The first aim of this thesis is to perform relativistic calculation of atomic and ionic polarizabilities and two-photon decay rates. Hydrogenic systems are treated by the Lagrange-mesh method. The extension to alkali-like systems is realized by means of a semiempirical-core-potential approach combined with the Lagrange-mesh method. The studied systems are partitioned into frozen-core electrons and an active valence electron. The core orbitals are defined by a Dirac-Hartree-Fock (DHF) calculation using the GRASP2K package. The valence electron is described by a Dirac-like Hamiltonian involving a core-polarization potential to simulate the core-valence electron correlation. Polarizabilities appear in a large number of fields and applications, namely in cold atoms physics, metrology and chemical physics. Two-photon transitions are part of a priori highly unlikely processes and are therefore called forbidden radiative processes. Experimental situations report decays from metastable excited states through these channels. Long lifetimes were measured for highly charged Be-like ions in recent storage-ring experiments, but their interpretation is problematic. The study of the competition between forbidden (one-photon beyond the dipole approximation, or multi-photon) and unexpected (hyperfine-induced or induced by external magnetic fields) radiative processes is all obviously relevant. The second aim of this thesis is to perform relativistic ab initio calculations of electronic isotope-shift (IS) factors by using the multiconfiguration DHF (MCDHF) method implemented in the RIS3/GRASP2K and RATIP program packages. Using the MCDHF method, two different approaches are adopted for the computation of electronic IS factors for a set of transitions between low-lying levels of neutral systems. The first one is based on the estimate of the expectation values of the one- and two-body nuclear recoil Hamiltonian for a given isotope, including relativistic corrections derived by Shabaev, combined with the calculation of the total electron densities at the origin. In the second approach, the relevant electronic factors are extracted from the calculated transition shifts for given triads of isotopes. These electronic quantities together with observed ISs between different pairs of isotopes provide the changes in mean-square charge radii of the atomic nuclei. Within this computational approach for the estimation of the mass- and field-shift factors, different models for electron correlation are explored in a systematic way to determine a reliable computational strategy, and to estimate theoretical error bars of the IS factors. / Doctorat en Sciences de l'ingénieur et technologie / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ce travail de thèse s’inscrit dans le domaine émergent du « théranostique » qui associe le diagnostic par l’imagerie à la thérapie au sein d’un même système. De nouveaux photosensibilisateurs (PS) pour la thérapie photodynamique (PDT) activables par un processus d’excitation biphotonique ont été synthétisés. Ils sont composés de porphyrines reliées à des unités dicétopyrrolopyrroles. Ces systèmes présentent d’importantes valeurs de sections efficaces d’absorption biphotonique dans le proche infra-rouge ainsi que de bons rendements quantiques de formation d’oxygène singulet. Deux PS ont ensuite été reliés à des complexes de Gd(III) permettant d’apporter la fonction d’imagerie par résonance magnétique (IRM). En plus de conserver de bonnes propriétés d’absorption biphotonique, ces systèmes présentent également de remarquables valeurs de relaxivité. Enfin, des études de phototoxicité in cellulo ont démontré l’activité d’un des agents théranostiques sous irradiation biphotonique. Ces résultats permettent de valider pour la première fois le concept d’un agent moléculaire unique pour la PDT par absorption biphotonique et pour l’IRM. / The work presented in this thesis belongs to the emerging field of « theranostic » whose aim is to combine a diagnostic and a therapeutic agent within the same system. New photosensitizers (PS) activated by a two-photon absorption process for Photodynamic Therapy (PDT) have been synthesised. These systems consist of porphyrins conjuguated to diketopyrrolopyrrole units. These compounds have significant high two-photon absorption cross-sections in the near infrared and good singlet oxygen quantum yields. Two PS have been linked to Gd(III) complexes in order to bring the magnetic resonance imaging (MRI) function. These systems still have good two-photon absorption properties and also show remarkable high relaxivity values. Finally, in cellulo phototoxicity studies have been performed for one of the theranostic agent and the two-photon PDT activity has been retained. These results validate, for the first time, a proof of concept of a single molecular agent for two-photon PDT and for MRI.

L’imagerie fonctionnelle cérébrale détecte les changements hémodynamiques induits par un stimulus pour déterminer les zones d’activation neuronale. Plus particulièrement, l’imagerie BOLD en IRMf détecte les changements d’oxygénation du sang grâce aux propriétés paramagnétiques de la déoxyhémoglobine. L’oxygène n’est donc pas uniquement un substrat énergétique pour le tissu neuronal, il joue également un rôle majeur dans l’imagerie noninvasive du cerveau humain. Au cours de ma thèse, j’ai tout d’abord participé à la mise au point d’une nouvelle technique non-invasive d’imagerie de l’oxygène dans le cerveau d’animaux anesthésiés. Couplant un nouveau senseur phosphorescent de l’oxygène (Finikova et al., 2008) et la microscopie biphotonique, cette approche permet à la fois de cartographier l’oxygène en 3D avec une résolution spatiale et temporelle jusqu’alors inégalée, mais aussi de suivre simultanément l’oxygène et le flux sanguin dans les capillaires cérébraux au repos ou lors d’une activation neuronale (Lecoq et al., 2011). Tirant profit des nouvelles possibilités de cette technique, nous avons alors démontré: • la présence d’un shunt artério-veineux uniquement basé sur la diffusion de l’oxygène. Ce résultat, obtenu chez le rat dans la couche la plus superficielle du bulbe olfactif: la couche du nerf (ONL), confirme que l’oxygène ne diffuse pas uniquement à partir des capillaires et démontre que les artérioles contribuent significativement à l’oxygénation du tissu cérébral. Il démontre également qu’il n’est pas possible de déterminer ni la Po2 capillaire ni la Po2 tissulaire à partir de la Po2 veineuse. • l’existence de transitoires de Po2 associés à chaque globule rouge dans le compartiment capillaire, appelés EATs (erythrocyte-associated transients) (Hellums, 1977; Cabrales and Intaglietta, 2007). En bref, de part leur diamètre supérieur à celui de la lumière d’un capillaire, les globules rouges passent un à un dans la lumière des capillaires, laissant entre eux un espace de plasma. Cependant, la faible solubilité de l’oxygène dans le plasma crée une barrière à la diffusion, ce qui se traduit par une inhomogénéité de la Po2 capillaire: celle-ci est élevée au bord du globule rouge et décroit avec la distance pour atteindre un minimum à mi-distance entre deux globule rouges. Poursuivant l’étude des EATs (Parpaleix et al., 2013), nous avons observé les points suivants: • La Po2 tissulaire dans l’environnement immédiat d’un capillaire peut être déterminée à partir de la Po2 vasculaire à mi-distance entre deux érythrocytes. Ce résultat est intéressant en ce qu’il permettra d’effectuer des mesures non invasives de Po2 tissulaire, utile notamment chez l’animal éveillé. • L’amplitude des EATs est si large (35 mmHg en moyenne) que la Po2 capillaire moyenne ne reflète en rien la saturation en oxygène de l’hémoglobine. • Une empreinte filtrée des EATs vasculaires est détectable dans le tissu (_5 mmHg d’amplitude). • Au cours d’une stimulation neuronale, une diminution de la Po2 capillaire moyenne peut être détectée avant l’hyperémie fonctionnelle, un résultat jusqu’à présent controversé dans le domaine de l’imagerie BOLD en IRMf, mais important en ce que ce dip pourrait être un rapporteur très résolutif de l’activation neuronale. Parmi les questions restant en suspens et pouvant être étudiées finement avec notre approche, j’en citerai une principale: quel est le poids des différents facteurs (métaboliques, présynaptiques ou post-synaptiques) et du flux sanguin dans l’établissement de la Po2 cérébrale au repos? / In humans, functional mapping of brain activity mainly relies on the increase of cerebral blood flow (CBF) triggered by neuronal activation. This neurovascular coupling provides energy substrates such as oxygen and glucose to the activated area. The steady state concentration of oxygen, as well as its dynamics upon neuronal activation, have been investigated with numerous methods, however, none of them provided highly resolute measurements in depth. During my PhD, we combined a phosphorescence quenching approach with two-photon microscopy to detect, in depth and with a micrometer spatial resolution scale, the emission of phosphorescence by PtP-C343, a new oxygen nano-sensor designed for two-photon excitation. We first characterized the technique and then reported two biological results, using the olfactory bulb (OB) glomerulus as a model to study oxygen concentration, at rest and upon odor stimulation. We found an arterio-venous shunt, purely based on diffusion, in the superficial nerve layer of the OB, confirming the role of arterioles in brain oxygenation. Simultaneous measurements of Po2 and blood flow allowed us to reveal the presence of erythrocyte-associated transients (EATs), i.e. Po2 fluctuations that are associated with individual erythrocytes. Pursuing the investigation of EAT characteristics, we found that in capillaries, Po2 at mid-distance between two erythrocytes is at equilibrium with, and thus reports Po2 in the nearby neuropil. Finally, we could observe that even in capillaries, a small oxygen initial dip can be detected prior to functional hyperemia, upon odor activation.

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Une grande partie des chimistes puisent leur inspiration auprès de la biologie. C’est le cas des chercheurs en chimie supramoléculaire, qui travaillent sur l’élaboration de récepteurs moléculaires synthétiques capables d’effectuer des reconnaissances moléculaires envers des substrats d’intérêt biologiques. Le but est ainsi de mimer l’activité des protéines naturelles, en vue d’applications cliniques.L’unité cyclotribenzylène (CTB) est une structure de symétrie C3 qui possède des propriétés complexantes intéressantes. Un CTB relié à une deuxième unité complexante par trois bras espaceurs constitue la famille des hémicryptophanes. Au cours de cette thèse, nous avons travaillé sur l’élaboration de récepteurs moléculaires basés sur cette unité CTB. Dans un premier temps nous avons développé une nouvelle méthode de synthèse d’hémicryptophane énantiopurs à l’échelle du gramme en vue d’effectuer des reconnaissances stéréosélectives de neurotransmetteurs chiraux. Nous avons ensuite développé des récepteurs CTB et hémicryptophanes combinant la chiralité du CTB et du groupement binaphtol. La configuration absolue des unités chirales ont été déterminées par une méthode de corrélation chimique. Ces récepteurs ont été utilisés pour réaliser des expériences de reconnaissance stéréosélective de saccharide et de bonnes diastéréosélectivités ont été obtenues. Enfin, nous avons travaillé sur l’élaboration d’une voie de synthèse d’hémicryptophanes fluorescents capables de subir des excitations bi-photoniques dans le but d’effectuer des expériences de suivi dans l’espace et dans le temps de substrats d’intérêt biologiques en milieu in-vivo. / Biology is an inspiration for chemists. Especially for the field of supramolecular chemistry, which one of the aim is to develop synthetic molecular receptors capable of molecular recognition to biological substrates, to mimic the activity of natural proteins for clinical applications.Cyclotribenzylene unit (CTB) is a C3-symmetry structure which present interesting recognition properties. When a CTB is connecting to another molecular unit by three spacers arms, it forms an hemicryptophane receptor. During this thesis, we worked on elaboration receptors based on CTB unit. First, a new way of enantiopure hemicryptophane synthesis on gram scale has been developed for stereoselective recognition of chiral neurotransmitters. Then receptors based on chirality of CTB and binaphthol unit has been developed. Assignment of absolute configuration of chiral unit was determined by a chemical correlation. Stereoselective recognition of carbohydrates by these receptors revealed good diastereoselectivity. Finally, a synthetic pathway leading to fluorescent hemicryptophanes was developed for bi-photonic excitation in order to realize in-vivo experiments of tracking biological substrates.

Le glioblastome (GB) est une tumeur hétérogène, agressive devant laquelle les possibilités thérapeutiques disponibles restent limitées. L’étude de la zone péritumorale macroscopiquement normale (ZMN) des GB est essentielle à la compréhension de ses mécanismes de progression et de récidive. Le premier objectif de ce travail de Thèse a été de comparer les données de transcriptomique et de protéomique issues de l’analyse de la zone tumorale des GB dans le cadre du Projet Gliome Grand Ouest. Le taux de concordance entre les 2 modalités est faible, retrouvant toutefois comme point commun une dysrégulation de la protéine légère des neurofilaments qui pourrait servir de biomarqueur potentiel des GB. Le deuxième objectif de ce travail de Thèse a été la caractérisation de la ZMN des GB. Nous avons mis en évidence que cette zone, dont l’aspect est similaire à première vue à celui du tissu cérébral sain, n’est pas une simple zone de transition entre le GB et le tissu cérébral sain. En effet, la ZMN est une entité spécifique possédant des caractéristiques qui lui sont propres, comme la présence d’un phénotype particulier de cellules tumorales infiltrantes et de cellules stromales et une sur’expression des protéines CRYAB et H3F3A. Ce travail de Thèse a aussi été l’occasion de développer de nouvelles techniques d’imagerie per-opératoire de la ZMN, afin d’évaluer la présence d’un contingent tumoral et ainsi optimiser la qualité de la résection chirurgicale. La caractérisation de cette ZMN nous permet de mieux appréhender son implication dans la tumorogenèse et la présence de caractéristiques spécifiques de cette zone ouvre la porte à la détection de biomarqueurs spécifiques, ainsi qu’au développement de thérapies ciblées. Ce travail de Thèse a été valorisé par 2 publications, 2 articles soumis et un brevet est en cours de dépôt et d’évaluation par un cabinet de brevet. / Glioblastoma (GB) is a heterogeneous andaggressive tumor, before which therapeutic options arelimited. The study of the macroscopically normalperitumoral brain zone (PBZ) of GB is essential tounderstand its mechanisms of progression andrecurrence.The first objective of this thesis work was tocompare the transcriptomic and proteomic data from theGB tumor area obtained through the “Grand Ouest”glioma Project. The concordance rate between the 2modalities is low. However, one of the common featureis the dysregulation of neurofilament light polypeptide,which could serve as a biomarker potential of GB.The second objective of this thesis was thecharacterization of the PBZ. We have shown that thisarea, similar at first glance to that of healthy braintissue, is not a simple transition area between the GBand healthy brain tissue but a specific entity withcharacteristics of its own. For example, the ZMNpresents a particular phenotype of infiltrating GB cellsand stromal cells and a surexpression of CRYAB andH3F3A proteins.This thesis work was also an opportunity todevelop new intraoperative imaging techniques of thePBZ, with the aim to assess the presence of a tumoralinfiltration and optimize the quality of the surgicalresection.The characterization of this PBZ allows us tobetter understand its involvement in tumorigenesis andthe presence of specific characteristics of this areaopens the door for the detection of specific biomarkersand the development of targeted therapies.This thesis work was led to 2 publications, 2articles submitted and a patent being evaluated andredacted by a patent office.

L’objectif de cette thèse est l’élaboration de sondes à base de lanthanide pour la microscopie optique biphotonique. Cette technique d’imagerie complémentaire à l’IRM et au scanner permet une analyse rapide et facile de tissus épais. Afin de permettre l’observation en profondeur, l’absorption et l’émission de la sonde doit se situer dans la zone de transparence biologique [700 – 1200 nm]. L’absorption à deux photons (ADP) est un phénomène d’optique linéaire de troisième ordre par lequel l’état excité est atteint par absorption simultanée de deux photons. De fait, l’excitation à énergie moitié se situe dans la zone de transparence biologique. Les sondes envisagées combineraient les propriétés optiques uniques des lanthanides, telles que des bandes d’émission très étroites allant du visible à l’infrarouge et des durées de vie de luminescence longues, et les avantages de l’ADP, permettant une excitation dans l’IR et une résolution tridimensionnelle. Dans ce contexte, cette thèse décrit l’élaboration de complexes d’europium et d’ytterbium à ligands macrocycliques stables en milieu aqueux et dont la luminescence peut être sensibilisée à deux photons. Ces complexes ont permis l’imagerie de la vascularisation de cerveaux de souris par microscopie biphotonique dans le proche infrarouge. La seconde approche consiste à encapsuler un complexe luminescent dans des nanoparticules desilice formées par la technique sol-gel (collaboration A. Ibanez, institut Néel, Grenoble) afin de protéger le complexe du milieu biologique. Enfin la dernière approche consiste à greffer des complexes de lanthanides à la surface d’une particule de silice par chimie organométallique de surface. Ces travaux ont conduit à la formation de nano-objet très brillants dans le rouge et le proche infrarouge, détectables à l’échelle de l’objet unique par microscopie à deux photons. / Two Photon Scanning Laser Microscopy (TPSLM) has evolved as an emerging bio-imaging technique widely used in academic research and in medical diagnosis. This technique requires the design of bioprobes specially optimized for such purpose. A particular attention is actually devoted bio-probes featuring both two-photon absorption (TPA) and emission in the near infra-red (NIR) spectral range [700 – 1200 nm], also called biological window that is particularly promising for thick tissues imaging. In this context, europium complexes emitting in the red (615 nm) has been recently sensitized by two photon antenna effect and used for TPSLM in cells combining the advantages of lanthanide emission (sharp line and long lived) and those of TPA. Based on this preliminary results, this thesis describe the design of europium and ytterbium complexes which have an improved stability in water and good emission properties sensitized by TPA. Theses complexes allow the imaging of mice’s brain vascularisation in the NIR. An another approach to stabilize lanthanide complexes was also used by encapsulating theses fluorophores in silica nanoparticle (collaboration with A. Ibanez, Institut Néel, Grenoble). Then the last approach consists on the grafting of the chromophores on silica sphere using surface organometallic chemistry methods. The nanoparticles obtained by both way are really luminescent in the red or infrared and can be imaged as single nanoparticle by TPSLM.

Depuis les années 60, la génération d’acide fort de Brönsted par un processus photoinduit à un photon est utilisée dans des nombreux domaines de recherche de plus en plus nombreux. Cependant, de tels acides peuvent-être facilement obtenus par voie biphotonique ce qui présente de nombreux avantages comme par exemple : une meilleure réactivité via une excitation direct du photoacide, l’utilisation possible d’une atmosphère non contrôlée, l’utilisation de microlasers à impulsions sub-nanosecondes peu couteux, mais aussi l’augmentation de la résolution spatiale des micro-objets 3D fabriqués. La génération d’acide se fait généralement par transfert d’électron entre un sensibilisateur et un générateur de photoacide (PAG). Une approche prometteuse consiste à associer, sur une même molécule, un PAG et un chromophore actif à deux photons. Il a donc semblé intéressant de développer de nouveaux PAG capables, par excitation biphotonique, d’amorcer directement la photopolymérisation. Nous avons choisi de préparer des systèmes capto-datifs stilbéniques, de nature neutre ou ionique. Aussi, une série de PAG neutres substitués par des groupements diphénylamino- donneur et iminosulfonates -cyanés accepteurs a été synthétisée. Nous avons également commencé, mais non achevé, la synthèse de PAG neutres portant des groupements iminosulfonates -trifluorométhylés. Puis, nous avons cherché à synthétiser des PAG ioniques substitués soit par un groupement éthoxy soit par un groupement diphénylamino soit par un groupement julolidine. Néanmoins, la dernière étape de la synthèse est pour l’instant un verrou synthétique. / Since the 60’s, the generation of strong Brönsted acids by a one-proton photoinduced process has been used in more and more research areas. Recently, it has been shown, that such acids are easily obtained by a two-photon process. This offers many advantages such as: i) a better reactivity owing to a direct excitation of the photoacid, ii) the possible use of a non-controlled atmosphere, iii) the use of inexpensive microlasers with sub-nanosecond impulsions, iv) the increase of spatial resolution in 3D microfabrication. The acid generation generally proceeds through a photo-induced electro transfer from an excited sensitizer to the photoacid generator (PAG). A promising approach should be the introduction on a single molecule of both a PAG and a two-photon active chromophore moiety. In this context, we have developed new PAGs able to initiate photopolymerisation through a two-photon activation process. The syntheses were focused on stilbenic push-pull systems having either a neutral or an ionic nature. A series of neutral PAGs bearing a diphenylamino donor group and an α-cyano iminosulfonate acceptor moiety has been synthesized. The preparation of neutral PAGs bearing iminosulfonate α-trifluoromethylated groups were not yet completed. The syntheses of ionic PAGs substituted by an ethoxy group, a diphenylamino group or a julolidine one, could not be completed either.

Photopolymerization is a technique used to create surface structures or microobjects from a photoresist. This process is started by illuminating the sample with a light of proper wavelength absorbed by the resist. After exposure, the sample is processed according to the type of the photoresist – be it heating, treating with developer or just washing the unaffected monomer with some reagent. Focused femtosecond laser beam with double wavelength can be used in the process. Short pulse length with high photon density starts two-photon absorption localized in the vicinity of focal point. The method resolution is thus increased and details with 1/10 micrometer size can be created. Moreover, very short laser pulse decreases the heat affected zone and the risk of thermal initiation is minimized. Manufacturing of larger structures composed of tiny details with two-photon photopolymerization is time-demanding process. Therefore, we have complemented the optical setup with spatial light modulator (SLM), which splits the incoming laser beam into several beams with holograms dynamically generated by a computer. Polymerization can be thus performed by multiple foci simultaneously which can be used to create separated microparticles or periodical surface structures. Additional speed improvement of the process can be substitution of static configuration, requiring sample replacement after each exposition, with continuous setup using microfluidic channel steadily supplied with photoresist transported to the active region of the sample.

The progress of miniaturisation towards the nanoscopic scale in science and technology has also influenced the biosciences. This is particularly important, since proteins, as the smallest functional units of life, exhibit a spectacular wealth of functionalities, enabling them to fulfil complex tasks in cells and organisms. For this reason, they are often termed molecular or cellular “machines”. To be able to investigate and better understand these fascinating molecules in their native environment, new analytical methods must be developed, with appropriately high sensitivity and spatial and temporal resolution. We describe one very promising technique based on fluorescence spectroscopy, which allows a quantitative analysis of protein- protein interactions in the live cell. / Die zunehmende Miniaturisierung bis hin zum nanoskopischen Maßstab in vielen technischen Disziplinen hat auch die Lebenswissenschaften ergriffen. Dies ist insofern von großer Bedeutung, als die Proteine als kleinste funktionale Einheiten des Lebens trotz ihrer winzigen Abmessungen eine faszinierende Komplexität aufweisen, die es ihnen erlauben, hoch differenzierte und spezialisierte Aufgaben in der Zelle und im Organismus zu übernehmen. Aus diesem Grund werden sie in der modernen Biologie auch als molekulare oder zelluläre „Maschinen“ bezeichnet. Um diese kleinen Wunderwerke zu studieren und ihre Funktionsweise in ihrer natürlichen Umgebung zu analysieren, bedarf es innovativer Technologien, die es erlauben, mit maximaler räumlicher und zeitlicher Auflösung auch einzelne Moleküle in der lebenden Zelle sichtbar zu machen und zu verfolgen. Im Folgenden wird eine von uns entwickelte fluoreszenzspektroskopische Methode vorgestellt, mit deren Hilfe die komplizierten Interaktionen zwischen Proteinen in der lebenden Zelle aufgeklärt werden können.