Orientador: José Luis Laus / Coorientador; Marcela Aldrovani Rodrigues / Banca: João Antonio Tadeu Pigatto / Banca: Bruno Watanabe Minto / Banca: Alexandre Lima de Andrade / Banca: Annelise Carla Camplesi dos Santos / Resumo: Visando ao estudo de técnicas para a expansão "ex-vivo" de células destinadas à reconstrução de superfícies oculares com deficiência de células tronco limbais (LSCD), explantes superficiais obtidos do limbo de coelhos foram cultivados sobre membrana amniótica (MA) humana. Dois grupos, diferindo quanto à configuração do sistema de cultivo celular, foram concebidos: G-mono, contendo células epiteliais expandidas sobre a face de uma camada de MA (sistema de cultivo bidimensional), e G-Sand, composto por células "ensanduichadas" entre duas MAs (sistema de cultivo tridimensional). Seis culturas celulares de cada grupo foram avaliadas por imuno-histoquímica quanto à presença de células progenitoras ou indiferenciadas e a de células em proliferação (avaliação pré-transplante), enquanto 21 foram transplantadas para olhos de coelhos com LSCD (n=10). Os olhos receptores de células cultivadas foram clinicamente avaliados, por até 63 dias. A terapia limbal adotada na pesquisa foi autógena. Após avaliações clínicas, os coelhos foram aleatoriamente distribuídos em parcelas e submetidos à eutanásia, para colheita de córneas (dias 14 e 63 após o transplante) que foram avaliadas quanto à morfometria tecidual e à expressão quali-quantitativa de imunomarcadores de indiferenciação celular (fator de transcrição nuclear delta p63), de proliferação celular (antígeno nuclear da proliferação celular, PCNA) e de apoptose (teste de TUNEL). Diferenças com P < 0.05 foram consideradas significativas. As c... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / In order to study techniques for the ex vivo expansion of cells for the reconstruction ocular surfaces with limbal stem cell deficiency (LSCD), superficial explants obtained from rabbit limbus were cultured on human amniotic membrane (MA). Two groups, differing in the configuration of the cell culture system, were designed: G-mono, containing expanded epithelial cells on an MA layer (two-dimensional culture system), and G-Sand, composed of cells "sandwiched" between two MAs (three-dimensional culture system). Six cell cultures of each group were processed by immunohistochemistry to identify the presence of progenitor or undifferentiated cells and for proliferating cells (pre-transplant evaluation), and 21 constructs were transplanted onto rabbit eyes with LSCD. The limbal therapy adopted in the research was autogenous and the transplanted eyes were clinically evaluated for up to 63 days. After clinical evaluations, the rabbits were randomly distributed into subgroups and submitted to euthanasia, to harvest corneas (days 14 and 63 post-transplant) that were evaluated for tissue morphometry and the qualitative-quantitative expression of imunnomarkers of indiferentiated cells (delta-p63 transcriptional factor), proliferative cells (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) and apoptosis (TUNEL assay). Differences with P <0.05 were considered significant. G-Sand... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

As lesões medulares acometem anualmente milhares de pessoas e animais em todo o mundo, causando diversos prejuízos econômicos e psicológicos. As principais causas das lesões medulares são traumas automobilísticos e doenças do disco intervertebral. Muito embora a medicina esteja bastante avançada no campo da neurocirurgia, a cura para esse tipo de lesão ainda esta longe de ser obtida. O avanço das pesquisas no campo da terapia celular em lesões medulares surge como uma esperança para os pacientes crônicos. Neste trabalho buscamos avaliar a reposta do tratamento com células-tronco de medula óssea fetal canina em cães com lesão medular crônica toracolombar. Nosso trabalho se baseia em parâmetros clínicos, comportamentais, de imagem e fisioterápicos. Antes de adentrar no experimento, todos os cães foram submetidos a vários exames pré-operatórios (hemograma, exames bioquímicos, eletrocardiograma) para então serem encaminhados para o exame de ressonância nuclear magnética visando um diagnostico mais preciso da lesão. Após esse exame, os cães foram avaliados por fisioterapeutas veterinários que não pertenciam ao nosso grupo de pesquisa para se estabelecer uma pontuação no teste comportamental de Olby. Os animais também tiveram alguns outros reflexos testados (dor profunda, reflexo de panículo). Após a primeira avaliação, os animais foram submetidos à procedimento cirúrgico de descompressão da medula espinhal e aplicação de células-tronco da medula óssea fetal canina. Durante o procedimento foram injetados 1x106 células diretamente em 3 pontos distintos da medula espinhal. Após o procedimento os cães foram encaminhados para a fisioterapia, e por 3 meses, foram submetidos a diversos exercícios de reabilitação com o intuito de potencializar um possível efeito benéfico da terapia celular. Durante a fisioterapia, os animais foram filmados com o intuito de acompanhar a sua evolução, e após o termino da fisioterapia foram novamente avaliados pelos fisioterapeutas. Ao final do experimento 7 animais foram operados e os resultados obtidos demonstraram um aumento do reflexo de marcha em 6 deles. O único animal que não apresentou essa melhora da marcha foi aquele acometido por outra patologia associada à compressão medular. Esses resultados nos levam a sugerir uma ação benéfica da terapia celular em cães portadores de lesão medular crônica. Por outro lado sugere continuar recrutando animais com o objetivo de aprimorar as técnicas utilizadas, para conseguir resultados cada vez melhores. / Spinal cord injuries annually involve thousands of people and animals worldwide, causing economic and psychological damages. The main causes of spinal cord injuries are vehicular traumas and intervertebral disc diseases. Although medicine is very advanced in neurosurgery field, the cure for this type of injury is still far from being achieved. Research progresses in cell therapy for spinal cord injuries appear to be a hope for chronic patients. In this article we aimed to evaluate clinical responses to the treatment using canine fetal bone marrow stem cells in dogs with thoracolumbar chronic spinal cord injury. Our study was based on the evaluation of clinical signs, animal behavior, imaging and physiotherapy aspects. Before clinical-surgery trial, all dogs underwent to preoperative tests as hemogram, blood chemistry, electrocardiogram and to nuclear magnetic resonance exam, in order to stablish more accurate diagnosis of the injury. Following clinical exams, Olby score was determined by evaluating animal behavior. Olby tests were performed by external scientific research group, composed by veterinary phisiotherapists, in order to guarantee blind evaluation. Animals were also tested to deep pain and panniculus reflexes. s, After being evaluated, animals underwent surgical spinal cord decompression and to a 1x106 stem cells injection in three different sites of the spinal cord. After the procedure, dogs were referred to physiotherapy for three months, undergoing to a variety of rehabilitation exercises in order to improve cell therapy hypothetical benefic effect. During therapy, animals were filmed in order to monitor their evolution, and after the end of physiotherapy they were re-evaluated by physiotherapists. At the end of the experiment, 7 animals were operated and had resulted in an increase of reflex motion in 6 of them. The only animal that showed no such improvement was the one whos had other pathology associated with the spinal cord compression, these results lead us to believe in a beneficial action of cell therapy in dogs with chronic spinal cord injury and suggests continue recruiting animas with the aim of improving the techniques used to achieve better results.

A produção de células-tronco induzidas (iPSC) a partir de fibroblasto fetal canino abre caminhos para a obtenção de células pluripotentes e o estudo de sua aplicabilidade para terapias alternativas na medicina veterinária. Neste contexto, este trabalho investigou metodologias adequadas avaliando a eficiência destas, para a produção de células-tronco pluripotentes no modelo canino in vitro (CTE-like), uma vez que a produção de células-tronco embrionárias verdadeiras, cultivadas a partir da MCI de blastocistos, ainda não foi completamente caracterizada em animais domésticos. Os experimentos visaram o aumento do conhecimento de fatores envolvidos no processo de reprogramação em cães, bem como a produção de tais linhagens e sua completa caracterização. No primeiro experimento, foi comparada a infecção retroviral, já padronizada por diversos grupos, com a reprogramação epissomal, inédita para a espécie, na tentativa de induzir células à pluripotência sem a integração viral, e ainda, estratégias para o aumento da eficiência de reprogramação, onde o plasmídeo epissomal foi somado a fatores de transcrição. A reprogramação epissomal gerou colônias quando acrescida do fator c-MYC, que provavelmente, aumentou a proliferação destas células produzindo colônias iPS com morfologia típica e positivas para o teste da fosfatase alcalina. Tais resultados, ainda preliminares pra conclusões, são essenciais para o processo de obtenção de linhagens sem a integração viral, aumentando a aplicabilidade na terapia celular. No segundo experimento objetivou-se avaliar os fatores OCT4 e SOX2 associados a proteínas repórteres. Os fibroblastos que receberam estes fatores, foram analisados por citometria de fluxo, permitindo a avaliação da influência de cada fator no processo de reprogramação, além de permitir a separação (sorting) das células que integraram o gene, aumentando a eficiência de reprogramação e o conhecimento biológico dos mecanismos de integração rastreados por uma proteína repórter. A análise por microscopia de fluorescência revelou que a distribuição de proteínas repórteres foi semelhante entre as duas diferentes construções proteicas e que não se restringe a uma região da célula em particular. OCT4 e SOX2 mostraram uma elevada expressão exógena de cada gene alvo, bem como células dupla positivas. No entanto, nenhuma interação foi observada pelo menos 6 dias após a transdução. O último capítulo experimental descreveu o mecanismo de reprogramação por integração lentiviral para indução da pluripotência em fibroblastos fetais de cão. As linhagens obtidas e completamente caracterizadas neste estudo foram independentes de LIF ou qualquer outra suplementação com inibidores, resistentes ao repique enzimático (Tryple Express), sendo apenas bFGF dependentes. Foram obtidas 66 linhagens clonais, das quais 10 (7 h+mOSKM e 3hOSKM) se mantiveram por 15 ou mais passagens e foram utilizadas para todos os testes de caracterização in vitro, com eficiência máxima de reprogramação de 0,001%. Todas as colônias foram positivas para o teste da fosfatase alcalina, bem como formaram corpos embrióides e se diferenciaram de forma espontânea, além de expressarem altos níveis dos fatores endógenos OCT4 e SOX2. In vivo, as colônias foram capazes de desenvolver tumor 120 dias após a inoculação (confirmado por análise histopatológica) comprovando sua origem predominantemente mesodérmica. A integridade cromossomal das linhagens foi avaliada por hidridização FISH, que não evidenciou qualquer tipo de anomalia. A completa caracterização de tais linhagens, bem como os experimentos não integrativos e com fatores associados a proteínas repórteres, aumentam o conhecimento da tecnologia de reprogramação, estabelecendo novas estratégias para indução da pluripotência de forma mais eficaz e segura para seu uso em testes clínicos e terapia celular / The production of induced pluripotent stem cells (iPSC) from canine fetal fibroblast opens new ways for obtaining pluripotent cells and study its applicability for alternative therapies in veterinary medicine. In this context, this study investigated appropriate methods for producing pluripotent stem cells using a in vitro canine model (ESC-like), so far the production of true embryonic stem cells from ICM cultured blastocysts has not been fully characterized in domestic animals. The experiments aimed at increasing knowledge of the factors involved in reprogramming process in dogs, as well as the production of such strains and complete characterization. In the first experiment, a retroviral infection was compared to episomal reprogramming (never done for this specie) in an attempt to induce cells to pluripotency state without viral integration, also to observe the development of cells receiving separately the episomal plasmid plus transcription factors. The generation of colonies was possible only in the episomal plus c-MYC factor group, leading to increased cell proliferation producing iPS colonies with typical morphology and positive for the alkaline phosphatase detection. These results, so far as preliminary conclusions, are essential to obtaining strains without viral integration, increasing its applicability for clinical cell therapy. In the second experiment, we aimed to evaluate the OCT4 and SOX2 factors associated with fluorescent reporter proteins. These were analyzed by flow cytometry allowing the performance evaluation of each factor on the reprogramming process the fluorescence activated separation of cells containing the integrated gene, increasing the enriching the efficiency of reprogramming. Fluorescence microscopy analysis showed that the distribution of reporter protein was similar between the two different protein structures and not restricted to a particular cell region. OCT4 and SOX2 showed a high exogenous expression of each target gene, and double positive cells. However, no colony formation was observed at least 6 days after transduction. The last experimental chapter aimed to described the reprogramming mechanism of lentiviral integration to induce pluripotency in dog fetal fibroblasts. The lines obtained were fully characterized in this study, showing independency of LIF or any other supplemental inhibitors, resistance to enzymatic process (Tryple Express) and bFGF dependency only. A total of 66 clonal strains were obtained (hOSKM and h+mOSKM) while 10 (7 h+m and 3h) were maintained for 15 or more passages and used for in vitro characterization tests, with maximum efficiency of reprogramming 0.001% . All colonies were positive for the alkaline phosphatase detection, embryoid bodies formation, spontaneously differentiated and expressed high levels of endogenous OCT4 and SOX2. In vivo, the colonies were able to developed tumors 120 days after inoculation (confirmed via histopathology analysis), with predominantly mesodermal tissues. Chromosomal evaluations were made by FISH hybridization showing no chromosomal abnormality in iPSCs canine lines. The fully characterization of such lines as well as non-integrated experiments and factors associated via reporter proteins increases the knowledge of the iPSCs technology, establishing new strategies for more efficient and safe induction of pluripotency for potential use in cell therapy and clinical trials

O meduloblastoma é o tumor maligno do sistema nervoso central mais frequente na infância e adolescência. A expressão de genes tipicamente expressos em células-tronco está correlacionada com pior prognóstico em pacientes com meduloblastoma e a expressão de POU5F1 se mostrou capaz de distinguir pacientes com desfecho clínico desfavorável e pior sobrevida. Apesar do seu valor prognóstico, não há evidências diretas da contribuição de OCT4 para a aquisição de fenótipos mais agressivos em meduloblastoma. Nesse contexto, o presente trabalho investigou o papel da isoforma OCT4A em características pró-tumorigênicas de meduloblastoma in vitro e in vivo, e também avaliou as alterações moleculares que podem ser responsáveis pela aquisição de fenótipo mais agressivo em células de meduloblastoma humano. Para tanto, foi realizada a superexpressão de OCT4A mediada por retrovírus em três linhagens celulares de meduloblastoma (Daoy, D283Med e USP-13-Med). As células de meduloblastoma com superexpressão de OCT4A exibiram maior proliferação e alterações no ciclo celular. Foram observados também aumentos na atividade clonogênica, geração de esferas tumorais e desenvolvimento tumoral em modelo subcutâneo, sendo esses efeitos dependentes dos níveis de OCT4A. A avaliação da mobilidade celular in vitro demonstrou diminuição na adesão celular e aumento da invasão celular de esferoide 3D. Em modelo ortotópico de meduloblastoma, as células com superexpressão de OCT4A geraram tumores mais desenvolvidos, com fenótipos mais agressivos, infiltrativos e metastáticos. A superexpressão de OCT4A foi associada a maior instabilidade genômica, entretanto, as aberrações em números de cópias variaram em frequência e tipo de alteração dependendo da linhagem celular, e sendo pouco associada com os genes diferencialmente expressos. De forma interessante, uma relevante expressão diferencial de RNAs não-codificadores de proteínas foi observada em células de meduloblastoma com superexpressão de OCT4A, incluindo os recém descobertos e pouco caracterizados RNAs não codificadores longos, além de múltiplos RNAs pequenos nucleolares. Assim, os resultados aqui apresentados fundamentam a relevância de fatores envolvidos em pluripotência para o agravamento de traços associados com desfecho clínico desfavorável em meduloblastoma e destacam o valor prognóstico e terapêutico de OCT4A neste tumor pediátrico do sistema nervoso central / Medulloblastoma is the most common malignant brain tumor in infants. The expression of typical pluripotency genes is correlated with poor prognosis in medulloblastoma and POU5F1 expression was shown capable of discriminating patients with poor survival outcome. Despite this prognostic value, direct evidences of OCT4 contribution to more aggressive traits in medulloblastoma are missing. In this context, we investigated the role of OCT4A isoform on pro-tumorigenic features of medulloblastoma in vitro and in vivo and evaluated molecular alterations that could be responsible for acquisition of a more aggressive phenotype in medulloblastoma cells. Retroviral-mediated overexpression of OCT4A were performed in three medulloblastoma cell lines (Daoy, D283Med and USP-13-Med). Medulloblastoma cells overexpressing OCT4A displayed enhanced cell proliferation and cell cycle alterations. Increased clonogenic activity, tumorsphere generation capability and subcutaneous tumor development were also observed, and these effects were OCT4A expression level-dependent. Evaluation of cell mobility in vitro showed loss of cell adhesion and greater 3D-spheroid invasion. In an orthotopic model of medulloblastoma, OCT4A overexpressing cells generated more developed, aggressive, infiltrative and metastatic tumors. OCT4A overexpression was associated with chromosomal instability but copy number aberrations varied in frequency and type according to the cell line, with little association with differently expressed genes. Interestingly, marked differential expression of non-coding RNAs, including newly discovered, still poorly characterized, long non-coding RNAs and multiple small nucleolar RNAs were observed in medulloblastoma cells with OCT4A overexpression. Altogether, our findings support the relevance of pluripotency-related factors in the aggravation of medulloblastoma traits classically associated with poor clinical outcome, and underscore the prognostic and therapeutic value of OCT4A in this challenging type of pediatric brain cancer

As células tronco possuem a capacidade de auto renovação ilimitada e de se manterem indiferenciadas durante um período prolongado de tempo, até se diferenciarem em uma linhagem celular específica. Devido as dificuldades encontradas na utilização de células embrionárias por questões éticas, de segurança e histocompatibilidade e a limitada plasticidade das células tronco adultas, as células tronco fetais, derivadas de tecidos extraembrionários, aparecem no cenário terapêutico como uma alternativa promissora. Uma vez que apresentam alta capacidade de proliferação e expansão in vitro, além de sua característica imunogênica, por se encontrarem na interface materno fetal. Por conta destas características, a membrana amniótica surgiu como uma nova e importante fonte de células tronco em diferentes espécies. Neste trabalho, foram utilizados 8 fetos de coelhos para a coleta da membrana amniótica. A membrana foi isolada pela técnica de explante, as amostras foram cultivadas em meio DMEM-HIGH, e posteriormente criopreservadas nas passagens P4 e P8 para realizar os experimentos. Em cultivo, essas células apresentaram aderência a placa, alta capacidade de proliferação e morfologia semelhante à fibroblastos. Na caracterização imunofenotípica, houve expressão de marcadores de citoesqueleto, de células mesenquimais, proliferação, pluripotência e para precursores de células hematopoiéticas, embora não tenha ocorrido a expressão de marcadores de células hematopoiéticas (CD-45) e de células precursoras neuronais. Quando induzidas a diferenciação in vitro, as células amnióticas tiveram capacidade de se diferenciarem nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica. Além disso, quando injetadas em camundongos nude, não foi verificada a formação de tumor. Nossos resultados demostram que células de membrana amniótica de coelho podem ser consideradas células tronco mesenquimais com possibilidade de serem utilizadas no futuro na terapia celular / Stem cells are capable of unlimited self renewal and to remain undifferentiated for a prolonged period of time up to differentiate into a specific cell lineage. Due to the difficulties in the use of embryonic cells due ethical reasons, security and histocompatibility, and in the other hands, the limited plasticity of adult stem cells, fetal stem cells, derived from extraembryonic tissues, appear in the therapeutic setting as a promising alternative. They have high capacity of proliferation and in vitro expansion, as well as immunogenic properties, since they are at the maternal-fetal interface. Due to these characteristics, the amniotic membrane has emerged as an important new source of stem cells in different species. In this work, we used 8 fetuses of rabbits to collect amniotic membrane. The membrane was isolated by the explant technique. Samples were cultured in DMEM-HIGH, and cryopreserved in the passages P4 and P8 in order to perform the experiments. In culture, these cells exhibited adhesion to the dishes, high proliferative capacity and fibroblast-like morphology. In immunophenotypic characterization, there was expression of markers related to cell cytoskeleton, mesenchymal stem cells, proliferation, pluripotency, and hematopoietic precursor cells. And there was no expression of hematopoietic cell markers (CD-45) and neuronal precursor cells. When induced to in vitro differentiation, the amniotic cells were able to differentiate in osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. Furthermore, when injected into nude mice, tumor formation has not been verified. Our results demonstrate that rabbit amniotic membrane cells can be considered mesenchymal stem cells with possibility to be used in the future in cell therapy

O saco vitelino é uma das membranas extra-embrionárias que desempenha um papel importante para a sobrevivência inicial do embrião, atua como fonte de nutrição durante o período em que a placenta verdadeira ainda não está completamente formada. É uma provável fonte de células tronco, o qual abriga as primeiras células do sangue durante o desenvolvimento em mamíferos, os eritrócitos, os quais expressam fatores de transcrição que especificam estas células a seu destino hematopoiético. O objetivo deste trabalho foi caracterizar as células tronco hematopoéticas provenientes do saco vitelino de embriões bovinos, em diferentes fases gestacionais, sendo estes coletados em abatedouro local. Para descrição da análise macroscópica e cultivo celular das células do saco vitelino, os embriões bovinos foram divididos em grupos de idade gestacional: Grupo I (25 a 29 dias), Grupo II (30 a 34 dias), Grupo III (35 a 39 dias), Grupo IV (40 a 44 dias) e Grupo V (45 a 50 dias) em que permaneceram mais tempo em cultura e apresentaram a formação de aglomerados celulares, diferente dos grupos IV e V (40 a 45 dias) em que permaneceram poucos dias em cultura e não apresentaram aglomerados celulares. Esta divergência relaciona-se à idade gestacional (45 a 50 dias), período em que se inicia a regressão do saco vitelino. Em citometria de fluxo os grupos I, II e III (25 a 39 dias) obtiveram características semelhantes, alta expressão de marcadores hematopoéticos (CD34, CD90 e CD117). Para os grupos IV e V (40 a 50 dias) observa-se um declínio da expressão de CD34 e CD117 (marcadores hematopoéticos) e no grupo V houve um acréscimo da expressão de CD45 (marcador para leucócito) confirmando que estas células não estão mantendo-se indiferenciadas As células demonstraram ser resistentes a criopreservação, capazes de formar colônias em matriz de Metilcelulose, mostraram a formação de colônias após 14 dias em cultivo e a morfologia para células sanguíneas (linfócitos e monócitos) foi confirmada na citologia celular. Na expressão gênica obteve-se baixa expressão do gene GATA3, níveis diferentes de expressão entre os grupos para o marcador RUNX1 e ANXA5. Dessa forma, nossos achados mais significativos comprovaram o isolamento de células hematopoéticas a partir do saco vitelino de embriões bovinos, sugerindo que este é uma fonte laboriosa, porém viável e eficaz para a obtenção de células tronco para futuras aplicações na terapia celular e gênica. / The yolk sac is one of the extra-embryonic membranes which plays an important role in early embryonic survival and serves as source of nutrition during the period where in the placenta is not completely true formed. The yolk sac is a likely source of stem cells, which have first blood cells during development in mammals, the red blood cells, which express transcription factors that specify these hematopoietic cells to their destination. This study aimed to identify and characterize hematopoietic stem cells from the yolk sac of bovine embryos at different stages of pregnancy, which are collected at a local slaughterhouse. For a description of the macroscopic and cellular culture of yolk sac cells, are as follows bovine embryos were divided into groups of gestational age: Group I (25 to 29 days), Group II (30 to 34 days), Group III (35 to 39 days ), Group IV (40 to 44 days) and Group V (45 to 50 days) which stayed longer in culture and showed the formation of cell clusters, different from groups IV and V (40-45 days) in few that remained days in culture and showed no cell clumps. This divergence is related to gestational age (45 to 50 days), during which begins regression of the yolk sac. In flow cytometry groups I, II and III (25 to 39 days) had similar characteristics, high expression of hematopoietic markers (CD34, CD90 and CD117). For the groups IV and V (40 to 50 days) it is observed a decrease in expression of CD117 and CD34 (hematopoietic markers) and in group V were increased expression of CD45 (leukocyte marker), confirming that these cells are not keeping Undifferentiated cells are shown to be resistant to cryopreservation, capable of forming colonies in methylcellulose matrix showed the formation of colonies after 14 days in culture morphology and to blood cells (lymphocytes and monocytes) was confirmed by cytology cell. In gene expression was low GATA3 gene expression, different levels of expression between the groups for the marker and RUNX1 ANXA5. Our most significant findings confirmed the isolation and identification of hematopoietic cells from the bovine embryo yolk sac, therefore, it is feasible and an effective way of obtaining stem cells for future applications in cell therapy and gene.

Orientador: Reinaldo Marchetto / Coorientador: Gildásio de Cerqueira Daltro / Banca: Ademario Galvão Spínola / Banca: Luis Schiper / Resumo: Pseudoartrose é definida como a ausência de evidências radiográficas do processo de consolidação de uma fratura. Células-tronco, são células com capacidade de proliferar e originar células de qualquer linhagem, formando qualquer tecido do organismo. Estudos com animais demonstraram que o uso de medula óssea contendo células do estroma melhoram os resultados do tratamento das pseudoartroses, mas os dados ainda são experimentais e necessitam de mais testes, com número relevante de pacientes, para demonstrar sua segurança e eficácia. Desta forma, este trabalho objetiva a comparação do método tradicional de tratamento da pseudoartrose da tíbia, realizado com o uso de fixador externo, haste ou placa e parafuso com o tratamento combinado do uso das técnicas convencionais e infiltração de células-tronco mesenquimais autólogas. Para isso, foram feitos ensaios clínicos randomizados, aberto, com cegamento dos grupos experimentais, com 18 pacientes diagnosticados com pseudoartrose divididos em dois grupos: grupo controle, formado por 9 pacientes e grupo experimental, também com 9 pacientes. A idade média do grupo foi de 38,3 anos e a maioria se autodeclarou pardo ou negro. O nível de escolaridade mostrou-se baixo, com 72 % dos participantes não tendo concluído o Ensino Médio. Cinco pacientes foram tratados com uso de haste metálica e apenas três tiveram a colocação de fixador externo. O tempo de doença (pseudoartrose) e o tempo cirúrgico não mostraram influenciar no desfecho. Em relação... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Pseudoarhrosis is defined such as no radiographic evidence during consolidation fracture process. Stem cells are undifferentiated cells, multipotent, capable of proliferating and originating cells of any lineage, forming any tissue of the body. Animal studies have shown that using bone marrow containing stromal cells improves the results of pseudoarthrosis treatment, but the results are still experimental and require further testing with a significant number of patients to demonstrate their safety and efficacy. Thus, this study aims to compare the traditional method of treatment of tibial pseudoarthrosis, performed with the use of external fixator, rod or plate and screw with the combined treatment of the use of conventional techniques and infiltration of autologous mesenchymal stem cells. For this, randomized, open-label clinical trials with blinded experimental groups were performed with 18 patients diagnosed with pseudoarthrosis divided into two groups: a control group consisting of 9 patients and an experimental group, also with 9 patients. The mean age of the group was 38.3 years old and the majority self-declared brown or black. The level of schooling was low, with 72% of the participants not having finished high school. Five patients were treated with metal rod and only three had external fixator placement. Disease duration (pseudoarthrosis) and surgical time did not influence the outcome. Regarding the clinical outcome, patients treated with the combination of convent... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-11-01T11:45:18Z No. of bitstreams: 1 TES_CAROLINA_CUCCO_COMPLETO.pdf: 1206857 bytes, checksum: f0c340e4e00138cbbfe5a1fa0ae23e6e (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-11-01T11:45:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TES_CAROLINA_CUCCO_COMPLETO.pdf: 1206857 bytes, checksum: f0c340e4e00138cbbfe5a1fa0ae23e6e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-01T11:45:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TES_CAROLINA_CUCCO_COMPLETO.pdf: 1206857 bytes, checksum: f0c340e4e00138cbbfe5a1fa0ae23e6e (MD5) Previous issue date: 2015-06-15 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Teeth exhibit limited repair in response to damage, and studies have shown that dental pulp stem cells (DPSCs) probably provide a source of cells to replace those damaged and to facilitate repair. Additionally, in vivo transplantation into immunocompromised mice demonstrated the ability of DPSCs to generate functional dental tissue in the form of dentine/pulp-like complexes. Therefore, the purpose of this study was to characterize the endothelial fate of DPSCs in vivo and to start to understand the role of Tie2/Ang-1 signaling pathway on the regulation of the endothelial differentiation of DSPCs.! DPSCs stably transduced with LacZ were seeded into tooth slices and implanted into immunodeficient mice for 7, 14, 21 ad 28 days. A combination of in vitro and in vivo assays were performed to determine the role of Ang-1 in the vasculogenic fate of DPSCs. Histologic analysis and immunohistochemistry from the retrieved tooth slices were performed. Dental pulp stem cells seeded in tooth slice/scaffolds and transplanted into SCID mice showed a continuous crescent number of beta-galactosidase-positive odontoblastic and endothelial cells along the 7, 14, 21 and 28 days of the study. At 21 days beta-galactosidase-positive capillaries located close to murine blood vessels were detected, confirming our previous report (Cordeiro et al, 2008; Sakai et al, 2010). DPSCs exposed to Ang-1 differentiated into cells expressing VEFGR2, CD31 and Tie2. Exposure of VEGFR1-silenced DSPC to Ang-1 and VEGF induced the activation of STAT3, Erk and Akt, while VEGF alone inhibited the phosphorylation of STAT3. This is consistent with the role of Akt and STAT3 in the regulation of cell survival and cell-cell interation of DPSC through Tie2/Ang-1 signaling pathway. This study demonstrates that Angiopoietin-1 is involved in the vasculogenic differentiation of DSPCs. / As c?lulas-tronco provenientes da polpa de dentes adultos (DPSC) s?o uma fonte promissora de c?lulas-tronco para a terapia regenerativa. J? foi demonstrado que elas podem se diferenciar em c?lulas endoteliais, mas os relatos histol?gicos temporais do seu destino ainda n?o foram demonstrados. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo elucidar o destino das DSPC-LacZ, bem como avaliar o efeito de algumas mol?culas envolvidas na diferencia??o endotelial destas c?lulas. Para isso, DPSC Lac-Z foram semeadas em scaffolds de fatias dent?rias e implantadas no subcut?neo de camundongos imunodeficientes. 14 dias ap?s a recupera??o dos tecidos, observou-se c?lulas beta-galagtosidase positivas alinhadas ao longo das paredes internas das fatias de dente, sugerindo a diferencia??o destas em c?lulas semelhantes ? odontoblastos. Ainda neste per?odo, c?lulas beta-galactosidase positivas foram localizadas pr?ximas aos vasos sangu?neos do roedor, algumas formaram estruturas tubulares e continham elementos celulares dentro do seu l?men. Aos 21 dias, um tecido muito semelhante a polpa dental foi encontrado dentro das fatias dentais, e no dia 28 o n?mero de c?lulas betagalactosidade postivas era maior do que todos os periodos anteriores. Ainda, avaliou-se o papel da mol?cula VEGF e Ang-1 na diferencia??o endotelial destas c?lulas bem como na fosforila??o de algumas vias de sinaliza??o. Para isso, um meio de cultura alpha- MEM suplementado com 50 ng/mL rhVEGF + 200 ng/mL rhAng-1, foi utlizado como est?mulo para as DPSC se diferenciarem em c?lulas endoteliais. Durante um per?odo de 28 dias as c?lulas expressaram marcadores endoteliais como VEGFR2, CD31, Ang-1 e Ang-2. Quando utilizamos c?lulas DPSC shRNA VEGFR-1 estimuladas pelas mesmas mol?culas, a fosforila??o de ERK e AKT foi aumentada, o que n?o ocorreu no grupo controle.

Objetivos: Avaliar o potencial terapêutico e a segurança do uso intravítreo de (FMMO) contendo células CD34+ em pacientes portadores de degeneração macular relacionada com a idade na forma atrófica. Casuística e Métodos: Foram avaliados 10 pacientes com degeneração macular relacionada à idade (DMRI) seca e acuidade visual no pior olho <=20/100. Foi obtido aspirado da medula óssea de todos os pacientes, e após o processamento do material no hemocentro, foi injetado 0,1 ml da suspensão de FMMO intravítreo no olho com pior acuidade. Os pacientes foram avaliados no baseline, 1, 3, 6, 9 e 12 meses após a injeção. Todos realizaram medida da melhor acuidade visual corrigida (MAVC), microperimetria, eletrorretinografia multifocal (ERGmf), autofluorescência, Tomografia de coerência óptica (OCT) e responderam o questionário VFQ-25 em todos seguimentos. Também foi realizada angiografia fluoresceínica antes da injeção, seis e doze meses após. Resultados: Todos os pacientes completaram o seguimento de seis meses, e seis finalizaram os doze meses. Antes da injeção, a média da MAVC foi de 1,18 logMAR (20/320-1); variando de 20/125 a 20/640-2. Aos doze meses, a média foi de 1,0 logMAR (20/200), com melhora significativa em todos os meses de seguimento. A média do limiar de sensibilidade na microperimetria mostrou melhora significativa a partir do sexto mês (p=0,009). Ao se dividirem os pacientes com área de atrofia maior e menor, por meio da medida da hipoautofluorescência, observou-se que a melhora foi significativa apenas no grupo de menor atrofia. Não houve diferença significativa na ERGmf. A angiofluoresceinografia não apresentou crescimento de neovasos ou tumores. O questionário de qualidade de vida mostrou diferença significativa na saúde mental (p=0,003) e na visão de cores (p=0,005) e forte tendência à significância na análise que abordou a visão geral (p=0,05) e dependência (p=0,067). Houve declínio em relação à saúde geral (p=0,77). Conclusões: Os resultados indicam que o uso de FMMO intravítreo em pacientes com DMRI é seguro e está associado à melhora da acuidade visual e microperimetria. Pacientes com área menor de atrofia têm melhor resposta. Não é possível afirmar, mas acredita-se no resgate funcional das células em sofrimento, que ainda não se degeneraram. / Objectives: To assess the therapeutic potential and safety of the intraviteral use of a bone marrow mononuclear fraction (BMMF) containing CD 34+ cells in patients with the atrophic form of age-related macular degeneration (AMD). Casuistic and Methods: The study was conducted on 10 patients with the atrophic form of ARMD with worse eye visual acuity <=20/100. Bone marrow was aspirated from each patient under local anesthesia. After processing and separation of mononuclear cells, 0.1 ml of the suspension was injected intravitreally into the eye of lower acuity. The patients were evaluated at baseline and 1, 3, 6, 9 and 12 months after the injection. All were submitted to measurement of best corrected visual acuity (BCVA), microperimetry, multifocal electroretinography (ERGmf), autofluorescence, and optical coherence tomography (OCT) and all responded to the VFQ-25 questionnaire at all follow-up visits. Fluorescein angiography was performed before the injection and six and 12 months later. Results: All patients completed the six month follow-up and six completed the 12 month follow-up after the injection. Before the injection, mean BCVA was 1.18 logMAR (20/320-1), ranging from 20/125 to 20/640-2 and at 12 months it was 1.0 logMAR (20/200), with a significant improvement over all followup months. Mean perimetric threshold sensitivity improved significantly starting at the sixth month (p=0.009). When the patients with a larger area of atrophy measured by hypoautofluorescence were considered separately, a significant improvement was observed only in the group with lower atrophy. There was no significant difference in electroretinography. Angiofluoresceinography did not reveal neovessel or tumor growth. The quality of life questionnaire showed a significant difference in mental health (p=0.003) and color vision (p=0.005), and a strong tendency in the analysis of general vision (p=0.05) and dependence (p=0.067). There was a decline in general health (p=0.77). Conclusions: The results indicate that the use of intravitreal BMMF in patients with AMD is safe and is associated with improved visual acuity and microperimetry. Patients with a smaller atrophy area obtained a better response. The paracrine effect of these cells may explain the functional improvement observed in the present study; however, a larger series should be study to confirm these clinical findings.

Tratamentos pulpares conservadores, como as pulpotomias de dentes decíduos, requerem a utilização de materiais capeadores que respeitem as propriedades biológicas da polpa dentária remanescente, preservando sua vitalidade, estimulando sua capacidade de defesa e favorecendo sua regeneração. Conhecer as respostas de células-tronco pulpares a esses materiais são de particular interesse. Acredita-se que um material capeador que estimule a regeneração pulpar permitirá a diferenciação de células-tronco pulpares em odontoblastos, induzindo a formação de nova dentina e selando biologicamente a câmara pulpar. Portanto, o objetivo deste trabalho é avaliar os efeitos biológicos do MTA, hidróxido de cálcio (HC) e Biodentine sobre células-tronco de dentes decíduos exfoliados humanos (SHED). Para isso, as SHED foram cultivadas em meio de cultura MEMα condicionado com um dos materiais capeadores (MTA, HC ou Biodentine) e submetidas a ensaios de proliferação, migração e diferenciação através da análise de expressão gênica para DMP-1. Os três materiais na concentração de 1 mg/mL induziram um aumento na taxa de proliferação celular, sendo que aos 7 dias foi observado maior número de células para o grupo do HC. Além disso, observou-se maior migração celular em direção ao meio condicionado por Biodentine, seguida pela migração ao MTA e ao HC. Quanto à diferenciação, os resultados sugerem que todos os materiais testados induzem a diferenciação de células-tronco em odontoblastos, sendo o MTA o material com maior potencial odontogênico, visto que a expressão de DMP-1 foi observada a partir do dia 7 e foi mais intensa quando comparado aos demais grupos ao longo do tempo. Portanto, os três materiais permitem proliferação, e induzem migração e diferenciação, características desejáveis para materiais de capeamento pulpar em pulpotomias de dentes decíduos. A possibilidade de induzir células-tronco a se diferenciar em um tipo celular através de uma indução guiada é muito importante, pois possibilita a sua utilização em várias terapias de regeneração e engenharia tecidual. / Conservative pulp treatments, such as the pulpotomies of primary teeth, require the use of capping materials that respect the biological properties of the remaining dental pulp, thus preserving its vitality, stimulating its defensive ability and enhancing its regeneration. Knowing the responses of dental pulp stem cells to these materials is of particular interest. It is believed that a capping material that stimulates pulp regeneration will allow differentiation of dental pulp stem cells into odontoblasts, inducing the formation of new dentin and sealing the pulp chamber biologically. Therefore, the aim of this study is to evaluate the biological effects of MTA, calcium hydroxide (CH) and Biodentine on stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED). Thus, SHED were cultured in MEMα culture medium conditioned with one of the capping materials (MTA, Biodentine or CH) and tested for proliferation, migration and differentiation through the analysis of DMP-1 gene expression. The three materials at a concentration of 1 mg/mL induced an increase in the rate of cell proliferation, with a greater number of cell observed for CH group at the 7th day. Besides, greater cell migration toward Biodentine conditioned medium was observed, followed by the migration toward MTA and CH. Regarding differentiation, the results suggest that all the tested materials induce stem cell differentiation into odontoblasts, with MTA presenting the greatest odontogenic potential, since DMP-1 expression was observed from day 7 and was more intense when compared to the other groups over time. Therefore, the three materials induce proliferation, migration and differentiation, which are desirable features for pulp capping materials in pulpotomy of primary teeth. The possibility of inducing stem cells to differentiate into a cell type through a guided induction is very important because it enables their use in various regenerative therapies and tissue engineering. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES