Les maladies cardio-vasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. L’hypertrophie cardiaque est un processus de remodelage provoqué par une surcharge de travail du muscle cardiaque afin de mieux répondre à la demande de l’organisme. Bien que bénéfique à court terme, une hypertrophie trop accentuée conduira à long terme, à une insuffisance cardiaque. L’hypertrophie est associée à un remodelage électrique qui conduit généralement à un allongement du potentiel d’action, une des causes des arythmies ventriculaires et de la mort subite. Généralement, le mécanisme causal est la fibrillation ventriculaire, un trouble du rythme irréversible dont les mécanismes sont complexes et méconnus. Si les conséquences fonctionnelles in vitro des mutations génétiques ou du remodelage ionique sont relativement simples à étudier ou à prévoir, leur rôle dans les mécanismes des troubles du rythme in vivo sont plus difficiles à appréhender. Parmi les nombreux modèles animaux développés pour la recherche sur les troubles du rythme, la souris est de plus en plus utilisée en raison de notre capacité à muter, invalider ou sur-exprimer les gènes d'intérêt chez ces animaux. L'objectif de mon travail de thèse était de mieux comprendre le rôle des canaux ioniques en physiopathologie cardiaque, en particulier dans la survenue des troubles du rythme in vivo. Ces travaux ont permis d'améliorer notre connaissance du rôle des anomalies génétiques impliquant des canaux ioniques et du remodelage ionique dans la physiopathologie des troubles du rythme et pourrait ainsi ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement anti-remodelage cardiaque et la prévention de la mort subite. / Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world each year. If no action is taken to improve cardiovascular health and current trends continue, WHO estimates that 25% more healthy life years will be lost to cardiovascular disease globally by 2020. Cardiac hypertrophy is the consequence of an excessive workload of the heart muscle leading to cardiac remodeling process. As the workload increases, the ventricular walls grow thicker, lose elasticity and eventually may fail to pump with as much force as a healthy heart. Furthermore, hypertrophied myocardium is not physiologically normal and may confer a predisposition to potentially fatal arrhythmias. Generally, the causal mechanism is ventricular fibrillation, a cardiac rhythm disorder which is irreversible but the pathophysiological mechanisms are complex and poorly understood. The functional consequences of mutations or ionic remodeling are relatively simple to study in vitro, but their role in the pathophysiology of arrhythmias in vivo is more difficult to grasp. Among the different animal models developed in cardiac arrhythmias research, the mouse is increasingly used because of our ability to mutate, knock-out or over-express genes of interest. The objective of my thesis was to study the role of ion channels in physiology as well as cardiac pathophysiology, particularly in the involvement of the occurrence of cardiac arrhythmias in vivo. This thesis will improve our understanding of the role of genetic abnormalities involving ionic remodeling in the pathogenesis of the heart and may also open new therapeutic perspectives in the treatment of cardiac remodeling as well as sudden cardiac death. / Thèse en cotutelle avec Université de Nantes - Pays de La Loire - France (2005-2010)

Au niveau du cerveau et dans le plasma de malades atteints de maladie d'Alzheimer (MA), l'accumulation de C22:0 et d'acides gras à très longue chaîne (C24:0 ; C26:0), la diminution d'acide docosahexaenoique (C22:6 n-3) et les modifications quantitatives et qualitatives de plasmalogènes suggèrent l'implication de dysfonctions peroxysomales. En fonction de ces constatations, les activités biologiques de C22:0, C24:0 et C26:0 ont été recherchées sur des cellules neuronales humaines SK-N-BE. La lipotoxicité des acides gras (C22:0, C24:0 et C26:0) induit divers effets au niveau des mitochondries (modifications topographiques, morphologiques et fonctionnelles), conduit à une rupture de l'équilibre RedOx (surproduction d'espèces radicalaires de l'oxygène, modification de l'activité des enzymes anti-oxydantes : catalase, SOD, GPx), à une peroxydation lipidique et à une désorganisation du cytosquelette (microfilaments d'actine, tubuline, neurofilaments). Ces acides affectent aussi l'amyloïdogenèse et la tauopathie. L'amyloïde béta favorise aussi l'accumulation intracellulaire de C22:0, C24:0 et C26:0. A fortes concentrations, ces acides gras induisent une mort cellulaire non apoptotique. Par ailleurs, les données immunohistochimiques en relation avec l'expression de marqueurs peroxysomaux (ABCD1, ABCD2, ABCD3, ACOX1 et catalase) au niveau du cerveau de souris transgéniques APP PS1 ΔE9 ainsi que les profil d'acide gras obtenus sur le cerveau et le sang de ces souris suggèrent qu'elles pourraient constituer un bon modèle pour l'étude des relations entre MA et métabolisme peroxysomal. L'étude clinique réalisée sur plasma et érythrocytes de malades déments (MA, démences vasculaires, autres démences) montre une forte accumulation de C22:0, C24:0 et C26:0. Le C26:0 pourrait constituer un excellent biomarqueur de la MA. Le C18:0 à est aussi augmenté ainsi que les acides gras n-6. De forts indices de stress oxydant sont aussi révélés. Dans son ensemble, le travail réalisé suggère que les acides gras (C22:0, C24:0 et C26:0) ainsi que le métabolisme des acides gras en relation avec le métabolisme peroxysomal pourraient contribuer à la neurodégénéréscence associée aux démences incluant la MA

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Dans le but de générer une souris transgénique produisant des anticorps humains, les trois loci humains (HC, LCκ et LCλ) ont été reconstitués sous forme de YAC circulaires. Puis, pour simplifier la manipulation des gènes codant pour la chaîne lourde, quatre vecteurs plasmidiques qui résument l’information génétique contenue dans le locus humain de la chaîne lourde ont été réalisés. La construction HC Minilocus (78 kbp) est donc composée des 13 segments V sélectionnés, de la région D-J synthétisée et des gènes codant pour les parties constantes de type μ, ɣ3 et ɣ1. Trois autres constructions (~22 kbp) ont été dérivées des étapes intermédiaires de clonage. Elles sont basées sur 7 segments V et la région D-J synthétisée. Le HC Microlocus Classic (22 kb) a été obtenu après clonage du gène codant pour la partie constante ɣ1 en 3’ des éléments V, D et J précédemment cités; cette construction code pour des chaînes lourdes d’IgG1 (ɣ1 HC). De la même façon, le HC Microlocus Light (21.5 kb) contient le gène codant pour ɣ1 CH1-, cette construction code donc pour des chaînes lourdes IgG sans domaine CH1 (ɣ1 HC CH1-). Les chaînes lourdes de ce type sont exprimées sans être associées à des chaînes légères, à l’image de ce qui est observé chez les camélidés (Heavy Chain only antibodies). Enfin le HC Microlocus Light shRNA (22 kbp) est une construction basée sur le Microlocus Light à laquelle a été ajoutée une séquence codant pour quatre shRNA (small hairpin RNA) visant à réprimer l’expression d’IgM murin. Ce locus est destiné à être injecté dans des souris natives (wilde type, WT). La fonctionnalité de ces quatre vecteurs a été évaluée par transfection dans la lignée cellulaire 300-19, des lymphocytes pro B d’origine murine pouvant progresser du stade pro B au stade de cellule B mature, lorsqu’elles sont maintenues en culture. Pour les quatre constructions, plusieurs réarrangements DJ et VDJ ont été identifiés, montrant une grande diversité combinatoire et jonctionelle. Par cytométrie en flux (FACS), des chaînes lourdes humaines ont été identifiées dans le cytoplasme et à la surface des cellules transfectées avec les trois constructions intermédiaires. Les cellules exprimant des chaînes lourdes en surface ont été enrichies par FACS. Par la suite, en utilisant des méthodes immuno-enzymatiques (ELISA et ELISPOT), il a été prouvé que les chaines lourdes d’anticorps humains étaient secrétées dans le milieu extracellulaire. La transgénèse avec les constructions HC Microlocus Light et HC Microlocus Light shRNA s’est révélée efficace puisque nous avons obtenu plusieurs animaux transgéniques. Aucune cellule B n’a été détectée dans les souris HC Microlocus Light (background HC KO); alors que cette même construction associée à un shRNA (HC Microlocus Light shRNA) dans une souris transgénique au système immunitaire humoral intact, montre l’expression de chaînes lourdes d’anticorps humains dans le cytoplasme et à la surface des cellules B. La chaine lourde humaine est exprimée en parallèle des immunoglobulines endogènes à la surface des cellules pre-B, ainsi que dans les cellules B immatures et matures. / In order to generate a transgenic mouse producing human antibodies, three human loci (HC, LCκ et LCλ) were reconstituted in the form of circular YAC. Then, to simplify the manipulation of genes encoding the heavy chain, four vectors summarizing the genetic information contained in the human heavy chain locus were designed and cloned. The HC Minilocus (78 kbp) is composed of 13 V segments, a synthetic DJ cluster and the genes encoding the constant parts Cμ, Cɣ3 and Cɣ1. Three other constructions (~22 kbp) were derived from the intermediate cloning steps. They are based on 7 V segments and a DJ region synthesized. The HC Microlocus Classic (22 kbp) was obtained after cloning of the gene encoding the constant part ɣ1 in 3' of the V , D and J elements mentioned above; this construct encodes the heavy chain of IgG1 (ɣ1 HC). The HC Microlocus Light (21.5 kb) contains the gene encoding ɣ1 CH1-, therefore, this construction encodes IgG1 HC without CH1 domain (ɣ1HC CH1-). Such HC are expressed without being associated with light chain (Heavy Chain only antibodies). Finally, the HC Microlocus Light shRNA (22 kb) is based on the HC Microlocus Light to which was added a sequence encoding four shRNA (small hairpin RNA) to repress the murine IgM expression. This locus is designed to be injected into wild type mouse. The functionality of the four reduced human HC constructs was assessed in mouse cells. The 300-19 cell line was used because is a pro-B cell line able to rearrange endogenous or transgenic Ig genes and to express the rearranged genes as Ig proteins. 300-19 cells were transduced with the four reduced human HC constructs and the expression of the transgenic Ig genes was investigated in detail. Indeed, DJ and VDJ rearrangement, recombinatory diversity, junctional diversity, transcription, mRNA maturation, alternative splicing, Ig surface expression and secretion were assessed. The data demonstrated that these constructs undergo editing and processing in murine cells and give rise to a large diversity of human heavy chains. The HC Microlocus Light was injected in HC knock out mouse oocytes and the HC Microlocus Light shRNA (which is exactly identical to the Microlocus Light concerning the antibody gene part) in wild type mouse oocytes. Injection in wild type mice led to human γ1 HC expression, whereas injections in HC KO mice did not show any B cell population reconstitution and consequently no human HC γ1 expression. Transgenic human ɣ1 HC and endogenous mouse IgM are co-expressed at the surface of progenitor-, immature- and mature B cells.

Le cervelet permet l’apprentissage moteur et la coordination des mouvements fins. Pour ce faire, il intègre les informations sensorielles provenant de l’ensemble du corps ainsi que les commandes motrices émises par d’autres structures du système nerveux central. Les noyaux cérébelleux profonds (DCN) constituent la sortie du cervelet et intègre les informations provenant des cellules de Purkinje (PC), des fibres moussues et des fibres grimpantes. Nous avons étudié les connexions fonctionnelles entres les PC et les DNC in vivo, grâce à une stimulation optogénétique des lobules IV/V du cortex cérébelleux et à l’enregistrement multi unitaire du noyau médian. Nous avons ainsi identifié deux groupes de cellules au sein des DCN, présentant des caractéristiques propres au niveau de leur fréquence de décharge et de la forme des potentiels d’action, en accord avec la dichotomie établie par une précédente étude in vitro permettant de séparer les neurones GABAergiques des autres neurones. Nos résultats suggèrent que les PC contrôlent la sotie du cervelet d’un point de vue temporel. De plus, la ciruiterie interne des DCN conforte ce résultat de part le fait que les cellules GABAergiques ne produisent pas d’effet temporel au travers de l’inhibition locale. / The cerebellum integrates motor commands with somatosensory, vestibular, visual and auditory information for motor learning and coordination functions. The deep cerebellar nuclei (DCN) generates the final output by processing inputs from Purkinje cells (PC), mossy and climbing fibers. We investigated the properties of PC connections to DCN cells using optogenetic stimulation in L7-ChR2 mice with in vivo multi electrode extracellular recordings in lobule IV/V of the cerebellar cortex and in the medial nuclei. DCN cells discharged phase locked to local field potentials in the beta, gamma and high frequency bands. We identified two groups of DCN cells with significant differences in action potential waveforms and firing rates, matching previously discriminated in vitro properties of GABAergic and non-GABAergic cells. PCs inhibited the two group of cells gradually (rate coding), however spike times were controlled for only non-GABAergic cells. Our results suggest that PC inputs temporally control the output of cerebellum and the internal DCN circuitry supports this phenomenon since GABAergic cells do not induce a temporal effect through local inhibition.

Au niveau du cerveau et dans le plasma de malades atteints de maladie d’Alzheimer (MA), l’accumulation de C22:0 et d’acides gras à très longue chaîne (C24:0 ; C26:0), la diminution d’acide docosahexaenoique (C22:6 n-3) et les modifications quantitatives et qualitatives de plasmalogènes suggèrent l’implication de dysfonctions peroxysomales. En fonction de ces constatations, les activités biologiques de C22:0, C24:0 et C26:0 ont été recherchées sur des cellules neuronales humaines SK-N-BE. La lipotoxicité des acides gras (C22:0, C24:0 et C26:0) induit divers effets au niveau des mitochondries (modifications topographiques, morphologiques et fonctionnelles), conduit à une rupture de l’équilibre RedOx (surproduction d’espèces radicalaires de l’oxygène, modification de l’activité des enzymes anti-oxydantes : catalase, SOD, GPx), à une peroxydation lipidique et à une désorganisation du cytosquelette (microfilaments d’actine, tubuline, neurofilaments). Ces acides affectent aussi l’amyloïdogenèse et la tauopathie. L’amyloïde béta favorise aussi l’accumulation intracellulaire de C22:0, C24:0 et C26:0. A fortes concentrations, ces acides gras induisent une mort cellulaire non apoptotique. Par ailleurs, les données immunohistochimiques en relation avec l’expression de marqueurs peroxysomaux (ABCD1, ABCD2, ABCD3, ACOX1 et catalase) au niveau du cerveau de souris transgéniques APP PS1 ΔE9 ainsi que les profil d’acide gras obtenus sur le cerveau et le sang de ces souris suggèrent qu’elles pourraient constituer un bon modèle pour l’étude des relations entre MA et métabolisme peroxysomal. L’étude clinique réalisée sur plasma et érythrocytes de malades déments (MA, démences vasculaires, autres démences) montre une forte accumulation de C22:0, C24:0 et C26:0. Le C26:0 pourrait constituer un excellent biomarqueur de la MA. Le C18:0 à est aussi augmenté ainsi que les acides gras n-6. De forts indices de stress oxydant sont aussi révélés. Dans son ensemble, le travail réalisé suggère que les acides gras (C22:0, C24:0 et C26:0) ainsi que le métabolisme des acides gras en relation avec le métabolisme peroxysomal pourraient contribuer à la neurodégénéréscence associée aux démences incluant la MA / In the brain and in the plasma of patients with Alzheimer’s disease (AD), marked accumulation of C22:0 and of very long chain fatty acids (C24:0 ; C26:0) have been reported. Important decreases of docosahexaenoic acid (DHA; C22:6 n-3) have also been described as well as quantitative and qualitative modifications of plasmalogens. Altogether, these lipid modifications suggest an implication of peroxisomal metabolism disorders in the physiopathology of AD. Therefore, the biological activities of C22:0, C24:0 and C26:0 have been studied on human neuronal cells SK-N-BE. On these cells, the lipotoxicity of fatty acids (C22:0, C24:0 and C26:0) leads to various cellular modifications: topographical, morphological and functional changes at the mitochondrial level, rupture of RedOx equilibrium (overproduction of reactive oxygen species, modification of the activity of enzymes involved in anti-oxidant defenses: catalase, SOD, GPx), lipid peroxidation, cytoskeleton disorganization (actin microfilaments, tubulin, neurofilaments). These fatty acids also favor amyloidogenesis and tauopathy. At elevated concentrations, these fatty acids trigger a non apoptotic mode of cell death. Moreover, data obtained by immunohistochemistry with antibodies raised against peroxisomal components (ABCD1, ABCD2, ABCD3, ACOX1 and catalase) on histological tissue sections of the brain of transgenic mice APP PS1 ΔE9 as well as lipidomic analysis performed on the blood and the brain of these mice suggest that they could constitute interesting model to study the relationships between AD and peroxisomal metabolism. The clinical study performed on the plasma and on the erythrocytes of patients with dementia (AD, vascular dementia, other dementia) revealed an important accumulation of C22:0, C24:0 and C26:0. Hexacosanoic acid (C26:0) might constitute an excellent biomarker of AD. The fatty acid C18:0 and (n-6) fatty acids have also been found at increased concentrations. A strong oxidative stress has also been revealed. Altogether, our data support that the fatty acids (C22:0, C24:0 and C26:0) as well as the fatty acid metabolism depending on the peroxisome might contribute to neurodegeneration leading to various types of dementia including AD

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