O controle do parasita na fase crônica da infecção por Trypanosoma cruzi se dá principalmente por uma resposta mediada por anticorpos, uma resposta celular TH1 e uma resposta mediada por linfócitos T CD8. Na fase crônica, co-existem linfócitos T CD8 com fenótipo CD8Low CD45RCLow (CD8LL que apresentam marcadores de células sensibilizadas pelo antígeno) junto com células CD8High CD45RCHigh (CD8HH, que em grande parte apresentam fenótipo de célula naive). Células CD8High CD45RCLow (CD8HL) podem ser também observadas. As células CD8LL se apresentam no camundongo independente da cepa de T. cruzi infectante. Verificou-se que na sua grande maioria as células CD8LL tem fenótipo de células em repouso, baixa expressão de CD62L baixa expressão de CD127 (CD62LLOWCD127LOW), sendo estas as características de células efetoras de memória (EM). Este tipo celular ainda pode chegar a expressar marcadores de células NK de significado incerto. Observa-se, na análise funcional, que na estimulação in vitro das células CD8 com anticorpos anti-CD3/CD28 há uma recuperação baixa de CD8 por provável morte por AICD. Este fato é reforçado pelo aumento da ligação à anexina nas células sobreviventes, bem como através da expressão de CD69. Estudos anteriores relataram que o número de células CD8 diminuía após desafio in vivo com o parasita; porém o observado foi uma diminuição das células CD8LL na estimulação inespecífica in vivo com Poli-IC, um ligante de TLR-3. O desafio in vivo com antígeno de tripanossoma na cavidade pleural ocasiona uma migração preferencial de células CD8 e entre estas migram células de fenótipos CD8LL e CD8HL. No entanto, ao contrário do esperado, este estímulo resulta em uma diminuição da expressão de CD69 nas células CD8 infiltrantes. Visando determinar in vivo o papel protetor das células CD8, em um primeiro momento células de baço total foram tranferidas para camundongos sadios e, após a infecção com T. cruzi, observou-se um controle parcial da infecção, caracterizado por um retardo no pico de parasitemia e diminuição na intensidade de infecção, evidenciando um papel protetor parcial in vivo. Na determinação de fatores envolvidos na geração e manutenção das células CD8LL, observou-se que os camundongos deficientes em CD28, INOS ou CD4 têm geração normal de células CD8LL. Os camundongos IL-12p40-KO têm uma deficiência parcial na geração de células CD8LL. Já os camundongos deficientes em INF-gama, por sua vez, possuem uma deficiência acentuada destas células, apesar de que a diminuição poderia se dever a um aumento da necessidade periférica. Por outro lado, os camundongos IL-12p40-KO e INF-gama-KO desenvolvem um quadro neurológico sub-agudo progressivo, onde as células CD8 infiltrantes na medula espinhal apresentam um fenótipo misto CD8LL e CD8HL, e não são anérgicas, por sinal. / The control of the parasite in the chronic phase of infection by Trypanosoma cruzi occurs mainly by an antibody response mediated by a TH1 response and a cellular response mediated by CD8 T lymphocytes. In the chronic phase, co-exist with CD8 T lymphocyte phenotype CD8Low CD45RCLow (CD8LL showing markers of cells sensitized by antigen) with cell CD8High CD45RCHigh (CD8HH which have largely naive cell phenotype). Cells CD8High CD45RCLow (CD8HL) can also be observed. CD8LL cells were present in mice independent of the strain of T. cruzi infecting. It was found that in most cells CD8LL cell phenotype is at rest, low expression of CD62Llow expression of CD127 (CD62LLOWCD127LOW), which are the characteristics of effector memory cells (MS). This cell type can still get to express markers of NK cells of uncertain significance. There is, in functional analysis, which in vitro stimulation of CD8 cells with anti-CD3/CD28 antibodies there is a low recovery of CD8 by probable death IACD. This fact is reinforced by the increase in connection anexina cells survived, and through the expression of CD69. Previous studies reported that the number of CD8 cells decreased after in vivo challenge with the parasite, but the observed was a decrease in cell CD8LL the nonspecific stimulation in vivo with poly-IC, a ligand of TLR-3. The challenge with antigen in vivo of trypanosome in the pleural cavity causes a preferential migration of CD8 cells and between the migrating cells CD8LL phenotypes and CD8HL. However, unlike the expected, this stimulation results in a decrease in the expression of CD69 on CD8 cells infiltrating. To determine the in vivo protective role of CD8 cells in a first time total spleen cells were transferred to healthy mice and after infection with T. cruzi, there was a partial control of infection, characterized by a delay in peak parasitemia and decrease in intensity of infection, indicating a partial protective role in vivo. In determining the factors involved in the generation and maintenance of cells CD8LL, it was observed that mice deficient in CD28, iNOS and generation have normal CD4 cell CD8LL. The mouse IL-12p40-KO have a partial deficiency in the generation of cells CD8LL. But the mice deficient in INF-gamma, which in turn have a marked deficiency of these cells, although the decrease could be due to increased peripheral need. Moreover, the mice IL-12p40-KO and INF-gamma-KO develop a progressive neurological sub-acute, where the infiltrating CD8 cells in the spinal cord showed a mixed phenotype CD8LL and CD8HL, and are not anergic, by signal.

As células da linhagem macrofágica são fundamentais na infecção por T. cruzi. Além do reconhecimento por PRRs, a interação com anticorpos e/ou complemento facilita a internalização. Avaliamos o papel in vivo e in vitro de IgM e IgG específicas na saída de parasitas Sylvio X10/4 do sangue, um clone miotrópico de T. cruzi que causa infecção sem parasitemia patente. Devido à sua saída espontânea, estudamos a remoção no sexto dia de infecção, momento em que a parasitemia subpatente aumenta. Camundongos foram infectados e tratados com soro normal (NMS), soro crônico (B6) e soro de animais CD28KO crônicos (que produzem somente IgM). O grupo tratado com soro de CD28KO apresentou uma remoção significativa, porém menos eficiente do que com soro crônico (B6). Tais resultados foram reproduzidos em estudo in vitro na invasão de macrófagos (derivados de medula óssea ou do peritônio) com os distintos tratamentos. Concluímos que os macrófagos são fundamentais na remoção dos parasitas e os anticorpos, não somente IgG, mas também os da classe IgM reforçam este processo. / The cells of the macrophage lineage are essential for the infection by T. cruzi. Besides the recognition by PRRs, interaction with antibodies and/or complement facilitates internalization. We evaluated the role in vivo and in vitro of specific IgM and IgG in the blood output of parasites Sylvio X10/4, clone myotropic of T. cruzi which causes infection without patent parasitemia. Due to its spontaneous exit, we studied the removal on the sixth day of infection, when the parasitemia subpatent increases. Mice were infected and treated with normal mouse serum (NMS), chronic serum (B6) and serum from CD28KO chronic mice (which produce only IgM). The group treated with CD28KO serum showed a significant removal, but less efficiently than with chronic serum (B6). These results were reproduced in vitro study on the invasion of macrophages (derived from bone marrow or peritoneum) with these different treatments. We conclude that macrophages are essential in the removal of parasites and antibodies, not only IgG, but also IgM enhance this process.

A importância de aminoácidos em tripanossomatídeos vai além da síntese de aminoácidos, envolvendo processos tais como a diferenciação, osmorregulação e metabolismo energético. A disponibilidade dos aminoácidos envolvidos nestas funções depende, entre outras coisas, de seu transporte na célula. Aqui, caracterizamos o transporte de glutamato e GABA do parasita protozoário humano Trypanosoma cruzi. No transporte de glutamato dados cinéticos amostram um único sistema saturável com uma Km de 0.30 mM e uma velocidade máxima de 98.34 pmoles min-1 per 2 x 107 células para epimastigotas é 20 pmoles min-1 per 2 x 107 células para trypomastigotas, e uma Vmax de 84.45 pmoles/min/20x106 células com uma Km de 0.4 mM para o sistema de transporte de GABA. O transporte não apresentou alterações em condições de jejum de até 3 horas. Aspartato, alanina, glutamina, asparagina, metionina, oxaloacetato é alfa-cetoglutarato competiram com o substrato em concentrações dez vezes em excesso na incorporação de glutamato. Interessantemente, o transporte de glutamato aumentou fortemente na presença de GABA. O transporte de glutamato foi fortemente dependente do pH, mas não de concentrações de Na+ e K+ no meio extracelular, e o transporte de GABA foi fortemente dependente de K+. Estes dados foram consistentes com uma sensibilidade do sistema de transporte a um ionóforo (FCCP), sugerindo que o transporte é levado por um gradiente de concentração de H+ na membrana plasmática nos dois sistemas de transporte. O transporte de glutamato e GABA aumentou linearmente com a temperatura na faixa de 15 a 40o C. / The role of amino acids in trypanosomatids goes beyond protein synthesis, involving processes such as differentiation, osmoregulation and energy metabolism. The availability of the amino acids involved in those functions depends, among other things, on their transport into the cell. Here we characterize a glutamate transporter and GABA transport from the human protozoan parasite Trypanosoma cruzi. In the glutamate transport, data kinetics show a single saturable system with a Km of 0.30 mM and a maximum velocity of 98.34 pmoles min-1 per 2 x 107 cells for epimastigotes and 20 pmoles min-1 per 2 x 107 cells for trypomastigotes, and, a Vmax de 84.45 pmoles/min/20x106 cells and a Km of 0.4 mM for GABA transport system. Transport was not affected by parasite nutrient starvation for up to 3h in the two transport system. Aspartate, alanine, glutamine, asparagine, methionine, oxaloacetate and alpha-ketoglutarate competed with the substrate in 10-fold excess concentrations in the glutamate incorporation. Interestingly, the glutamate transport was strongly increased in the presence of GABA. Glutamate uptake was strongly dependent on pH, but not on Na+ or K+ concentrations in the extracellular medium, and the GABA transport was strongly dependent of K+. These data were consistent with the sensitivity of the system to the H+ ionophore carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone, suggesting that transport is driven by H+ concentration gradient across the cytoplasm membrane in two transport systems. The glutamate and GABA transport increased linearly with temperature in a range from 15 to 40 degrees C.

Anuros há muito tempo são conhecidos como portadores de tripanossomas em todo o mundo. Esses tripanossomas são transmitidos por sanguessugas e insetos hematófagos. Nenhum levantamento foi feito na América do Sul. A taxonomia tradicional resulta em identificações não confiáveis desses tripanossomas, a diversidade genética foi pouco investigada e o a filogenético é pouco conhecida. Neste estudo mostramos grande prevalência e marcada diversidade molecular e morfológica entre tripanossomas de várias espécies de anuros da Amazônia, Floresta Atlântica e Pantanal. O relacionamento filogenético inferido entre tripanossomas do Brasil, América do Norte, Europa e África revelou 5 clados de isolados de anuros. Um deles contem isolados de anuros e flebotomíneos, sugerindo que esses insetos possam ser vetores de tripanossomas de anuros. Em geral, os dados mostraram certo grau de associação entre clados de isolados e filogeografia de anuros e sugeriram que trocas de hospedeiros e adaptação ecológica desempenharam um papel importante na história evolutiva desses tripanossomas. / Amphibians of the order Anura have long been known to be infected with trypanosomes worldwide, infecting frogs and toads and transmitted by leeches and insects. No surveys were carried out in South American anurans. Traditional taxonomy renders unreliable identification of these trypanosomes, genetic diversity was poorly investigated and phylogenetic relationships are far from be understood. In this study, we showed high prevalence and marked morphological and molecular diversity among trypanosomes from several species from Amazonia, Atlantic Forest and Pantanal. Phylogenetic relationships inferred among trypanosomes from Brazil, North America, Europe and Africa disclosed 5 major clades of anuran isolates. One clade contains anuran and sand fly isolates, suggesting that these insects can be vectors of anuran trypanosomes. In general, data showed a certain degree of association between clades of isolates and anuran phylogeography and suggested that host switching and ecological fitting also play a role in the evolutionary history of these trypanosomes.

As doenças negligenciadas são conseqüências marcantes do subdesenvolvimento que atinge diversas regiões do planeta. Dentre estas, destaca-se a Doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, a qual afeta aproximadamente um quarto da população da América Latina e para qual os fármacos utilizados apresentam baixa eficácia, toxidez e sérios efeitos colaterais. Este quadro é agravado pela emergência de cepas resistentes, o que indica a grande necessidade de desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos contra esta doença. A enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) da via glicolítica do T. cruzi é um alvo macromolecular interessante devido ao seu papel essencial no metabolismo de tripanossomatídeos. Constitui o objetivo desta tese o desenvolvimento, a padronização e a validação de ensaios enzimáticos para a realização de extensivas triagens bioquímicas de modo a contribuir para a identificação de novos inibidores da GAPDH pertencentes a diversas classes químicas. Os compostos estudados são provenientes de síntese orgânica e de complexos inorgânicos de Rutênio, bem como de origem natural. Paralelamente, a realização do ensaio virtual em larga escala a partir de uma base de dados dirigida e da estrutura da GAPDH de T. cruzi resultou na identificação de um inibidor inédito da proteína alvo. Estudos do mecanismo de ação enzimático levaram à elucidação da modalidade de alguns inibidores identificados nesse estudo. / Parasitic diseases are a major global cause of illness, long-term disability, and death, with severe socio-economic consequences for millions of people worldwide. In Latin America, nearly one fourth of the population is infected by Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. The limited existing drug therapies suffer from a combination of drawbacks including poor efficacy, resistance and serious side effects. Therefore, there is an urgent need for new drugs that can overcome resistance and are safe and effective for use in human. The crucial dependence on glycolysis as a source of energy makes the glycolytic parasite enzymes promising targets for drug design. In this context, the enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was identified as an attractive target for drug design. The development of standard enzymatic assays combined with extensive biological screening was the aim of this work and it has been contributing for the identification of novel GAPDH inhibitors. These compounds belong to several chemical classes from different sources, including organic synthesis, inorganic complexes and natural products. In addition, a virtual screening approach was applied in a focused database, previously filtered by drug-like properties, in order to identify new hits. This strategy resulted in the discovery of a novel scaffold with significant inhibitory activity against T. cruzi GAPDH. Kinetic and inhibition assays were conducted to shed light on the mechanism of action of the promising inhibitors.

A doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi e foi descoberta em 1909 por Carlos Chagas. A doença atinge cerca de 18 milhões de indivíduos na região das Américas, causando 50.000 mortes ao ano e deixando mais de 100 mil pessoas sob risco de infecção. Os tratamentos disponíveis foram desenvolvidos ainda na década de 70 apresentando baixa eficácia e fortes efeitos colaterais. Assim, é extremamente importante o desenvolvimento de novos fármacos mais seguros e eficazes para o tratamento da doença de Chagas. Uma importante estratégia que pode ser utilizada para o planejamento de novas moléculas bioativas é o planejamento baseado em um receptor-alvo. Nessa tese o alvo em estudo é a enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) que faz parte da via glicolítica do protozoário T. cruzi. Este trabalho compreendeu os estudos estruturais e mecanísticos de quatro complexos cristalográficos da GAPDH na presença de ligantes diferentes. As estruturas obtidas subsidiaram estudos que forneceram informações importantes no planejamento de novos inibidores. Foi elucidado o modo pelo qual os compostos alquilantes iodoacetamida e iodoacetato atuam causando a inativação enzimática e as diferenças existentes nesse processo foram esclarecidas, mostrando que é necessária a expulsão do NAD+ do sítio ativo para que a inativação ocorra por parte do iodoacetamida. Além disso, o mecanismo de nitrosilação por complexos de rutênio foi investigado fornecendo informações que contribuem para o entendimento do mecanismo de inibição enzimática por parte dessa classe compostos. Além disso, a partir de um dos complexos estruturais obtidos, foi possível identificar a localização de um novo sítio alostérico que se forma na superfície da proteína. Essa informação é extremamente importante, pois abre novas perspectivas para o planejamento de novos inibidores mais potentes e seletivos da enzima GAPDH de T. cruzi. / Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi protozoan, was discovered in 1909 by Carlos Chagas. The disease affects about 18 million people in the American region, causing 50,000 deaths per year, leaving more than 100 thousand people at risk of infection. Available treatments developed in the 70 decade present low efficiency and strong side effects. Thus, it is extremely important the development of new drugs that safer and more effective. An important strategy used for the design of new bioactive molecules is based on a macromolecular target. The goal of this thesis is to study the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), an enzyme that participates of the glycolytic pathway of the parasite T. cruzi. This work comprised structural and mechanistic studies of four complex crystallographic GAPDH in the presence of different ligands. The structures obtained subsidized structural and mechanistic studies that provided important information for the design of new inhibitors. It was clarified the way in which the alkylating agents iodoacetamide and iodoacetate acts causing enzyme inactivation and the differences in this process were resolved, showing that it is necessary the NAD+ is excluded of the active site wherefore the inactivation occurs by the iodoacetamide. Moreover, the mechanism of enzyme nitrosylation by ruthenium complexes was investigated, providing information that contributed to the understanding of the mechanism of enzyme inhibition by this class of compounds. Moreover, from the structural complexes obtained, it was possible to identify the location of a new allosteric site formed at the surface of the protein. This information is extremely important, because it opens new perspectives for the design of new inhibitors that are more potent and selective for the enzyme GAPDH of T. cruzi.

As espécies do gênero Trypanosoma parasitam vertebrados de todas as classes (peixes, anfíbios, répteis, aves e mamíferos) e as espécies do gênero Leishmania parasitam mamíferos no Velho e Novo Mundo. Possuem ciclos de vida com alternância entre vertebrados e invertebrados. A maioria das espécies se desenvolve em artrópodes hematófagos que podem pertencer a diversas ordens e famílias. Os tripanossomas circulam no ambiente silvestre como enzootias, associados com os hospedeiros e seus respectivos ecótopos. A Leishmaniose visceral é uma importante zoonose e possui canídeos silvestres e domésticos como importantes reservatórios conhecidos. Estudos realizados com algumas espécies de tripanossomas apontam uma grande complexidade do ciclo silvestre em biomas brasileiros, incluindo a Mata Atlântica e a diversidade genética de L. (L.) infantum chagasi no Brasil ainda não é conhecida. Ressalta-se o fato que existem poucos trabalhos realizados no Estado do Espírito Santo. Até o momento, não foram avaliados os pequenos mamíferos terrestres, grandes mamíferos (Tapirus terrestris) e morcegos como reservatórios silvestres destes parasitas neste Estado. O presente estudo tem por objetivo principal, o conhecimento da diversidade de parasitas do gênero Leishmania e Trypanosoma em animais silvestres da Reserva Biológica Córrego do Veado e domésticos do seu entorno na cidade de Pinheiros no estado do Espírito Santo através do isolamento, caracterização molecular e estudos filogenéticos com marcadores tradicionais utilizados para o grupo. Foram realizadas duas campanhas de captura nos meses de junho e novembro de 2012 totalizando um esforço de 28800 armadilhas/dia para os pequenos mamíferos terrestres e 12600 h/m2 com um total de 157 indivíduos, pertencentes a cinco ordens distintas, 23 gêneros e 27 espécies. Do total de animais capturados 18 (11.46%) apresentaram hemocultura positivas e 11 (7.01%) culturas foram estabelecidas e criopreservadas com morfologia compatível a parasitas do gênero Trypanosoma. Os isolados foram identificados e posicionados através de sequências da região V7V8 SSU rDNA e um isolados de T. cruzi marinkellei e oito de T. dionisii foram detectados em hospedeiros quirópteros e dois isolados de Tapirus terrestris apresentaram morfologia distinta das já descritas para o gênero Trypanosoma e a caracterização parcial através do gene 18S rDNA completo e gGAPDH apontam para uma nova espécie deste gênero e tratam-se dos primeiros isolados obtidos nestes hospedeiros. Nos cães, foram obtidas cultura de linfonodo poplíteo bilateral e todos animais foram negativos. Além disso, a análise sorológica também foi negativa para todos os animais domésticos amostrados no entorno. / The species of the genus Trypanosoma parasites of all vertebrate classes (fish, amphibians, reptiles, birds and mammals) and the genus Leishmania parasites mammals in the New World and have life cycles with alternating between vertebrates and invertebrates. Most species develops in arthropod vectors, which may belong to different orders and families. Trypanosomes circulating in sylvatic enzootic diseases as associated with the hosts and their ecotopes. Most species are not pathogenic, Visceral Leishmaniasis is an important zoonosis and has wild and domestic canids as important reservoirs known. Studies in some species of trypanosomes show a great complexity of the sylvatic cycle in biomes, including the Atlantic and genetic diversity of L. (L.) infantum chagasi in Brazil is not known. We emphasize the fact that there are few studies in the State of Espírito Santo. So far, have not been evaluated small terrestrial mammals, large mammals (Tapirus terrestris) and wild bats as reservoirs of these parasites in this state. This study\'s main objective, knowledge of the diversity of parasites of the genus Leishmania and Trypanosoma in wild Biological Reserve Stream Deer and domestic of your surroundings in the Pinheiros city in the state of Espírito Santo through isolation, characterization and molecular studies with traditional phylogenetic markers used for the group. There were two campaigns capture in June and November 2012 totaling an effort of 28,800 trap / day for small terrestrial mammals and h.m2 12600 with a total of 157 individuals belonging to five distinct orders, 23 genera and 27 species. Of the total of 18 animals captured (11:46%) had positive blood cultures and 11 (7.1%) cultures were established and cryopreserved with morphology the parasites of the genus Trypanosoma. Isolates were identified and positioned through V7V8 region sequences of SSU rDNA and one isolate of T. cruzi marinkellei and eight T. dionisii hosts were detected in bats and two isolates showed a distinct morphology Tapirus terrestris those already described for the genus Trypanosoma and partial characterization by 18S rDNA gene gGAPDH complete and point to a new species of this genus and these are the first isolates from these hosts. In domestic animals, dogs were obtained culture of popliteal lymph node of both hind legs and all animals were negative. Furthermore, serological analysis was also negative for all dogs sampled in the vicinity of the Biological Reserve of Deer Creek.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2018-08-06T15:04:45Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-08-06T15:07:55Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2018-08-06T15:07:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2016-03-17 / Os parasitos do gênero Trypanosoma são descritos em uma ampla variedade de espécies de peixes. Devido ao pleomorfismo destes protozoários e à rara especificidade quanto ao hospedeiro vertebrado, muitas das espécies descritas podem ter sua validade contestada. Visando contribuir para o conhecimento dos tripanossomas de peixes que circulam no Brasil, este estudo apresenta a caracterização morfológica e morfométrica das formas tripomastigotas sanguíneas encontradas em cascudos Hypostomus affinis e Hypostomus luetkeni, de duas localidades no estado de Minas Gerais, aliada ao seu isolamento e manutenção em meios de cultura. A infecção por tripanossomas foi detectada em 100% de H. affinis e em 84,6% de H. luetkeni amostrados, com uma tendência no registro das parasitemias mais elevadas nos hospedeiros menores. As análises morfológicas permitiram o agrupamento dos tripomastigotas sanguíneos em quatro morfotipos distintos, sendo que dois aparentemente não apresentam semelhanças a nenhum outro tripanossoma de peixe já descrito no Brasil. O isolamento in vitro dos parasitos foi possível nos três meios bifásicos testados, enquanto a manutenção dos mesmos pôde ser realizada apenas no meio hiposmótico. O tempo necessário para observação dos primeiros epimastigotas in vitro diferiu entre as duas localidades. As formas evolutivas observadas por exame direto das culturas foram “esferomastigotas”, epimastigotas e tripomastigotas sendo o processo de multiplicação, caracterizado como divisão binária. A sequência de duplicação das organelas seguiu tanto o padrão registrado para tripanossomas de peixes de água doce, com segregação do cinetoplasto anterior à do núcleo, quanto de água salgada, com o núcleo se multiplicando anteriormente ao cinetoplasto. Ao final do processo de divisão puderam ser gerados dois tripomastigotas, dois epimastigotas ou um tripomastigota e um epimastigota. Os isolados deste trabalho apresentaram características in vitro distintas da única espécie isolada no Brasil, especialmente no que se refere às características fisiológicas e à ordem de divisão das organelas, sugerindo que eles possam pertencer a espécies distintas, o que só poderá ser confirmado por análises moleculares. / Parasites of the Trypanosoma genus have been described in a great number of fish species. Due to the pleomorphism presented by these protozoans and the rare specificity related to the vertebrate host, a lot of described species can have their validity questioned. Aiming to contribute with the knowledge about Brazilian fish trypanosomes, this study provides morphological and morphometric characterization of blood trypomastigotes from Hypostomus affinis and Hypostomus luetkeni collected in two sites of Minas Gerais state, along with their culture isolation and maintenance. The trypanosome infections were detected in 100% of H. affinis and 84,6% of H. luetkeni, showing a tendency of highest parasitemias on smaller hosts. The morphological analyses have allowed the distinction of four morphotypes, two of wich are possibly not related with any fish trypanosome species previously described in Brazil. The in vitro isolation of parasites was achieved in three biphasic media that were tested; however, their maintenance was possible only in the hyposmotic medium. The time required for the observation of first in vitro epimastigotes was different for each sampling site. The culture forms observed were spheromastigote-like, epimastigote and trypomastigote, and that latest two have showed a binary fission multiplication process. The multiplication sequence of cell organelles has followed the typical pattern of freshwater fish trypanosomes, with kinetoplast division starting before nucleus division, and also the salt water trypanosomes arrangement, with nucleus multiplication occurring previously to the kinetoplast. As result of the division process were generated two trypomastigotes, two epimastigotes, or one trypomastigote and one epimastigote. The trypanosomes isolates described here have showed in vitro features distinct from those of single trypanosome species isolated in Brazil, nominally: their physiological characteristics related to the medium growth and the division sequence of cell organelles. Altogether, these results can suggest that these trypanosomes could belong to different species; however, this hypothesis can only be confirmed by molecular analysis.

Orientador: Silmara Marques Allegretti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T21:11:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teodoro_AnnaKarollinaMenezes_M.pdf: 4367892 bytes, checksum: ee9aded885185f6f74b60fa635f80ecc (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os gambás do gênero Didelphis (Marsupialia, Didelphimorphia), são animais sinantrópicos, cuja dieta generalista os predispõe a infecções por endoparasitas. Tal fato, agravado pela presença cada vez mais frequente dos mesmos em área urbana e periurbana os torna potenciais hospedeiros e veiculadores de protozoários e helmintos. O gênero já foi descrito albergando diferentes tipos de parasitos, incluindo espécies potencialmente zoonóticas, sendo necessários novos estudos para uma melhor compreensão do mesmo e suas relações com os ciclos de vida dos parasitos. Para isso, a presente pesquisa teve por objetivo estudar os parasitos intestinais e sanguíneos em Didelphis spp. capturados em área urbana pelo Serviço de Controle de Zoonoses, de janeiro de 2010 a janeiro de 2013, e em fragmentos de mata ciliar associados à Bacia do Rio Capivari, no município de Monte Mor, São Paulo (22o56'48" latitude sul, 47o18'57" longitude oeste), de junho de 2011 a maio de 2012. Os espécimes capturados foram medidos, pesados, marcados, fotografados, avaliados clinicamente, registrados e identificados para verificar a duplicidade de capturas. Foram coletadas amostras de sangue e fezes para pesquisa de parasitos intestinais e sanguíneos, bem como fragmentos teciduais para avaliação biomolecular. Foram capturados pelo Serviço de Controle de Zoonoses de Monte Mor, 46 animais da espécie D. albiventris, dos quais 17 foram necropsiados. Neste período 02 animas foram recapturados, sendo 01 deles por 02 vezes, gerando assim um total de 49 capturas realizadas pelo serviço durante o estudo. Em coletas com armadilha, foram obtidos 02 animais da espécie D. aurita e 08 D. albiventris, sendo 01 deles recapturado uma vez, totalizando 11 capturas em área de mata. Em análise do conteúdo fecal, constatou-se que 77,6% das amostras foram positivas para parasitos do filo Nematoda, das quais Cruzia tentaculata foi o ovo mais comumente encontrado, 34,5% para parasitos da classe Trematoda e 32,7% para protozoários, não sendo encontrados parasitos da classe Cestoda. Dos animais necropsiados, 08 albergavam parasitos no sistema gastrintestinal, destaque para estômago e intestino, 08 não albergavam nenhum tipo de parasito e 01 não se pode determinar parasitismo devido ausência de algumas vísceras, decorrente de ataque por cão. Os helmintos adultos identificados foram Cruzia tentaculata, Rhopalias coronatus, Viannaia sp., Travassostrongylus sp., Turgida turgida e Aspidodera raillieti. Dois animais da espécie D. aurita foram encontrados naturalmente infectados por Trypanosoma cruzi, sendo as formas tripomastigotas visualizadas nos esfregaços sanguíneos e a positividade confirmada por meio de PCR dos fragmentos teciduais. Em análise molecular, um animal D. albiventris capturado em área de mata também foi identificado como positivo para DNA de Leishmania spp., demonstrando a necessidade de novos estudos no município / Abstract: Opossums of the genus Didelphis (Marsupialia, Didelphimorphia) are synanthropic animals, whose generalist diet predisposes to infections with endoparasites. This fact, exasperated by the even higher frequency in urban and periurban areas, makes them potential host and carriers of protozoans and helminths. The genus has been described harboring differents parasite, including potentially zoonotic species, and more studies are necessary for a better understanding of it and its relationship to the parasites life cycles. The present research aimed to study the intestinal and blood's parasites in Didelphis spp. captured in an urban area by the Zoonosis Municipal Control Service, January 2010 to January 2013, and fragments of riparian associated to the Capivari river basin, in the municipality of Monte Mor, São Paulo (22º56'48"south latitude, 47º18'57" west longitude), from June 2011 to May 2012. Captured specimens were measured, weighed, tagged, photographed, clinically evaluated, recorded and identified to verify duplicity catching. Blood and stool samples were collected for research of parasites and blood and tissue samples for biomolecular evaluation. Forty six animals of the species D. albiventris were captured by the Zoonoses Control Service of Monte Mor, which 17 were necropsied. Two animals were recaptured, and one of them twice, generating a total of 49 catches for the service during the study. Samples collected with trapping resulted in 02 animals of D. aurita and 08 species of D. albiventris, one of them being recaptured once, totaling 11 catches in the forest area. In fecal analysis, 77.6% of samples were positive for parasites of the phylum Nematoda, which Cruzia tentaculata was the most common egg found, 34.5% for the class Trematoda parasites and 32.7 % for protozoans, no parasites of the class Cestoda has been found. The necropsy results, 08 harbored parasites in the gastrointestinal system, especially stomach and intestine, 08 weren't harboring any sort of parasite and 01 could not be determined because of lack of some organs due to the attack by dogs. Helminths adults were identified as Cruzia tentaculata, Rhopalias coronatus, Viannaia sp., Travassostrongylus sp., Turgida turgida and Aspidodera raillieti. Two animals of the species D. aurita were found naturally infected by Trypanosoma cruzi, with trypomastigotes visualized in blood smears and confirmed positive by PCR technique from tissue samples. Molecular analysis in an animal D. albiventris captured in the forest area, was also identified positive for DNA of Leishmania spp., demonstrating the need for further studies in the municipality / Mestrado / Parasitologia / Mestra em Parasitologia

Orientador: Fernanda Ramos Gadelha / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T03:23:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peloso_EduardodeFigueiredo_D.pdf: 2969065 bytes, checksum: 6920a8df71d5ab432dce07d0beb2e5eb (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas para a qual não há vacina e os tratamentos disponíveis têm eficácia limitada, sendo agravada pela heterogeneidade das cepas do parasita. Na busca por novos alvos terapêuticos, destaca-se o sistema antioxidante do parasita. As proteínas desse sistema como as triparedoxinas peroxidases citosólica e mitocondrial e as superóxido dismutases A e B (TcCPx, TcMPx, SODA e SODB, respectivamente) são fundamentais para a sobrevivência do parasita. Neste sentido, analisou-se o envolvimento da TcCPx e TcMPx na bioenergética mitocondrial de T. cruzi que superexpressavam estas enzimas (CPx e MPx, respectivamente) e também em células controle (pTEX), bem como a expressão dessas enzimas e das SODA e SODB, a liberação de H2O2 e a produção de O2 .- ao longo da curva de proliferação nas cepas Tulahuen 2 e Y. Paralelamente, foi verificado o nível de expressão da TcCPx e TcMPx na forma tripomastigota de cultura sob incubação com H2O2, tanto intracelularmente quanto no meio de incubação e a expressão dessas enzimas comparada com a da forma epimastigota. Em relação à CPx e MPx, foi possível observar que na CPx há um aumento na expressão da TcMPx, e a mesma correlação para a MPx foi observada. Diferenças na liberação de H2O2 entre CPx e MPx foram detectadas apenas quando a cadeia respiratória mitocondrial foi inibida. A MPx teve maiores taxas de consumo de oxigênio do que a pTEX e CPx, entretanto em todas as células, o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de ATP foram similares. Em relação às cepas Tulahuen 2 e Y, diferenças foram observadas em relação à liberação de H2O2 e produção de O2.- não somente entre as cepas, mas também ao longo da curva de proliferação. Todas as enzimas estudadas nessas cepas variaram sua expressão em função do tempo em cultura. Contudo, na cepa Y, o nível de expressão de todas as enzimas foi menor do que da Tulahuen 2, exceto para a SODA. Em relação à forma tripomastigota, tanto a TcCPx quanto a TcMPx tiveram padrões de expressão similares, com um aumento em baixas concentrações (10?M) seguido por uma redução até concentrações maiores de H2O2. No sobrenadante do meio de incubação a TcMPx não foi detectada, contudo a TcCPx foi e em níveis que aumentaram concomitantemente com a redução da sua expressão no compartimento intracellular. Adicionalmente, o nível de expressão de ambas peroxiredoxinas foi maior na forma tripomastigota em relação à epimastigota. Devido a um leve desacoplamento observado nas MPx, a presença ou indução de um transportador na membrana mitocondrial é sugerido quando a TcMPx é expressa em maiores níveis. Além disso, houve uma modulação das enzimas antioxidantes ao longo da curva de proliferação e entre as diferentes cepas, formas do parasita e tratamento com H2O2. Dada a importância das espécies reativas de oxigênio na sinalização redox do parasita, a expressão diferencial das enzimas antioxidantes nos diferentes parâmetros analisados sugere que as mesmas desempenham diversos papéis na sobrevivência, proliferação e diferenciação do parasita / Abstract: Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease, which has no vaccine and the available treatments have limited efficacy that is aggravated by the heterogeneity of parasite strains. In the search for new therapeutic targets, the antioxidant system of the parasite has attracted attention. The proteins of this system such as the cytosolic and mitochondrial tryparedoxin peroxidases and superoxide dismutases A and B (TcCPx, TcMPx, SODA and SODB, respectively) are essential for parasite survival. In this sense, analysis of the involvement of TcCPx and TcMPx in the mitochondrial bioenergetics in T. cruzi overexpressing these enzymes (CPx and MPx, respectively) and also in control cells (pTEX) as well as the expression of these enzymes and SODA and SODB, H2O2 release and O2 .- production along the growth curve in two strains Tulahuen 2 and Y were performed. In parallel, the expression level of TcCPx and TcMPx was determined in tissue culture-derived trypomastigotes under incubation with H2O2, both intracellularly and in the incubation medium and the expression of these enzymes compared to the epimastigote form. Regarding CPx and MPx, it was observed that in CPx the expression of TcMPx was increased, and the same correlation was observed for MPx. Differences in H2O2 release between CPx and MPx were detected only when the mitochondrial respiratory chain was inhibited. MPx had higher oxygen consumption rates than pTEX and CPx, however in all cells, the mitochondrial membrane potential and ATP levels were similar. Regarding Tulahuen 2 and Y strains, differences were observed in relation to H2O2 release and O2.- production not only between strains but also along the growth curve. All the enzymes studied in these strains varied their expression in function of time in culture. However, in the Y strain, the expression level of all enzymes was lower than Tulahuen 2, except for SODA. Regarding trypomastigotes, not only TcCPx but also TcMPx had similar expression patterns, with an increasing in lower concentrations (10?M) followed by a reduction till higher H2O2 concentrations. In the supernatant of the incubation medium TcMPx was not detected, but TcCPx was detected and its levels increased concomitantly with the reduction in its expression in the intracellular compartment. Additionally, the level of expression of both peroxiredoxinas was higher in trypomastigote compared to epimastigote. Because of the mild uncoupling observed in MPx, the presence or induction of a carrier in the mitochondrial membrane is suggested when the TcMPx is expressed at higher levels. In addition, there was a modulation of the antioxidant enzymes along the growth curve and between different strains, forms of the parasite and treatment with H2O2. Given the importance of reactive oxygen species in parasite redox signaling, the differential expression of the antioxidant enzymes in the different parameters analyzed suggests that they play different roles in the survival, proliferation and differentiation of the parasite / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular