Em contraste com a vasta descrição na literatura científica dos biofilmes bacterianos, poucos trabalhos focam o estudo da formação e as estratégias de inibição da constituição do biofilme fúngico. Este trabalho objetiva a caracterização do potencial antifúngico e antibiofilme do sal imidazólico 1-metil-3-octilimidazol cloreto (C16MImCl), e das frações (F70 e F90) purificadas de saponinas mate (Ilex paraguariensis A. st. Hil.), frente a células de biofilme de seis isolados clínicos de Candida tropicalis. A Concentração Inibitória Mínima (CIM) do C16MImCl foi de 0,014μg/mL frente às células planctônicas, ao passo que as Frações de Saponinas da Erva Mate (FSEM) não apresentaram atividade antifúngica. Utilizando o cateter traqueal (CT) como corpo de prova, foi utilizado para avaliar a capacidade de inibição e remoção do biofilme. Avaliou-se também a Concentração Mínima de Erradicação do Biofilme (CMEB) para remoção do biofilme pré-formado pelo método da microplaca. Para a atividade antibiofilme foi observado que o C16MImCl, apresentou melhor resultado quando comparado ao fluconazol. As FSEM também apresentaram atividade antibiofilme quando comparados ao fluconazol, entretanto menores do que o tensoativo sintético Pela análise dos resultados de CMEB, o C16MImCl foi o composto com maior capacidade de erradicar o biofilme pré-formado, na concentração de 0,9 μg/mL (92% a 100% de remoção do biofilme). Os demais compostos testados (fluconazol, FEM e a água) não apresentaram atividade removedora, observando-se valores menores que 80% de remoção. Tanto as concentrações nas quais C16MImCl inibiu as células planctônicas (0,014 μg/mL) como as de biofilme (0,028 -0,225 μg/mL) foram mais baixas que as obtidas pelo fluconazol. Os resultados obtidos demonstram a potencialidade destes tensoativos, principalmente o C16MImCl, que demonstrou baixa toxicidade e provável mecanismo de ação sobre a síntese do ergosterol. Assim, é possível afirmarmos que estes tensoativos representam uma potencial alternativa para o controle químico de fungos leveduriformes, especialmente as ocasionadas por células de biofilme por C. tropicalis. / In contrast to the extensive description in the literature of bacterial biofilms, few works focus on the study of the formation and strategies for inhibiting the formation of fungal biofilms. This work aims to characterize the antifungal potential and antibiofilm the imidazole salt 1 - methyl - 3 - octilimidazol chloride (C16MImCl), and fractions (F70 and F90) purified saponins mate (Ilex paraguariensis A. st. Hil.), against to biofilm cells of six clinical isolates of Candida tropicalis. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of C16MImCl was 0.014 mg / mL to planktonic cells, whereas the Saponin Fractions of Yerba Mate (SFYM) showed no antifungal activity. Using the tracheal catheter (CT) as a specimen was used to evaluate the ability of the biofilm inhibition and removal. We also assessed the Minimum Biofilm Eradication Concentration (MBEC) to remove the preformed biofilms by the microplate method. For antibiofilm activity was observed that C16MImCl, showed better results when compared to fluconazole. The SFYM also had antibiofilm activity when compared to fluconazole, however smaller than the synthetic surfactant. By analyzing the results MBEC, the compound C16MImCl was capacity to eradicate pre- formed biofilm in a concentration of 0.9 mg / mL (92% to 100% biofilm removal) The other tested compounds (fluconazole, SFYM and water) showed no activity remover, observing less than 80 % removal values. Both concentrations at which they inhibit planktonic cells C16MImCl (0.014 μg/mL) and the biofilm (0.028 -0.225 μg/ml) were lower than those obtained by fluconazole. The results obtained demonstrate the potential of these surfactants, especially C16MImCl, which demonstrated low toxicity and probable mechanism of action on the synthesis of ergosterol. Thus, it is possible to assert that these surfactants are a potential alternative to chemical control of yeasts, especially those caused by biofilm cells of C. tropicalis.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Bruna Malacarne.pdf: 2452979 bytes, checksum: bd4d5918bd0a11fc40527e153ad97a3d (MD5) Previous issue date: 2010-12-10 / A frequência de candidemia tem aumentado nas últimas décadas, com crescente ocorrência de espécies não-albicans. Candida tropicalis representa, em geral, a espécie não-albicans mais freqüente no Brasil e pode apresentar crescimento tipo trailing nos testes de microdiluição em caldo, frente a drogas azólicas, o que dificulta e confunde a leitura dos valores de concentração inibitória mínima (CIM). Os objetivos do presente trabalho foram avaliar a ocorrência de candidemia causada por C. tropicalis no Hospital Universitário Cassiano Antônio de Moraes (HUCAM), Vitória Espírito Santo, e seu perfil de suscetibilidade a fluconazol, itraconazol e anfotericina B, conforme metodologia de referência M27-A3 (CLSI, 2008), propor modificações deste teste, além de avaliar a influência de diferentes períodos de incubação e formas de leitura. Isolados de Candida tropicalis (82) testados pelo método referência foram selecionados e submetidos aos testes modificados, como incubação na temperatura de 42°C, adição de Tricostatina A (TSA) e do composto colorimétrico resazurina. Os resultados obtidos nos testes modificados foram avaliados através da determinação das concordâncias categóricas e essenciais com o teste padrão. Os resultados mostraram que no período de 2006 a 2009, a frequência de candidemia no HUCAM variou de 1,21 a 1,65 casos/1.000 admissões hospitalares e de 0,16 a 0,25 casos/1.000 pacientes-dia. C. albicans representou 45% dos episódios, seguida por C. tropicalis (26%), C. parapsilosis (14%), C. glabrata (10%) e outras (C. krusei, C. guilliermondii e C. lusitaniae). Os maiores percentuais de resistência de C. tropicalis a fluconazol e a itraconazol ocorreram com 48 horas de incubação (26% versus 5% e 17% versus 1,2%, respectivamente). Foi observado que 28,05% dos isolados apresentaram crescimento tipo trailing para uma ou para as duas drogas testadas. As concordâncias categóricas e essenciais dos testes modificados, em relação à metodologia padrão, variaram de 70 a 87%, com 24 horas de incubação e para ambas a drogas. Com 48 horas de incubação, as modificações introduzidas (incubação a 42ºC e adição de TSA) propiciaram menores percentagens de concordâncias categóricas e essenciais que o método com adição de resazurina. A incubação a 42°C correlacionou com as melhores concordâncias entre as formas de leitura visual e espectrofotométrica, em comparação com o 9 método padrão. Diferentes perfis de crescimento tipo trailing foram observados, sendo que as três modificações realizadas foram eficazes em reduzir este fenômeno com 24 horas de incubação, mas apenas os métodos a 42ºC e com TSA foram capazes de reduzir o trailing com 48 horas de incubação. A análise de prontuários médicos permitiu verificar que isolado com crescimento tipo trailing apresentou resposta terapêutica satisfatória ao fluconazol e que isolado que permaneceu resistente nos testes modificados não respondeu a tratamento com fluconazol, in vivo / The frequency of candidemia has increased in recent decades, with raising occurrence of non-albicans species. In general, Candida tropicalis is the most frequent non-albicans species in Brazil and may present trailing growth in broth microdilution tests with azole drugs, which complicates and confuses the reading of MIC values. The objectives of this study were evaluate the occurrence of candidemia caused by C. tropicalis in HUCAM and your susceptibility profile with fluconazole, itraconazole and amphotericin B, according to reference methodology M27-A3 (CLSI, 2008) propose modifications in this test, and evaluate the influence of different incubation periods and ways of reading. Isolates of Candida tropicalis were selected and submitted to the modified tests: incubation temperature of 42°C, addition of TSA and colorimetric compound resazurin. The results obtained with modified tests were evaluated through essential and categorical agreements considering the reference methodology. The results showed that in the period of 2006 to 2009, the frequency of candidemia in HUCAM ranged from 1.21 to 1.65 cases / 1,000 admissions and 0.16 to 0.25 cases / 1,000 patient-days. C. albicans accounted for 45% of the episodes, followed by C. tropicalis (26%), C. parapsilosis (14%), C. glabrata (10%) and other ones (C. krusei, C. guilliermondii and C. lusitaniae). The highest percentages of resistance to fluconazole and itraconazole occurred with 48 hours of incubation (26% versus 5% and 17% versus 1.2%, respectively). 28.05% of the isolates showed trailing growth for one or both drugs. The categorical and essential agreements of the modified tests when compared with the standard methodology, ranged from 70 to 87%, with 24 hours of incubation and for both drugs. With 48 hours of incubation, the modifications (incubation at 42°C and addition of TSA) provided smaller percentages of categorical and essential agreements when compared with the addition of resazurin. The best agreement between ways of reading (visual and spectrophotometric) was obtained with the incubation at 42°C, compared with the standard method. Different trailing growth profiles were observed and the three modified methods were effective in reducing this phenomenon with 24 hours of incubation, but only the methods 42°C and TSA were able to reduce it at 48 hour. The analysis of medical records indicated that isolated with trailing growth showed 11 satisfactory therapeutic response to fluconazole and the isolated that remained resistant in the modified tests did not respond to treatment with fluconazole in vivo

Em contraste com a vasta descrição na literatura científica dos biofilmes bacterianos, poucos trabalhos focam o estudo da formação e as estratégias de inibição da constituição do biofilme fúngico. Este trabalho objetiva a caracterização do potencial antifúngico e antibiofilme do sal imidazólico 1-metil-3-octilimidazol cloreto (C16MImCl), e das frações (F70 e F90) purificadas de saponinas mate (Ilex paraguariensis A. st. Hil.), frente a células de biofilme de seis isolados clínicos de Candida tropicalis. A Concentração Inibitória Mínima (CIM) do C16MImCl foi de 0,014μg/mL frente às células planctônicas, ao passo que as Frações de Saponinas da Erva Mate (FSEM) não apresentaram atividade antifúngica. Utilizando o cateter traqueal (CT) como corpo de prova, foi utilizado para avaliar a capacidade de inibição e remoção do biofilme. Avaliou-se também a Concentração Mínima de Erradicação do Biofilme (CMEB) para remoção do biofilme pré-formado pelo método da microplaca. Para a atividade antibiofilme foi observado que o C16MImCl, apresentou melhor resultado quando comparado ao fluconazol. As FSEM também apresentaram atividade antibiofilme quando comparados ao fluconazol, entretanto menores do que o tensoativo sintético Pela análise dos resultados de CMEB, o C16MImCl foi o composto com maior capacidade de erradicar o biofilme pré-formado, na concentração de 0,9 μg/mL (92% a 100% de remoção do biofilme). Os demais compostos testados (fluconazol, FEM e a água) não apresentaram atividade removedora, observando-se valores menores que 80% de remoção. Tanto as concentrações nas quais C16MImCl inibiu as células planctônicas (0,014 μg/mL) como as de biofilme (0,028 -0,225 μg/mL) foram mais baixas que as obtidas pelo fluconazol. Os resultados obtidos demonstram a potencialidade destes tensoativos, principalmente o C16MImCl, que demonstrou baixa toxicidade e provável mecanismo de ação sobre a síntese do ergosterol. Assim, é possível afirmarmos que estes tensoativos representam uma potencial alternativa para o controle químico de fungos leveduriformes, especialmente as ocasionadas por células de biofilme por C. tropicalis. / In contrast to the extensive description in the literature of bacterial biofilms, few works focus on the study of the formation and strategies for inhibiting the formation of fungal biofilms. This work aims to characterize the antifungal potential and antibiofilm the imidazole salt 1 - methyl - 3 - octilimidazol chloride (C16MImCl), and fractions (F70 and F90) purified saponins mate (Ilex paraguariensis A. st. Hil.), against to biofilm cells of six clinical isolates of Candida tropicalis. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of C16MImCl was 0.014 mg / mL to planktonic cells, whereas the Saponin Fractions of Yerba Mate (SFYM) showed no antifungal activity. Using the tracheal catheter (CT) as a specimen was used to evaluate the ability of the biofilm inhibition and removal. We also assessed the Minimum Biofilm Eradication Concentration (MBEC) to remove the preformed biofilms by the microplate method. For antibiofilm activity was observed that C16MImCl, showed better results when compared to fluconazole. The SFYM also had antibiofilm activity when compared to fluconazole, however smaller than the synthetic surfactant. By analyzing the results MBEC, the compound C16MImCl was capacity to eradicate pre- formed biofilm in a concentration of 0.9 mg / mL (92% to 100% biofilm removal) The other tested compounds (fluconazole, SFYM and water) showed no activity remover, observing less than 80 % removal values. Both concentrations at which they inhibit planktonic cells C16MImCl (0.014 μg/mL) and the biofilm (0.028 -0.225 μg/ml) were lower than those obtained by fluconazole. The results obtained demonstrate the potential of these surfactants, especially C16MImCl, which demonstrated low toxicity and probable mechanism of action on the synthesis of ergosterol. Thus, it is possible to assert that these surfactants are a potential alternative to chemical control of yeasts, especially those caused by biofilm cells of C. tropicalis.

A administração de Ags solúveis via mucosas, antes da sensibilização com o mesmo Ag, leva a tolerância. Na presente tese estudou-se o efeito do LPS i.n. durante a indução de tolerância nasal a ovalbumina (OVA). A maioria dos modelos murinos de asma utilizam a OVA como alérgeno, desse modo também utilizamos o extrato de Blomia tropicalis (Bt), um ácaro prevalente em pacientes asmáticos. Características da Bt impedem o estabelecimento de tolerância e evidências experimentais indicam que a tolerância a um Ag pode induzir tolerância a um Ag não relacionado (tolerância cruzada). Assim, avaliamos se a tolerância a OVA ou lizozima de ovo (HEL) poderia induzir tolerância cruzada a Bt. Observou-se que o LPS i.n. durante a indução de tolerância a OVA previne o estabelecimento da tolerância, resultando em neutrofilia pumonar, IgG2a, diminuição de IgE com aumento de IgG1 anafilática. Observou-se também que a tolerância nasal, a HEL ou OVA, não é eficaz em induzir tolerância cruzada para as respostas contra Bt. Já, a tolerância oral com OVA induziu tolerância cruzada para Bt. / Mucosal administration of soluble Ags, before the sensitization with the same Ag, leads to mucosal tolerance. We studied the effect of i.n. LPS during the induction of ovalbumin (OVA) nasal tolerance. The majority of murine models of asthma used OVA as allergen,thus, we also used Blomia tropicalis (Bt) extract, a mite more common in asthmatic patients. Features of Bt block the nasal tolerance establishment and experimental data indicates that tolerance towards an Ag can promote tolerance to another not related Ag (cross-tolerance). Therefore, we evaluated if OVA or hen-egg white lisozyme (HEL) tolerance could result in cross-tolerance to the Bt. Our data showed that i.n. LPS during induction of tolerance to OVA prevents the establishment of this tolerance, resulting in neutrophil migration, IgG2a production, decreased levels of IgE and increased anaphylactic IgG1. We verify that nasal tolerance to HEL or OVA is not capable in induce cross-tolerance against the Bt. We also observed that OVA oral tolerance is able to induce cross-tolerance against Bt.

Dans les zones humides, un déclin dramatique des populations d’amphibiens a été observé au niveau mondial depuis les années 80. Malgré de nombreuses études suggérant que les amphibiens sont très sensibles aux pressions anthropiques cumulées, le rôle joué par les perturbateurs endocriniens dans le déclin de leurs populations reste incertain. Parmi les perturbateurs endocriniens contaminants les zones humides, le benzo[a]pyrène (BaP) et le triclosan (TCS) sont couramment retrouvés. Au cours de ce travail, nous avons étudié la réponse physiologique de xénopes (Xenopus tropicalis) exposés à court terme (24 heures) et à long terme (du têtard à l’adulte mature) au BaP et au TCS à des concentrations réalistes d’un point de vue environnemental. En combinant une approche transcriptomique à haut débit et une caractérisation des modifications cellulaires et physiologiques, nous avons mis en évidence que le BaP, le TCS et leur mélange perturbent la physiologie globale du foie. Ce trouble est caractérisé par un phénotype semblable à de l’insulino-résistance et à une stéatopathie non alcoolique (NAFLD) associé à une hépatotoxicité médiée par une altération du métabolisme lipidique. Outre les effets directs sur le métabolisme des individus exposés, il apparaît que les perturbateurs endocriniens étudiés affectent également le succès reproducteur de ces individus et le développement de leur descendance. Prises dans leur ensemble, nos observations apportent ainsi des débuts de réponse quant aux rôles de la contamination chronique des milieux sur le déclin des populations d’amphibiens. / In wetlands, dramatic decline in amphibian populations have been described worldwide since the 80s. Despite numerous studies suggesting that amphibians are highly sensitive to cumulative anthropogenic stresses, the role played by endocrine disruptors in the decline of amphibian populations remains unclear. Among the endocrine disruptors contaminating wetlands, benzo[a]pyrene (BaP) and triclosan (TCS) are recurrently found. In this work, we studied the physiological response of Xenopus tropicalis exposed to environmentally realistic concentrations of BaP and TCS during a short-term (24 hours) and long-term (from tadpole to mature adult) period. By combining a high throughput transcriptomic approach and a characterization of cellular and physiological modifications, we showed that BaP, TCS and their mixture disrupt overall liver physiology highlighted by insulin resistance-like and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-like phenotypes together with hepatotoxicity due to the impairment of lipid metabolism. Additionally to direct metabolic impact observed on exposed individuals, the studied endocrine disruptors affected their fitness and their progeny development. Altogether, our observations bring new insights into the role plays by chronic contamination of wetlands on amphibian population decline.

A tolerância pode ser considerada um dos pilares da imunologia. Sabe-se que a tolerância a um antígeno pode gerar tolerância a outro antígeno não relacionado, fenômeno conhecido como tolerância cruzada. Neste trabalho caracterizamos a tolerância cruzada utilizando a OVA como tolerógeno e extrato de Blomia tropicalis (Bt) ou Hemocianina de Keyhole limpet (KLH) como alérgenos. Verificamos que é possível reproduzir o fenômeno da tolerância cruzada neste modelo de inflamação alérgica induzida tanto pelo KLH quanto pela Bt, com diminuição do infiltrado inflamatório no pulmão, eosinófilos, IgE total e produção de muco. Ainda, a estratégia de utilizar a tolerância cruzada terapeuticamente, i.é., após a sensibilização com KLH, a indução de tolerância cruzada não foi capaz de prevenir a resposta alérgica. Em conjunto, nossos dados mostram que a tolerância à OVA modifica as respostas alérgicas tanto à Bt quanto ao KLH no modelo de inflamação pulmonar experimental de forma profilática, mas que a tolerância cruzada não é eficiente em animais já sensibilizados. / Tolerance is among the Immunology pillars. Experimental data indicate that tolerance towards an antigen can promote tolerance to an unrelated antigen, a phenomenon known as cross-tolerance. Here we sought to characterize cross tolerance using OVA as a tolerogen and Blomia tropicalis (Bt) extract or Keyhole limpet Hemocianina (KLH) as allergens. We found that cross tolerance can be reproduced in the model of allergic lung disease induced by KLH or Bt, with less inflammatory infiltrate in the lung, eosinophils, total IgE and mucus production. Using cross tolerance therapeutically, i.e., after KLH sensitization, was not effective, since the allergic lung response was not modulated. Altogether, our data shows that OVA tolerance modulate allergic lung disease induced either by Bt or KLH when used as prophylactic model, however cross tolerance is ineffective in sensitized animals.

Infecções causadas por Candida tropicalis (C. tropicalis) são associados à elevada morbi-mortalidade, e foram consideradas como importantes causas de infecção de corrente sanguínea no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) de março de 1998 a março de 2001. Adicionalmente, são responsáveis pelo aumento do tempo e dos custos de hospitalização e necessidade de cuidados intensivos. Esse estudo tem como objetivo a caracterização molecular e perfil de sensibilidade de 61 isolados de C. tropicalis a partir de candidemias no HCFMUSP e Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), através das técnicas de amplificação aleatória do DNA polimórfico (RAPD), eletroforese em campo pulsátil (PFGE), tipagem de sequências de múltiplos locus gênicos (MLST) e antifungigrama por microdiluição pelos métodos propostos, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) e European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST). A análise filogenética por RAPD evidenciou que os iniciadores P1 e P2 mostraram maior capacidade de discriminação que P3. Na análise por PFGE com enzimas de restrição SfiI, SmaI, BssHII e NaeI, a enzima BssHII mostrou maior poder discriminatório. MLST contribuiu com 36 novas diploid sequence type (DSTs) e 23 novos alelos, de acordo com o banco de dados oficial do MLST (http://pubmlst.org/ctropicalis/), representando o primeiro estudo que caracterizaram isolados sequenciais na América do Sul. Entre os isolados sequenciais de um mesmo paciente, as microvariações foram mais frequentes no fragmento de gene XYR1 em 8 pacientes e macrovariações ocorreram em quatro pacientes com mais de um isolado, destacando-se três que apresentaram diferença nos seis alelos estudados. A análise comparativa entre os métodos evidenciou diferenças entre os isolados múltiplos dos pacientes 3, 7 e 11, considerados diferentes pelos três métodos. O poder discriminatório foi de 83,47% para RAPD, 82,18% para PFGE e 97,4 % para MLST. Os resultados do antifungigrana mostraram concordância entre os métodos CLSI e EUCAST de 73,8% para o fluconazol, 67,2% para o itraconazol e 80,3% para o voriconazol. Do total de 61 isolados estudados, 3 isolados de diferentes pacientes foram resistentes ao fluconazol, com MIC de 64 g/mL. O fenômeno de trailing foi observado em 50% das amostras testadas frente ao fluconazol, 23% ao voriconazol e 21,3% ao itraconazol. O uso de pH 5,0 para re-análise do CLSI frente ao fluconazol revelou-se como uma ferramenta útil para esclarecer o perfil de sensibilidade de isolados que apresentaram o fenômeno de trailing. Não houve correlação entre perfil genético gerado pelas técnicas de caracterização molecular estudadas e o perfil fenotípico através do teste de sensibilidade aos antifúngicos / Infections caused by Candida tropicalis (C. tropicalis) have been characterized as important causes of candidemia at the Hospital of the Medical school, University of São Paulo (HCFMUSP) from March 1998 to March 2001 and are associated with high morbidity and mortality. Additionally, they have been related to higher hospitalization costs because of longer hospitalization times and intensive care needs. This study aims to analyze the molecular typing and antifungal susceptibility profile of 61 isolates of C. tropicalis from 41 patients with candidemia in HCFMUSP and University of Campinas (UNICAMP), through Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), Multilocus Sequence Typing (MLST) and broth microdilution antifungal susceptibility methodologies proposed by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) and European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST). Phylogenetic analysis showed higher discriminatory power index of P1 and P2 primers than P3 by RAPD analysis. PFGE was performed with restriction enzymes SfiI, SmaI, NaeI and BssHII) and the enzyme BssHII presented the best performance. MLST analyses revealed 36 new diploid sequence type (DSTs) and 23 new alleles according to the C. tropicalis MLST database (http://pubmlst.org/ctropicalis/), representing the first study to characterize the sequential isolates of C. tropicalis candidemia in South America. Microvariation in a single gene was found in the sequential isolates from 8 patients. The main polymorphisms occurred in the alleles of the XYR1 gene. Macrovariation was detected in isolates from four patients, where 3 patients presented polimorphisms in six gene fragments. The comparative analysis revealed differences among sequential isolates from patients 3, 7 and 11, considered by three different methods. The discriminatory power was 83.47% for RAPD, 82.18% for PFGE and 97.4% for MLST. The agreement between the CLSI and EUCAST methods was 73.8% to fluconazole susceptibility, 67.2% to itraconazole and 80.3% to voriconazole. Of the 61 isolates tested, 3 isolates from different patients were resistant to fluconazole, MIC of 64 mg/mL. The trailing phenomenon was observed in 50% to fluconazole, 23% to voriconazole and 21.3% to itraconazole. Among the isolates studied, the use of pH 5.0 facilitated the determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) for the re-analysis of fluconazole by CLSI, proving to be an important tool for the trailing phenomenon. No correlation was observed between genetic profile generated by the techniques of molecular characterization and phenotypic profile determined by susceptibility tests to antifungal drugs

por fatores químicos e físicos, promovendo infecções hospitalares relacionadas ao uso de cateteres e demais instrumentos hospitalares, elevando os índices de mortalidade e morbidade de pacientes. Portanto, garantir a correta desinfecção capaz de impedir contaminações e infecções em ambientes hospitalares é de extrema importância. Para este fim, neste estudo explorou-se a seleção de uma substância capaz de marcar e ser biocida contra biofilmes fúngicos em superfícies de aço inox, a partir de nove candidatos benzimidazóis fluorescentes, com códigos NB1 a NB9 e oito sais imidazólicos de corantes azóicos, denominados C4MImErioCr, C10MImMO, C16MImMO, (C10)2MImMO, C4MImMO, C10MImORANGEII, C16MImORANGEII e (C10)2MImORANGEII. Desenvolveu-se para este fim um roteiro metodológico para determinar quais destas substancias são capazes de marcar e eliminar biofilmes de forma eficaz e segura. Os métodos utilizados para avaliar as substâncias foram (1) a Concentração Mínima Inibitória (MIC) conforme protocolo do CLSI M27-A3, (2) microscopias verificando capacidade das substâncias em marcar células, (3) ensaios com deposição sobre superfície do corpo de prova (placas de aço inox) com biofilme, (4) verificação da atividade biocida sobre biofilmes utilizando microscopias e (5) ensaios de citotoxicidade. Essas substâncias foram testadas frente a nove cepas de Candida spp., incluindo C. tropicalis, C. albicans e C. parapsilosis Na avaliação das substâncias, SI de corantes azóicos inibiram o crescimento celular de fungos, já o benzimidazol fluorescente NB7 apresentou atividades simultâneas de detecção e ação biocida sobre o biofilme. Todas as cepas testadas foram sensíveis a essa substância. Além disso, os biofilmes formados pelas cepas ATCC 18804 (C. albicans,) ATCC 22019 (C. parapsilosis) e ATCC 750 (C. tropicalis) na superfície de aço inox 304 sofreram ação biocida, quando expostas por 15 segundos a NB7, sendo um potencial sanitizante. / Biofilms provide an environment capable of protecting microbial cells from damage by chemical and physical factors of the immune system, and hinder the penetration of various antimicrobial agents, promoting nosocomial infections related to catheters, increasing mortality and morbidity of patients. Therefore, it is important to ensure proper hygiene to prevent contamination and infections in hospital environments. For this purpose, this study explored the identification of a substance that both detects and have biocide activity against fungal biofilms on stainless steel surfaces. Both nine fluorescent benzimidazole substances, coded NB1 to NB9 and eight imidazolium salts of azo dyes, named denominados C4MImErioCr, C10MImMO, C16MImMO, (C10)2MImMO, C4MImMO, C10MImORANGEII, C16MImORANGEII e (C10)2MImORANGEII were tested as candidates. These substances were tested applying a methodology developed to determine if a substance is able detecting and have biocide activity against fungal biofilms. Overall, this study involved the following methods: (1) Minimum Inhibitory concentration test following the CLSI protocol (M27-A3; the substances were tested against nine fungal strains, including C. tropicalis, C. albicans and C. parapsilosis.), (2) microscopy to determine the marker capacity, (3) spraying tests of the substances on surfaces (stainless steel) with fungal biofilms, (4) tests to verify the capability of the substances to both stain and were biocide against fungal biofilms, applying microscopic techniques and (5) cytotoxicity tests Within the set of seventeen substances, benzimidazole derivative NB7 was identified with the desired capabilities, staining and biocide activity against fungal biofilms at the same time. All tested fungal strains were sensible to this substance. A biocide activity was identified on the biofilms of ATCC 18804 (C. albicans), ATCC 22019 (C. parapsilosis) and ATCC 750 (C .tropicalis), grown on stainless steel 304, when exposed fifteen seconds to substance NB7. Although this substance showed being cytotoxic, it represents a promising candidate for sanitization purposes, including medical tools.

La métamorphose des amphibiens est le processus rapide et irréversible par lequel un têtard aquatique se transforme en une grenouille respirant à la surface. Cette transition écologique, réminiscente de la période périnatale chez les mammifères, s'accompagne de changements spectaculaires (régime alimentaire, organes locomoteurs, système respiratoire...). Ces modifications morphologiques et physiologiques nécessitent la réponse concertée à un signal hormonal, les hormones thyroïdiennes (HT), de différents tissus vers des destin parfois opposés : apoptose (dans la queue), prolifération (dans les pattes), et remodelage (dans les intestins et le système nerveux central). Toutefois, la synchronisation de la réponse des différents tissus fait appel à d'autres signaux hormonaux, et notamment les glucocorticoïdes (GC). Ces derniers sont également les médiateurs principaux de la réponse au stress. Les processus endocriniens de la métamorphose et la réponse au stress sont fortement couplés. Les GC peuvent ainsi jouer le rôle d'interface permettant l'intégration de signaux environnementaux au niveau de réseaux de régulation. Dans le cadre de mon doctorat, j'ai analysé les transcriptomes des bourgeons de membres postérieurs et de l'épiderme caudal de têtards de Xenopus tropicalis traités ponctuellement avec des HT et / ou des GC. La comparaison de ces deux tissus a permis de caractériser la diversité des profils d'expression des gènes cibles des HT et des GC.Il en ressort plusieurs résultats majeurs. Tout d'abord, la diversité des profils d'interaction entre ces deux voies est limitée, et la majorité des types de profils sont communs aux deux tissus. Indépendamment du tissu, certains profils sont caractéristiques de fonctions biologiques spécifiques comme le remodelage de la matrice extracellulaire et le système immunitaire. Les gènes impliqués dans ces fonctions communes aux deux tissus sont cependant différents. Enfin, plusieurs facteurs impliqués dans la méthylation de l'ADN sont régulés par les deux hormones. / Amphibian metamorphosis is the rapid and irreversible process during which an aquatic tadpole transforms into an air breathing adult frog. This ecological transition, reminiscent of the mammalian perinatal period, comes with spectacular changes (diet, locmotor organs, respiratory system...). These morphological and physiological modifications necessitate the properly timed response to a single hormonal signal, the thyroid hormones (TH), in various tissues to lead them to sometimes opposite fates : apoptosis (in the tail), cell prolifération and differenciation (in the limbs) and remodeling (in the intestine and the central nervous system).However, TH do not act alone. In particular, glucocorticoids (GC) play important roles during this process. They also are the main mediator of the stress response. Endocrine processes of the metamorphosis and the stress response are deeply intertwined. GC can thus act as an interface to integrate environmental inputs into regulatory networks.During my doctorate, I analyzed the possible transcriptional crosstalks between TH and GC in two larval tissues : the tailfin (TF) and the hindlimb buds (HLB). Comparing these two tissues allowed me to caracterize the diversity of TH and GC target gene expression profiles. This resulted in several major results. First, the diversity of the profiles of crosstalk between these two pathways is limited, and the majority of the types of profiles is common to both tissues. Next, independently ofthe tissues, some profiles are caracteristic of spécific biological functions such as extracellular matrix remodeling and the immune system. Yet, the genes involved in these shared functions are different between the TF and the HLB. Finally, several factors involved in DNA methylation are subject to a crosstalk between the two hormones.

Infecções causadas por Candida tropicalis (C. tropicalis) são associados à elevada morbi-mortalidade, e foram consideradas como importantes causas de infecção de corrente sanguínea no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) de março de 1998 a março de 2001. Adicionalmente, são responsáveis pelo aumento do tempo e dos custos de hospitalização e necessidade de cuidados intensivos. Esse estudo tem como objetivo a caracterização molecular e perfil de sensibilidade de 61 isolados de C. tropicalis a partir de candidemias no HCFMUSP e Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), através das técnicas de amplificação aleatória do DNA polimórfico (RAPD), eletroforese em campo pulsátil (PFGE), tipagem de sequências de múltiplos locus gênicos (MLST) e antifungigrama por microdiluição pelos métodos propostos, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) e European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST). A análise filogenética por RAPD evidenciou que os iniciadores P1 e P2 mostraram maior capacidade de discriminação que P3. Na análise por PFGE com enzimas de restrição SfiI, SmaI, BssHII e NaeI, a enzima BssHII mostrou maior poder discriminatório. MLST contribuiu com 36 novas diploid sequence type (DSTs) e 23 novos alelos, de acordo com o banco de dados oficial do MLST (http://pubmlst.org/ctropicalis/), representando o primeiro estudo que caracterizaram isolados sequenciais na América do Sul. Entre os isolados sequenciais de um mesmo paciente, as microvariações foram mais frequentes no fragmento de gene XYR1 em 8 pacientes e macrovariações ocorreram em quatro pacientes com mais de um isolado, destacando-se três que apresentaram diferença nos seis alelos estudados. A análise comparativa entre os métodos evidenciou diferenças entre os isolados múltiplos dos pacientes 3, 7 e 11, considerados diferentes pelos três métodos. O poder discriminatório foi de 83,47% para RAPD, 82,18% para PFGE e 97,4 % para MLST. Os resultados do antifungigrana mostraram concordância entre os métodos CLSI e EUCAST de 73,8% para o fluconazol, 67,2% para o itraconazol e 80,3% para o voriconazol. Do total de 61 isolados estudados, 3 isolados de diferentes pacientes foram resistentes ao fluconazol, com MIC de 64 g/mL. O fenômeno de trailing foi observado em 50% das amostras testadas frente ao fluconazol, 23% ao voriconazol e 21,3% ao itraconazol. O uso de pH 5,0 para re-análise do CLSI frente ao fluconazol revelou-se como uma ferramenta útil para esclarecer o perfil de sensibilidade de isolados que apresentaram o fenômeno de trailing. Não houve correlação entre perfil genético gerado pelas técnicas de caracterização molecular estudadas e o perfil fenotípico através do teste de sensibilidade aos antifúngicos / Infections caused by Candida tropicalis (C. tropicalis) have been characterized as important causes of candidemia at the Hospital of the Medical school, University of São Paulo (HCFMUSP) from March 1998 to March 2001 and are associated with high morbidity and mortality. Additionally, they have been related to higher hospitalization costs because of longer hospitalization times and intensive care needs. This study aims to analyze the molecular typing and antifungal susceptibility profile of 61 isolates of C. tropicalis from 41 patients with candidemia in HCFMUSP and University of Campinas (UNICAMP), through Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), Multilocus Sequence Typing (MLST) and broth microdilution antifungal susceptibility methodologies proposed by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) and European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing (EUCAST). Phylogenetic analysis showed higher discriminatory power index of P1 and P2 primers than P3 by RAPD analysis. PFGE was performed with restriction enzymes SfiI, SmaI, NaeI and BssHII) and the enzyme BssHII presented the best performance. MLST analyses revealed 36 new diploid sequence type (DSTs) and 23 new alleles according to the C. tropicalis MLST database (http://pubmlst.org/ctropicalis/), representing the first study to characterize the sequential isolates of C. tropicalis candidemia in South America. Microvariation in a single gene was found in the sequential isolates from 8 patients. The main polymorphisms occurred in the alleles of the XYR1 gene. Macrovariation was detected in isolates from four patients, where 3 patients presented polimorphisms in six gene fragments. The comparative analysis revealed differences among sequential isolates from patients 3, 7 and 11, considered by three different methods. The discriminatory power was 83.47% for RAPD, 82.18% for PFGE and 97.4% for MLST. The agreement between the CLSI and EUCAST methods was 73.8% to fluconazole susceptibility, 67.2% to itraconazole and 80.3% to voriconazole. Of the 61 isolates tested, 3 isolates from different patients were resistant to fluconazole, MIC of 64 mg/mL. The trailing phenomenon was observed in 50% to fluconazole, 23% to voriconazole and 21.3% to itraconazole. Among the isolates studied, the use of pH 5.0 facilitated the determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) for the re-analysis of fluconazole by CLSI, proving to be an important tool for the trailing phenomenon. No correlation was observed between genetic profile generated by the techniques of molecular characterization and phenotypic profile determined by susceptibility tests to antifungal drugs