Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2009-09-23T19:35:07Z No. of bitstreams: 1 2008_MarcosEmanuelDeASegura.pdf: 574467 bytes, checksum: fce0309b24c8011036f4480f92e85389 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-12-12T10:45:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_MarcosEmanuelDeASegura.pdf: 574467 bytes, checksum: fce0309b24c8011036f4480f92e85389 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-12T10:45:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_MarcosEmanuelDeASegura.pdf: 574467 bytes, checksum: fce0309b24c8011036f4480f92e85389 (MD5) Previous issue date: 2008 / Apesar da punção aspirativa por agulha fina da tireóide ser o melhor teste propedêutico na avaliação do nódulo tireoidiano, existem casos suspeitos que não podem ser definidos citologicamente como malignos ou benignos. Diante desses casos indefinidos, os cirurgiões optam pela tireoidectomia, não por um ato terapêutico, mas diagnóstico. O resultado disso é que a maioria dos nódulos suspeitos é operada e, no exame histopatológico, mais de dois terços são classificados como benigno (bócios, hiperplasias e adenomas), tendo o procedimento cirúrgico sido realizado sem necessidade, portanto gerando grandes gastos hospitalares e causando eventuais morbidades relacionadas com a cirurgia radical da tireóide. A partir disso buscou-se ao longo dos anos, um marcador molecular que diferenciasse, nos esfregaços citológicos, quais materiais eram provenientes de nódulos benignos ou malignos. A galectina-3 é apontada pela literatura com um dos principais candidatos para essa função. Para se testar essa hipótese foi feito um estudo retrospectivo para pesquisa da galectina-3, através de imunohistoquímica, em produtos de tireoidectomia. Foram selecionados 15 casos de bócio adenomatoso, 24 de adenoma folicular, 29 de carcinoma papilar e 22 de carcinoma folicular. A expressão da galectina-3 foi comparada com o diagnóstico histopatológico (padrão-ouro). Os valores para a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo, acurácia diagnóstica, "Likelihood Ratio" Positiva e "Likelihood Ratio" Negativa da positividade citoplasmática foram respectivamente de 92,16%, 94,38%, 90,38%, 95,45%, 93,57%, 16,40 e 0,08. Após correção da prevalência para 5%, o valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e acurácia diagnóstica passaram a ser 46,33%, 99,56% e 94,27%. Esses dados, obtidos em preparados histológicos, sugerem que a pesquisa da galectina-3 em esfregaços citológicos poderá ser um importante auxílio para a definição diagnóstica. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Fine needle aspiration biopsy is considered to be the best propedeutic method used in evaluation of a thyroid nodule. However, in some situations, it is impossible to cytologically distinguish a malignant and a begnin disease; therefore, surgeons must indicate thyroidectomy for a diagnostic purpose. This results that most suspect nodules are referred to surgery and, in histopathologic analysis, more than two thirds are considered begnin (goiters, hiperplasis and adenomas). This situation lead to a search for a molecular marker that could discriminate, on cytological smers, those obtained from malignant nodules. Galectin-3 is considered a strong candidate for that function. To best this hypothesis a retrospective study was conducted in order to evaluate the expression of galectin-3 in thyroidectomy specimens using immunohistochemistry. Fifteen cases of nodular goiter, 24 of follicular adenoma, 29 of papillary carcinoma and 22 of follicular carcinoma were selected. Galectin-3 expression was compared to histopathologic diagnosis (gold-standard). Values for sensibity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, diagnostic accuracy, positive likelihood ratio, negative likelihood ratio were 92,16%, 94,38%, 90,38%, 95,45%, 93,57%, 16,40%, and 0,08. Prevalence of disease was corrected for 5% leading to positive predictive value, negative predictive value, diagnostic accurary of 46,33%, 99,56% and 94,27%. This data, seggest that galectin-3 could be an important aid in diagnostic definition.

O RC-3095 é um novo antagonista sintético de receptores do tipo bombesina/fator de liberação da gastrina (BN/GRP), que produz longas remissões tumorais em modelos de tumores murinos e humanos. Nesta dissertação são apresentados os resultados de dois estudos relevantes para o início de seu desenvolvimento clínico. No primeiro deles, é descrito o seu método de análise no plasma humano. No segundo, são apresentados os resultados de um estudo de fase I em pacientes com câncer avançado, em que é avaliada sua segurança, bem como aspectos de sua farmacocinética no plasma e efeitos farmacodinâmicos. Vinte e cinco pacientes com tumores sólidos avançados e em progressão receberam RC-3095 diariamente através da via subcutânea em doses que variaram de 8 a 96 μg/kg. Foram coletadas amostras de plasma para estudo farmacocinético. Para o estudo farmacodinâmico, foram analisados gastrina, EGF, VEGF, IGF e b-FGF plasmáticos, bem como a expressão de EGFR, VEGFR e GRPR em pele normal e amostras tumorais. Houve apenas desconforto no local da injeção em pacientes tratados nos níveis mais altos de dose. Nenhuma outra toxicidade clínica foi observada no estudo. Nenhuma resposta tumoral objetiva foi documentada. Entretanto, uma regressão tumoral transitória foi observada em uma paciente com carcinoma medular da tireóide, cujo tumor apresentava uma alta expressão de receptores de GRP. Dois pacientes com câncer de próstata avançado obtiveram uma diminuição transitória dos níveis plasmáticos do PSA. Embora uma queda transitória de gastrina plasmática tenha sido demonstrada em alguns pacientes, não houve nenhuma correlação inibitória consistente do uso do RC-3095 em relação a gastrina plasmática. O estudo farmacocinético do RC-3095 mostrou uma meia-vida de eliminação de cerca de 8 horas. Uma dose do RC-3095 de 96 μg/kg produziu uma diminuição de 50% nos níveis de gastrina plasmática em um paciente hipergastrinêmico com a Síndrome de Zollinger-Ellison. O desconforto no local da injeção foi a única toxicidade dose limitante (TDL). Considerando o seu mecanismo de ação inovador e a sua baixa toxicidade sistêmica, futuros estudos clínicos com o RC-3095 deverão ser iniciados. / The novel BN/GRP synthetic receptor antagonist, RC-3095, was able to produce long-lasting tumor remissions in various murine and human tumor models. In this paper we present the results of two important studies of the beginning of its clinical development. The first one, it was described a method for quantification of RC-3095 in human plasma. The second paper shows the results of a phase I trial in patients with advanced cancer, with respect of safety profile, as well as pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters. Twenty-five patients with advanced and progressive solid tumors received RC-3095 daily by subcutaneous route at doses ranging from 8 to 96 μg/kg according to a phase I methodology. Plasma samples were collected for pharmacokinetic studies. For the study of pharmacodynamic effects on RC-3095, plasma gastrin, EGF, VEGF, IGF and b- FGF levels, as well as EGFR, VEGFR and GRPR expression in normal skin and tumor samples were analyzed. Except for the occurrence of local discomfort at the injection site in patients treated at the highest dose levels, no other clinical toxicity was observed in the study. No objective tumor responses were documented. A minor response was observed in a patient with medullary carcinoma of the thyroid, who showed a high expression of GRPR in the tumor. Two patients with advanced prostatic cancer showed transient decrease in plasma PSA levels. Although a transient inhibitory effect was observed in some patients, there was no consistent inhibitory effect of RC-3095 on plasma gastrin or growth-factor levels in plasma. The plasma pharmacokinetics of RC-3095 showed an elimination half-life of about 8 hours. The dose of RC-3095 was 96 μg/kg was able to produce a decrease in plasma gastrin levels down to 50% of basal levels in a clearly hyper-gastrinemic individual with the Zollinger-Ellison syndrome. The dose-limiting toxicity was local discomfort at the injection site. Local discomfort at the injection site is the only dose –limiting toxicity. Considering its novel mechanism of action and its low systemic toxicity, further trials with RC-3095 are warranted.

O RC-3095 é um novo antagonista sintético de receptores do tipo bombesina/fator de liberação da gastrina (BN/GRP), que produz longas remissões tumorais em modelos de tumores murinos e humanos. Nesta dissertação são apresentados os resultados de dois estudos relevantes para o início de seu desenvolvimento clínico. No primeiro deles, é descrito o seu método de análise no plasma humano. No segundo, são apresentados os resultados de um estudo de fase I em pacientes com câncer avançado, em que é avaliada sua segurança, bem como aspectos de sua farmacocinética no plasma e efeitos farmacodinâmicos. Vinte e cinco pacientes com tumores sólidos avançados e em progressão receberam RC-3095 diariamente através da via subcutânea em doses que variaram de 8 a 96 μg/kg. Foram coletadas amostras de plasma para estudo farmacocinético. Para o estudo farmacodinâmico, foram analisados gastrina, EGF, VEGF, IGF e b-FGF plasmáticos, bem como a expressão de EGFR, VEGFR e GRPR em pele normal e amostras tumorais. Houve apenas desconforto no local da injeção em pacientes tratados nos níveis mais altos de dose. Nenhuma outra toxicidade clínica foi observada no estudo. Nenhuma resposta tumoral objetiva foi documentada. Entretanto, uma regressão tumoral transitória foi observada em uma paciente com carcinoma medular da tireóide, cujo tumor apresentava uma alta expressão de receptores de GRP. Dois pacientes com câncer de próstata avançado obtiveram uma diminuição transitória dos níveis plasmáticos do PSA. Embora uma queda transitória de gastrina plasmática tenha sido demonstrada em alguns pacientes, não houve nenhuma correlação inibitória consistente do uso do RC-3095 em relação a gastrina plasmática. O estudo farmacocinético do RC-3095 mostrou uma meia-vida de eliminação de cerca de 8 horas. Uma dose do RC-3095 de 96 μg/kg produziu uma diminuição de 50% nos níveis de gastrina plasmática em um paciente hipergastrinêmico com a Síndrome de Zollinger-Ellison. O desconforto no local da injeção foi a única toxicidade dose limitante (TDL). Considerando o seu mecanismo de ação inovador e a sua baixa toxicidade sistêmica, futuros estudos clínicos com o RC-3095 deverão ser iniciados. / The novel BN/GRP synthetic receptor antagonist, RC-3095, was able to produce long-lasting tumor remissions in various murine and human tumor models. In this paper we present the results of two important studies of the beginning of its clinical development. The first one, it was described a method for quantification of RC-3095 in human plasma. The second paper shows the results of a phase I trial in patients with advanced cancer, with respect of safety profile, as well as pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters. Twenty-five patients with advanced and progressive solid tumors received RC-3095 daily by subcutaneous route at doses ranging from 8 to 96 μg/kg according to a phase I methodology. Plasma samples were collected for pharmacokinetic studies. For the study of pharmacodynamic effects on RC-3095, plasma gastrin, EGF, VEGF, IGF and b- FGF levels, as well as EGFR, VEGFR and GRPR expression in normal skin and tumor samples were analyzed. Except for the occurrence of local discomfort at the injection site in patients treated at the highest dose levels, no other clinical toxicity was observed in the study. No objective tumor responses were documented. A minor response was observed in a patient with medullary carcinoma of the thyroid, who showed a high expression of GRPR in the tumor. Two patients with advanced prostatic cancer showed transient decrease in plasma PSA levels. Although a transient inhibitory effect was observed in some patients, there was no consistent inhibitory effect of RC-3095 on plasma gastrin or growth-factor levels in plasma. The plasma pharmacokinetics of RC-3095 showed an elimination half-life of about 8 hours. The dose of RC-3095 was 96 μg/kg was able to produce a decrease in plasma gastrin levels down to 50% of basal levels in a clearly hyper-gastrinemic individual with the Zollinger-Ellison syndrome. The dose-limiting toxicity was local discomfort at the injection site. Local discomfort at the injection site is the only dose –limiting toxicity. Considering its novel mechanism of action and its low systemic toxicity, further trials with RC-3095 are warranted.

Tumor de bexiga é o tipo de tumor mais comum que ocorre no trato urinário, originado a partir do epitélio estratificado da bexiga. A incidência em homens é maior do que em mulheres, está associado com a industrialização e relacionado com a origem ocupacional do paciente. Mais de 90% dos tumores de bexiga são devidos a alterações neste epitélio, sendo o principal tipo, o tumor nas células transicionais. A linhagem T24 de tumor de bexiga humana tem sido usada como modelo de tumor invasivo de bexiga. Nucleotídeos são uma importante classe de moléculas sinalizadoras, conhecidos por regular muitas funções pato-fisiológicas no espaço extracelular. O ATP extracelular é conhecido por mediar uma variedade de respostas biológicas no sistema nervoso central e periférico, principalmente pela ligação aos receptores acoplados à proteína G, P2Y ou pelos receptores ligados aos canais iônicos, P2X. A sinalização mediada pelos nucleotídeos é controlada por uma eficiente cascata enzimática que inclui os membros das ecto-nucleotidases ENTPDases, E-NPPs e ecto-fosfatases alcalinas as quais de formas diferenciadas podem gerar AMP que pode ser hidrolisado pela ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT, CD73) gerando adenosina. Muitos estudos têm indicado que o ATP extracelular exerce um efeito primordial no trato urinário e que suas ações são mediadas por receptores P2. Baseado na ampla distribuição das ecto-nucleotidases em vários tipos de tecidos e considerando a potencial participação destas enzimas na regulação da sinalização purinérgica em tecido de bexiga normal e tumoral, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade das ectoenzimas e a presença dos receptores purinérgicos nas células T24 de tumor de bexiga humano. Muitos estudos vêm demonstrando evidências da relação entre o sistema purinérgico e o crescimento tumoral. Nossos resultados mostraram que as células T24 apresentam uma extrema diminuição da capacidade de hidrólise dos nucleotídeos tri- e difosfatados quando comparada com os nucleotídeos monofosfatados, que apresentam uma alta capacidade de hidrólise. Os resultados obtidos pela hidrólise mostram uma baixa expressão das E-NTPDases, contrastando com uma significante atividade da ecto-5’- nucleotidase, e pelo menos um membro da família das E-NPPs. Muitos papéis fisiológicos para a família das E-NPPs têm sido descritos incluindo reciclagem de nucleotídeos e modulação da sinalização purinérgica. No presente estudo nós analisamos a atividade desta enzima na linhagem celular T24 em pH ótimo para as E-NPPs e em pH fisiológico para cultura de células. Curvas de tempo e substrato mostraram atividade das E-NPPs apenas no pH ótimo da enzima. A análise por RT-PCR mostrou a presença apenas da E-NPP1. Quanto à expressão das ecto-enzimas, nosso estudo mostrou que a linhagem T24 expressa apenas a E-NTPDase 5 (CD39L4) e não expressa as demais E-NTPDases. Nós identificamos todos os receptores P2Y nas células, dando suporte a idéia de que alterações no número de células tumorais pode ser devido a modulação da proliferação celular via receptores P2. Em nosso estudo também investigamos o efeito do ATP extracelular nas células T24, em diferentes concentrações e tempos de tratamento, mostrando que o ATP extracelular diminui significativamente o número de células. Estes dados indicam que as vias de sinalização purinérgica podem ter um importante papel na regulação das funções da bexiga urinária. Outros estudos são necessários para confirmar as funções do sistema purinérgico nos tumores de bexiga e as possíveis terapias antitumorais. / Bladder cancer is the most commonly tumor occurring in urinary tract, originating from normal stratified transitional epithelium of the bladder. The incidence in men is bigger than in women and is associated with industrialization and related to occupational origin. More than 90% of histological cell type of bladder cancer is transitional cell carcinoma. The T24 cell is a lineage of human bladder transitional cell carcinoma, and it has been used as model of invasive bladder cancer. Nucleotides, an important class of signaling molecules, are known to regulate many pathophysiological functions in the extracellular space. Extracellular ATP is recognized as an agonist that mediates a wide variety of biological responses in the central and peripheral nervous systems, largely by binding to either G protein-coupled receptors P2Y or ligand- gated P2X receptors. The nucleotide-mediated signaling is controlled by a highly efficient enzymatic cascade which includes the members of E-NTPDase (ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase) family, E-NPP (ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase) family and ecto-alkaline phosphatases. The AMP formed by the action of these enzymes is hydrolyzed to adenosine by the action of an ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT, CD73). Although several lines of evidence have indicated that extracellular ATP plays primordial role in the urinary tract and these actions are mediated by P2 receptors. Based on the wide distribution of ecto-nucleotidases in various tissues and considering the potential participation of these enzymes in the regulation of purinergic signaling in normal and tumoral bladder tissues, the objective of the present study was to examine the activity of ecto-enzymes and the presence of the purinergic receptors in T24 human bladder tumor cell line. Several studies have demonstrated evidence for the relation between the purinergic signaling and tumor growth. Our results show that T24 cell line presents an extremely decreased capacity to hydrolyze all tri- and di-phosphate nucleosides when compared to the nucleoside monophosphates, which have a higher capacity to hydrolyze. The results obtained show a low expression of E- NTPDases, contrasting to a significant activity of ecto-5’-nucleotidase, and at least one of the enzymes family of E-NPPs. Multiple physiological roles for E-NPPs have been related, including nucleotide recycling and modulation of purinergic receptor signaling. In the present study, we describe an enzyme activity in T24 cell line in the optimum pH for ENPP and in physiological pH to the culture cells. Time and substrate curve have shown an E-NPP activity only in the enzyme optimal pH. The RT-PCR analysis showed the presence of only the E-NPP1. Regarding the expression of the ecto-enzymes, our study has showed that the T24 cell line expresses only the E-NTPDase 5 (CD39L4) and does not express the other E-NTPDases. We have identified all P2Y receptors in the cell line studied supporting the idea that the alteration of cancer cell number might be due to modulation of cell proliferation via P2 receptors. In this study we also investigated the effects of extracellular ATP in T24 cell line in different concentrations and times of treatment. As shown, the extracellular ATP decreases significantly the cell number. These data could indicate that the purinergic signaling pathways may play an important role in regulating urinary bladder function. Further studies to provide functions for the purinergic system in bladder tumor will be necessary to improve the possibilities of antitumor therapies.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-02-04T15:30:55Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseEfeitosTratamento.pdf: 2287212 bytes, checksum: d7ad35175d859510682177690fcab16f (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-02-05T11:59:05Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseEfeitosTratamento.pdf: 2287212 bytes, checksum: d7ad35175d859510682177690fcab16f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-05T11:59:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseEfeitosTratamento.pdf: 2287212 bytes, checksum: d7ad35175d859510682177690fcab16f (MD5) Previous issue date: 2014 / Mundialmente, entre os diferentes tipos de tumores, o câncer de pulmão se destaca como um grave problema de saúde pública. Na busca por terapias inovadoras, várias moléculas estão sendo estudadas, neste contexto, insere-se a Angiotensina-(1-7), que possui propriedades vasodilatadoras, anti-angiogênicas, anti-trombóticas e anti-proliferativas. Recentemente, a Ang-(1-7) vem sendo descrita como um candidato potencial para modular os níveis da proteína ciclooxigenase-2 (COX-2). A enzima COX-2, assume posição de destaque na regulação dos mecanismos moleculares associados ao processo pró-inflamatório tumoral, sendo super-expressa em tumores de pulmão. Outro componente importante no desenvolvimento do processo pró-inflamatório tumoral é a proteína fosfatase e tensina homóloga (PTEN), que em tumores apresenta-se frequentemente deletada e/ou mutada; sendo relacionada por diversos autores com os níveis de expressão da proteína COX-2 em tumores, via modulação da atividade de PI3K/AKT. Baseado nas informações disponíveis na literatura, neste trabalho, procurou-se estabelecer um modelo celular com a finalidade de melhor entender a associação entre os níveis de expressão das proteínas COX-2 e PTEN; e também avaliar o envolvimento de pequenas moléculas reguladoras da expressão gênica destas proteínas. Para isso células A549 foram tratadas com Ang-(1-7) 10-7 M por diferentes intervalos de tempo, e logo após foram realizados ensaios de mensuração de lactato e pH, mensuração da atividade de COX-2, análises da expressão dos transcritos e proteínas COX-2 e PTEN; expressão de microRNAs envolvidos na modulação da expressão de COX-2, PTEN e FOXO-1; análise de expressão gênica de FOXO-1 e das proteínas de adesão Claudina, EPCAM e Integrina _-8. Como resultado, observou-se que o tratamento com Ang-(1-7) induz alterações celulares, dentre elas, um efeito negativo no metabolismo tumoral da linhagem celular A549, diminuindo a produção de ácido lático, elevando assim o pH extracelular; apesar de modular a expressão das proteínas COX-2 e PTEN, não foi identificada uma associação; analisando os miRNAs, não foi possível mostrar uma associação entre estas pequenas moléculas e a expressão de COX-2 e PTEN; Ang-(1-7) promove modulação dos níveis de expressão das proteínas de adesão e FOXO-1, sendo identificada uma sincronia entre o padrão de expressão de FOXO-1 e dos genes das proteínas de adesão investigadas Claudina-1 e EPCAM. ______________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Worldwide, between different types of tumors, lung cancer stands out as a serious public health problem. In the search for novel therapies, several molecules have been studied in this context, is part of the Angiotensin-(1-7), which has vasodilator properties, antiangiogenic, anti-thrombotic and anti-proliferative. Recently Ang-(1-7) is described as a potential candidate to modulate levels of protein cyclooxygenase-2 (COX-2). The COX-2 enzyme takes on a prominent position in the regulation of the molecular mechanisms related to tumor pro-inflammatory process, being overexpressed in lung tumors. Another important component in the development of tumor pro-inflammatory process is protein phosphatase and homologous tensin (PTEN), which in tumors are frequently presents mutated or deleted; Several authors are related to the levels of expression of COX-2 protein in tumors via modulation of the activity of PI3K/AKT. Based on the information available in the literature, in this work, we tried to establish a cellular model in order to better understand the association between the expression levels of COX-2 protein and PTEN; and also to evaluate the involvement of small regulatory molecules of gene expression of these proteins. For that A549 cells were treated with Ang-(1-7) 10-7 M for different time intervals, and after testing the measurement of lactate and pH measurement of the activity of COX-2, analysis of the expression of the transcripts were performed and COX-2 and PTEN protein; Expression of microRNAs involved in the modulation of the expression of COX-2 and PTEN FOXO-1; analysis of gene expression of FOXO-1 and adhesion proteins Claudin, EPCAM and Integrin-8. As a result, it was observed that treatment with Ang-(1-7) induces cellular changes, among them a negative effect on tumor cell line A549 metabolism, reducing lactic acid production thereby increasing the extracellular pH; while modulating the expression of COX-2 and PTEN protein was not identified a association; analyzing miRNAs, we could not show a association between these small molecules and the expression of COX-2 and PTEN; Ang-(1-7) promotes modulation of the expression levels of adhesion proteins and FOXO-1, identifying synchrony between the pattern of expression of FOXO-1 and genes of adhesion proteins investigated Claudin-1 and EPCAM.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade Gama, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-12-09T14:27:47Z No. of bitstreams: 1 2016_MarinaPinheiroMarques.pdf: 31908439 bytes, checksum: 46f14a6226402bb30bf87b11553f1169 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-10T20:34:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MarinaPinheiroMarques.pdf: 31908439 bytes, checksum: 46f14a6226402bb30bf87b11553f1169 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-10T20:34:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MarinaPinheiroMarques.pdf: 31908439 bytes, checksum: 46f14a6226402bb30bf87b11553f1169 (MD5) / O Hepatocarcinoma é um tipo de tumor hepático com altos índices de morte no mundo todo. Quando diagnosticados em sua fase inicial, os nódulos tumorais de até 3cm podem ser tratados por ablação por radiofrequência (RFA). Este procedimento é realizado por uma incisão minimamente invasiva de um eletrodo, guiado por imagem até o foco do tumor, que entrega a corrente alternada em alta frequência ao tecido e causa a necrose celular por volta de 45°C-60°C. Apesar de oferecer pouco dano e baixo risco de complicações quando comparado a outros tratamentos, a RFA é pouco utilizada no Brasil por ter um custo elevado e poucos profissionais capacitados para realizá-la. Neste trabalho é apresentado o desenvolvimento e análise de um eletrodo ativo monopolar para ser acoplado ao equipamento SOFIA de RFA desenvolvido no Laboratório de Engenharia Biomédica da Universidade de Brasília. Além disso, propõe uma relação entre a potência e geometria do eletrodo para garantir a zona de ablação e o acontecimento do roll-off, evento caracterizado pela variação brusca de impedância após a necrose, com e sem aceleradores, soluções de álcool anidro e ácido acético, injetadas para acelerar a queima. Foi construído um eletrodo guarda-chuva, ativo e monopolar, com liga NiTi com micro-soldagem por laser de fibra Yb. Para avaliação do eletrodo foram realizados análise da solda por microscopia eletrônica de varredura. Para sua validação, foram realizados testes ex vivo em fígado bovino com comparações das dimensões de maior largura, menor largura e profundidade da zona de ablação obtidas com outros 8 eletrodos de eletrocirurgia. Por meio de um teste cego, somente 4 eletrodos foram escolhidos para avaliar as combinações de 40W e 80W de potência a 400kHz por 10min, 20min e 30min. Foram feitas simulações do modelo do eletrodo guarda-chuva de cinco hastes (5H) no software COMSOL e comparado com os resultados in vitro. E, devido as diferenças de propriedades entre um tecido vivo e um ex vivo, foi realizada uma modelagem matemática com um modelo Cole-Cole adaptado, para avaliar a influência da impedância no eletrodo guarda-chuva 5H desenvolvido. O processo de fabricação adotado neste trabalho pode reduzir em até 10x o custo do eletrodo ativo comparado aos modelos comerciais. Os experimentos que testaram o eletrodo mostraram que a potência com 40W por até 30min é possível queimar um volume de até 2,5cm³ a 3cm³. Foi constatada que a geometria adia o acontecimento do roll-off e consequentemente produz zonas de ablação maiores e mais bem definidas que os demais eletrodos testados. Dentre os aceleradores, o álcool anidro combinado com a RFA possui maior potencial de auxílio na necrose tumoral. Este estudo constatou a impedância do tecido influi na densidade elétrica e por isso existe variação entre a ablação produzida em tecidos in vivo e post mortem. __________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Hepatocellular carcinoma is a type of liver tumor with high death rates around the world. When it is diagnosed at an early stage, tumor nodules of up to 3cm can be treated by radiofrequency ablation (RFA). This procedure is carried out through a minimally invasive incision to insert an electrode which is image-guided to the location of the tumor and delivers an alternate high-frequency current to the tissue, causing cellular necrosis at around 45°C-60°C. In spite of offering little damage and low risk of complications when compared to other treatments, RFA is not often used in Brazil because of its elevated costs and because there are only few professionals that are trained to perform it. This paper presents the development and analysis of an active monopolar electrode that is to be attached to the SOFIA equipment for hepatic RFA developed in the Biomedical Engineering Laboratory of the University of Brasília. In addition, the paper proposes a relation between the potency and geometry of the electrode to ensure the zone of ablation and that the roll-off will happen, which is an event characterized by the precipitous variation of impedance after necrosis, with and without accelerators (solutions of anhydrous alcohol and acetic acid) injected to quicken the burn. An umbrella electrode, active and monopolar, was built with nickel titanium and micro welding by laser of Yb fiber. For the evaluation of the electrode, the analysis of the solder by scanning electron microscope was carried out. For its validation, ex vivo tests were performed on bovine livers, with comparisons of dimensions of larger width, narrow width and depth of the ablation zone obtained with 8 other electrosurgery electrodes. Through a blind experiment, only 4 electrodes were chosen to evaluate the combinations of 40W and 80W of potency at 400kHz per 10min, 20min and 30min. Simulations of the umbrella electrode model with 5 electrodes (5H) were performed in the COMSOL software and compared to the ex vivo results. And due to the difference of properties between live and ex-vivo tissue, a mathematic modeling with and adapted Cole-Cole model was made to evaluate the influence of impedance on the developed 5H umbrella electrode. The manufacturing process used in this work can reduce up to 10x the cost of the active electrode. The experiments that tested the electrode showed that with potency of 40W for up to 30min it is possible to burn a volume of up to 2,5cm³ a 3cm³. We found that the geometry delays the roll-off and consequently produces larger and better-defined ablation zones than any other electrode that was tested. Between the accelerators, anhydrous alcohol combined with RFA is potentially more helpful in tumor necrosis. This study found that tissue impedance influences the electrical density and that is why a variation between the ablation produced on in vivo and post mortem tissues exists.

Tumor de bexiga é o tipo de tumor mais comum que ocorre no trato urinário, originado a partir do epitélio estratificado da bexiga. A incidência em homens é maior do que em mulheres, está associado com a industrialização e relacionado com a origem ocupacional do paciente. Mais de 90% dos tumores de bexiga são devidos a alterações neste epitélio, sendo o principal tipo, o tumor nas células transicionais. A linhagem T24 de tumor de bexiga humana tem sido usada como modelo de tumor invasivo de bexiga. Nucleotídeos são uma importante classe de moléculas sinalizadoras, conhecidos por regular muitas funções pato-fisiológicas no espaço extracelular. O ATP extracelular é conhecido por mediar uma variedade de respostas biológicas no sistema nervoso central e periférico, principalmente pela ligação aos receptores acoplados à proteína G, P2Y ou pelos receptores ligados aos canais iônicos, P2X. A sinalização mediada pelos nucleotídeos é controlada por uma eficiente cascata enzimática que inclui os membros das ecto-nucleotidases ENTPDases, E-NPPs e ecto-fosfatases alcalinas as quais de formas diferenciadas podem gerar AMP que pode ser hidrolisado pela ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT, CD73) gerando adenosina. Muitos estudos têm indicado que o ATP extracelular exerce um efeito primordial no trato urinário e que suas ações são mediadas por receptores P2. Baseado na ampla distribuição das ecto-nucleotidases em vários tipos de tecidos e considerando a potencial participação destas enzimas na regulação da sinalização purinérgica em tecido de bexiga normal e tumoral, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade das ectoenzimas e a presença dos receptores purinérgicos nas células T24 de tumor de bexiga humano. Muitos estudos vêm demonstrando evidências da relação entre o sistema purinérgico e o crescimento tumoral. Nossos resultados mostraram que as células T24 apresentam uma extrema diminuição da capacidade de hidrólise dos nucleotídeos tri- e difosfatados quando comparada com os nucleotídeos monofosfatados, que apresentam uma alta capacidade de hidrólise. Os resultados obtidos pela hidrólise mostram uma baixa expressão das E-NTPDases, contrastando com uma significante atividade da ecto-5’- nucleotidase, e pelo menos um membro da família das E-NPPs. Muitos papéis fisiológicos para a família das E-NPPs têm sido descritos incluindo reciclagem de nucleotídeos e modulação da sinalização purinérgica. No presente estudo nós analisamos a atividade desta enzima na linhagem celular T24 em pH ótimo para as E-NPPs e em pH fisiológico para cultura de células. Curvas de tempo e substrato mostraram atividade das E-NPPs apenas no pH ótimo da enzima. A análise por RT-PCR mostrou a presença apenas da E-NPP1. Quanto à expressão das ecto-enzimas, nosso estudo mostrou que a linhagem T24 expressa apenas a E-NTPDase 5 (CD39L4) e não expressa as demais E-NTPDases. Nós identificamos todos os receptores P2Y nas células, dando suporte a idéia de que alterações no número de células tumorais pode ser devido a modulação da proliferação celular via receptores P2. Em nosso estudo também investigamos o efeito do ATP extracelular nas células T24, em diferentes concentrações e tempos de tratamento, mostrando que o ATP extracelular diminui significativamente o número de células. Estes dados indicam que as vias de sinalização purinérgica podem ter um importante papel na regulação das funções da bexiga urinária. Outros estudos são necessários para confirmar as funções do sistema purinérgico nos tumores de bexiga e as possíveis terapias antitumorais. / Bladder cancer is the most commonly tumor occurring in urinary tract, originating from normal stratified transitional epithelium of the bladder. The incidence in men is bigger than in women and is associated with industrialization and related to occupational origin. More than 90% of histological cell type of bladder cancer is transitional cell carcinoma. The T24 cell is a lineage of human bladder transitional cell carcinoma, and it has been used as model of invasive bladder cancer. Nucleotides, an important class of signaling molecules, are known to regulate many pathophysiological functions in the extracellular space. Extracellular ATP is recognized as an agonist that mediates a wide variety of biological responses in the central and peripheral nervous systems, largely by binding to either G protein-coupled receptors P2Y or ligand- gated P2X receptors. The nucleotide-mediated signaling is controlled by a highly efficient enzymatic cascade which includes the members of E-NTPDase (ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase) family, E-NPP (ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase) family and ecto-alkaline phosphatases. The AMP formed by the action of these enzymes is hydrolyzed to adenosine by the action of an ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’-NT, CD73). Although several lines of evidence have indicated that extracellular ATP plays primordial role in the urinary tract and these actions are mediated by P2 receptors. Based on the wide distribution of ecto-nucleotidases in various tissues and considering the potential participation of these enzymes in the regulation of purinergic signaling in normal and tumoral bladder tissues, the objective of the present study was to examine the activity of ecto-enzymes and the presence of the purinergic receptors in T24 human bladder tumor cell line. Several studies have demonstrated evidence for the relation between the purinergic signaling and tumor growth. Our results show that T24 cell line presents an extremely decreased capacity to hydrolyze all tri- and di-phosphate nucleosides when compared to the nucleoside monophosphates, which have a higher capacity to hydrolyze. The results obtained show a low expression of E- NTPDases, contrasting to a significant activity of ecto-5’-nucleotidase, and at least one of the enzymes family of E-NPPs. Multiple physiological roles for E-NPPs have been related, including nucleotide recycling and modulation of purinergic receptor signaling. In the present study, we describe an enzyme activity in T24 cell line in the optimum pH for ENPP and in physiological pH to the culture cells. Time and substrate curve have shown an E-NPP activity only in the enzyme optimal pH. The RT-PCR analysis showed the presence of only the E-NPP1. Regarding the expression of the ecto-enzymes, our study has showed that the T24 cell line expresses only the E-NTPDase 5 (CD39L4) and does not express the other E-NTPDases. We have identified all P2Y receptors in the cell line studied supporting the idea that the alteration of cancer cell number might be due to modulation of cell proliferation via P2 receptors. In this study we also investigated the effects of extracellular ATP in T24 cell line in different concentrations and times of treatment. As shown, the extracellular ATP decreases significantly the cell number. These data could indicate that the purinergic signaling pathways may play an important role in regulating urinary bladder function. Further studies to provide functions for the purinergic system in bladder tumor will be necessary to improve the possibilities of antitumor therapies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2012. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-10-29T14:09:23Z No. of bitstreams: 1 2012_LudmyllaCostaCunha_Parcial.pdf: 2564492 bytes, checksum: 6e6ce6ca592e7c52d9722490cc9c373a (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-11-22T12:01:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_LudmyllaCostaCunha_Parcial.pdf: 2564492 bytes, checksum: 6e6ce6ca592e7c52d9722490cc9c373a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-22T12:01:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_LudmyllaCostaCunha_Parcial.pdf: 2564492 bytes, checksum: 6e6ce6ca592e7c52d9722490cc9c373a (MD5) / Gliomas representam o tipo de tumor cerebral primário de maior malignidade. Entre as alterações que conferem competência tumoral ao glioma, está o aumento na expressão do canal de potássio hEag1. Na última década, a interferência de RNA (RNAi) tem se destacado como técnica para estudo da função de genes em mamíferos, via silenciamento gênico pós-transcricional. Neste sentido, a técnica de RNAi foi utilizada no atual estudo para silenciar o gene Eag1 em células de glioma. Na primeira etapa deste projeto, foram identificados alvos para RNAi na região codante do gene hEag1 (NM_172362.2), via algoritmo baseado em redes neurais artificiais. Foram identificados 25 alvos de RNAi, com escores variando de 0,82 a 0,87, e selecionados para o atual estudo os dois alvos com maiores escores. Foi realizada síntese química de siRNAs para estes alvos situados nos exons 2 e 8, daí a denominação e2_hEag1 e e8_hEag1. Também foram sintetizados o siRNA controle positivo descrito anteriormente Kv10.1-3 e o controle negativo scramble (Qiagen). Foi inicialmente determinado o ponto temporal (4h, 8h, ou 48h) e a concentração (18,75 nM, 37,5 nM ou 75,0 nM) de maior silenciamento de hEag1, utilizando-se os siRNAs controles transfectados em lipossomas catiônicos. O maior silenciamento foi observado no tempo de 8h pós-transfecção, na menor dosagem testada, 18,75 nM. Nesta condição experimental, foi testado o grau de silenciamento de Eag1 causado pelos dois novos siRNAs, em comparação com o controle positivo Kv10.1-3. Ambos siRNAs desenhados no atual estudo -e2_hEag1 e e8_hEag1 -foram mais efetivos que o controle positivo Kv10.1-3, reduzindo assim o conteúdo relativo de hEag1 em 0,46 vezes e 0,52 vezes, respectivamente, em relação ao valor obtido no controle negativo scramble (p < 0,05). Na última etapa deste estudo, foi avaliado se vetores de expressão de short hairpins RNAs (shRNA) direcionados ao alvo 5´ GTCCACTTGGTCCATGTCCAG 3´ do controle positivo Kv10.1-3 (pKv10.1-3hum_LI), causariam alteração de fenótipo celular, ou seja, redução da viabilidade dos gliomas. O efeito destes vetores de expressão (pKv10.1-3hum_LI ou pScramble, dose de 0,2 µg) sobre a viabilidade de gliomas, em uso isolado ou em combinação com interferon gama (IFN-y, 25 ng/mL ) foi testado pelo ensaio de MTT. A redução de viabilidade obtida com a combinação do vetor pKv10.1-3hum_LI e IFN-y (40,4 %)foi superior àquela obtida com o uso isolado de ambos, 16,0% e 11,4%, nesta ordem (p < 0,05). Este efeito sinérgico não foi observado com o vetor controle negativo pScramble, o que indica tratar-se de efeito sequência-específico, ou seja, dependente da sequência do shRNA expresso pelo vetor pKv10.1-3hum_LI. Em síntese, o presente estudo mostra que é possível silenciar a expressão de hEag1 de gliomas via siRNAs sintéticos. Além disto, revela a importância de hEag1 para a viabilidade celular do glioma, principalmente durante a injúria por IFN-y. No sentido tecnológico, o atual estudo apresenta um protocolo inovador com potencial uso na terapêutica de gliomas, baseado na associação de RNAi sobre hEag1 com o agente imunomodulador IFN-y. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Glioma is the most common type of primary malignant brain tumor. The disease presents poor clinical outcome and the treatment is essentially palliative. Among the genetic changes that confer capability to tumor cells is the hEag1 gene overexpression. RNA interference (RNAi) has rapidly advanced into a practical technique for mammalian gene function studies, through post-transcriptional genetic silencing. The technique was used in the present study to silence hEag1 gene in glioma cells in culture. We first identified RNAi targets in the coding region of hEag1 (NM_172362.2) by using algorithms based on artificial neural networks. Twenty-five hEag1 RNAi targets were found, with scores ranging from 0.82 to 0.87; the two highest rated were selected. They were chemically synthesized as short interfering RNAs (siRNAs), and designated e2_hEag1 and e8_hEag1, according to the targeted exon. Positive and negative siRNA controls were the previously published Kv10.1-3, and the scramble All Star (Qiagen), respectively. We first determined the time-point (4h, 8h, or 48h) and siRNA concentration (18.75 nM, 37.5 nM, or 75.0 nM) that provide the highest silencing effect, by using RT-qPCR. The best hEag1 knock-down occurred at 8h post-transfection with 18.75 nM siRNA concentration. We used this experimental condition to compare the two new siRNAs - e2_hEag1 and e8_hEag1 – with the positive control Kv10.1-3. Both siRNAs in test produced higher silencing effects compared to Kv10.1-3 (p < 0.05). The mRNA fold decrease varied from 0.46 to 0.52, according to each transfected siRNA e2_hEag1 or e8_hEag1, respectively. Finally, we evaluated whether an expressed short hairpin RNA (shRNA) to the same hEag1 Kv10.1-3 target sequence (5´- GTCCACTTGGTCCATGTCCAG 3´) would decrease the glioma cell viability. The expression vectors (pKv10.1-3hum_LI or a scramble control one pScramble, dose 0.2 µg) were transfected into glioma cells, with or without interferon gamma concurrent treatment (IFN- y, 25 ng/mL ) viability was determined by MTT assay. The association of the vector pKv10.1-3hum_LI and IFN- y decreased the glioma cell viability to 40.4%, which surpassed the results obtained from their isolate use, 16.0% and 11.4%, respectively (p<0.05). As pScramble showed no synergism with IFN- y we consider the pKv10.1-3hum_LI effects were sequence-specific. In conclusion, this study showed the ability of two unpublished siRNAs to knock-down hEag1. Our results are in agreement with previous data that established a role for Eag1 in the tumor cell viability. This role seems to be even more important during IFN-y injury. Regarding to biotechnology, this study presents an innovative treatment able to reduce the glioma cell viability, based on the association of shRNA expression vector to hEag1 and the immunomodulatory agent IFN- y.

Dissertação (mestrado)— Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-10-29T14:43:25Z No. of bitstreams: 1 2013_RicardoAmoreiraGepp.pdf: 1242435 bytes, checksum: a146601c5b5f73f3b58e6363d9d021af (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-10-30T12:36:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_RicardoAmoreiraGepp.pdf: 1242435 bytes, checksum: a146601c5b5f73f3b58e6363d9d021af (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-30T12:36:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_RicardoAmoreiraGepp.pdf: 1242435 bytes, checksum: a146601c5b5f73f3b58e6363d9d021af (MD5) / Introdução: A RM é o padrão atual de imagem para o diagnóstico de tumores encefálicos, com imagens anatômicas e funcionais. Achados anatômicos por meio da ressonância magnética são insuficientes na avaliação prognóstica dos tumores, sendo necessária a utilização de outros métodos. A análise da metilação do gene promotor do MGMT é outro fator importante no prognóstico de gliomas anaplásicos. Este estudo teve o objetivo de estudar o prognóstico e as relações entre aspectos de perfusão na ressonância magnética e a análise da metilação do gene promtor de MGMT. Métodos: Foram analisados 39 pacientes com gliomas malignos encefálicos. Os pacientes foram submetidos a ressonância magnética com estudo da perfusão e após a cirurgia foi realizada a análise da presença do gene promotor de MGMT. Foi feito a análise estatística e o estudo das curvas de sobrevivências do grupo metilado e não metilado e da perfusão. Resultados:O estudo demonstrou que a sobrevida média dos pacientes negativos para metilação no gene promotor de MGMT foi de 17,9 meses, enquanto que no grupo positivo para metilação a sobrevida foi de 29,2 meses (p<0,05). A curva de Kaplan-Meier demonstrou uma sobrevida maior no grupo com metilação do gene promotor de MGMT (p<0,01 log-rank teste). A curva de sobrevivência da análise da metilação do gene promotor do MGMT com relação a perfusão demonstrou que nos pacientes com presença do gene a variação da perfusão entre alta e baixa não foi significante (p=0,944). Na avaliação dos casos sem a presença do gene, os pacientes com perfusão alta tiveram pior sobrevida (p=0,038). Conclusão: A presença de metilação do gene promotor de MGMT associado a uma perfusão baixa na ressonância magnética são fatores para melhor prognóstico nos gliomas malignos encefálicos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / BACKGROUND: Magnetic resonance imaging is the current standard in the diagnostic imaging of brain tumors, yielding both anatomical and functional images. Anatomical findings on MRI are insufficient for the prognostic assessment of tumors; thus, other methods are needed. MGMT promoter methylation assessment is another important factor in the prognosis of malignant gliomas. The aim of the present study was to examine prognosis and the relationships between perfusion features on MRI and the presence of MGMT promoter methylation. METHOD: A total of 39 patients with malignant brain gliomas were evaluated. The patients underwent brain MRI and perfusion, and the presence of MGMT promoter methylation was assessed postoperatively. Statistical analysis and a study of the survival curves of the methylated and unmethylated groups were performed, and perfusion was assessed for each group. RESULTS: The mean survival of patients who were negative for MGMT promoter methylation was 17.9 months, while in the methylation-positive group survival was 29.2 months (p<0.05). The Kaplan-Meier curve showed longer survival for the groupwith MGMT promoter methylation (p<0.01 by the log-rank test). The survival curve of MGMT promoter methylation in relation to perfusion showed that variations between high and low perfusion values were not significant (p=0.944) for themethylation-positive patients. In the evaluation of the methylation-negative patients, those who showed high perfusion values had poorer survival (p=0.038). CONCLUSION: Presence of MGMT promoter methylation in conjunction with low perfusion on MRI are factors of better prognosis in malignant brain gliomas.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-02-27T12:58:18Z No. of bitstreams: 1 2013_FernandaSouzaNatividade.pdf: 1509011 bytes, checksum: 93d3f1ec92cf9a443682e2fa0a9a3897 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-02-27T14:24:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_FernandaSouzaNatividade.pdf: 1509011 bytes, checksum: 93d3f1ec92cf9a443682e2fa0a9a3897 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-27T14:24:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_FernandaSouzaNatividade.pdf: 1509011 bytes, checksum: 93d3f1ec92cf9a443682e2fa0a9a3897 (MD5) / O mastocitoma é a neoplasia cutânea maligna de maior frequência em cães. Mesmo com o estudo e desenvolvimento de diversos marcadores prognósticos, na tentativa de prever o comportamento biológico deste tipo de neoplasia, a graduação histológica continua sendo utilizada como principal delineador prognóstico dos animais acometidos, mesmo não conseguindo prever o comportamento de mastocitomas de diferenciação intermediária. Diferentes marcadores de proliferação e atividade celular vêm sendo testados com resultados promissores, entretanto, em sua maioria, demandam técnicas específicas de coloração e imuno-histoquímica que ainda hoje são de alto custo e muitas vezes não estão facilmente disponíveis. O índice mitótico é um dos métodos indiretos de mensuração da atividade proliferativa celular que pode ser contabilizado em uma lâmina comum de avaliação histológica, e estudos vem determinando-o como importante marcador prognóstico para o mastocitoma canino. Dada a recente publicação sugerindo nova graduação em 2 graus (alto e baixo) e indisponibilidade das técnicas específicas utilizadas na determinação de outros fatores prognósticos, objetivou-se avaliar o poder prognóstico das diferentes classificações, associando-as à sobrevida destes animais e comparando com o índice mitótico. Apesar de isoladamente ambas as classificações histológicas apresentarem associação com a sobrevida (P<.001) dos animais acometidos, na analise multifatorial nenhuma foi significativamente associada com a sobrevida (P>0,05). O índice mitótico foi o fator prognóstico mais confiável para sobrevida independente do ponto de corte utilizado (P<0,05), principalmente quanto aos mastocitomas grau 2 de Patnaik et al. (1984) que apresentam comportamento biológico variado, sendo também associado à ocorrência de recidivas tanto locais como distantes e de síndromes paraneoplásicas (P<0,05). Conclui-se ser o índice mitótico o melhor marcador prognóstico na ausência de técnicas específicas mais avançadas. Preconiza-se seu uso associado às graduações histológicas, visando um melhor poder prognóstico. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Mast cell tumor (MCT) is the most common malignant cutaneous neoplasm in dogs. Even with several prognostic markers being studied, in attempt to prevent the biological behavior of these tumors, the histological grading is still commonly used to predict behavior, however, it is not significant to predict intermediately differenciated MCT behavior. Different prognostic and cell proliferation markers are being tested with promising results however, the majority of then requires specific staining and immunohistochemical techniques that even nowadays are expensive and not suitable for all veterinarians. Mitotic index is an indirect measure of cell proliferation and it can be established in a common histological microscope slide, and studies indicate it as an important prognostic marker for MCT in dogs. Given the recent publication of the novel two-tier histologic grading system and the unavailability of specific techniques to determine other prognostic markers, this study objective to evaluate the prognostic value of the different grading systems associating with survival and compare it with the mitotic index. Even though both grading systems associate with survival in the univariable analyses (P<.001), at the multivariable analyses neither was associated with survival (P>0,05), and the mitotic index was the best predictive marker for survival, regardless of the cut-off point used (P<0,05), especially when Patnaik grade 2 tumors with unpredictable biological behavior were analysed. The mitotic index was also significantly associated with both local and distant reccurence and paraneoplastic syndrome. In this study, mitotic index was the best prognostic marker, in the abscense of specific staining and advanced immunohistochemical techniques, and its use is indicated associated with the histological grading, aiming to add higher prognostic value possible.