L’histoire naturelle de l’infection anale par le virus du papillome de type 16 (VPH-16) est mal définie pour les hommes ayant des relations sexuelles avec d’autres hommes (HARSAHs) VIH-séropositifs. Le but de cette étude était d’évaluer l’association entre la charge épisomale et intégrée du VPH-16 et la progression de la néoplasie intraépithéliale anale (AIN). Les charges épisomales et intégrées du VPH-16 furent mesurées par PCR quantitatif en temps réel sur 665 spécimens anaux obtenus de 135 hommes VPH-16-positifs participant à l’étude prospective HIPVIRG (Human Immunodeficiency and Papilloma VIrus Research Group). Le grade de l’AIN fut déterminé sur des biopsies obtenues lors des anuscopies à haute résolution périodiques. L’intégration du VPH-16 fut confirmée par DIPS-PCR pour démontrer la présence de jonctions virales-cellulaires. La charge épisomale du VPH-16 [ratio de cote (OR) 1.5, intervalle de confiance (IC) à 95%=1.1–2.1], le nombre de types de VPH [OR 1.4 (IC 95%=1.1–1.8)] et le tabagisme actuel [OR 4.8 (IC 95%=1.3–18.6)], mais non la charge intégrée, furent associés aux lésions de haut-grade (AIN-2,3) après ajustement pour l’âge et le décompte des lymphocytes CD4. La charge épisomale du VPH-16 était le seul facteur prédictif de progression de l’AIN de bas-grade (AIN-1) vers l’AIN-2,3 [OR 8.0 (IC 95%=1.2–55.4)]. Les spécimens avec une charge épisomale du VPH-16 élevée étaient moins susceptibles de contenir de l’intégration [OR 0.5 (IC 95%=0.3–0.8)]. L’intégration du VPH-16 fut détectée en absence d’AIN, dans l’AIN-1 et dans l’AIN-2,3. L’analyse des jonctions virales-cellulaires ne permit pas d’identifier un site d’intégration spécifique. / The natural history of human papillomavirus type 16 (HPV-16) anal infection is undefined among HIV-seropositive men having sex with men (MSM). The aim of this study was to assess the association between HPV-16 episomal and integrated viral loads and the progression of anal intraepithelial neoplasia (AIN). HPV-16 episomal and integrated loads were measured on 665 specimens from 135 HPV-16-positive men participating in the prospective HIPVIRG (Human Immunodeficiency and Papilloma VIrus Research Group) study. AIN grade was evaluated on biopsies obtained during periodical high-resolution anoscopies. HPV-16 integration was confirmed by DIPS-PCR to demonstrate the presence of viral-cellular junctions. HPV-16 episomal loads [odds ratio (OR) 1.5, 95% confidence interval (CI)=1.1–2.1], burden of HPV infection [OR 1.4 (95% CI=1.1–1.8)] and current smoking [4.8 (95% CI=1.3–18.6)], but not integrated loads, were associated with high-grade lesions (AIN-2,3) after age and CD4 counts adjustment. A high HPV-16 episomal load was the only predictive factor of progression from low-grade AIN to high-grade AIN [OR 8.0 (95% CI=1.2–55.4)]. Specimens with higher HPV-16 episomal loads were less likely to contain integration [OR 0.5 (95% CI=0.3–0.8)]. HPV-16 integration was detected in the absence of AIN, in AIN-1 and in AIN-2,3. The analysis of the viral-cellular junctions did not allow identifying a specific site of integration.

Le virus de l’Herpès simplex de type 1 (HSV-1) est le pathogène humain responsable des lésions herpétiques labiales, plus communément appelé « feux sauvages ». Annuellement, il est responsable de plusieurs cas d’encéphalites et d’infections de l’appareil visuel qui sont la principale cause de cécité en Amérique du Nord. Bien qu’il existe quelques traitements antiviraux, aucun vaccin ou médicament ne permet de prévenir ou de guérir les infections causées par ce virus. Aujourd’hui, les infections produites par l’HSV-1 sont présentes partout sur la planète. Récemment, une étude en protéomique effectuée sur les virus matures extracellulaires a permis d’identifier la présence d’ubiquitines libres et d’enzymes reliées à la machinerie d’ubiquitination dans le virus. De plus, le virus exploite cette machinerie au cours de l’infection. Il est connu que certaines protéines virales sont ubiquitinées durant une infection et que le virus imite même certaines enzymes d’ubiquitination. Nous avons donc entrepris des recherches afin d’identifier des protéines virales ubiquitinées qui pourraient être présentes dans les virus matures ainsi que leurs rôles potentiels. La protéine majeure de la capside, VP5, un constituant très important du virus, a été identifiée. Nos recherches nous ont permis de caractériser le type d’ubiquitination, une monoubiquitination sur les lysines K810 et/ou K1275 de VP5. Le rôle que pourrait jouer l’ubiquitination de VP5 dans le cycle de réplication virale et dans les virus matures n’est toutefois pas encore connu. / Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is the human pathogen responsible for herpetic lesion such as cold sores. On a yearly basis, it is responsible for many cases of encephalitis and infections of the eye that are the most common cause of blindness in North America. Antiviral treatments exist, but no vaccines or drugs are able to prevent or cure the diseases caused by this virus. Today, infections caused by HSV-1 are present all around the world. Recently a proteomics approach was used to study mature extracellular viruses. This study highlighted the presence in the virus of free ubiquitin and ubiquitin related enzymes. Furthermore, the virus exploits this machinery during the course of infection. Also, it is known that certain virally encoded proteins are ubiquitinated and that the virus mimics some ubiquitin related enzymes. Our researches focused on identifying ubiquitinated viral proteins that could be present in mature extracellular viruses and their potential roles. The major capsid protein, VP5, an important virus component, was identified. We characterised the type of ubiquitination, a monoubiquitination of lysine K810 and/or K1275 of VP5. The role that could play the ubiquitination of VP5 in the viral cell cycle and in mature virions has yet to be identified.

Le virus de l’immunodéficience humaine ou VIH est l’agent qui cause le SIDA. Le VIH donne lieu à une dérégulation dans la production de certaines cytokines qui ont un rôle immunologique très important chez les patients infectés. L’IL-18, autrement nommé facteur inducteur d’IFN-γ, est une cytokine pro-inflammatoire qui affecte le système immunitaire de façon importante. Son activité est régulée par l’"IL-18 Binding Protein" (IL-18BP), une autre cytokine qui se lie avec l’IL-18 et inhibe son activité biologique. Des études ultérieures ont montré des niveaux élevés d’Il-18 chez les patients infectés par le VIH par rapport aux personnes saines. Cependant, aucune étude n’a été réalisée concernant la production d’IL-18BP chez ces patients. Due à sa relevance dans la régulation de l’IL-18, nous avons étudié l’effet de l’infection par le VIH sur l’équilibre entre ces deux facteurs et l’impact de cet équilibre sur l’homéostasie des cellules NK. Nous avons mesuré les taux de l’IL-18 et de l’IL-18BP circulantes dans les sérums des patients infectés par le VIH en les comparants avec le même nombre de personnes saines et séronégatives. Nous avons aussi déterminé le nombre total des différents sous-types de cellules NK et analysé l’activité des cellules NK (Natural Killer). Finalement nous avons cherché à déterminer si l’IL-18 pouvait induire l’apoptose des cellules NK en activant l’expression de Fas ligand. Nos résultats nous démontrent que les patients infectés par le VIH ont trois fois plus d’IL-18 que les donneurs sains. Cependant les niveaux d’IL-18BP sont plus bas chez les patients infectés comparés aux donneurs sains. Alors, le ratio IL-18/IL-18BP est augmenté chez les patients infectés, ce qui entraîne une grande quantité d’IL-18 libre et biologiquement active circulante dans leur organisme. Nos études démontrent que chez ces patients, les concentrations d’IL-18 sont en corrélation négative avec l’activité cytotoxique de leurs cellules NK. Nos études in vitro démontrent que le traitement des cellules NK par l’IL-18 induit de façon fratricide leur apoptose en augmentant l’expression de Fas ligand. Finalement, cette production non coordonnée de ces deux facteurs pourrait contribuer à une immunopathologie induite par l’IL-18 en entraînant une apoptose fratricide des cellules NK qui possèdent un rôle important dans la réponse antivirale. Le dérèglement de l’homéostasie des cellules NK pourrait donc contribuer à la pathogenèse induite par le VIH. / HIV-1, the causative agent of AIDS, induces a deregulated production of several immunologically important cytokines in the infected persons. One of these cytokines is IL-18: a powerful proinflammatory cytokine that can regulate both innate and adaptive immune responses. In vivo, its activity is tightly regulated by IL-18 Binding Protein (IL-18BP), another cytokine that specifically binds and neutralizes IL-18 with high affinity. Previous studies have shown that IL-18 concentrations are significantly increased in the circulation of HIV-infected AIDS patients compared to those in healthy people. However, it is not yet clear how the increased levels of this cytokine affect the development of AIDS in HIV infected persons. Furthermore, little is known concerning the production of IL-18 antagonist (IL-18BP) in these patients. These issues were addressed in the studies presented in this thesis. We measured levels of IL-18 and IL-18BP in the sera of HIV-infected patients by using commercial ELISA kits and compared them with the values obtained from a similar number of healthy HIV-seronegative persons. We also determined the absolute and total number of different NK cell subsets and NK cell activity in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of these individuals. Finally we determined the effects of recombinant human IL-18 as well as of IL-18-rich sera from AIDS patients on cytolytic activity and survival of human NK cells. Our results show that sera from HIV- infected patients contain up to 3 fold higher levels of IL-18 compared to the sera from healthy people. However, levels of IL-18BP were lower in the infected individuals compared to the healthy ones. Consequently, IL-18/IL-18BP ratio is increased in the patients resulting in a further increase in the concentrations of biologically active IL-18 in the circulation of these patients. Our results show that the concentrations of IL-18 correlated inversely with NK cell numbers as well as with their cytolytic activity in the infected persons. These results suggested the involvement of IL-18 in the disappearance of NK cells that prompted us to determine the potential cytocidal effects of this cytokine on human NK cells. The results from our in vitro experiments show that recombinant human IL-18 and IL-18-rich sera from AIDS patients caused apoptosis in a human NK cell line as well as in primary human NK cells. Anti-FasL antagonist antibodies inhibited this cell death. In a series of experiments, we found that IL-18 enhances expression of FasL but does not affect the expression of Fas on human NK cells. In vitro IL-18 also stimulated transcription from human FasL promoter. Furthermore, the cytokine also enhanced susceptibility of NK cells to Fas-mediated death, as it decreased the expression of an anti-apoptotic protein Bcl-XL. Our study shows that enhanced IL-18 bioactivity in HIV-infected patients may contribute to the pathogenesis of AIDS by disrupting NK cell homoeostasis.

Le VIH-1 a développé plusieurs mécanismes menant à la dégradation de son récepteur cellulaire, la molécule CD4, dans le but d’augmenter la relâche de particules virales infectieuses et d’éviter que la cellule soit surinfectée. L’un de ces mécanismes est la dégradation, induite par la protéine virale Vpu, du CD4 nouvellement synthétisé au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Vpu doit lier CD4 et recruter l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP, via sa liaison à β-TrCP, afin de dégrader CD4. Puisque CD4 doit être retenu au RE pour permettre à Vpu d’induire sa dégradation via le système ubiquitine-protéasome, il a été suggéré que ce processus implique un mécanisme semblable à une voie cellulaire de dégradation des protéines mal-repliées appelée ERAD (« endoplasmic reticulum-associated degradation »). La dégradation par ERAD implique généralement la dislocation des protéines du RE vers le cytoplasme afin de permettre leur poly-ubiquitination et leur dégradation par le protéasome. Nous avons démontré que Vpu induit la poly-ubiquitination de CD4 dans des cellules humaines. Nos résultats suggèrent aussi que CD4 doit subir une dislocation afin d’être dégradé par le protéasome en présence de Vpu. De plus, un mutant transdominant négatif de l’ATPase p97, qui est impliquée dans la dislocation des substrats ERAD, inhibe complètement la dégradation de CD4 par Vpu. Enfin, nos résultats ont montré que l’ubiquitination sur des résidus accepteurs de l’ubiquitine (lysines) de la queue cytoplasmique de CD4 n’était pas essentielle, mais que la mutation des lysines ralentit le processus de dégradation de CD4. Ce résultat suggère que l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 pourrait représenter un événement important dans le processus de dégradation induit par Vpu. L’attachement de l’ubiquitine a généralement lieu sur les lysines de la protéine ciblée. Toutefois, l’ubiquitination sur des résidus non-lysine (sérine, thréonine et cystéine) a aussi été démontrée. Nous avons démontré que la mutation de tous les sites potentiels d’ubiquitination cytoplasmiques de CD4 (K, C, S et T) inhibe la dégradation par Vpu. De plus, la présence de cystéines dans la queue cytoplasmique apparaît suffisante pour rendre CD4 sensible à Vpu en absence de lysine, sérine et thréonine. Afin d’expliquer ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 serait nécessaire à sa dégradation et où les sites d’ubiquitination de CD4 seraient sélectionnés de façon non spécifique par l’ubiquitine ligase recrutée par Vpu. Enfin, nous avons observé que la co-expression d’une protéine Vpu incapable de recruter β-TrCP (Vpu S52,56/D) semble stabiliser le CD4 qui est retenu au RE. De plus, d’autres mutants de Vpu qui semblent capables de recruter β-TrCP et CD4 sont toutefois incapables d’induire sa dégradation. Ces résultats suggèrent que l’association de Vpu à CD4 et β-TrCP est essentielle mais pas suffisante pour induire la dégradation de CD4. Par conséquent, ces résultats soulèvent la possibilité que Vpu puisse recruter d’autres facteurs cellulaires pour induire la dégradation de CD4. Les résultats présentés ont permis de mieux définir le mécanisme de dégradation de CD4 par Vpu dans des cellules humaines. De plus, ces résultats nous ont permis d’élaborer un modèle dans lequel l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP démontre de la flexibilité dans le choix des résidus à ubiquitiner afin d’induire la dégradation de CD4. Enfin, ces études jettent un oeil nouveau sur le rôle de Vpu dans ce processus puisque nos résultats suggèrent que Vpu doive recruter d’autres partenaires cellulaires, mis à part β-TrCP, pour induire la dégradation de CD4. / HIV-1 has developed many mechanisms leading to the down-regulation of its cellular receptor, the CD4 molecule, in order to increase the release of infectious viral particles and to inhibit superinfection of the target cell. One of these mechanisms is the HIV-1 Vpu-mediated degradation of newly synthesized CD4 at the level of endoplasmic reticulum (ER). Vpu must interact with CD4 and recruit the cellular ubiquitin ligase SCFβ-TrCP, via its binding to β-TrCP, in order to induce CD4 degradation. Because CD4 has to be retained in the ER to allow Vpu to induce its degradation via the ubiquitin-proteasome system, it has been suggested that this process involves a mechanism reminiscent of a cellular degradation pathway involved in the proteolysis of unfolded proteins called ERAD (endoplasmic reticulum-associated degradation). The ERAD degradation usually involves the dislocation of proteins from the ER to the cytoplasm in order to induce their poly-ubiquitination and subsequent degradation by the proteasome. We demonstrated that Vpu induces the poly-ubiquitination of CD4 in human cells. Our results also suggest that CD4 has to be dislocated in order to be degraded by the proteasome in presence of Vpu. Furthermore, the expression of a transdominant negative mutant of the ATPase p97, that is involved in the dislocation of ERAD substrates, inhibits completely the Vpu-mediated CD4 degradation process. Finally, our results demonstrated that the ubiquitination of putative ubiquitin acceptor residues (lysines) in the cytosolic tail of CD4 is not essential but the mutation of these lysines slowed down the process of CD4 degradation induced by Vpu. This results suggests that ubiquitination of CD4 cytosolic tail could represent an important step during Vpu-mediated CD4 degradation. Ubiquitin is usually attached on lysine residues in the targetted protein. However, the ubiquitination on non-lysine residues (S, T and C) has also been demonstrated. We demonstrated that the mutation of all cytosolic potential ubiquitination sites (K, C, S and T) of CD4 abolishes Vpu-mediated degradation. In addition, the presence of cysteines in the cytosolic tail of CD4 appeared sufficient to render CD4 sensitive to Vpu in absence of lysine, serine or threonine. In order to explain these results, we propose a model in which CD4 cytosolic tail ubiquitination is necessary for its degradation and where ubiquitination sites are selected non specifically by the ubiquitin ligase recruited by Vpu. Finally, we observed that co-expression of a phosphorylation mutant of Vpu unable to interact with β-TrCP (Vpu S52,56/D) appears to stabilize ER-retained CD4 molecules. In addition, other Vpu mutants seem able to recruit β-TrCP and CD4 without inducing CD4 degradation. These results suggest that Vpu association with CD4 and β-TrCP is essential but not sufficient for CD4 degradation. Consequently, these results raised the possibility that other cellular factors could be recruited by Vpu in order to induce CD4 degradation. The results presented here allowed us to better define the mechanism underlying Vpu-mediated CD4 degradation. In addition, these results allowed us to elaborate a model in which the ubiquitin ligase SCFβ-TrCP show some flexibility in the choice of ubiquitination sites in order to induce CD4 degradation. Finally, theses studies shed a new light on the role of Vpu in the CD4 degradation process because our results suggest that Vpu could recruit, in addition of β-TrCP, other cellular partners in order to induce CD4 degradation.

Le VPH-16 de même que certains VPH, dont le VPH-18, causent le cancer du col utérin. Son intégration dans le génome humain pourrait être un marqueur de progression de l’infection. Les charges virales totale et intégrée sont présentement mesurées en quantifiant par PCR en temps réel les gènes E6 (RT-E6) et E2 (RT-E2-1) du VPH-16. Nous avons évalué l’impact du polymorphisme du gène E2 sur la quantification de l’ADN du VPH-16 dans des spécimens cliniques. Dans un premier temps, le gène E2 de 135 isolats de VPH-16 (123 appartenaient au clade Européen et 12 à des clades non- Européens) fut séquencé. Ensuite, un test de PCR en temps réel ciblant les séquences conservées dans E2 (RT-E2-2) fut développé et optimisé. Cent trente-neuf spécimens (lavages cervicaux et vaginaux) provenant de 74 participantes (58 séropositives pour le VIH, 16 séronégatives pour le VIH) ont été étudiés avec les trois tests E2 (RT-E2-2), E6 (RT-E6) et E2 (RT-E2-1). Les ratios de la quantité d’ADN de VPH-16 mesuré avec RT-E2-2 et RT-E2-1 dans les isolats Européens (médiane, 1.02; intervalle, 0.64-1.80) et Africains 1 (médiane, 0.80; intervalle, 0.53-1.09) sont similaires (P=0.08). Par contre, les ratios mesurés avec les isolats Africains 2 (médiane, 3.23; intervalle, 1.92-3.49) ou Asiatique- Américains (médiane, 3.78; intervalle, 1.47-37) sont nettement supérieurs à ceux obtenus avec les isolats Européens (P<0.02 pour chaque comparaison). Les distributions des quantités de E2 contenues dans les 139 échantillons mesurées avec RT-E2-2 (médiane, 6150) et RT-E2-1 (médiane, 8960) étaient statistiquement différentes (P<0.0001). Nous avons observé que les charges virales totale (odds ratio (OR) OR, 2.16 95% intervalle de confiance (IC) 1.11-4.19), et épisomale du VPH-16 (OR, 2.14 95% IC 1.09-4.19), mais pas la présence de formes intégrées (OR, 3.72 95% IC 1.03-13.4), sont associées aux néoplasies intraepitheliales cervicales de haut grade (CIN-2,3), et ce, en contrôlant pour des facteurs confondants tels que l’âge, le taux de CD4 sanguin, l’infection au VIH, et le polymorphisme de VPH-16. La proportion des échantillons ayant un ratio E6/E2 > 2 pour les femmes sans lésion intraépithéliale (7 de 35) est similaire à celle des femmes avec CIN-2,3 (5 de 11, p=0.24) ou avec CIN- 1 (4 de14, P=0.65). Le polymorphisme du gène E2 est un facteur qui influence la quantification des charges intégrées de VPH-16. / Episomal and integrated HPV-16 loads are currently estimated by quantitation with real-time PCR of HPV-16 E6 (RT-E6) and E2 (RT-E2-1) DNA. We assessed the impact of HPV-16 E2 polymorphism on quantitation of integrated HPV-16 DNA in clinical specimens. First, HPV-16 E2 was sequenced from 135 isolates (123 from European and 12 from non-European lineages). A novel assay targeting conserved HPV-16 E2 sequences (RT-E2-2) was optimized and applied with RT-E6 and RTE2- 1 on 139 HPV-16-positive cervicovaginal lavages collected from 74 women (58 HIV-seropositive, 16 HIV-seronegative). Ratios of HPV-16 DNA copies measured with RT-E2-2 and RT-E2-1 with European (median, 1.02; range, 0.64-1.80) and African 1 (median, 0.80; range, 0.53-1.09) isolates were similar (P=0.08). Ratios obtained with African 2 (median, 3.23; range, 1.92-3.49) or Asian-American (median, 3.78; range, 1.47-37) isolates were greater than those with European isolates (P<0.02 for each comparison). Distributions of HPV-16 E2 copies measured in 139 samples with RT-E2-2 (median, 6150) and RT-E2-1 (median, 8960) were different (P<0.0001). HPV-16 total (odds ratio (OR) OR, 2.16 95% confidence interval (CI) 1.11-4.19), episomal (OR, 2.14 95% CI 1.09-4.19) but not integrated (OR, 3.72 95% CI 1.03-13.4) load, were associated with high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN-2,3) after controlling for age, CD4 count and HIV, and HPV-16 polymorphism. The proportion of samples with an E6/E2 ratio >2 in women without SIL (7 of 35) was similar to that of women with CIN-2,3 (5 of 11, P=0.24) or CIN-1 (4 of 14, P=0.65). E2 polymorphism was a factor that influenced measures of HPV-16 integrated load.

Le gène L1 encode pour la protéine majeure de la capside des papillomavirus humains (VPH). L’information relative au polymorphisme de L1 pour les types autres que VPH- 16 est jusqu’ici limitée. Cet ouvrage explore le polymorphisme de L1 en comparant les séquences des types phylogénétiquement apparentés VPH-31, -33, -35 à VPH-16. Des spécimens génitaux recueillis de 732 femmes VIH-séropositives et 323 VIHséronégatives ont été criblés à le recherche d’ADN de VPH par PCR consensus au niveau du gène L1. Les échantillons positifs pour VPH-16 (n=74), -31 (n=74), -33 (n=37) et -35 (n=58) étaient analysés par PCR-séquençage pour la totalité du gène L1. Le nombre de nucléotides substitués pour L1 variait de 19 pour VPH-33 à 52 pour VPH-31. Le rapport du nombre de variantes sur le nombre d’isolats testés était plus élevé pour VPH-31 (56.4%, p=0.05) et VPH-35 (60.3%, p=0.04) comparativement à VPH-16 (40.5%), alors que ce ratio était inférieur pour VPH-33 mais sans différence statistiquement significative (24.3%, p=0.14). La distance entre les variantes était plus grande à l’intérieur des cinq boucles présumément exposées à la surface de la protéine L1 que dans la séquence à l’extérieur (p<0.01) Des variations synonymes étaient observées chez 1.7% (95% CI 1.1- 2.3) des nucléotides intra-boucles et 2.4% (95% CI 1.2-3.7) de ceux extra-boucles. Les variations non-synonymes étaient rencontrées pour 1.8% (95% CI 1.1-2.5) des nucléotides intra-boucles et 0.2% (95% CI 0-0.4) pour les nucléotides extra-boucles. Les ratios dN/dS étaient inférieurs à 1.0 pour les régions extra-boucles et encore davantage pour les régions intra-boucles. Ces résultats suggèrent que les séquences des régions hypervariables de L1 ont été sélectionnées positivement. / The L1 gene encodes for the major capsid protein of human papillomaviruses (HPV). There is limited information on the polymorphism of L1 for types related to HPV-16. This report explores the polymorphism of L1 in phylogenetically-related types 31, 33, and 35 compared to HPV-16. Genital specimens collected from 732 HIV-seropositive and 323 HIV-seronegative women were screened for HPV DNA with consensus L1 PCR. Cervical samples positive for HPV-16 (n=74), -31 (n=78), -33 (n=37), and -35 (n=58) were further characterized by PCR-sequencing of the complete L1 gene. The number of nucleotide substitutions within L1 ranged from 19 for HPV-33 to 52 for HPV-31. The ratio of the number of variants/number of isolates tested was higher for HPV31 (56.4%, p=0.05) and HPV-35 (60.3%, p=0.04) compared to HPV-16 (40.5%), while this ratio was lower for HPV-33 (24.3%), although not significantly (p=0.14). The maximal distance between HPV variants was greater in the five putative surface-exposed loops of L1 than in sequences outside the loops (p<0.01). Synonymous variations were encountered in 1.7% (95% CI 1.1-2.3) of nucleotides inside the L1 loops and 2.4% (95% CI 1.2-3.7) of nucleotides outside the L1 loops. Non-synonymous variations were encountered in 1.8% (95% CI 1.1-2.5) of nucleotides within the L1 loops and 0.2% (95% CI 0-0.4) of nucleotides outside the loops. dN/dS ratios were below 1.0 in extra-loop and intra-loop regions, but they were lower in extra-loop regions. These results suggest that sequences within and outside the hypervariable loops of L1 were under selective constraint.

L’adénovirus possède plusieurs caractéristiques faisant de ce virus un candidat de choix pour la construction de vecteurs utiles dans les études de génomique fonctionnelle. Dans la majorité de ces applications, on a recours à un vecteur adénoviral de première génération délété de sa région E1. L’utilisation de vecteurs adénoviraux comprend deux maillons faibles : la construction du vecteur et la production subséquente de ce dernier. Le développement de méthodes alternatives est donc nécessaire pour renforcer ces deux maillons, permettant ainsi une utilisation étendue de ces vecteurs. Ce développement va s’articuler sur deux axes : l’ingénierie du vecteur de transfert pour la construction de l’adénovirus recombinant et l’ingénierie d’une lignée cellulaire pour la production du vecteur. En utilisant un vecteur de transfert adénoviral co-exprimant, à partir d’un promoteur régulable à la tétracycline, la protéase de l’adénovirus et une protéine de fluorescence verte (GFP) par l’intermédiaire d’un site d’entrée ribosomal interne (IRES), notre groupe a établi que la sélection positive, via l’expression ectopique de la protéase, est un processus efficace pour la création de librairie d’adénovirus recombinants. Par contre, la diversité atteinte dans ce premier système est relativement faible, environ 1 adénovirus recombinant par 1 000 cellules. Le travail effectué dans le cadre de cette thèse vise à construire un nouveau transfert de vecteur dans lequel l’expression de la protéase sera indépendante de celle du transgène permettant ainsi d’optimiser l’expression de la protéase. Ce travail d’optimisation a permis de réduire le phénomène de transcomplémentation du virus parental ce qui a fait grimper la diversité à 1 virus recombinant par 75 cellules. Ce système a été mis à l’épreuve en générerant une librairie adénovirale antisens dirigée contre la GFP. La diversité de cette librairie a été suffisante pour sélectionner un antisens réduisant de 75% l’expression de la GFP. L’amplification de ce vecteur adénoviral de première génération doit se faire dans une lignée cellulaire exprimant la région E1 telle que les cellules 293. Par contre, un adénovirus de première génération se répliquant dans les cellules 293 peut échanger, par recombinaison homologue, son transgène avec la région E1 de la cellule créant ainsi un adénovirus recombinant réplicatif (RCA), compromettant ainsi la pureté des stocks. Notre groupe a déjà breveté une lignée cellulaire A549 (BMAdE1) exprimant la région E1, mais qui ne peut pas recombiner avec le transgène du virus. Par contre, le niveau de réplication de l’adénovirus dans les BMAdE1 est sous-optimal, à peine 15-30% du niveau obtenu dans les cellules 293. Le travail fait dans le cadre de cette thèse a permis de mettre en évidence qu’une expression insuffisante d’E1B-55K était responsable de la mauvaise réplication du virus dans les BMAdE1. Nous avons produit de nouveaux clones à partir de la lignée parentale via une transduction avec un vecteur lentiviral exprimant E1B-55K. Nous avons confirmé que certains clones exprimaient une plus grande quantité d’E1B-55K et que ces clones amplifiaient de manière plus efficace un vecteur adénoviral de première génération. Ce clone a par la suite été adapté à la culture en suspension sans sérum. / The adenovirus has numerous interesting characteristics making this particular virus an ideal candidate for the construction of vector for conducting studies in functional genomics. The vast majority of those applications rely on a so-called “first-generation vector” in which the E1 region is replaced by a transgene. Despite all their advantages, there are 2 weak links associated with first-generation vector: the efficient construction of the actual vector and its production. Therefore, the development of alternative methods for construction and production is necessary to ensure their usefulness. The development will involve 2 axes: the reengineering of the transfer vector for the construction of recombinant adenovirus and the reengineering of the cell line capable of producing the vector. Using a transfer vector co-expressing the adenoviral protease (PS) gene and GFP by using an IRES under the control of a tetracycline-regulated promoter, our laboratory previously established the proof of concept that positive selection of recombinant adenovirus through ectopic expression of the PS gene was an efficient approach to generate adenoviral libraries. However, the diversity achieved was quite low, around 1 recombinant adenovirus per 1,000 cells. The goal of this thesis was to design a new transfer vector in which the PS expression was independent from the expression of the transgene in order to be able to optimize its expression independently. We also improved library diversity by lowering the amount of PS in order to reduce the the trans-complementation from the transfer vector. Using this method, at least 1 recombinant adenovirus per 75 cells was generated with 100% of the plaques being recombinant. This system was successfully used to generate an antisense library targeting GFP. The diversity of the library was high enough to allow the selection of an antisense that inhibited 75% of GFP expression. Amplification of those first-generation recombinant adenoviruses must take place in an E1-expressing cell such as 293 cells. However, when replicating in 293 cells, the recombinant adenovirus can exchange their transgene with the E1 region of the cell by homologous recombination, which results in the generation of a fully replicative adenovirus (RCA), a situation that compromises the purity of the viral preparation. Our laboratory has previously patented an A549 cell line expressing the E1 region and producing RCA-free recombinant adenovirus (BMAdE1). However, the replication of E1-deleted adenovirus in BMAdE1 cells was sub-optimal, in the range of 15-30% the level obtained in 293 cells. The work done in this thesis establishes that the low level of E1B-55K could be responsible for the lower productivity of BMAdE1 cells. Thus, we have derived new clones following lentiviral transduction in order to increase E1B-55K expression. Western blot confirmed that some clones expressed more E1B-55K than BMAdE1, and this correlated with a more robust replication of a recombinant adenovirus in those clones. This newly optimized BMAdE1 cell line was adapted to serum-free suspension culture.

L'hépatite C pose un problème de santé publique majeur, dans la mesure où le risque de développer une infection chronique est relativement élevé (40 à 60%) et où la résistance au traitement de choix - l’interféron alpha pégylé et la ribavirine - touche près de la moitié des patients. Cette persistence virale repose avant tout sur de puissantes stratégies d’évasion du système immunitaire inné de l’hôte par le virus. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de la réponse antivirale dans des hépatocytes primaires humains normaux et chroniquement infectés avec le VHC, un domaine encore largement inconnu dû à la difficulté d’obtenir ce type de matériel primaire. Nous avons étudié la fonctionnalité de deux voies majeures de détection des pathogènes viraux suite à l’exposition d’hépatocytes primaires humains à de l’ARNdb intracellulaire, via le récepteur et adaptateur RIG-I/MDA5-CARDIF, et extracellulaire via TLR3-TRIF, mimant ainsi les étapes précoces de la détection d’un virus par la cellule hôte. Nous avons établi par RT-PCR quantitatif et analyse transcriptomique par microarray, que ces deux voies de stimulation sont fonctionnelles dans des hépatocytes primaires normaux et que leur activation entraîne à la fois l’expression de gènes antiviraux communs (ISG56, ISG15, CXCL10, …) mais aussi spécifiques avec les gènes IL28A, IL28B et IL29 qui sont une signature de l’activation de la voie de détection de l’ARNdb intracellulaire. La protéine virale NS3/4A joue un rôle majeur à la fois dans le clivage de la polyprotéine virale initiale, mais aussi en interférant avec les cascades de signalisation engagées suite à la détection par la cellule hôte de l’ARN du VHC. Plus particulièrement, nous avons démontré que l’expression ectopique de NS3/4A dans des hépatocytes primaires humains normaux entraîne une diminution significative de l’induction des gènes antiviraux dûe au clivage de CARDIF au cours de l’activation de la voie de signalisation médiée par RIG-I. Nous avons également démontré que l’expression de la NS3/4A entraîne des modifications de l’expression de gènes-clé impliqués dans la régulation de l’apoptose et du programme de mort cellulaire, en particulier lorsque la voie TLR3 est induite. L’ensemble de ces effets sont abolis en présence de BILN2061, inhibiteur spécifique de NS3/4A. Malgré les stratégies de subversion de l’immunité innée par le VHC, nous avons démontré l’induction significative de plusieurs ISGs et chemokines dans des hepatocytes primaires provenant de patients chroniquement infectés avec le VHC, sans toutefois détecter d’interférons de type I, III ou certains gènes antiviraux précoces comme CCL5. Ces observations, concomitantes avec une diminution de l’expression de CARDIF et une correlation inverse entre les niveaux d’ARNm des ISGs et l’ARN viral révèlent une réponse antivirale partielle dûe à des mécanismes interférents sous-jacents. Cette réponse antivirale détectable mais inefficace est à mettre en lien avec l’échec du traitement classique PEG-IFN-ribavirine chez la moitié des patients traités, mais aussi en lien avec l’inflammation chronique et les dommages hépatiques qui mènent ultimement au développement d’une fibrose puis d’une cirrhose chez une grande proportion de patients chroniquement infectés. / Hepatitis C infection is a worldwide health problem since the risk to develop a persistent infection is relatively elevated (40 to 60%) and nearly half of the infected patients do not respond to the classical anti-HCV therapy based on a combination of PEG-IFNα and ribavirin. Viral persistence is based on powerful evasion strategies of the host’s innate immune system. In our study, we characterized antiviral response in primary human normal and chronically HCV-infected hepatocytes, a cutting-edge in our field due to the difficulty to isolate this particular cell type. In order to better define the antiviral response in freshly isolated human primary hepatocytes, we stimulated these cells with extracellular and intracellular dsRNA to trigger TLR3/TRIF and RIG-I-MDA5/CARDIF-mediated antiviral signaling pathways. By using qRT-PCR and microarray analysis, we report that both detection pathways are functional in normal human hepatocytes, their activation leading to the expression of both common (IFIT1, OASL, ISG15 and CXCL10) and specific genes (IL28A, IL28B and IL29), these last ones being a signature of the intracellular dsRNA-mediated pathway. HCV NS3/4A plays a key role in the viral polyprotein processing and upon viral RNA detection by interfering with the host’s antiviral signalling cascades. We report that major antiviral genes induction following activation of RIG-I mediated pathway are severely impaired in ectopically NS3/4A expressing normal hepatocytes due to CARDIF cleavage, but can be restored by specific NS3/4A inhibitor BILN2061. Our microarray analysis also revealed a role for NS3/4A following TRL3-mediated pathway activation on regulation of apoptosis and programmed cell death, which could be linked to strategies for the virus to persist in its host. Despite HCV strategies to circumvent the host’s immune defense system, we observed significant upregulation of ISGs and chemokines in liver biopsies and corresponding isolated hepatocytes from chronically HCV-infected patients. However, no type I and III interferon, neither key-antiviral genes (e.g., CCL5) were detected, underlying an ongoing –but inefficient- antiviral response unable to eradicate the virus. Moreover, we obtained significant inverse correlations between ISGs mRNAs and viral RNA in addition to CARDIF decrease, clearly unravelling efficient viral interfering strategies in a context of chronic HCV infection. This sustained -albeit incomplete- hepatic innate immune response is certainly associated to the failure of the classical IFN-based therapy in half of the infected patients and to the chronic inflammation causing liver damages and eventually leading to hepatocarcinoma which is often observed at late stage of the disease.

Les virus exploitent la machinerie cellulaire de l’hôte de façon très variée et plusieurs types vont même jusqu’à incorporer certaines protéines cellulaires. Nous avons récemment effectué la première analyse protéomique du virion mature de l’Herpès simplex de type 1 (HSV-1), ce qui nous a permis de déterminer que jusqu’à 49 protéines cellulaires différentes se retrouvaient dans ce virus (Loret, S. et al. (2008). "Comprehensive characterization of extracellular herpes simplex virus type 1 virions." J Virol 82(17): 8605-18.). Afin de déterminer leur importance dans le cycle de réplication d’HSV-1, nous avons mis au point un système de criblage nous permettant de quantifier le virus produit et relâché dans le milieu extracellulaire en utilisant un virus marqué à la GFP ainsi que des petits ARN interférents (pARNi) ciblant spécifiquement ces protéines cellulaires. Cette approche nous a permis de démontrer que 17 des protéines identifiées précédemment jouaient un rôle critique dans la réplication d’HSV-1, suggérant ainsi que leur incorporation dans le virus n’est pas aléatoire. Nous avons ensuite examiné le rôle d’une de ces protéines, DDX3X (DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, X-linked), une protéine multifonctionnelle connue pour son implication dans les cycles de réplication de plusieurs virus humains. À l’aide de pARNi ainsi que de différentes lignées cellulaires, dont une lignée DDX3X thermosensible, nous avons démontré que l’inhibition de DDX3X résultait en une diminution du nombre de capsides intracellulaires et induisait une importante diminution de l’expression des gènes viraux. Nous avons aussi démontré que la fraction de DDX3X incorporée dans le virion contribuait activement au cycle infectieux d’HSV-1. Ces résultats confirment l’intérêt de notre approche afin d’étudier les interactions hôte-pathogène en plus de démontrer la contribution des protéines cellulaires incorporées à HSV-1 dans l’infection virale. / Viruses exploit the cellular machineries in many ways and several viruses specifically incorporate host proteins. To understand their biological relevance, we recently performed the first comprehensive characterization of the mature herpes simplex virus type 1 (HSV-1) in which up to 49 distinct cellular proteins were identified by mass spectrometry. In the present study, we sought to identify which of these cellular factors are critical for the HSV-1 life cycle. To this end, we performed a functional screen using small interfering RNA (siRNA) and a GFP-tagged virus, which indicated that at least 17 of the virion-incorporated host proteins alter HSV-1 proliferation in cell culture. Interestingly, these include several Rab GTPases and other intracellular transport components as well as proteins involved in signal transduction, gene regulation and immunity. Among them, the DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, X-linked protein (DDX3X) is a multifunctional molecule previously linked to several other viruses. Its relevance for HSV-1 was further confirmed with different siRNA reagents and cell lines, including a DDX3X thermosensitive cell line. We found that DDX3X inactivation reduced intracellular capsid abundance via a strong inhibition of viral gene expression. We also report evidence that the pool of DDX3X present in the mature virions actively contributes to HSV-1 life cycle. Altogether, this highlights a powerful and biologically relevant approach to characterize host-pathogen interactions and points to the important contribution host proteins within mature viral particles.

La primo-infection est un moment critique de l'établissement du réservoir justifiant de l'initiation d'un traitement précoce. Nous avons initié un essai randomisé évaluant l'impact de deux ans d'un traitement antirétroviral intense (essai ANRS147 OPTIPRIM, trithérapie versus pentathérapie) sur le réservoir et avons initié des études physiopathologiques au cours de cet essai. Nous montrons ainsi la faible diversité génétique des virus en primo-infection dans les compartiments sanguins et rectaux. Le réservoir s'établit dès le premier mois de l'infection par diffusion d'un cluster viral homogène au sein des lymphocytaires T CD4 naïfs (TN) et mémoires centrales (TCM), transitionnelles (TTM), effectrices (TEM) quiescents. Il en résulte une perturbation de l'homéostasie lymphocytaire associée à une faible contribution au réservoir des cellules peu différenciées à longue demi-vie, TN et TCM. Par ailleurs nous montrons que la majorité des patients au moment de leur primo-infection n'ont pas la capacité de développer des réponses T CD8 à même de supprimer la réplication virale comme chez les patients HIV Controllers. Après deux ans de traitement, nous observons que la diversité virale n'a pas évolué, par contre la taille du réservoir est fortement réduite. Les anomalies de l'homéostasie lymphocytaire T CD4 persistent, par contre le traitement très précoce a permis de protéger les TN et TCM. Il n'y a pas de bénéfice additionnel d'une pentathérapie mais nous avons validé le concept qu'un traitement précoce permet d'induire un contrôle virologique au long cours après arrêt de traitement. Nos résultats indiquent qu'un traitement plus long que deux ans permettrait de renforcer la diminution du réservoir. Ces résultats seront à prendre en compte pour l'élaboration de futurs essais en primo-infection visant à réduire le réservoir pour une rémission au long cours.