<p><a>The processive plant cellulose synthase (CESA) synthesizes (1→4)-β-D-glucans. CESAs assemble into a six-fold symmetrical cellulose synthase complex (CSC), with an unknown symmetry and number of CESA isomers. The CSC synthesizes a cellulose microfibril as the fundamental scaffolding unit of the plant cell wall. CESAs are approximately 110 kDa glycosyltransferases with an N-terminal RING-type zinc finger domain (ZnF), seven transmembrane α-helices (TMHs) and a cytoplasmic catalytic domain (CatD). In the CatD, the uridine diphosphate glucose (UDP-Glc) substrate is synthesized into</a> (1→4)-β-D-glucans. The ZnF is likely to facilitate dimers in the CSC. Recombinant class-specific region (CSR), a plant specific insertion to the C-terminal end of the CatD is also known to form dimers<i> in vitro</i>. The CSR sequence is the primary source of distinction between CESA isoforms and class structure. Also within the CESA CatD is a 125-amino acid insertion known as the plant-conserved region (P-CR), whose molecular structure was unknown. The function of the P-CR is still unclear, especially in the context of complete CESA and CSC structures. Thus, one major knowledge gap is understanding how multimeric CSCs synthesize multiple chains of (1→4)-β-D-glucans that coalesce to form microfibrils. The specific number of CESAs in a CSC and how interactions of individual CESA isoforms contribute to the CSC are not known. Elucidating the structure-function relationships of the P-CR domain, and with the consideration of the ability of CSR and ZnF domains to dimerize, it is possible to more completely model the structure of the CSC.</p> <p>Recombinantly expressed rice (<i>Oryza sativa</i>) secondary cell wall OsCESA8 P-CR domain purifies as a monomer and shows distinct α-helical secondary structure by circular dichroism analysis. A molecular envelope of the P-CR was derived by small angle X-ray scattering (SAXS). The P-CR was crystallized and structure solved to 2.4 Å resolution revealing an anti-parallel coiled-coiled domain. Connecting the coiled-coil α-helices is an ordered loop that bends back towards the coiled-coils. The P-CR crystal structure fits the molecular envelope derived by SAXS, which in turn fits into the CatD molecular envelope. The best fit places the P-CR between the membrane and substrate entry portal. In depth analysis of structural similarity to other proteins, and 3D-surface structure of the P-CR, leads to hypotheses that it could function in protein-protein interactions as a dimer, trimer or tetramer in the CSC, that it could form protein-protein interactions with CESA-interacting proteins, and/or modulate substrate entry through its N- and/or C-terminus. From modeling, hypothetically important residues within the P-CR or related to the P-CR through potential protein contacts were mutated in <i>Arabidopsis thaliana</i> <i>AtCESA1</i> constructs. These constructs were expressed in the temperature-sensitive <i>radial swelling</i> (<i>rsw</i>)<i> rsw1-1</i> mutant of <i>AtCESA1 </i>to test for complementation of growth phenotypes at restrictive temperatures. Preliminary experiments indicate that some mutated CESA1 sequences fail to complement the <i>rsw1-1</i> phenotype, suggesting that specific functions of individual amino can be tested using this system.</p>

In einem komplexen tierexperimentellen Ansatz wurde das Potenzial der anti huCD4-Antikörper MAX16H5 und MAX12F6 zur Modulierung zellvermittelter Immun-reaktionen in vivo untersucht. Dafür kam ein mehrfach transgenes Mausmodell zur Anwendung, in dem das humane Zielmolekül und dessen physiologischer Ligand als Transgene exprimiert waren. Als T-Zell vermittelte Immunreaktion wurde eine Kon-taktreaktion (delayed type hypersensitivity, DTH) gegen DNFB etabliert und validiert. An der DTH wurde untersucht, ob und wie die verschiedenen Antikörper die Sen-sibilisierungs- und die Auslösungsphase beeinflussen. Die experimentellen Ergeb-nisse zeigen, dass die Antikörper epitop- und isotypabhängig die beiden Phasen der DTH unterschiedlich beeinflussen. Die Applikation der Antikörper während der Sensi-bilisierung führte zu einer unterschiedlich ausgeprägten Suppression der DTH. Dage-gen hatten sie gegensätzliche Effekte auf die Auslösung. Während nach MAX12F6-Behandlung eine stärkere und prolongierte DTH gemessen wurde, verlief die DTH-Reaktion nach MAX16H5-Applikation deutlich abgeschwächt. Mittels flowzytometri-scher Analysen konnte gezeigt werden, dass die Antikörper unterschiedliche Subpo-pulationen der T-Helferzellen depletieren. Darüber hinaus führte MAX16H5 offen-sichtlich zur Induktion regulatorischer T-Zellen. Die Daten erklären unterschiedliche Erfolge aus ersten klinischen Studien mit verschiedenen anti huCD4 Antikörpern. Auch eignet sich CD4 auch als diagnostisches Target zur in vivo Diagnostik T-Zell vermittelter Entzündungsreaktionen. Mit Antikörperfragmenten von MAX16H5 wurde ein immunszintigraphisches Verfahren entwickelt, das die spezifische Darstellung der mit der DTH einhergehenden Entzündungsreaktion ermöglicht.

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In einem komplexen tierexperimentellen Ansatz wurde das Potenzial der anti huCD4-Antikörper MAX16H5 und MAX12F6 zur Modulierung zellvermittelter Immun-reaktionen in vivo untersucht. Dafür kam ein mehrfach transgenes Mausmodell zur Anwendung, in dem das humane Zielmolekül und dessen physiologischer Ligand als Transgene exprimiert waren. Als T-Zell vermittelte Immunreaktion wurde eine Kon-taktreaktion (delayed type hypersensitivity, DTH) gegen DNFB etabliert und validiert. An der DTH wurde untersucht, ob und wie die verschiedenen Antikörper die Sen-sibilisierungs- und die Auslösungsphase beeinflussen. Die experimentellen Ergeb-nisse zeigen, dass die Antikörper epitop- und isotypabhängig die beiden Phasen der DTH unterschiedlich beeinflussen. Die Applikation der Antikörper während der Sensi-bilisierung führte zu einer unterschiedlich ausgeprägten Suppression der DTH. Dage-gen hatten sie gegensätzliche Effekte auf die Auslösung. Während nach MAX12F6-Behandlung eine stärkere und prolongierte DTH gemessen wurde, verlief die DTH-Reaktion nach MAX16H5-Applikation deutlich abgeschwächt. Mittels flowzytometri-scher Analysen konnte gezeigt werden, dass die Antikörper unterschiedliche Subpo-pulationen der T-Helferzellen depletieren. Darüber hinaus führte MAX16H5 offen-sichtlich zur Induktion regulatorischer T-Zellen. Die Daten erklären unterschiedliche Erfolge aus ersten klinischen Studien mit verschiedenen anti huCD4 Antikörpern. Auch eignet sich CD4 auch als diagnostisches Target zur in vivo Diagnostik T-Zell vermittelter Entzündungsreaktionen. Mit Antikörperfragmenten von MAX16H5 wurde ein immunszintigraphisches Verfahren entwickelt, das die spezifische Darstellung der mit der DTH einhergehenden Entzündungsreaktion ermöglicht.

In der Entwicklung des peripheren Nervensystems formen Schwannzellen eine Myelinscheide um Axone mit einem Durchmesser von mehr als 1 μm durch die Bildung multipler kompakter Membranschichten. Voraussetzung einer optimalen Nervenleitgeschwindigkeit ist dabei ein physiologisches Verhältnis der Dicke der Myelinscheide zu dem jeweiligen Axondurchmesser. Eine zentrale Rolle spielt dabei der axonale EGF-like growth factor NRG1 Typ III, der ErbB2/3- Rezeptoren der Schwannzelle bindet. Der PI3K-AKT-Signalweg ist ein bekannter intrazellulärer Effektor des ErbB2/3-Rezeptors und wurde bereits mit dem Prozess der Myelinisierung in Verbindung gebracht. Um die spezifische Funktion des PI3K-AKT-Signalwegs in Schwannzellen zu erforschen, generierten wir mit Hilfe des Cre/LoxP-Systems Mausmutanten, die eine zellspezifische Inaktivierung des Gens Phosphatase and Tensin Homolog (Pten) in myelinisierenden Gliazellen aufweisen (Pten-Mutanten). Der Verlust der Lipidphosphatase PTEN führte zu einer Anreicherung ihres Substrates, des second messenger Phosphatidyl-(3,4,5)-Trisphosphat (PIP3), und damit zu einer gesteigerten Aktivität des PI3K-AKT-Signalwegs in den Schwannzellen der Pten-Mutanten. Wir beobachteten in den Pten-Mutanten eine ektopische Myelinisierung von unmyelinisierten C- Faser-Axonen sowie eine Hypermyelinisierung von Axonen bis 2 μm Durchmesser. Bei Axonen über 2 μm Durchmesser kam es zu Myelinausfaltungen und fokalen Hypermyelinisierungen (Tomacula) anliegend an Regionen des unkompakten Myelins (Paranodien und Schmidt- Lantermann-Inzisuren). Weiterhin bildeten die mutanten Remak-Schwannzellen unkompakte Membranwicklungen um nicht-myelinisierte C-Faser-Axone und um Kollagenfaserbündel aus („Remak-Myelin“). Sowohl in den Regionen unkompakten Myelins als auch in Remak- Schwannzellen konnte eine erhöhte Aktivität des PI3K-AKT-Signalwegs nachgewiesen werden. Vermutlich setzt die Anreicherung von PIP3 mit Überaktivierung des PI3K-AKT-Signalwegs in den mutanten Gliazellen einen zellautonomen Prozess der Umwicklung von Axonen in Gang. Die zusätzliche Bildung von „Remak-Myelin“ um Kollagenfasern, die keine Membranoberfläche besitzen, weist darauf hin, dass dieser Prozess nicht von einer bidirektionalen axo-glialen Kommunikation abzuhängen scheint. Die beobachteten Tomacula und Myelinausfaltungen zeigten Ähnlichkeiten mit Mausmodellen für hereditäre Neuropathien des Menschen, wie HNPP und CMT4B. Wir vermuten, dass PTEN im unkompakten Myelin unkontrolliertes Membranwachstum verhindert und dass eine gestörte Balance von Phosphoinositiden einen Pathomechanismus von tomaculösen Neuropathien darstellt. Somit identifizieren wir den PI3K-AKT-Signalweg als ein mögliches Ziel zukünftiger Therapiekonzepte für hereditäre Neuropathien des Menschen.

Die Dissertation befasst sich mit der Untersuchung der Ko-Expression des GFAP- und des PLP-Promotors in Müllerzellen der Netzhaut transgener Mäuse. Die verwendete Mauslinie ist tripel-transgen für den GFAP- und den PLP-Promotor sowie für einen ROSA26-Reporter. Durch die Quantifizierung der EYFP-Expression in Müllerzellen konnte gezeigt werden, dass es nach akuter ischämischer Schädigung sowie einer angeborenen retinalen Degeneration in Müllerzellen zu einer Aktivierung des oligodendrozytären PLP-Promotors kommt. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Sox-9, der sowohl für die Entwicklung der Müllerzellen als auch für die Oligodendrogenese von entscheidender Rolle ist, mit dieser Promotoraktivierung korreliert. Diese Ergebnisse implizieren, dass Müllerzellen im Rahmen ihrer Stammzelleigenschaften in der Lage sind, auf embryonale Entwicklungsprozesse, die auch die oligodendrozytäre Zellreihe beinhalten, zurückgreifen zu können.

Dans le but de générer une souris transgénique produisant des anticorps humains, les trois loci humains (HC, LCκ et LCλ) ont été reconstitués sous forme de YAC circulaires. Puis, pour simplifier la manipulation des gènes codant pour la chaîne lourde, quatre vecteurs plasmidiques qui résument l’information génétique contenue dans le locus humain de la chaîne lourde ont été réalisés. La construction HC Minilocus (78 kbp) est donc composée des 13 segments V sélectionnés, de la région D-J synthétisée et des gènes codant pour les parties constantes de type μ, ɣ3 et ɣ1. Trois autres constructions (~22 kbp) ont été dérivées des étapes intermédiaires de clonage. Elles sont basées sur 7 segments V et la région D-J synthétisée. Le HC Microlocus Classic (22 kb) a été obtenu après clonage du gène codant pour la partie constante ɣ1 en 3’ des éléments V, D et J précédemment cités; cette construction code pour des chaînes lourdes d’IgG1 (ɣ1 HC). De la même façon, le HC Microlocus Light (21.5 kb) contient le gène codant pour ɣ1 CH1-, cette construction code donc pour des chaînes lourdes IgG sans domaine CH1 (ɣ1 HC CH1-). Les chaînes lourdes de ce type sont exprimées sans être associées à des chaînes légères, à l’image de ce qui est observé chez les camélidés (Heavy Chain only antibodies). Enfin le HC Microlocus Light shRNA (22 kbp) est une construction basée sur le Microlocus Light à laquelle a été ajoutée une séquence codant pour quatre shRNA (small hairpin RNA) visant à réprimer l’expression d’IgM murin. Ce locus est destiné à être injecté dans des souris natives (wilde type, WT). La fonctionnalité de ces quatre vecteurs a été évaluée par transfection dans la lignée cellulaire 300-19, des lymphocytes pro B d’origine murine pouvant progresser du stade pro B au stade de cellule B mature, lorsqu’elles sont maintenues en culture. Pour les quatre constructions, plusieurs réarrangements DJ et VDJ ont été identifiés, montrant une grande diversité combinatoire et jonctionelle. Par cytométrie en flux (FACS), des chaînes lourdes humaines ont été identifiées dans le cytoplasme et à la surface des cellules transfectées avec les trois constructions intermédiaires. Les cellules exprimant des chaînes lourdes en surface ont été enrichies par FACS. Par la suite, en utilisant des méthodes immuno-enzymatiques (ELISA et ELISPOT), il a été prouvé que les chaines lourdes d’anticorps humains étaient secrétées dans le milieu extracellulaire. La transgénèse avec les constructions HC Microlocus Light et HC Microlocus Light shRNA s’est révélée efficace puisque nous avons obtenu plusieurs animaux transgéniques. Aucune cellule B n’a été détectée dans les souris HC Microlocus Light (background HC KO); alors que cette même construction associée à un shRNA (HC Microlocus Light shRNA) dans une souris transgénique au système immunitaire humoral intact, montre l’expression de chaînes lourdes d’anticorps humains dans le cytoplasme et à la surface des cellules B. La chaine lourde humaine est exprimée en parallèle des immunoglobulines endogènes à la surface des cellules pre-B, ainsi que dans les cellules B immatures et matures. / In order to generate a transgenic mouse producing human antibodies, three human loci (HC, LCκ et LCλ) were reconstituted in the form of circular YAC. Then, to simplify the manipulation of genes encoding the heavy chain, four vectors summarizing the genetic information contained in the human heavy chain locus were designed and cloned. The HC Minilocus (78 kbp) is composed of 13 V segments, a synthetic DJ cluster and the genes encoding the constant parts Cμ, Cɣ3 and Cɣ1. Three other constructions (~22 kbp) were derived from the intermediate cloning steps. They are based on 7 V segments and a DJ region synthesized. The HC Microlocus Classic (22 kbp) was obtained after cloning of the gene encoding the constant part ɣ1 in 3' of the V , D and J elements mentioned above; this construct encodes the heavy chain of IgG1 (ɣ1 HC). The HC Microlocus Light (21.5 kb) contains the gene encoding ɣ1 CH1-, therefore, this construction encodes IgG1 HC without CH1 domain (ɣ1HC CH1-). Such HC are expressed without being associated with light chain (Heavy Chain only antibodies). Finally, the HC Microlocus Light shRNA (22 kb) is based on the HC Microlocus Light to which was added a sequence encoding four shRNA (small hairpin RNA) to repress the murine IgM expression. This locus is designed to be injected into wild type mouse. The functionality of the four reduced human HC constructs was assessed in mouse cells. The 300-19 cell line was used because is a pro-B cell line able to rearrange endogenous or transgenic Ig genes and to express the rearranged genes as Ig proteins. 300-19 cells were transduced with the four reduced human HC constructs and the expression of the transgenic Ig genes was investigated in detail. Indeed, DJ and VDJ rearrangement, recombinatory diversity, junctional diversity, transcription, mRNA maturation, alternative splicing, Ig surface expression and secretion were assessed. The data demonstrated that these constructs undergo editing and processing in murine cells and give rise to a large diversity of human heavy chains. The HC Microlocus Light was injected in HC knock out mouse oocytes and the HC Microlocus Light shRNA (which is exactly identical to the Microlocus Light concerning the antibody gene part) in wild type mouse oocytes. Injection in wild type mice led to human γ1 HC expression, whereas injections in HC KO mice did not show any B cell population reconstitution and consequently no human HC γ1 expression. Transgenic human ɣ1 HC and endogenous mouse IgM are co-expressed at the surface of progenitor-, immature- and mature B cells.

Die Dissertation befasst sich mit der Untersuchung der Ko-Expression des GFAP- und des PLP-Promotors in Müllerzellen der Netzhaut transgener Mäuse. Die verwendete Mauslinie ist tripel-transgen für den GFAP- und den PLP-Promotor sowie für einen ROSA26-Reporter. Durch die Quantifizierung der EYFP-Expression in Müllerzellen konnte gezeigt werden, dass es nach akuter ischämischer Schädigung sowie einer angeborenen retinalen Degeneration in Müllerzellen zu einer Aktivierung des oligodendrozytären PLP-Promotors kommt. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Sox-9, der sowohl für die Entwicklung der Müllerzellen als auch für die Oligodendrogenese von entscheidender Rolle ist, mit dieser Promotoraktivierung korreliert. Diese Ergebnisse implizieren, dass Müllerzellen im Rahmen ihrer Stammzelleigenschaften in der Lage sind, auf embryonale Entwicklungsprozesse, die auch die oligodendrozytäre Zellreihe beinhalten, zurückgreifen zu können.:Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................................... 3 Bibliographische Darstellung ..................................................................................................... 5 Abkürzungsverzeichnis und Erläuterungen ................................................................................ 6 1 Einleitung ............................................................................................................................ 8 1.1 Die Retina als Teil des Auges ................................................................................................. 8 1.1.1 Aufbau .............................................................................................................................. 8 1.2 Die gliale Müllerzelle ............................................................................................................ 12 1.2.1 Definition und Morphologie der Müllerzellen ............................................................... 12 1.2.2 Funktion .......................................................................................................................... 13 1.2.3 Ursprung und Ontogenese der Müllerzelle ..................................................................... 14 1.3 Erkrankungen der Netzhaut .................................................................................................. 15 1.3.1 Akute Läsionen ............................................................................................................... 15 1.3.2 Chronische Erkrankungen der Netzhaut ......................................................................... 15 1.3.3 Die Rolle der Müllerzelle in der erkrankten Retina ....................................................... 16 1.4 Mausgenetik .......................................................................................................................... 18 1.4.1 Das Cre-loxP-System ..................................................................................................... 18 1.5 Pax-6 und Sox-9: Transkriptionsfaktoren spezifizieren das Zellschicksal ........................... 24 1.5.1 Die PAX-Familie ............................................................................................................ 24 1.5.2 SOX-9-Gene ................................................................................................................... 25 2 Ziele .................................................................................................................................. 26 3 Material und Methoden ..................................................................................................... 27 3.1 Material ................................................................................................................................. 27 3.1.1 Chemikalien .................................................................................................................... 27 3.1.2 Antikörper ....................................................................................................................... 27 3.1.3 Größenstandards ............................................................................................................. 28 3.1.4 Mauslinien ...................................................................................................................... 29 3.1.5 Geräte ............................................................................................................................. 31 3.2 Methoden .............................................................................................................................. 31 3.2.1 Genotypisierung transgener Mäuse ................................................................................ 31 3.2.2 Akute retinale Läsion durch Anlegen eines erhöhten Augeninnendrucks („high intraocular pressure“, HIOP) .......................................................................................... 37 3.2.3 Herstellung und Fixierung der retinalen Gewebsproben ................................................ 37 3.2.4 Immunhistochemische Färbungen .................................................................................. 38 3.2.5 Mikroskopische Auswertung .......................................................................................... 39 3.2.6 Datenverarbeitung und Statistik ..................................................................................... 41 4 Ergebnisse ......................................................................................................................... 42 4.1 Technische Aspekte: Vergleich der Quantifizierung in Ganzpräparate und Querschnitte ... 42 4.1.1 Vergleich der Abbildungen ............................................................................................ 42 4.1.2 Auszählung Retina-Ganzpräparate ................................................................................. 43 4.1.3 Auszählung der Zellen in Querschnitten der Netzhaut ................................................... 45 4.1.4 Vergleich der Quantifizierung von Ganzpräparaten und Querschnitten ........................ 46 4.1.5 Quantifizierung ............................................................................................................... 48 4.2 Analyse der Reporterexpression in der Retina tripel-transgener Mäuse ............................... 49 4.2.1 Quantitative Auswertung GS-positiver Müllerzellen ..................................................... 49 4.2.2 Quantitative Auswertung EYFP-positiver Müllerzellen ................................................ 51 4.2.3 Auswertung des prozentualen Anteils der EYFP-positiven Müllerzellen ...................... 53 4.3 Auswertung der Transkriptionsfaktorexpression von Pax-6 und Sox-9 ............................... 56 4.3.1 Auswertung der Pax-6-positiven Müllerzellen ............................................................... 57 4.3.2 Auswertung der Sox-9-positiven Müllerzellen .............................................................. 60 5 Diskussion ......................................................................................................................... 63 5.1 Die GFAP-Expression in der Müllerzellgliose ..................................................................... 63 5.2 Auswertung und Vergleich der retinalen Ganzpräparate und Querschnitte ......................... 64 5.3 Die Untersuchung der Promotoraktivität nach retinaler Ischämie ........................................ 65 5.4 Die Untersuchung der Promotoraktivität bei angeborener retinaler Degeneration ............... 66 5.5 Die Rolle der Transkriptionsfaktoren Pax-6 und Sox-9 ........................................................ 68 5.5.1 Pax-6 ............................................................................................................................... 68 5.5.2 Sox-9 ............................................................................................................................... 69 5.6 Einordnung der Ergebnisse in die Zellbiologie der Müllerzelle ........................................... 72 6 Zusammenfassung ............................................................................................................. 74 7 Literaturverzeichnis .......................................................................................................... 77 8 Lebenslauf ......................................................................................................................... 83 9 Danksagung ....................................................................................................................... 84 10 Eigenständigkeitserklärung ............................................................................................... 85

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Advancements in human genomics have simultaneously enhanced our basic understanding of the human body and ability to combat debilitating diseases. Historically, research has shown that there have been many hindrances to realizing this medicinal revolution. One hindrance, with particular regard to the kidney, has been our inability to effectively and routinely delivery genes to various loci, without inducing significant injury. However, we have recently developed a method using hydrodynamic fluid delivery that has shown substantial promise in addressing aforesaid issues. We optimized our approach and designed a method that utilizes retrograde renal vein injections to facilitate widespread and persistent plasmid and adenoviral based transgene expression in rat kidneys. Exogenous gene expression extended throughout the cortex and medulla, lasting over 1 month within comparable expression profiles, in various renal cell types without considerably impacting normal organ function. As a proof of its utility we by attempted to prevent ischemic acute kidney injury (AKI), which is a leading cause of morbidity and mortality across among global populations, by altering the mitochondrial proteome. Specifically, our hydrodynamic delivery process facilitated an upregulated expression of mitochondrial enzymes that have been suggested to provide mediation from renal ischemic injury. Remarkably, this protein upregulation significantly enhanced mitochondrial membrane potential activity, comparable to that observed from ischemic preconditioning, and provided protection against moderate ischemia-reperfusion injury, based on serum creatinine and histology analyses. Strikingly, we also determined that hydrodynamic delivery of isotonic fluid alone, given as long as 24 hours after AKI is induced, is similarly capable of blunting the extent of injury. Altogether, these results indicate the development of novel and exciting platform for the future study and management of renal injury.