Th. 3e cycle--Pharmacol. et parmacocinétique exp. et clin.--Montpellier 1, 1981.

Thesis (doctoral)--Lund, 1983.

Le canal sodique épithélial sensible à l'amiloride (ENaC) est une protéine composée de trois sous unités similaires [alpha][bêta][gamma] codées par trois gènes distincts et associées en un complexe hétérotétramérique [alpha]2[bêta][gamma]. ENaC est localisée au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales à jonctions serrées. C'est une protéine clé de la réabsorption du sodium au niveau du néphron distal, des voies aériennes supérieures et du colon distal. Son rôle dans la régulation du volume extracellulaire et la pression sanguine a été renforcé par la découverte de deux maladies génétiques humaines liées à la fonction du canal : le syndrome de Liddle et le pseudoaldostéronisme de type I (PHA I) due respectivement à un gain et une perte de fonction du canal. L'activité et l'expression de ce dernier sont finement régulées. Sa régulation par les sérines protéases et le sodium extracellulaire (auto-inhibition) a été mis en évidence par Chraïbi et collaborateurs en 1997, mais peu de choses sont connues sur les mécanismes et le rôle fonctionnel de la boucle extracellulaire dans ces différentes voies de régulation. Notre objectif est d'identifier les sites potentiels impliqués dans ces différentes voies de régulation. Pour ce faire, des mutations au niveau de la partie terminale de la boucle extracellulaire des sous unités [alpha], [bêta] et [gamma] du canal ont été réalisées par mutagenèse dirigée et l'effet des sérines protéases et du sodium extracellulaire a été étudié. Nos résultats, obtenus par la technique de voltage-clamp à deux électrodes, montrent que le domaine WPS (un domaine conservé dans les trois sous unités des différentes espèces et situé au niveau de la partie terminale de la boucle extracellulaire du canal) est impliqué dans la régulation d'ENaC par les sérines protéases et le sodium extracellulaire. Nous avons montré plus particulièrement que le tryptophane [alpha]W453 a un rôle fonctionnel majeur dans ces deux voies de régulation. Sa substitution par une arginine au niveau de la sous unité [alpha] rend ENaC résistant à la trypsine et abolit totalement l'inactivation du canal par le sodium extracellulaire. Par contre, la même mutation au niveau de la sous unité [gamma] ne change ni la réponse du canal à la trypsine ni sa sensibilité au sodium extracellulaire, alors que les canaux portant la mutation W/R au niveau de la sous unité [bêta] ont une sensibilité intermédiaire. L'ensemble de ces résultats montre le rôle fonctionnel de la boucle extracellulaire d'ENaC dans la régulation du canal par les sérine-protéases et le sodium extracellulaire.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2005. / Titre de l'écran-titre (visionné le 23 février 2006). Bibliogr.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La β-lactoglobuline (β-Lg) bovine contient plusieurs séquences peptidiques à activité biologique qui présentent un intérêt à titre d’ingrédients nutraceutiques. Toutefois, des études ont démontré que certains de ces peptides, actifs lors de tests in vitro, sont inefficaces suite à leur ingestion orale chez l’animal, suggérant leur dégradation lors du transit gastro-intestinal. L’objectif de ce travail était d’étudier les interactions β-Lg:peptide bioactif et d’évaluer l’impact de ces interactions sur la digestibilité in vitro des complexes. Premièrement, il a été démontré que l’hydrolyse pepsique et chymotrypsique de certains peptides bioactifs varie en fonction de la longueur de la chaîne peptidique, la nature du peptide et la présence d’autres peptides dans le milieu réactionnel. Par la suite, il a été démontré à l’aide d’une méthode d’ultrafiltration que les peptides β-Lg f102-105, f142-148 et f69-83 se lient en quantité significative à la β-Lg A, avec des taux de fixation de 1.5, 1.1 et 0.7 moles de peptides par mole de protéine respectivement. Ces résultats ont été validés par spectroscopie de fluorescence frontale. Les spectres d’émission de fluorescence ont démontré que la liaison de ces peptides à la β-Lg A modifie l’environnement des résidus tryptophane dans la structure de la protéine. De plus, une analyse par calorimétrie à titration isothermique a démontré que le peptide antihypertensif β-Lg f142-148 se lie à la β-Lg A selon un modèle de liaison séquentielle à trois sites. Pour ce peptide, les isothermes de liaison ont révélé des constantes d’association de 2 X 103, 1 X 103 et 0.4 X 103 M-1 pour le 1ier, 2ième et 3ième site de liaison, avec une enthalpie de liaison exothermique dans le cas des deux premiers sites, mais endothermique pour le troisième site. Enfin, l’hydrolyse in vitro de la protéine et des complexes à l’aide de pepsine, trypsine, chymotrypsine et pancréatine a démontré que le les complexes sont hydrolysés plus lentement que la protéine native par la chymotrypsine ou un mélange pepsine/chymotrypsine. L’ensemble de ces résultats supporte donc l’hypothèse que la liaison de peptides bioactifs à la β-Lg A pourrait permettre d’améliorer leur résistance à la protéolyse et ainsi, maintenir leur intégrité structurale et leur bioactivité lors du transit gastro-intestinal. / Bovine β-lactoglobulin (β-Lg) contains numerous peptide sequences with biological activities, which have a high potential as nutraceutical ingredients. However, studies have demonstrated that some of these peptides, which are active during in vitro tests, loose their activity in animal models following oral ingestion, suggesting their enzymatic degradation during gastrointestinal transit. The aim of this work was to study β-Lg:bioactive peptide interactions and to investigate the in vitro digestibility of the resulting complexes. Firstly, it was shown that pepsic and chymotryptic digestions of some bioactive peptides varied according to the peptide chain length, the nature of the peptide and the presence of other peptides in the reaction medium. Using an ultrafiltration method, it was demonstrated that peptides β-Lg f102-105, f142-148 and f69-83 bind to β-Lg A in significant amounts corresponding to 1.5, 1.1 and 0.7 moles of peptides per mole of protein respectively. These results were validated by front-face fluorescence spectroscopy, which also provided evidences that the binding of the three peptides to β-Lg A modified the polarity of tryptophan environment in the protein structure. In addition, binding isotherms obtained by isothermal titration calorimetry showed that the binding of the antihypertensive peptide β-Lg f142-148 to β-Lg A followed a sequential three-site binding model with constants of associations of 2 X 103, 1 X 103 and 0.4 X 103 M-1 for the 1st, 2nd, and 3rd binding sites respectively. The enthalpy of binding was exothermic for the 1st and 2nd binding sites and endothermic for the 3rd binding site. Lastly, the in vitro digestibility of the protein and the complexes with pepsin, trypsin, chymotrypsin, and pancreatin showed that the complexes were hydrolyzed more slowly than the native protein by chymotrypsin or pepsin/chymotrypsin. The overall results support the hypothesis that the binding of bioactive peptides to β-Lg A could improve their resistance to proteolysis, and thus could contribute to maintain their structural integrity and bioactivity during gastrointestinal transit.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.