Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-14T14:03:09Z No. of bitstreams: 1 Roberta Carvalho Ferreira - Avaliação da colonização de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli no trato intestinal de Rhodnius prolixus - 2014.pdf: 1324987 bytes, checksum: b6cd417c99954e8fdca43e7c13cf5538 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-14T14:03:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Roberta Carvalho Ferreira - Avaliação da colonização de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli no trato intestinal de Rhodnius prolixus - 2014.pdf: 1324987 bytes, checksum: b6cd417c99954e8fdca43e7c13cf5538 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-14T14:03:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Roberta Carvalho Ferreira - Avaliação da colonização de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli no trato intestinal de Rhodnius prolixus - 2014.pdf: 1324987 bytes, checksum: b6cd417c99954e8fdca43e7c13cf5538 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-14T14:03:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Roberta Carvalho Ferreira - Avaliação da colonização de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli no trato intestinal de Rhodnius prolixus - 2014.pdf: 1324987 bytes, checksum: b6cd417c99954e8fdca43e7c13cf5538 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Os parasitos Trypanosoma rangeli e Trypanosoma cruzi entram no tubo digestivo do vetor através do repasto sanguíneo e o intestino médio anterior (IMA) é o local onde se dão as primeiras interações parasito-hospedeiro. Sendo assim, a colonização do IMA de Rhodnius prolixus por T. cruzi (cepa CL) e T. rangeli (cepa CHOACHI) foi avaliada no presente estudo. Inicialmente, o estabelecimento da infecção em ninfas infectadas com epimastigotas de cultura ou tripomastigotas sanguíneas foi comparativamente avaliado. A avaliação de diferentes parâmetros mostrou que a dinâmica de colonização foi diferente dependendo da forma do parasito utilizada para a infecção em ambas as espécies. Dessa forma, a avaliação da dinâmica de colonização dos parasitos no intestino de insetos infectados foi realizada com tripomastigotas sanguíneas, as formas naturalmente presentes no hospedeiro vertebrado. Além disso, a porção do trato intestinal onde ocorre a diferenciação das formas tripomastigotas para epimastigotas foi determinada para as duas espécies. Para infecções por T. rangeli, a diminuição gradativa no número de tripomastigotas no IMA e o concomitante aparecimento de formas intermediárias e epimastigotas a partir do primeiro dia pós-infecção (pi) indicaram que a sua diferenciação acontece nessa porção do intestino. No caso de infecções por T. cruzi, a presença de apenas formas tripomastigotas e intermediárias no IMA e a presença de formas intermediárias e epimastigotas no intestino médio posterior (IMP) dos insetos sugere que a sua diferenciação ocorre no IMP do vetor. A quantificação dos parasitos mostrou uma redução de mais de 80% nas populações de T. cruzi nas primeiras 24 horas pi. A primeira hipótese para avaliar esta redução seria a de que os parasitos estariam cruzando rapidamente o IMA e estabelecendo a infecção no IMP dos insetos. Entretanto, o reduzido número de parasitos encontrado no IMP não corroborou a hipótese. Na segunda hipótese, os parasitos poderiam estar aderidos ao epitélio do IMA e por essa razão não teriam sido quantificados nas contagens a fresco. A ausência de parasitos no IMA através da quantificação por qPCR, associada a análise do epitélio intestinal em miscroscópio, sugerem fortemente que o parasito não se adere ao epitélio intestinal do IMA. Finalmente, a possibilidade dos parasitos estarem sendo eliminados do IMA nestas primeiras horas pi foi avaliada. A significativa redução no número de parasitos incubados com diferentes tecidos de R. prolixus, particularmente com o IMA de insetos recém-alimentados, sugere que uma parte significativa da população de T. cruzi que entra no vetor juntamente com o repasto é eliminada por fatores presentes no IMA do inseto. Em conclusão, o presente estudo mostrou que embora T. cruzi e T. rangeli apresentem formas infectivas similares, os parasitos utilizam diferentes estratégias para iniciar a infecção nos seus hospedeiros invertebrados. / Trypanosoma rangeli and Trypanosoma cruzi enter the vector’s intestinal tract together with the bloodmeal and the anterior midgut is the first compartment they interact with. Therefore, in the present study, the colonization of Rhodnius prolixus anterior midgut by T. cruzi (CL strain) and T. rangeli (CHOACHI strain) was evaluated. Initially, the parasite establishment was compared in the anterior midgut of nymphs infected with culture epimastigotes versus blood trypomastigotes. The evaluation of different parameters showed that the colonization dynamics was different according to the parasite development stage used in the infection, for both species. Thereby, the next objective was to evaluate the anterior midgut colonization in insects infected with blood trypomastigotes, which are the forms naturally present in the vertebrate host. Additionally, the midgut portion where trypomastigotes differentiate into epimastigotes was determined for both flagellates. In T. rangeli infections, the gradual decrease in trypomastigote numbers and the finding of intermediate and epimastigote forms 24 hours (pi) in the anterior midgut indicates that the differentiation of the parasite occurs in this portion of the midgut. During T. cruzi infections, only trypomastigote and intermediate forms were observed in the anterior midgut, and the finding of intermediate and epimastigote forms in the posterior midgut suggests that its differentiation occurs in the insect’s posterior midgut. The parasite quantification showed that T. cruzi populations in the anterior midgut were reduced in about 80% during the first 24 hours pi. The first hypothesis to be tested evaluated wheter parasites rapidly crossed the anterior midgut and established infection in the posterior midgut. However, the low amount of parasites in the posterior midgut did not confirm this hypothesis. The other hypothesis suggests that parasites could be attached to the anterior midgut epithelium and, therefore, could not be quantified by the fresh counts. However, absence of parasites in the anterior midgut by qPCR and the analysis of the intestinal epithelium in the microscope showed that no parasites were attached to the anterior midgut at that period time point. Finally, the third hypothesis evaluated the possibility that parasites could have been killed in the anterior midgut during the first 24 hours pi. The reduction in number of parasites incubated with different tissues of R. prolixus, particularly with anterior midguts from blood fed insects indicates that a significant part of the T. cruzi population ingested with the blood meal is eliminated by factors present in the vector’s anterior midgut. In conclusion, this study showed that although T. cruzi and T. rangeli present similar infective forms, the parasites present different strategies to initiate the infection on their invertebrate hosts.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-07-23T17:05:59Z No. of bitstreams: 1 Carlos Gustavo Silva dos Santos Caracterização molecular....pdf: 1743940 bytes, checksum: 3a0047fb24b0ac8cad48dfd0a4088b8f (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-07-23T17:06:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Carlos Gustavo Silva dos Santos Caracterização molecular....pdf: 1743940 bytes, checksum: 3a0047fb24b0ac8cad48dfd0a4088b8f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-23T17:06:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carlos Gustavo Silva dos Santos Caracterização molecular....pdf: 1743940 bytes, checksum: 3a0047fb24b0ac8cad48dfd0a4088b8f (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A Doença de Chagas é uma infecção parasitária causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. As cepas de T. cruzi se constituem de uma população heterogênea, apresentando várias subpopulações. Essas populações circulam entre animais vertebrados domésticos, silvestres e humanos, além de insetos vetores. Devido a essas múltiplas relações, o T. cruzi demostra uma grande variedade biológica, genética, bioquímica e imunológica. A caracterização das cepas de T. cruzi pode utilizar várias metodologias que pode ter foco biológico, bioquímico, isoenzimático e molecular. Dentre essas, a molecular vem ganhando destaque devido a rapidez, sensibilidade e precisão do método. Deste modo, com a presente pesquisa o objetivo foi caracterizar molecularmente as cepas de Tripanosoma cruzi (Chagas 1909) isoladas em vetores e reservatórios na zona urbana de Salvador. Foram incluídas neste estudo amostras de T. cruzi isoladas de triatomíneos e reservatórios provenientes de diversas localidades da cidade de Salvador, capturados entre Julho de 2007 e Junho de 2011, perfazendo um total de 4 anos de amostragem. Adotamos a técnica de tipagem molecular do T. cruzi sugerida por Zingales et al. (2009) em sistema de eletroforese capilar. Das 930 amostras de triatomíneos avaliados, 99,35% da espécie Triatoma tibiamaculata, 482 amostras (52%) não estavam em condições de análise. Das 448 amostras passíveis de análises foram randomizadas 192 amostras (43%) para avaliação das linhagens de T. cruzi. Dentre as amostras analisadas, 20 (10,4%) não apresentaram sinal satisfatório na eletroforese capilar e foram excluídas, restando 172 amostras. Foi detectado T. cruzi em 21,5% das amostras de triatomíneos (n=37). A tipagem revelou o seguinte perfil nas amostras positivas: T. cruzi 1 (32,4%), T. cruzi 2 (59,4%), T. cruzi 3 (2,7%). Foi detectado também triatomíneos com múltipla infecção com linhagens diferentes de T. cruzi 1 & 2 (5,4%). Adicionalmente, foram avaliados 78 marsupiais, Didelphis spp. A taxa de infecção nos marsupiais foi de 29,4%, e nas amostras positivas foi observado o seguinte perfil molecular de tipagem pelo T. cruzi: T. cruzi 1 (30,4%), T. cruzi 2 (60,8%), T. cruzi 1 e 2 (8,6%). A alta taxa de infecção dos vetores e reservatórios avaliados pode ser efeito da fragmentação florestal, causada pela expansão urbana. O Triatoma tibiamaculata já foi associado à transmissão oral do T. cruzi por alimentos infectados no Brasil e a ocorrência de exemplares infectados desta espécie no ambiente intradomicíliar na cidade de Salvador é fator de risco para a transmissão da doença de Chagas para a população local. Os dados obtidos na tipagem molecular das cepas isoladas em Salvador demonstrou maior prevalência do T. cruzi 2 em seguida do T. cruzi 1 nos vetores e reservatórios avaliados. A presença de triatomíneos e marsupiais infectados, co-habitando e albergando diversas linhagens do T. cruzi em áreas de ocupação urbana é razão de alerta para os órgãos de vigilância em saúde locais. / Chagas disease is a parasitic infection caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. The T. cruzi strains constitute a heterogeneous population, with several subpopulations. These populations move between domestic vertebrate animals, wildlife and humans, and insect vectors. Because of these multiple relationships, T. cruzi demonstrates great biological diversity, genetic, biochemical and immunological. The characterization of T. cruzi strains can use various methodologies that may have biological, biochemical, and molecular isoenzyme focus. Among these, the molecular been gaining attention due to speed, sensitivity and precision of the method. Thus, the present study the objective was to characterize molecularly strains of Trypanosoma cruzi (Chagas 1909) isolated in vectors and reservoirs in the urban area of Salvador. Were included in this study T. cruzi samples of insects and shells from different localities of the city of Salvador, captured between July 2007 and June 2011, a total of four years of sampling. We adopt molecular typing technique of T. cruzi suggested by Zingales et al. (2009) in a capillary electrophoresis system. Of the 930 samples evaluated triatomine 99.35% of Triatoma tibiamaculata, 482 samples (52%) were not in analytical conditions. Of the 448 samples amenable to analysis 192 samples were randomized (43%) for evaluation of T. cruzi strain. Among the samples analyzed, 20 (10.4%) had no satisfactory signal in capillary electrophoresis and were excluded, leaving 172 samples. T. cruzi was detected in 21.5% of samples of insects (n = 37). The typing revealed the following profile in positive samples: T. cruzi 1 (32.4%) T. cruzi 2 (59.4%) T. cruzi 3 (2.7%). Triatominae was also detected with multiple infections with different strains of T. cruzi 1 & 2 (5.4%). Additionally, we evaluated 78 marsupials, Didelphis spp. The infection rate in marsupials was 29.4%, and the positive samples was observed the following molecular profile of typing T. cruzi: T. cruzi 1 (30.4%), T. cruzi 2 (60.8% ), T. cruzi 1 and 2 (8.6%). The high rate of infection vectors and reservoirs can be evaluated effect of forest fragmentation caused by urban sprawl. Triatoma tibiamaculata has been associated with oral transmission of T. cruzi by infected food in Brazil and the occurrence of infected specimens of this species within domestic environments in the city of Salvador is a risk factor for the transmission of Chagas disease to the local population. The data obtained in the molecular typing of strains isolated from Salvador showed a greater prevalence of T. cruzi 2 then 1 of T. cruzi in vectors and reservoirs evaluated. The presence of infected bugs and marsupials, co-habiting and harboring various strains of T. cruzi in urban areas of occupation is warning reason for the oversight bodies in local health

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A transsialidase é uma glicoproteína de membrana pertencente a uma família de genes de cópia múltipla, envolvida no processo de invasão celular do Trypanosoma cruzi no hospedeiro vertebrado. Esta dissertação foi concebida com um amplo componente analítico que dependia de dados publicamente disponíveis, ou seja, as sequências oriundas do projeto genoma de T. cruzi e cDNAs de trans-sialidase depositadas no Genbank-dbEST. Este componente analítico necessitou ser complementado e ampliado com a obtenção experimental de novas sequências, a partir da metodologia baseada na transcrição reversa acoplada a PCR. Os fragmentos obtidos de cepas de T. cruzi Dm28c (T. cruzi I), Y (T. cruzi II), CL-Brener (T. cruzi II, cepa híbrida), INPA4167 (zimodema III), 3663 (zimodema III) e Colombiana (zimodema III) foram clonados, sequenciados e analisados composicionalmente. Essas sequências foram editadas e alinhadas usando-se o software CLUSTAL X. Em uma seção específica do Genbank, denominada dbEST, buscamos os cDNAs homólogos a trans-sialidase. Esta busca por similaridade foi realizada individualmente com os números de acesso referentes às seqüências supracitadas contra o dbEST utilizando o BLAST a fim de obtermos informações funcionais e evolutivas. Em seguida, desenvolvemos metodologias experimentais que nos permitiu avaliar segmentos da 5 UTR, tais como os sítios de trans-splicing adicionais ou múltiplos em TS e seus respectivos sinais (região rica em polipirimidina), variação composicional e tamanho da região das sequências entre diferentes linhagens de T. cruzi. O resultado dessa averiguação também nos mostrou a quantidade de cDNAs relacionados com a transsialidase no dbEST bem como a relação desses cDNAs com o mini-exon. As cepas do zimodema III apresentaram tamanho médio dos fragmentos de 312 bases, enquanto T. cruzi I e T. cruzi II apresentaram, respectivamente 209 e 218. Trans splicing adicional ou duplicações gênicas com mutações no sítio primário de trans splicing não parece ser um fenômeno exclusivo de algum grupo populacional, embora seja mais evidente em T. cruzi zimodema III.

O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, possui um ciclo de vida complexo, deve lidar com diversas condições do ambiente e depende dos hospedeiros para suprir suas necessidades nutricionais. Uma delas é a necessidade de captar a molécula de heme (Fe-protoporfirina IX) que será utilizada como fator de crescimento. Os mecanismos envolvendo o metabolismo de heme são cruciais para a sobrevivência do T. cruzi pois o parasito não possui várias enzimas de biossíntese dessa porfirina e o heme livre pode apresentar citotoxicidade para célula. Na tentativa de perseguir o destino final do heme no parasito, nós estudamos essa via inexplorada no T. cruzi. Nessa tese, nós demonstramos que epimastigotas cultivados com heme, produziram os compostos, α-meso hidroxiheme, verdoheme e biliverdina (identificados por HPLC acoplado á espectrofotômetria). Além disso, nós observamos através de análise dos extratos de epimastigotas no espectrômetro de massas (LQT Orbitrap), espécies iônicas de m/z 583,4 e m/z 619,3. A fragmentação subsequente desses íons originaram espécies filhas típicas das moléculas de biliverdina e verdoheme, respectivamente. Nós observamos também, espécies iônicas de m/z 1397,4 e m/z 1135,4. A fragmentação dessas espécies produziram íons, sendo um deles com a mesma massa molecular de heme (m/z 616,3). Essa espécie iônica por sua vez, gerou fragmentos iônicos idênticos a uma molécula de heme, confirmando que esses intermediários são produtos da modificação da porfirina. Baseado nesses resultados, nós propomos um modelo onde o catabolismo de heme em T. cruzi, envolveria a conjugação da bis(glutationil)spermina, um derivado da tripanotiona presente em tripanossomatídeos, à porfirina (m/z 1137,4), seguido da remoção de dois resíduos de ácidos glutâmicos (m/z 1135,4). Embora o significado bioquímico e fisiológico da adição desse resíduo tiol na molécula de heme ainda é pouco compreendido, alguns trabalhos demonstram a abilidade desses compostos em ligar na porfirina, sem contar também, que esse heme conjugado poderia resultar em uma forma efetiva de prevenção de danos à membrana e a célula ocasionados pelo acúmulo de heme livre. Em conjunto, esses resultados fornecem novas abordagens do metabolismo de heme em T. cruzi, revelando possíveis alvos de intervenção quimioterápica futuros. Nossa proposta está direcionada para uma via ativa de catabolismo de heme que inclui a adição de grupos tiol (derivado da tripanotiona) à heme e a clivagem do anel porfirínico originando a molécula de biliverdina. / Trypanosoma cruzi, the causal agent of Chagas disease, has a complex life cycle and they must cope with diverse environmental conditions and depends on hosts for its nutritional needs. One of the nutritional characteristic is that they need a heme compound (Fe-protoporphyrin IX) as a growth factor. The mechanisms involved in these processes are crucial for their survival mainly because of trypanosomatids lack of the complete heme biosynthetic pathway and the cytotoxic activity of free heme. Following the fate of this porphyrin in the parasite we studied this missing pathway in T. cruzi. Here, we show that epimastigotes cultivated with heme yielded the compounds, α-meso hydroxyheme, verdoheme and biliverdin (as determined by HPLC with diode array detector). Furthermore, we observed ion species of m/z 583.4 and m/z 619.3 from epimastigotes extracts detected by direct infusion on LQT Orbitrap platform. A tipical biliverdin and verdoheme doughter-ion species were generated by m/z 583.4 and m/z 619.3 fragmentations, respectively. We also observed an ion species at m/z 1397.4 and m/z 1135. The subsequent fragmentation of this species produced a daughter-ions whose one with the same molecular mass as heme (m/z 616.4). This species, in turn, generated daughter species identical to an authentic heme, confirming that these intermediates were modified heme products. Based on these findings, we propose that heme catabolism in T. cruzi involves a additions of Bis(glutathionyl)spermine, a low molecular mass thiols occurring in trypanosomatids, to heme (m/z 1397.4), followed by removal of the glutamic residues (m/z 1135). Although the biochemical and physiological significance of the addition of thiol residues to heme molecule is underexplored, some works, already demonstrated their ability to bind heme and also this modified heme may resulting in the effective prevention of membrane damage and cytotoxicity by the heme accumulation. Taken together, these results offer new insights into heme metabolism in T. cruzi, revealing potential future therapeutic targets. We propose an active heme catabolism pathway that includes a trypanotione derivate additions and cleavage of the heme porphyring ring to biliverdin.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / As formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi proliferam e se diferenciam no interior de diferentes compartimentos do trato digestivo dos triatomíneos. Esses ambientes antagônicos, no que diz respeito à concentração de nutrientes, pH e status redox, constituem um desafio para o protozoário por conterem moléculas e fatores capazes de deflagrar diferentes sinalizações e respostas no parasito. Por isso, testamos a influência de produtos abundantes do metabolismo do vetor e de status redox distintos, frente aos processos de proliferação e diferenciação in vivo e in vitro. Como exemplo temos o heme e a hemozoína, subprodutos da digestão da hemoglobina, e o urato, rico na urina dos insetos. O heme é uma importante molécula em todos os seres vivos. Nosso grupo mostrou seu papel na proliferação in vitro de T. cruzi e que esse sinal é governado pela enzima redox-sensível CaMKII (Lara et al., 2007; Souza et al., 2009). Esse efeito parece depender de uma sinalização redox, onde o heme e não seus análigos induz a formação de EROs, modulando a atividade da CaMKII (Nogueira et al, 2011). Apesar de gerar espécies reativas de oxigênio (EROs) em formas epimastigotas, o heme não alterou a ultraestrutura desses parasitos mostrando uma adaptação a ambientes oxidantes. Além disso, a adição de FCCP inibiu a formação de EROs mitocondrial, diminuindo a proliferação dos parasitos. Em contrapartida, a AA aumentou drasticamente a produção de EROs mitocondrial levando à morte dos epimastigotas. Estes resultados confirmam a hipótese de regulação redox do crescimento de epimastigotas. A formação de β- hematina (hemozoína) constitui uma elegante estratégia para minimizar o efeito tóxico do heme nos insetos hematófagos. Contudo, a β-hematina não influenciou a proliferação ou a metaciclogênese in vitro. Já o urato, e outros antioxidantes clássicos como o GSH e o NAC prejudicaram a proliferação in vitro de epimastigotas. Estes efeitos foram parcialmente revertidos quando os antioxidantes foram incubados juntamente com o heme. Durante a metaciclogênese in vitro, o NAC e o urato induziram um aumento significativo das formas tripomastigotas e levaram a diminuição da porcentagem de formas epimastigotas. Em contrapartida, o heme e a β-hematina apresentaram o efeito oposto, diminuindo a porcentagem de formas tripomastigotas e aumentando a de epimastigotas. No intuito de confirmar a influencia do status redox na biologia do parasito in vivo, nós quantificamos a carga parasitária nas porções anterior e posterior e no reto do triatomíneo alimentado na presença ou na ausência de NAC e urato por qPCR. O tratamento com os antioxidantes aumentou a carga parasitária em todas as partes do intestino analisadas. Posteriormente, para diferenciar as formas evolutivas responsáveis pelo incremento da carga parasitária, foram realizadas contagens diferenciais nas mesmas porções do intestino do inseto vetor. Cinco dias após a infecção foi observado aumento significativo de formas tripomastigotas e diminuição de formas epimastigotas in vivo. Em conjunto, estes dados sugerem que, assim como a concentração de nutrientes e o pH, o status redox também pode influenciar a biologia do T. cruzi no interior do inseto vetor. Neste cenário, moléculas oxidantes agiriam a favor da proliferação, e em contraste, antioxidantes parecem favorecer a metaciclogênese. / Trypanosoma cruzi epimastigotes proliferate and differentiate inside different compartments of the triatomines gut. These environments are antagonic in terms of nutrient content, pH and redox status. All these factors represent a challenge to the protozoan due to the presence of molecules and factors which are able to induce different signals to the parasite. Thus, we tested the influence of abundant metabolism products of the vector, with distinct redox status, in the proliferation and metacyclogenesis in vitro and in vivo. These molecules are heme and hemozoin, both byproducts of hemoglobin digestion, and urate, present in the urine of insects. Heme is a ubiquitous molecule present in all living organisms. Our group studied its role in T. cruzi growth in vitro, showing that this signal is governed by the redox-sensitive enzyme CaMKII (Lara et al., 2007; Souza et al., 2009). Indeed, it seems to rely on a redox signaling pathway in which heme, but not its analogs, induces ROS formation, thus modulating CaMKII activity (Nogueira et al., 2011). Although it induces ROS in epimastigotes, the heme molecule had no deleterious effect upon the parasites ultrastructure, suggesting an adaptation to oxidative environments. In addition, FCCP inhibited mitochondrial ROS formation, then decreasing the parasite proliferation. On the other hand, AA drastically increased mitochondrial ROS production leading to cell death. These results corroborate the hypothesis of redox regulation of epimastigotes proliferation. Hemozoin (β- hematin) formation is an elegant strategy to minimize the toxic effect of heme in hematophagous insects. However, β-hematin had no influence upon the proliferation or metacyclogenesis in vitro. Also, urate, GSH and NAC impaired epimastigote proliferation. These effects were partially reversed when the antioxidants were incubated along with heme. During metacyclogenesis in vitro, NAC and urate induced a significant increment of trypomastigotes and decreased the percentage of epimastigotes. Heme and β-hematin presented the opposite effect diminishing the percentage of trypomastigotes and increasing the percentage of epimastigotes. To confirm the influence of the redox status in the parasite biology in vivo, we quantified the parasite loads in the anterior and posterior midguts and in the rectum of the triatomine vector fed with or without NAC and urate by qPCR. The treatment with the antioxidants increased the parasite loads in all midgut sections analyzed. Afterwards, in order to distinguish the evolutive forms responsible for the increment of parasite loads, we performed differential counting of the midgut sections. Five days post infection we observed an increment of trypomastigotes and a decrease of epimastigote forms in vivo. Taken together, these data suggests that, as well as nutrient content and pH, the redox status may also influence T. cruzi biology in the vector. In this scenario, oxidants act to turn on proliferation and in contrast, antioxidants seem to switch the cycle towards metacyclogenesis.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, transmitida através de insetos vetores triatomíneos durante a alimentação no hospedeiro vertebrado. Os triatomíneos ingerem numa única alimentação cerca de 10 mM de heme ligado à hemoglobina. O heme é uma importante molécula no metabolismo dos organismos. Um mecanismo intracelular importante no controle de sua homeostase é a degradação enzimática pela Heme Oxigenase (HO) formando biliverdina (Bv), monóxido de carbono e ferro. Como esta enzima não está presente no genoma de T. cruzi, esse trabalho tem por objetivo identificar uma atividade funcional de HO neste parasito, uma vez que dados do nosso laboratório mostram a presença de biliverdina nas incubações dessas células com heme. No presente trabalho testamos o efeito do SnPPIX (inibidor da HO-1), CoPPIX (indutor da HO-1) e Bv sobre a proliferação da forma epimastigota do parasito. A adição de SnPPIX diminuiu a proliferação do parasito na tanto na ausência quanto na presença de heme. Quando a Bv foi adicionada à cultura esse efeito foi revertido; a Bv aumenta a proliferação celular na presença de heme. Por outro lado, a adição de CoPPIX não interferiu na proliferação. Posteriormente, mostramos através da técnica de immunoblotting, utilizando anticorpo monoclonal contra a HO-1, um aumento da expressão de uma proteína em resposta ao heme. Diferentemente das HO-1 já descritas que possuem massa molecular de 32 kDa, a única banda reconhecida pelo anticorpo apresenta 45 kDa. Analisamos também a expressão da HO-1 na presença de CoPPIX, SnPPIX e biliverdina, e somente o CoPPIX foi capaz de modular os níveis de expressão da HO-1. A análise estrutural através da técnica de imunocitoquímica mostrou uma maior expressão da enzima na presença de heme, e que a HO-1 de T. cruzi pode ter mais de uma localização, apresentando marcação citoplasmática e glicossomal. A fim de investigar a sequência da HO-1 de T. cruzi, o DNA genômico foi extraído para amplificação por PCR do gene da HO-1 utilizando oligonucleotídeos desenhados no genoma de T. cruzi. Os dois pares de oligonucleotídeos utilizados nao foram capazes de amplificar uma sequência equivalente a uma HO. Em seguida, utilizamos a técnica de imunoprecipitação, seguida de immunoblotting, com anticorpo anti-HO-1, com objetivo de concentrar a proteína alvo, e observamos um aumento significativo do imunocomplexo nas células tratadas com heme 300 mM, cerca de 2 vezes em relação ao controle. Dando seguimento à tentativa de identificação da HO-1 de T. cruzi, utilizamos a técnica de espectrometria de massa a partir de eletroforese unidimensional, que mostrou uma grande alteração do perfil protéico na presença de heme, mas futuros experimentos são necessários, como eletroforese 2D, para a identificação da proteína alvo / Trypanosoma cruzi, the ethiologic agent of Chagas disease, is transmitted through triatomine vectors during their blood-meal on vertebrate host. These hematophagous insects ingest blood about 6 to 12 times its original weight, reaching in a single meal about 10 mM heme bound to hemoglobin. Heme (iron protoporphyrin IX) is an important molecule in metabolism of all living organisms. One important intracellular mechanism to control heme homeostasis is its enzymatic degradation by heme oxygenase (HO). HO catalyzes the degradation of heme to biliverdin (Bv), carbon monoxide and iron. HO is absent in T. cruzi genome, thus we have been investigating the presence of a functional HO in this parasite, since our previous results showed a presence of biliverdin in heme-treated epimastigotes. In the present work, we evaluated the effect of SnPPIX, a HO-1 inhibitor, CoPPIX, a HO inducer, and Bv upon T. cruzi epimastigotes proliferation. The addition of SnPPIX decreased the parasite proliferation in the absence or in the presence of heme. When Bv was added to the culture this effect was reversed; Bv increases the parasite proliferation in the presence of heme. On the other hand, CoPPIX did not interfered on proliferation. Furthermore, we showed through immunoblotting, using an anti-HO-1 monoclonal antibody, an increase in the protein expression in heme-treated epimastigotes. Differently of described HO-1 that has a mass molecular of a 32 kDa, we showed a 45 kDa protein, the only band recognize by the HO-1 antibody. HO-1 expression analysis in the presence of CoPPIX, SnPPIX and biliverdin, showed that only CoPPIX was able to modulate its expression level. Ultrastructural immunocytochemistry analysis suggests a higher expression of the enzyme in heme-treated epimastigotes, and that T. cruzi HO-1 might have a dual distribution, since the anti-HO-1 antibody labeled both cytosol and glycosomes. In order to investigate the T. cruzi HO-1 gene sequence, we isolated genomic DNA from T. cruzi for PCR amplification using primers designed as from the parasite genome. Unfortunately, the two pairs of the designed oligonucleotides tested were unable to amplify a sequence equivalent to a HO-1. In order to isolate the target protein, immunoprecipitation was performed and subsequently immunoblotted with anti-HO-1 antibody. The immunocomplex level was two-fold higher in heme-treated cells. Following the attempt to identify a HO-1 in T. cruzi, we used mass spectrometry from unidimensional electrophoresis. We showed a significant protein profile modification in heme-treated epimastigotes, but further experiments will be necessary, such as mass spectrometry from bidimensional electrophoresis, for identification of the target protein

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-28T16:26:07Z No. of bitstreams: 1 2016_AlineSilvaMoraes.pdf: 1493539 bytes, checksum: 3d4a2d5c7ca444ed6c0872b841d411bb (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-07-15T12:05:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AlineSilvaMoraes.pdf: 1493539 bytes, checksum: 3d4a2d5c7ca444ed6c0872b841d411bb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-15T12:05:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AlineSilvaMoraes.pdf: 1493539 bytes, checksum: 3d4a2d5c7ca444ed6c0872b841d411bb (MD5) / A doença de Chagas é considerada uma das principais endemias da América Latina, existindo cerca de oito milhões de pessoas infectadas com o Trypanosoma cruzi em todo o mundo, principalmente na América Latina. A associação entre a transferência gênica lateral de minicírculos de kDNA do T. cruzi para o genoma hospedeiro e o surgimento de manifestações clínicas da doença de Chagas está descrita na literatura. Entretanto os mecanismos que levariam ao desenvolvimento das reações autoimunes ainda precisam ser elucidados. No presente estudo, desenvolveu-se um protocolo de PCR quantitativa (qPCR) que permitiu a quantificação das integrações de minicírculos de kDNA de T. cruzi no genoma do hospedeiro, confirmando, dessa forma, a transferência dos minicírculos ao genoma de célula hospedeira. Verificou-se que há um acúmulo das integrações ao longo do tempo em células J774.A1. À medida que ocorre a inserção dos minicírculos de kDNA no genoma hospedeiro, observa-se alteração da temperatura de dissociação das amostras, indicando mudança na composição ou no tamanho dos fragmentos integrados. De fato, a clonagem e o sequenciamento dos amplicons demonstrou o truncamento da região variável do kDNA. O Benznidazol é capaz de eliminar a infecção, porém não previne a integração e o acúmulo das sequências de kDNA. Já o AZT, droga inibidora de retrotransposição, mostra-se efetivo no controle dos eventos de integração. Os experimentos in vivo corroboraram os achados in vitro, demonstrando uma maior quantidade de integrações em animais que se encontravam na fase crônica da doença de Chagas. Outros estudos são necessários para determinar o papel do acúmulo de integrações de kDNA e a severidade das manifestações clínicas. Entretanto, o real significado de tais mutações não fica restrito à doença de Chagas, mas, sim, estende-se ao longo do processo da evolução, em que a aquisição de DNA exógeno ajudaria a impulsionar um fluxo genético introdutor de complexidade crescente às espécies. / Chagas' disease is considered a major endemic disease in Latin America, and there are approximately eight million people infected with Trypanosoma cruzi worldwide, especially in Latin America. The association between lateral gene transfer of T. cruzi kDNA minicircle into host genome and the onset of clinical manifestations of Chagas disease is described in the literature. However, the mechanisms that lead to autoimmune reactions are to need to be elucidated. In the present study, we have developed a protocol quantitative PCR (qPCR), which permitted quantitation of kDNA minicircle integrations T. cruzi into the host genome, confirming thus the transfer of the minicircle into the genome of the host J774.A1 cells. It was found that there is an accumulation of integrations over time J774.A1 cells. As kDNA insertions occur, there is change in melting curve, indicating change in composition or size of the integrated fragments. In fact, cloning and sequencing of amplicons showed loss of nucleotides in kDNA variable region. Benznidazole is able to eliminate the infection, but does not prevent the integration and accumulation of kDNA sequences. AZT, an inhibitory drug for retro transposition, shows to be effective in controlling integration events. In vivo experiments confirmed in vitro findings, showing a greater amount of integrations in animals that were in the chronic phase of Chagas disease. Further studies are needed to determine the role of kDNA accumulation in severity of clinical manifestations. However, the real significance of such date is not restricted to Chagas disease, but rather extends throughout the evolutionary process, where the acquisition of exogenous DNA would help boost a genetic flow introducing higher complexity to species.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-02-24Bitstream added on 2014-06-13T20:29:39Z : No. of bitstreams: 1 ambrosio_dl_me_arafcf.pdf: 2442154 bytes, checksum: cc3386b51bef3a73071ee6043f88fc0e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Alguns fatores importantes no funcionamento das células eucarióticas correspondem à pequenos complexos de RNA e proteínas; essas partículas de ribonucleoproteínas (UsnRNPs) têm um papel essencial no processamento do pré-mRNA, principalmente durante o splicing (corte de íntrons e união de éxons). Embora as snRNPs estejam definidas em mamíferos, ainda não estão bem caracterizadas em certos tripanosomatídeos como o Trypanosoma cruzi. Assim, este trabalho propôs a caracterização molecular dos snRNAs (U2, U4, U5 e U6), por PCR e RT-PCR de formas epimastigotas de T. cruzi (cepa Y). Essas seqüências amplificadas foram clonadas, seqüenciadas e comparadas entre os tripanosomatídeos e o alinhamento múltiplo apresentou mais de 70% de identidade, exceto da U5 snRNA, que se mostrou menos conservada. Árvores filogenéticas mostraram a proximidade evolutiva dos snRNAs analisados em Trypanosoma brucei e Trypanosoma cruzi. As respectivas estruturas secundárias foram preditas, confirmando-se também as semelhanças com aquelas de T. brucei. O alinhamento das snRNAs de T. cruzi com as seqüências de Homo sapiens mostrou regiões únicas em U2, U4 e U5 snRNAs, nessa espécie, enquanto U6 mostrou-se fortemente conservada. Até o momento, ainda não foi possível a obtenção da seqüência completa de U1 snRNA de T. cruzi. / Some important factors in functioning of the eucariotic cells are the small complexes of RNA and proteins; these particles of ribonucleoproteins (UsnRNPs) have an essential role in the pre-mRNA processing, mainly during splicing (cut of introns and union of exons). Even though they are well defined in mammals, snRNPs are still not characterized in certain Trypanosomatids, as well, Trypanosoma cruzi. So, this work proposed the molecular characterization of the snRNAs (U2, U4, U5 and U6), by PCR and RT-PCR with T. cruzi epimastigote forms (Y strain). These amplified sequences were cloned, sequenced and compared among the Trypanosomatids and the multiple alignment presented more than 70% of identity, except for U5 snRNA, which showed less conserved. Phylogenetic trees showed the evolutionary proximity between the Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi snRNAs analysed. The respective secondary structures were predicted and also confirmed similarity with T. brucei. The alignment of T. cruzi snRNAs with Homo sapiens sequences showed unique regions in U2, U4 and U5 snRNAs in this species, while U6 was strongly conserved. Until this moment, it was not still possible to obtain U1 snRNA of T. cruzi complete sequence.

This paper aimed to describe some lab and histological findings from an experimental infection of Trypanosoma (Trypanozoon) evansi Steel, 1885 (Balbiani, 1888) in rats (Rattus novergicus) belonging to the Wistar strain, testing the effectiveness of three medications. These animals were divided in 4 groups of 10 each and treated to three different chemical treatments after the detection of more than eight tripomastigotes for visual side of the blood smears at the light microscope with 1000 increase. Was tested injectable oxytetracycline 10%, benzonidazol per oss and injectable diminazene 7% while one infected and untreated group remained as control. Evaluation of treatment efficacy was performed through daily blood smears stained by Panotico Rápido® for 60 days. The rats were necropsied aiming histological examination. Treatment with diminazene was the most efficient since no parasites having significant difference (p < 0.05) between males and females of that group, which presented survive after the treatment of 14,4 days more than the males. Histological alterations findings were not specific. / Este trabalho objetivou verificar os achados laboratoriais e histológicos da infecção experimental por Trypanosoma (Trypanozoon) evansi (Steel, 1885) Balbiani, 1888, em ratos (Rattus norvegicus) da linhagem Wistar, testando a eficácia de três medicamentos. Foram utilizados 40 ratos, divididos em quatro grupos de 10 cada, sendo cada grupo composto por 5 machos e cinco fêmeas, os quais foram tratados com três quimioterápicos distintos após a detecção de parasitemia superior a oito tripomastigotas por campo visual do esfregaço sangüíneo ao microscópio de luz (1000 vezes). Testou-se oxitetraciclina 10% injetável, benzonidazol comprimidos de 100mg e aceturato de diminazeno 7% injetável comparados com um grupo controle, experimentalmente infectado, mas não tratado. As avaliações foram feitas por contagens diárias da presença de hemoparasitas em esfregaço sangüíneo, corado por Panótico Rápido®, por 60 dias. Os ratos foram necropsiados e avaliados histologicamente à procura de alterações microscópicas dos órgãos afetados. O tratamento feito com aceturato de diminazeno foi o mais eficaz no controle da parasitemia, havendo diferença significativa (p < 0.05) entre machos e fêmeas desse grupo, as quais apresentaram período de sobrevida após o tratamento de 14,4 dias superior aos machos. Histologicamente as alterações encontradas nos órgãos afetados foram inespecíficas.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:16:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GeorgeHFS_DISSERT.pdf: 1763122 bytes, checksum: 18e2cb37f905538f998bc0737edfeb96 (MD5) Previous issue date: 2010-12-03 / Trypanosoma cruzi infection was evaluated in 390 resident individuals in different rural communities of Caic? municipality, State of Rio Grande do Norte (RN). Of 28 investigated communities the soroprevalence of T. cruzi infection was 2.8% in eight rural communities individuals. The epidemiological characteristics of seropositive shown that the age ranged from 22 to 64 years, being significantly raised from 31 years (90.9%). The female gender was predominant and low education degree. Those individuals reported that they never donated blood, but they had direct contact with triatomines bug. The isolation of the parasite was performed by blood culture and xenoculture methods to determine the genetic variability of the samples. Twenty seven T. cruzi isolates were analyzed by RAPD as genetic marker using three random primers (M13-40, gt11-F and L15996). The T. cruzi isolates showed 73.7% of shared bands considering the average obtained with the three primers, and were genetically well correlated. Using this marker it was possible to separate the populations of the parasite in three distinct groups. The first group composed by isolates obtained of triatomines and humans from four different districts (Caic?, Cara?bas, Serra Negra doNorte and Governador Dix-Sept Rosado); the second contained isolates obtained of triatomines of two different species (T. brasiliensis and P. lutzi) captured in Cara?bas and Serra Negra do Norte. The third grouped isolates obtained from humans of Angicos and Caic? municipalities. In different localities of distinct mesoregions, State of RN, a profile genetic well correlated was identified among all isolates and the presence of three distinct groups of the parasite circulating among vertebrate and invertebrate hosts / A infec??o pelo Trypanosoma cruzi foi avaliada em 390 indiv?duos residentes em diferentes comunidades rurais do munic?pio de Caic?, Estado do Rio Grande do Norte (RN). De 28 comunidades investigadas a soropreval?ncia da infec??o pelo T. cruzi foi 2,8% em indiv?duos de oito comunidades rurais. As caracter?sticas epidemiol?gicas dos indiv?duos com sorologia reativa demonstraram que, a idade variou de 22 a 64 anos, sendo significativamente mais elevada a partir de 31 anos (90,9%). O g?nero feminino foi predominante e baixo grau de escolaridade. Esses indiv?duos relataram que nunca doaram sangue, mas tiveram contato direto com triatom?neos. O isolamento do parasito foi realizado usando os m?todos de hemocultura e xenocultura para determinar ? variabilidade gen?tica das amostras. Em 27 isolados foi realizada a t?cnica de RAPD como marcador gen?tico usando tr?s iniciadores aleat?rios (M13-40, &#955;gt11-F e L15996). Os isolados do T. cruzi se mostraram bem correlacionados, com 73,7% de bandas compartilhadas, quando a an?lise foi realizada considerando a m?dia obtida com os tr?s iniciadores. Com este marcador foi poss?vel separar as popula??es do parasito em tr?s grupos distintos. O primeiro grupo composto por isolados obtidos de triatom?neos e humanos procedentes de quatro munic?pios distintos (Caic?, Cara?bas, Serra Negra do Norte e Governador Dix-Sept Rosado); o segundo agrupou os demais isolados obtidos de triatom?neos de duas esp?cies diferentes (T. brasiliensis e P. lutzi) capturadas em Cara?bas e Serra Negra do Norte. O terceiro grupo reuniu as amostras isoladas apenas de seres humanos procedentes dos munic?pios de Angicos e Caic?. Em diferentes munic?pios de mesorregi?es distintas do Estado do RN foi identificado um perfil gen?tico bem correlacionado entre todos os isolados e a presen?a de tr?s grupos gen?ticos distintos do parasito, circulando entre hospedeiros vertebrados e invertebrados