P. brasiliensis may have evolved mechanisms that counteract the constraints imposed by phagocytic cells. By using cDNA microarray technology we evaluated the early transcriptional response of this fungus to the environment of peritoneal murine macrophages in order to shed light on the mechanisms used by P. brasiliensis to survive within phagocytic cells. Of the 1152 genes analyzed, we identified 152 genes that were differentially transcribed. Intracellularly expressed genes were primarily associated with glucose and amino acid limitation, cell wall construction, and oxidative stress. For the first time, a comprehensive gene expression tool is used for the expression analysis of P. brasiliensis genes when interacting with macrophages. Overall, our data show a transcriptional plasticity of P. brasiliensis in response to the harsh environment of macrophages which may lead to adaptation and consequent survival of this pathogen.

Made available in DSpace on 2016-03-08T14:00:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 michelle_silva_ioc_dout_2012.pdf: 7931324 bytes, checksum: 70b78e7f6485074455de8780d640e2a3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A associação do HPV ao câncer de orofaringe tem sido sugerida, apesar da variável prevalência viral nos diferentes estudos. Por outro lado, a relação etiológica do HPV em casos de câncer oral ou de hipofaringe/laringe é ainda controversa. No entanto, estudos recentes tem sugerido que a presença do DNA do HPV nos tumores não é evidência suficiente para a associação causal, sendo fortemente indicado análises de expressão das oncoproteínas virais e do status do genoma do HPV. N presente estudo caso-controle, a prevalência do HPV foi analisada utilizando PCR-nested para detecção viral em 228 casos de câncer de cabeça e pescoço e 227 controles. A análise multivariada dos diferentes tipos de HPV e outros fatores de risco epidemiológicos, ambientais, clínicos e moleculares suportou a associação etológica do HPV no câncer de orofaringe corroborando a hipótese de duas diferentes vias na carcinogênese, uma desencadeada por fatores ambientais, como o consumo de tabaco e álcool e outra direcionada pelo HPV, cujo efeito é evidenciado na ausência desses outros fatores de risco. Entretanto , os dados aqui apresentados sugerem uma relação limitada do HPV aos tumores da cavidade oral e hipofaringe/laringe Apesar da similaridade da prevalência do HPV em casos e controles, os dados deste estudo sugerem fortemente que a distribuição dos tipos de HPV quanto ao potencial carcinogênico é diferenciado, sendo HPV de baixo risco mais frequente em controles e de alto-risco nos casos de câncer de orofaringe. O estudo de casos para presença de DNA e transcritos de RNA de E6 e E7 do HPV por ISH em dois TMAs construídos para o presente estudo mostrou atividade transcricional apenas para os casos de câncer de orofaringe. A superexpressão de p16INK4a foi coincidente na identificação de atividade do HPV por IHQ em caso de câncer de orofaringe, mostrando a eficiência deste marcador A presença de DNA do HPV integrado ao genoma foi detectada na maioria dos casos de câncer de orofaringe, diferente do encontrado para casos de câncer da cavidade oral ou hipofaringe/laringe. Este cenário mostra claramente a distinta associação etiológica do HPV nos diferentes sítios anatômicos de câncer de cabeça e pescoço, principalmente nos pacientes com câncer de orofaringe sem exposição aos principais fatores de risco, o tabaco e álcool / Human Papillomaviruses (HPV) have been associated with oropharynx cancer, even though previous studies show a wide variation o f viral prevalence. On the other hand, the etiological relation of HPV on oral or hypopharynx/ larynx cancers is still controve rsial. However, recent studies have been suggesting that the presence of HPV DNA in tumors is not sufficient evidence for the causal association, for which analyses of viral oncoproteins expression and genome status are strongly indicated. In this case - con trol study, the prevalence of HPV was analyzed using nested - PCR for viral detection in 228 cases of head and neck cancer and 227 controls. Multivariate analyses of different types of HPV and other risk factors epidemiological, environmental, clinical and m olecular supported the etiological association of HPV in oropharyngeal cancer, corroborating the hypothesis of two different pathways in carcinogenesis : O ne related to environmental factors such as tobacco and alcohol consumption , and the second linked to HPV, effect of which is evident in the absence of these other risk factors. However, the data presented here suggest a limited relationship of HPV in tumors of the oral cavity and hypopharynx/ larynx. Despite the similarity of HPV prevalence in cases and c ontrols, data from this study strongly suggest that the distribution of HPV types regarding the carcinogenic potential is differentiated, with low - risk HPV been frequent in controls and high - risk ones in cancer cases of oropharynx. The cases study for the presence of DNA and RNA transcripts of E6 and E7 HPV by ISH in two TMAs constructed for the present study showed transcriptional activity only for cases of oropharyngeal cancer. The overexpression of p16INK4a was coincident in identifying HPV activity by I HC in cases of oropharyngeal cancer, showing the efficiency of this marker. The presence of HPV DNA integrated into the genome was detected in the majority of cases of oropharyngeal cancer, unlike observed for cancers of the oral cavity or hypopharynx/ lar ynx. This scenario clearly show s the distinct etiological association of HPV in different anatomical sites of cancer of the head and neck, especially in patients with oropharyngeal cancer without exposure to the main risk factors, tobacco and alcohol

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2014-07-29T21:29:41Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_IdentificaçãoCaracterizaçãoMicroRNAs.pdf: 3736592 bytes, checksum: 44803158e7d571f01842a589d02f16a1 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-07-30T17:43:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_IdentificaçãoCaracterizaçãoMicroRNAs.pdf: 3736592 bytes, checksum: 44803158e7d571f01842a589d02f16a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-30T17:43:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_IdentificaçãoCaracterizaçãoMicroRNAs.pdf: 3736592 bytes, checksum: 44803158e7d571f01842a589d02f16a1 (MD5) Previous issue date: 2013 / microRNAs (miRNAs) são uma classe de reguladores pós-transcricionais com aproximadamente 22 nucleotídeos. Estas moléculas regulam a expressão gênica por se ligarem a sequências complementares existentes na região 3’UTR de mRNAs específicos, induzindo sua degradação ou silenciamento. Utilizando abordagens computacionais, nosso grupo de pesquisa identificou 42 novos miRNAs precursores em Schistosoma mansoni, sendo que 5 destes, eram de origem intrônica. Considerando que cerca de metade dos miRNAs humanos conhecidos estão localizados em íntrons de genes codificantes de proteínas e que muitos deles são expressos somente quando o gene é transcrito, levantamos a hipótese de que parte do repertório de miRNAs de S. mansoni poderia ser de origem intrônica. Para investigar esta hipótese foi utilizada a versão 5.1 do genoma deste parasito, bem como analisada o perfil de expressão utilizando a metodologia de qRT-PCR nos seguintes estágios evolutivos do parasito: cercárias, esquistossômulos jovens (3,5 e 24h de cultivo in vitro), vermes adultos, ovos e miracídios. Após a recuperação do arquivo contendo as sequências de íntrons presentes nos genes de S. mansoni, foram recuperadas somente as que continham entre 50 a 120 nucleotídeos e que apresentavam o mínimo de energia livre de ΔG<-25 Kcal/mol, estimado pelo software RNAfold. Essas análises mostraram um conjunto de 38 candidatos a moléculas precursoras de miRNAs. Posteriormente utilizando a ferramenta Mature Bayes foram preditos os miRNAs maduros, e a seguir, utilizados para busca de homologia no o banco de dados miRBase. Os resultados mostraram que os miRNAs preditos não apresentam homólogos no mirBase, levantando a hipótese de que este conjunto seja específico da espécie S. mansoni. A análise do perfil de expressão mostrou que dos 38 miRNAs preditos, 19 apresentaram expressão em pelo menos um estágio evolutivo analisado. Não foram identificados miRNAs estágios específicos, apesar de todos serem diferencialmente expressos. Com relação ao perfil de expressão dos genes hospedeiros, também foi observado uma expressão diferencial entre os estágios analisados. Finalmente para a predição dos alvos, foi utilizado o programa miRanda, evidenciando um conjunto de 993 alvos potenciais, sugerindo que 10% dos genes preditos em S. mansoni poderiam ser regulados por miRNAs. Em conjunto os resultados sugerem que parte dos miRNAs de S. mansoni estão localizados em genes que codificam proteínas. Esta observação levanta uma série de questões interessantes que serão futuramente investigadas __________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: microRNAs (miRNAs) are a class of post-transcriptional regulators with approximately 22 nucleotides. These molecules regulate gene expression by interaction to complementary sequences in the 3'UTR region of specific mRNA and inducing its degradation or silencing. Using computational approaches, our research group has identified 42 new miRNAs precursor in Schistosoma mansoni, and 5 of these were of intron origin. Whereas about half of the known human miRNAs are located in introns of protein coding genes and many of them are express only when the gene is transcribed, hypothesized was that part of the miRNAs repertoire in S. mansoni could be intron origin. To investigate this hypothesis we used version 5.1 of this parasite genome and analyzed the expression profile using qRT-PCR methodology in the following evolutionary stages of the parasite: cercariae, schistosomula young (3.5 and 24 hours of in vitro culture), adult worms, eggs and miracidium. After recovery of the file containing the sequence of introns present in the genes of S. mansoni, the sequences that contained between 50 and 120 nucleotides and who had at least ΔG<-25 Kcal/mol free energy, estimated by RNAfold software were recovered. Together, these analyzes revealed a set of 38 miRNA precursor candidates. Subsequently, the software Mature Bayes was used to miRNAs mature candidates and searched for homology using the miRBase database. The results showed that predicted miRNAs have no counter parts in mirBase, suggesting that this miRNA set is S. mansoni species-specific. The expression profile analysis showed that the 38 predicted miRNAs, 19 were expression in at least one developmental stage analyzed. miRNAs were not identified as stage specific expression, despite all being differentially expressed. Regarding the profile of expression of host genes was also observed a differential expression between stages analyzed. Finally for the prediction of targets, we used the software miRanda, revealing a set of 993 potential targets, suggesting that 10% of the predicted genes in S. mansoni could be regulated by miRNAs. Together these results suggest that parts of S. mansoni miRNAs are located in genes that encode proteins. This observation raises a number of interesting questions that will be further investigated.

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-03-13T14:43:13Z No. of bitstreams: 2 Vladimir da Mota Silveira Filho - Tese PPGG.pdf: 7570223 bytes, checksum: 939c1f76d28cf506a0b7eff7badba469 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T14:43:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Vladimir da Mota Silveira Filho - Tese PPGG.pdf: 7570223 bytes, checksum: 939c1f76d28cf506a0b7eff7badba469 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-03-15 / CPqAM CAPES CNPq Serviço de Referência em Peste / A peste, zoonose causada pela bactéria Yersinia pestis, continua sendo uma ameaça mundial. Como outras enfermidades relacionadas à pobreza, a peste é considerada uma doença negligenciada nos países tropicais, incluindo Brasil, onde ainda há detecção sorológica de atividade pestosa em animais-sentinela nos focos naturais. A ausência de uma vacina segura/efetiva, o surgimento de cepas multirresistentes e a possibilidade de seu uso como arma biológica aumentaram o interesse nos estudos genéticos/epidemiológicos do patógeno. Este trabalho teve como objetivos (1) comparar dois métodos moleculares de tipagem para identificar qual deles é capaz de estabelecer melhor correlação temporal e geográfica entre isolados brasileiros de Y. pestis; e (2) aprofundar os conhecimentos sobre os mecanismos de patogenicidade da bactéria. 25 cepas brasileiras de Y. pestis foram tipadas pela análise de múltiplos locos com número variável de repetições em tandem (MLVA) e pela eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A associação entre essas técnicas demonstrou, pela primeira vez, diversidade genética entre cepas brasileiras de Y. pestis. Contudo, apenas MLVA permitiu estabelecer correlação entre os isolados de diferentes eventos epidemiológicos, mostrando-se mais eficiente para tipagem de Y. pestis, em relação ao PFGE. Quatro cepas avirulentas P.CE 882/1R e 32R, P.Exu 369 e 390, e uma cepa controle indiana altamente virulenta (195P) foram comparadas a nível fenotípico, genotípico, transcricional e proteômico, a fim de identificar possíveis causas da perda de virulência. Não foi encontrada diferença fenotípica e genotípica entre os cinco isolados, onde foi detectada a presença dos genes irp2, psn, ybtE (localizados na Ilha de Alta Patogenicidade - HPI), fur, hmsH, YPO2271, YPO2281, sodA, phoP, psaA (cromossomais) e pla, lcrV, ymt, caf1 (plasmidiais). Entretanto, a análise transcricional mostrou diferentes níveis de transcrição dos genes da HPI, apesar de nenhuma alteração estrutural de sequência ter sido detectada. Provavelmente a presença de ferro livre no meio de cultura utilizado ativou a proteína Fur, um regulador transcricional negativo da HPI. A análise quantitativa revelou níveis de transcrição dos genes da HPI acima do esperado nas cepas P.Exu 369 e 390, sugerindo possível disfunção no mecanismo regulatório da captura de ferro. A análise proteômica da subcultura P.CE 882/1R sugere que distúrbios metabólicos decorrentes do subcultivo e/ou estocagem podem estar associados ao fenótipo de avirulência. Estes achados sobre os mecanismos de virulência de Y. pestis poderão contribuir para identificação de alvos importantes para o desenvolvimento de novas vacinas e abordagens terapêuticas contra a peste.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-10T18:11:34Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-VladimirSilveiraFilho.pdf: 7570666 bytes, checksum: acc48aa25629f4c3d970307fc0187b44 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T18:11:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-VladimirSilveiraFilho.pdf: 7570666 bytes, checksum: acc48aa25629f4c3d970307fc0187b44 (MD5) Previous issue date: 2012-03-15 / A peste, zoonose causada pela bactéria Yersinia pestis, continua sendo uma ameaça mundial. Como outras enfermidades relacionadas à pobreza, a peste é considerada uma doença negligenciada nos países tropicais, incluindo Brasil, onde ainda há detecção sorológica de atividade pestosa em animais-sentinela nos focos naturais. A ausência de uma vacina segura/efetiva, o surgimento de cepas multirresistentes e a possibilidade de seu uso como arma biológica aumentaram o interesse nos estudos genéticos/epidemiológicos do patógeno. Este trabalho teve como objetivos (1) comparar dois métodos moleculares de tipagem para identificar qual deles é capaz de estabelecer melhor correlação temporal e geográfica entre isolados brasileiros de Y. pestis; e (2) aprofundar os conhecimentos sobre os mecanismos de patogenicidade da bactéria. 25 cepas brasileiras de Y. pestis foram tipadas pela análise de múltiplos locos com número variável de repetições em tandem (MLVA) e pela eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A associação entre essas técnicas demonstrou, pela primeira vez, diversidade genética entre cepas brasileiras de Y. pestis. Contudo, apenas MLVA permitiu estabelecer correlação entre os isolados de diferentes eventos epidemiológicos, mostrando-se mais eficiente para tipagem de Y. pestis, em relação ao PFGE. Quatro cepas avirulentas P.CE 882/1R e 32R, P.Exu 369 e 390, e uma cepa controle indiana altamente virulenta (195P) foram comparadas a nível fenotípico, genotípico, transcricional e proteômico, a fim de identificar possíveis causas da perda de virulência. Não foi encontrada diferença fenotípica e genotípica entre os cinco isolados, onde foi detectada a presença dos genes irp2, psn, ybtE (localizados na Ilha de Alta Patogenicidade - HPI), fur, hmsH, YPO2271, YPO2281, sodA, phoP, psaA (cromossomais) e pla, lcrV, ymt, caf1 (plasmidiais). Entretanto, a análise transcricional mostrou diferentes níveis de transcrição dos genes da HPI, apesar de nenhuma alteração estrutural de sequência ter sido detectada. Provavelmente a presença de ferro livre no meio de cultura utilizado ativou a proteína Fur, um regulador transcricional negativo da HPI. A análise quantitativa revelou níveis de transcrição dos genes da HPI acima do esperado nas cepas P.Exu 369 e 390, sugerindo possível disfunção no mecanismo regulatório da captura de ferro. A análise proteômica da subcultura P.CE 882/1R sugere que distúrbios metabólicos decorrentes do subcultivo e/ou estocagem podem estar associados ao fenótipo de avirulência. Estes achados sobre os mecanismos de virulência de Y. pestis poderão contribuir para identificação de alvos importantes para o desenvolvimento de novas vacinas e abordagens terapêuticas contra a peste. / Plague, a zoonosis caused by the bacterium Yersinia pestis, remains as a global threat. As other poverty related diseases, plague is considered a neglected disease in tropical countries, including Brazil, where serological activity is still detected in sentinel animals in the natural foci. The lack of safe/effective vaccine and the rise of multiresistant strains and the possibility of its use as a biological weapon increased the interest in genetic/epidemiological studies of this pathogen. This work aimed (1) to compare two molecular typing methods to identify which offers better temporal and geographical correlation among Brazilian Y. pestis isolates; and (2) to further understand the pathogenicity mechanisms of the bacteria. 25 Brazilian strains of Y. pestis were typed by analysis of multiple loci with variable number of tandem repeats (MLVA) and by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). Association between these techniques demonstrated for the first time genetic diversity among Brazilian Y. pestis strains. However, only MLVA allowed establishing a correlation between isolates from different epidemiological events, proving to be more efficient for Y. pestis typing than PFGE. Four avirulent strains P.CE 882/1R and 32R, P.Exu 369 and 390, and a highly virulent Indian control strain (195P) were compared at phenotypic, genotypic, transcriptional and proteomic level in order to identify possible causes of virulence loss. No phenotypic and genotypic difference was found among the five isolates, which detected the genes irp2, psn, ybtE (from the High Pathogenicity Island - HPI), fur, hmsH, YPO2271, YPO2281, sodA, phoP, psaA (chromosomal) and pla, lcrV, ymt, caf1 (plasmidial). However, the transcriptional analysis indicated different transcription levels of the HPI genes, although no structural change on sequence being detected. Probably the presence of free iron in the culture medium activated the protein Fur, a negative HPI transcriptional regulator. Quantitative analysis revealed higher than expected transcription levels of P.Exu 369 and 390 HPI genes, suggesting possible alteration in the iron uptake regulation mechanism. The proteomic analysis of the subcultive P.CE 882/1R suggests that metabolic disturbances resulting from the subculture and/or storage may be associated with avirulence phenotype. Those findings about mechanisms of virulence of Y. pestis may contribute to identify important targets for development of new vaccines and therapies against plague.

A ampliação do conhecimento sobre as formas de comunicação, controle e regulação existentes em bactérias traz luz aos avanços no combate das infecções hospitalares que são responsáveis por inúmeros prejuízos relacionados à saúde pública em todo planeta. DUMOULIN et al (2013), descreveram o regulador transcricional (RT) ElrR, que regula positivamente a transcrição do gene elrA, um fator de virulência de Enterococcus faecalis. ElrA apresenta grande similaridade com as internalinas de Listeria monocytogenes, que facilitam a invasão da bactéria ao hospedeiro. ElrR é considerada como pertencente à família Rgg-like de RT exclusivo de bactérias Gram positivas. Por vários motivos a família Rgg foi inserida à superfamília RNPP, gerando a superfamília RRNPP de RT. Os RRNPP fazem parte de um sistema de regulação por quorum sensing (QS), um sistema de comunicação célula-célula dependente de densidade celular, com função associada na ativação ou inibição da expressão de proteínas relacionadas, dentre outros, à virulência, formação de biofilme e esporulação. Para a melhor compreensão do mecanismo de como ocorre a ativação da transcrição do fator de virulência ElrA, este trabalho apresenta resultados de expressão heteróloga em E. coli e purificação das proteínas ElrR e ElrA, bem como resultados de experimentos biofísicos que caracterizam algumas propriedades estruturais e biológicas destas proteínas. Utilizando técnicas de cromatografia, espectroscopia de dicroísmo circular (CD), anisotropia de fluorescência, espalhamento dinâmico de luz (DLS), cristalografia de raios X e ressonância plasmônica de superfície (SPR), foi possível a obtenção da estrutura tridimensional de ElrR e de indícios da interação com uma região de 25bp do DNA. Realizou-se ainda, em colaboração com Dra. Pascale Serror, a tentativa de obtenção da molécula autoindutora (AI) de ElrR. São apresentados primeiros resultados da obtenção heteróloga de ElrA, sua purificação e cristalização, com importantes características que permitirão a continuação da investigação deste fator de virulência. ElrR é composta somente por alfa-hélices e apresenta-se dimérico em solução. Apesar da similaridade estrutural dos RRNPP, a identidade da sequência entre ElrR e os outros membros é extremamente baixa, o que motivou a resolução das fases cristalográficas experimentalmente. A estrutura de ElrR apresenta-se similar às homólogas, porém, com maior interface de interação entre os protômeros, que formam o dímero. O sítio de ligação do AI, em ElrR, apresenta-se mais amplo, com cavidade maior que as demais estruturas estudadas, conservando vários dos resíduos apresentados nos homólogos que realizam a estabilização do AI. Os altos fatores de temperatura dos cristais de ElrR, adicionado a anisotropia dos átomos, de uma das estruturas obtidas, apresenta a grande flexibilidade desse RT. Os indícios de interação entre ElrR e DNA aqui apresentados, obtidos por SPR e anisotropia de fluorescência, apresentam que ElrR liga especificamente ao fragmento proposto do DNA, ainda na ausência do AI. A não cristalização do complexo (ElrR-DNA), adicionada a alta flexibilidade apresentada na estrutura e a instabilidade observada na ligação ao DNA (por SPR) apontam para a obrigatoriedade da molécula de regulação (AI) para que o complexo ElrR-DNA seja estável. / The enhancing of the knowledge about communication, control and regulation in bacteria bring possibilities on the advance of hospital-acquired infections control responsible for various prejudices related to public health worldwide. DUMOULIN, et al (2013) described ElrR, a transcriptional regulator (TR), that positively regulates transcription of the elrA gene, which codifies a virulence factor of Enterococcus faecalis. ElrA shows high similarity with Listeria monocytogeneses internalins, which facilitates host invasion by these bacteria. ElrR are considered belonging to Rgg-like TR family exclusive of Gram positive bacteria. Several reasons include the Rgg family into the RNPP superfamily, generating the RRNPP superfamily of TR. The RRNPP are controlled by a quorum sensing (QS) regulation system, a cell-cell communication system based on cellular density that activates or inhibits the expression of proteins related with virulence, biofilm formation, sporulation, and others. For a better understanding of the transcription activation mechanism of ElrA, this work shows ElrR and ElrA heterologous expression in E. coli and purification of these proteins, as well as biophysics assays to characterize some structural and biological features of both proteins. Using chromatography, circular dichroism (CD), fluorescence anisotropy, dynamic light scattering (DLS), X-ray crystallography and surface plasmon resonance (SPR) technics, it was possible to obtain the tridimensional structure of ElrR, and evidences of ElrR-DNA complex formation, confirming DNA interaction site of ElrR with a 25 bp fragment. In collaboration with Dr. Pascale Serror, we attempted to achieve the ElrR auto-induction (AI) molecule. Also, results of the heterologous obtainment of ElrA are presented, as well as ElrA purification and crystallization, presenting important characteristics which will allow the further investigation of this virulence factor in near future. ElrR is composed by alpha-helices presenting dimeric fold in solution. Despite the similarity between the RRNPP members, the low identity of ElrR to the other members motivates the experimental crystallographic phases solution. ElrR structure is very similar to the homologous structures, presenting a higher interface between the protomers that compose the dimer. Its AI binding site is wider than the other structures studied, conserving several amino acid residues presented at the homologous proteins, that stabilizes the AI molecule. High temperature factors of the amino acid residues showed in all the obtained ElrR crystallographic structures plus the anisotropy of the atoms in one of those structures show the high flexibility of this TR. The evidence of the ElrR-DNA complex presented in this study, obtained by SPR and fluorescence anisotropy, indicates that ElrR binds at the proposed DNA site even in the absence of the AI molecule. The failure to obtain the ElrR-DNA complex crystals added to the high flexibility presented at some places of the structure and the observed instability at the formed complex (observed at SPR) suggest the mandatory need of the AI molecule to create a stable ElrR-DNA complex.