Hepatitis B Virus (HBV) Infektionen verursachen entzündliche Erkrankungen der Leber. Insbesondere die frühen Phasen des HBV Lebenszyklus sind noch nicht geklärt, so ist z.B. der Rezeptorkomplex an den HBV bindet unbekannt. Mittlerweile stehen neue Infektionsmodelle zur Verfügung um den HBV Lebenszyklus zu untersuchen. Dies erfordert eine effiziente Zellkultur basierende Methode um große Mengen infektiöser Partikel zu generieren. Ein Ziel der Arbeit war durch Kultivierung auf Mikrocarrier die HBV Produktion der Zelllinie HepG2.2.15 zu steigern. Die Analyse von Protein und HBV Sekretion, Infektiösität und MAP Signalübertragung ergab eine 18x höhere HBV Produktion bei einer reduzierten Sekretion von subviralen Partikeln durch HepG2.2.15 die auf Mikrocarrier kultiviert wurden. Der Anstieg der Virusproduktion korreliert mit einer verstärkten Aktivierung der MAP Kinase ERK-2, die mit HBV Replikation in Verbindung steht. Ein weiterer wenig verstandener Teil des HBV Lebenszyklus ist der Kernimport des HBV Genoms. Spuren der viralen Polymerase finden sich im Zellkern von HBV infizierten Zellen. Ziel der Arbeit war, Motive in der HBV Polymerase zu finden, die in der Lage sind Zelllokalisation zu beeinflussen. Durch Sequenzvergleich wurde eine konservierte zweiseitige Kernlokalisationssequenz im Terminalen Protein der HBV Polymerase identifiziert, die eine Proteinkinase CKII Erkennungsstelle enthält. Inhibition der CKII Aktivität in HBV infizierten primären Hepatozyten sowie die Zerstörung der CKII Erkennungsstelle im Terminalen Protein inhibieren die HBV Replikation. Die Funktionalität der Kernlokalisationssequenz wurde durch Fusion an GFP bestätigt und war Abhängig von CKII Aktivität in der Zelle. Dies wurde in vitro durch Bindung des Adapterproteins Karyopherin-alpha an CKII-phosphoryliertes Terminales Protein bestätigt. Die HBV Polymerase enthält eine konservierte zweiseitige Kernlokalisationssequenz deren Funktionalität durch CKII Phosphorilierung vermittelt wird. / Hepatitis B virus (HBV) infection causes acute and chronic liver inflammation. Especially the early phase of the HBV life cycle is not clearly understood. For example the receptor complex that mediates viral entry is not known. Novel infection models to study the HBV lifecycle are described that demand for a large amount of cell culture generated infectious HBV particles. One aim was to enhance HBV production of the cell line HepG2.2.15 by cultivation on microcarrier substrate. Analysis of protein and viral particle secretion, infectivity, and cellular MAP kinase signaling revealed an up to 18x increased HBV production and a decreased subviral particle secretion by HepG2.2.15 when cultivated on microcarrier. The observed effect was due to an enhanced phospho-activation of MAP kinase ERK-2 that is tightly associated with HBV replication. Another poorly understood part of the HBV lifecycle is the mechanism that delivers the HBV genome into the nucleus. Traces of HBV polymerase can be found in HBV infected cells. The second objective was to identify motifs on the HBV polymerase that determine its subcellular localization. By sequence alignment a conserved bipartite nuclear localization signal was found in the terminal protein of the HBV polymerase encompassing a protein kinase CKII recognition site. Inhibition of CKII kinase in infected primary hepatocytes and destruction of the identified CKII recognition site in the viral polymerase impaired virus production. The functionality of the putative nuclear localization signal was confirmed by fusion to GFP. Moreover, its functionality was depended on CKII activity that was verified by in vitro binding experiments of terminal protein to the import adaptor karyopherin-alpha. This data identified a nuclear localization signal in the HBV polymerase, which functionality is mediated by CKII phosphorylation.

What explains the geographic distribution of pathogens? Better understanding and characterising disease patterns will help scientists to identify areas likely to host future epidemics and epizootics and to prioritise surveillance and intervention. However, the use of disease surveillance data to assess the risk of transmission and generate risk maps raises conceptual and methodological issues. Indeed, pathogens and more particularly viruses aren't ”species” like others that live in the open environment and must be studied with methods and concepts of their own. Avian influenza (AI), a disease caused by a virus infecting bird populations, has been selected to study these issues. AI has a major economic impact on the poultry industry in many countries, raises concerns of livelihood in low and middle-income countries, and represents a major concern for human health. The aim of this PhD thesis was to improve the knowledge on the spatial epidemiology of AI in different settings and conditions (i). For this, recent epizootics caused by the subtypes A (H5N1) and A (H7N9) were selected as case studies. First, highly pathogenic subtypes of the A (H5N1) virus have been studied in poultry farms (ducks and chickens) at different spatial scales: at the continental scale and the regional scale in the Mekong (Cambodia, Laos, Vietnam, Thailand) and the Nile Delta in Egypt. All these cases occurred between 2003, the date on which the virus starts to spread outside China, and 2015; the HPAI A (H5N1) subtypes are still reported today in many countries. Human infections caused by the A (H7N9) virus in China from March 2013 to 2017 were also studied. Studied different AI subtypes at different spatial scales within different host species also allowed to develop a conceptual model of AI transmission and to discuss the issue of the transferability of results in epidemiology (ii). Lastly, this PhD thesis leads to a discussion about the transfer of methods and concepts from ecology to spatial epidemiology, with a particular emphasis on their possible limitations (iii). / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

No description available.

No description available.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est responsable de la pandémie du SIDA (syndrome de l’immunodéficience acquise). Des souches virales résistantes aux antirétroviraux actuellement utilisés apparaissent rapidement. Il est donc important d’identifier de nouvelles cibles dans le cycle de réplication du VIH-1 pour développer de nouveaux agents contre ce virus. La traduction des protéines de structure et des enzymes du VIH-1 est une étape essentielle du cycle de réplication virale. Ces protéines sont exprimées à partir de l’ARN messager (ARNm) pleine-longueur (ARNmPL) à la fin du cycle de réplication. L’ARNmPL du VIH-1 peut utiliser un mode d’initiation de la traduction coiffe-dépendant, comme la majorité des ARNm cellulaires, mais peut aussi utiliser un mode d’initiation alternatif, car sa région 5’ non-traduite (5’UTR) contient un site interne d’entrée du ribosome (IRES), ce qui lui permet d’initier la traduction suivant un mode IRES-dépendant. L’initiation IRES-dépendante permet à l’ARNmPL d’être traduit quand l’initiation coiffe-dépendante est inhibée. L’activité de l’IRES de la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1 (IRES5’UTR) est faible dans des conditions physiologiques, mais est stimulée lorsque la cellule est arrêtée à la transition G2/M du cycle cellulaire, un arrêt qu’induit l’infection par le VIH-1. Une grande portion de l’IRES5’UTR, que nous nommons IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux et a une activité semblable à celle de l’ IRES5’UTR, ce qui indique que le mode IRES-dépendant peut être utilisé par tous les messagers du VIH-1. Lors de mes études doctorales, j’ai caractérisé le fonctionnement de l’IRES5’UTR du VIH-1. J’ai transfecté des cellules lymphocytaires Jurkat T, dérivées des cibles naturelles du VIH-1, avec un vecteur dual-luciférase contenant les séquences codantes des luciférases de la Renilla (Rluc) et de la luciole (Fluc) séparées par la région 5’UTR de l’ARNmPL du VIH-1. La traduction de la Rluc est coiffe-dépendante alors que celle de la Fluc dépend de l’IRES5’UTR. J’ai d’abord effectué une analyse mutationnelle et j’ai identifié trois régions qui stimulent l’activité de l’IRES5’UTR et une tige-boucle qui réprime l’activité de cet IRES, que j’ai nommée IRENE (IRES negative element). J’ai montré que l’effet répresseur d’IRENE est aboli lorsque les cellules sont soumises à un stress oxydatif, un type de stress induit lors d’une infection par le VIH-1. Nous proposons que IRENE maintiendrait l’IRES5’UTR dans une conformation peu active dans des conditions physiologiques. On sait que les IRES sont activés par divers facteurs cellulaires, appelés ITAF (IRES trans-acting factors). Nous proposons que l’IRES5’UTR adopterait une conformation active suite à la liaison d’un ITAF exprimé ou relocalisé lors d’un stress oxydatif. Ces travaux ont fait l’objet d’une publication (Gendron et al., 2011, Nucleic Acids Research, 39, 902-912). J’ai ensuite étudié l’effet de la protéine virale Tat sur l’activité de l’IRES5’UTR. En plus de son rôle essentiel dans la transactivation de la transcription des ARNm viraux, Tat stimule leur traduction coiffe-dépendante, en empêchant l’inhibition d’un facteur d’initiation canonique, eIF2, induite par la protéine kinase modulée par l’ARN double-brin (PKR) et en déroulant la structure TAR présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm du VIH-1. Elle affecte aussi l’expression de plusieurs gènes cellulaires. J’ai montré que les isoformes Tat86 et Tat72, mais non Tat101, stimulent l’activité de l’IRES5’UTR. Cet effet est indépendant de PKR et de TAR, mais dépendrait de la conformation de Tat. Nous proposons que Tat activerait un facteur de transcription cellulaire qui déclenche l’expression d’un ITAF de l’IRES5’UTR ou encore qu’elle activerait directement un tel ITAF. J’ai de plus montré que PKR stimule l’activité de l’IRES5’UTR, ce qui est surprenant puisque PKR est une protéine antivirale. Cet effet est indépendant de l’inhibition d’eIF2 par PKR et pourrait résulter de l’activation d’un ITAF. Sachant qu’une portion active de l’IRES5’UTR, IRES5’UTRc, est présente dans tous les ARNm viraux, notre hypothèse est que la stimulation de cet IRES par PKR permettait de traduire l’ARNm de Tat au début du cycle de réplication, ce qui permettrait ensuite la traduction coiffe-dépendante des ARNm du VIH-1, qui est stimulée par Tat. Ces travaux font l’objet d’un manuscrit (Gendron et al., soumis à RNA). Mes résultats, couplés aux données de la littérature, me conduisent à la conclusion que, à la fin du cycle de réplication du VIH-1, l’activité de l’IRES5’UTR est stimulée par le stress oxydatif, l’arrêt en G2/M et la présence de quantités élevées de Tat, alors que la traduction coiffe-dépendante est compromise. L’initiation IRES-dépendante serait alors indispensable pour que le VIH-1 traduise l’ARNmPL. L’IRES5’UTR constituerait donc une cible très intéressante pour développer des agents anti-VIH. / The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is the causative agent of AIDS (acquired immunodeficiency syndrome). Viral strains that are resistant to antiretroviral agents used for the treatment of HIV-1 infected patients rapidly emerge. It is thus important to study the viral replication cycle in order to discover new targets for the development of novel agents against HIV-1. Translation of structural proteins and viral enzymes is a key step of the viral replication cycle. These proteins are translated from the HIV-1 full-length mRNA during late stages of the replication. This mRNA can be translated by a cap-dependent mode which is used by the majority of cellular mRNAs. However, since its 5’ untranslated region (5’UTR) contains an internal ribosome entry site (IRES) that we call IRES5’UTR, it can also be translated by an IRES-dependent mode. The IRES-dependent mode enables the full-length mRNA to be translated when the cap-dependent mode is impaired. The activity of the IRES5’UTR is weak in physiological conditions, but it is stimulated when the cell cycle is arrested at the G2/M transition, an arrest induced by HIV-1 infection. A large portion of this IRES, which we name IRES5’UTRc, is present in all HIV-1 mRNAs and its activity is similar to the activity of the complete IRES, which indicates that the IRES-dependent mode can be used by all HIV-1 mRNAs. During my doctoral studies, I investigated how the HIV-1 IRES5’UTR functions. I transfected Jurkat T cells, a lymphocytic cell line derived from the natural target cells of HIV-1, with a dual-luciferase reporter containing the coding sequences of the Renilla luciferase (Rluc) and the firefly luciferase (Fluc) separated by the complete 5’UTR of the HIV-1 full-length mRNA. Translation of Rluc is cap-dependent while translation of Fluc depends on HIV-1 IRES5’UTR. First, I performed a mutational analysis and I discovered three regions that stimulate the activity of IRES5’UTR and a stem-loop that represses its activity, which we named IRENE (IRES negative element). I showed that the repression induced by IRENE is relieved when cells are exposed to oxidative stress, a type of stress caused by HIV-1 infection. We propose that IRENE maintains the IRES5’UTR in a weakly active conformation in physiological conditions. It is known that IRESes are activated by cellular factors, called ITAFs (IRES trans-acting factors). We propose that the IRES5’UTR adopts an active conformation triggered by the binding of an ITAF that is expressed or relocalized during oxidative stress. These results generated a publication (Gendron et al. Nucleic Acids Research, 2011, 39, 902-912). I then decided to study the effect of the viral protein Tat on the IRES5’UTR activity. In addition to its essential role in the transcription of HIV-1 mRNAs, Tat stimulates the cap-dependent translation of HIV-1 mRNAs by interfering with the inhibition of a canonical initiation factor, eIF2, induced by the protein kinase modulated by double-stranded RNA (PKR) and by unwinding the TAR structure present at the 5’end of all HIV-1 mRNAs. Tat also affects the expression of several cellular genes. I showed that the Tat86 and Tat72 isoforms, but not Tat101, stimulate the activity of the IRES5’UTR. This effect is independent of PKR and TAR, but appears to be dependent upon the conformation of Tat. We suggest that Tat could activate a transcription factor that controls the expression of an ITAF of the IRES5’UTR or else that Tat could directly activate such an ITAF. I also showed that PKR stimulates the IRES5’UTR activity, which is surprising since PKR is an antiviral protein. This effect is independent of the inhibition of eIF2 by PKR and could result from the activation of an ITAF. Knowing that IRES5’UTRc, an active portion of IRES5’UTR is present in all HIV-1 RNAs, our hypothesis is that the stimulation of the IRES activity by PKR would allow Tat mRNA to be translated in the beginning of the replication cycle. This would subsequently allow the cap-dependent translation of HIV-1 mRNAs to proceed, which is stimulated by Tat. These results generated a manuscript that is submitted for publication to RNA. Altogether, my results, coupled to data from literature, lead me to conclude that, in the late phases of the replication cycle, the activity of the HIV-1 IRES5’UTR is stimulated by oxidative stress, by the cell cycle arrest in G2/M and by the presence of high amounts of Tat, while cap-dependent translation is impaired. The IRES5’UTR would thus be critical to translate the HIV-1 full-length mRNA. Consequently, the IRES5’UTR would constitute a very interesting target for the development of novel anti-HIV agents.

Pour compléter leur cycle de vie, les virus interagissent avec de nombreux facteurs de la cellule-hôte. Le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1) ne fait pas exception. Une récente étude protéomique du virus effectuée par notre laboratoire a permis d’identifier 49protéines cellulaires potentiellement incorporées dans les virions matures d’HSV-1 [1]. Étant donné que certaines de ces protéines peuvent jouer des rôles importants au cours du cycle de vie du virus, elles constituent des cibles de choix pour identifier et caractériser de nouvelles interactions hôte-pathogène dans le contexte d’HSV-1. D’ailleurs le laboratoire a été effectué un criblage aux petits ARN d’interférence qui a démontré qu'au moins 15 des protéines incorporées sont impliqués dans le cycle de réplication de HSV-1 en culture cellulaire (Annexe 1). Des nombreuses études rapportent l'incorporation des protéines de l'hôte dans les virions matures mais très peu abordent l'importance de la fraction des protéines cellulaires incorporée dans les virions pour le cycle virale. Pour vérifier ça, nous avons déplété ces protéines des virions matures extracellulaires en utilisant des petits ARN d’interférence. Par la suite, nous avons utilisé ces virus déplétés pour réinfecter des cellules déplétées ou normales. Cette méthode nous a permis d'identifier pour la première fois 8 protéines (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A, Rab10 et 14-3-3ζ) dont l'absence dans les virions réduit la production virale d'au moins 50%. Pour mieux comprendre à quelle étape du cycle viral ces protéines sont nécessaires, nous avons aussi quantifié les virus intracellulaires, produits des cellules déplétées individuellement des quinze protéines cellulaires. Ainsi, nous avons trouvé que dans nos conditions 7 de ces 8 protéines cellulaires (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A et Rab10) semblent impliquées dans la production des virus intracellulaires, ce qui nous a stimulés à débuter une série de tests plus approfondis de l’entrée d’HSV-1. Les résultats préliminaires, démontrent l’implication dans l’entrée d’HSV-1 d’au moins 3 à 4 de ces protéines (HSPA8, KRT10, Rab5A et Rab10). / To complete their life cycle viruses interact with many factors of the host cell. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is no exception. A recent proteomic study of the virus carried by our laboratory has identified up to 49 cellular proteins potentially incorporated into the mature virions of HSV-1[1]. Since some of these proteins may play important roles during the viral life cycle, they are interesting targets for identification and characterization of new host-pathogen interactions in the context of HSV-1. To target the proteins that are relevant to the viral life cycle of Herpes, the laboratory performed a screening with small interfering RNAs (siRNAs), which showed that at least 15 incorporated proteins are involved in the replication cycle of HSV- 1 in cell culture (Appendix 1). Numerous studies report the incorporation of host proteins in mature virions but few addresses the importance for the viral infectivity of the fractions of cellular proteins incorporated into the virions. To verify this, we depleted these proteins from the mature extracellular virions using siRNAs. Subsequently, we used these viruses to re-infect depleted or normal cells. This method allowed us to identify for the first time eight proteins (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A, Rab10 and 14-3-3ζ) whose absence in virions reduced viral production by at least 50%. As part of understanding at what stage of the life cycle these proteins are necessary for HSV-1, we tested the infectivity of intracellular depleted viruses. Thus, we found at least seven cellular proteins (DDX3X, HSPA8, KRT10, MIF, Rab5A, Rab6A and Rab10) to have a pronounced effect on the replication of herpes virus, which has stimulated us to begin a series of more in-depth tests of the entry of HSV-1. Preliminary results demonstrate the involvement in the entry of HSV-1 of at least three to four proteins (HSPA8, KRT10, Rab5A and Rab10).

Les papillomavirus humains (VPHs) sont reconnus comme les agents étiologiques du cancer du col de l’utérus. Notre étude a pour but de décrire le polymorphisme de la région régulatrice virale (LCR) et du gène E6 du VPH52 chez 216 femmes canadiennes avec différents grades de lésion du col et d’établir s’il existe une association entre les variantes décrites et la présence de lésions intraépithéliales de haut-grade (CIN2,3) du col de l’utérus ou de cancer invasif. L’âge (OR 1.1, 95% CI 1.02-1.17, p=0.005) fut significativement associé à la présence de cancer invasif. Une variante de la région régulatrice virale, MTL-52-LCR-02, présentant une substitution nucléotidique au niveau du nucléotide 7436, fut aussi associée à la présence de cancer du col de l’utérus (p=0.015). Dans une analyse multivariée, après ajustement pour l’âge, l’ethnicité et le site de recrutement, une délétion au niveau du nucléotide 7695 (OR 5.7, 95% CI 1.2-27.9) ainsi qu’une substitution au niveau du nucléotide 7744 (OR 8.3, 95% CI 1.1-61.0) du LCR, et la variante K93R de la protéine E6 (OR 9.5, 95% CI 1.3-68.9) furent associées de façon significative avec la présence de CIN2,3. Ainsi, le polymorphisme du LCR et du gène E6 du VPH52 est associé avec la présence de CIN2,3 et probablement avec celle d’un cancer invasif. / Human papillomaviruses (HPVs) are the main etiological agents of cervical cancer. Our study aims to describe HPV52 polymorphism in the long control region (LCR) and in the E6 gene, and to investigate the association between LCR and E6 polymorphism and high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN2,3) or invasive cervical cancer in 216 canadian women with various grades of cervical disease. Age was significantly associated with cervical cancer (OR 1.1, 95% CI 1.02-1.17, p=0.005). The MTL-52-LCR-02 variant, with a nucleotide substitution in the LCR at position 7436, was also associated with cervical cancer. MTL-52-LCR-02 has been identified in 28.6% of women with cervical cancer and in 0.0% of women without cervical cancer or CIN2,3 (p=0.015). In a multivariate analysis, after adjusting for age, ethnicity, detection of HPV16 or 18, and study site, a deletion at nucleotide position 7695 (OR 5.7, 95% CI 1.2-27.9), a variation at nucleotide position 7744 (OR 8.3, 95% CI 1.-61.0) in the LCR and the K93R variant of the protein E6 (OR 9.5, 95% CI 1.3-68.9) were associated with CIN2,3. This study confirms that HPV52 polymorphism in the LCR and in the E6 gene is associated with risk of development of CIN2,3 and possibly invasive cancer of the uterine cervix.

Les papillomavirus sont des virus à ADN qui infectent la peau et les muqueuses. Ils causent des verrues et peuvent aussi mener au développement de cancers, dont le cancer du col de l’utérus. La réplication de leur génome nécessite deux protéines virales : l’hélicase E1 et le facteur de transcription E2, qui recrute E1 à l’origine de réplication virale. Pour faciliter l’étude de la réplication du génome viral, un essai quantitatif et à haut débit basé sur l’expression de la luciférase a été développé. Parallèlement, un domaine de transactivation a été identifié dans la région régulatrice N-terminale de la protéine E1. La caractérisation de ce domaine a montré que son intégrité est importante pour la réplication de l’ADN. Cette étude suggère que le domaine de transactivation de E1 est une région protéique intrinsèquement désordonnée qui permet la régulation de la réplication du génome viral par son interaction avec diverses protéines. / Papillomaviruses are small DNA viruses that infect skin and mucosa. They cause warts and can also lead to the development of cancers, including cervical cancer. Replication of their genome requires two viral proteins: the E1 helicase and the E2 transcription factor, which recruits E1 to the viral origin of replication. To facilitate the study of viral genome replication, a quantitative and high-throughput assay based on luciferase expression has been developed. In parallel, a transactivation domain has been identified in the N-terminal regulatory region of the E1 protein. Characterization of this domain showed that its integrity is important for DNA replication. This study suggests that the E1 transactivation domain is an intrinsically unstructured protein region that allows regulation of viral genome replication by its interaction with diverse proteins.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), l’agent étiologique du SIDA, est un rétrovirus complexe arborant plusieurs protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr, et Vpu. Celles-ci sont impliquées dans la modulation de la réplication virale, dans l’évasion immunitaire et dans la progression de la pathogenèse du SIDA. Dans ce contexte, il a été démontré que la protéine virale R (Vpr) induit un arrêt de cycle cellulaire en phase G2. Le mécanisme par lequel Vpr exerce cette fonction est l’activation, ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-dépendante, du point de contrôle de dommage à l’ADN, mais les facteurs et mécanismes moléculaires directement impliqués dans cette activité demeurent inconnus. Afin d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec Vpr, nous avons utilisé une purification d’affinité en tandem (TAP) pour isoler des complexes protéiques natifs contenant Vpr. Nous avons découvert que Vpr s’associait avec CRL4A(VprBP), un complexe cellulaire d’E3 ubiquitine ligase, comprenant les protéines Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) et VprBP (Vpr-binding protein). Nos études ont mis en évidence que le recrutement de la E3 ligase par Vpr était nécessaire mais non suffisant pour l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2, suggérant ainsi que des événements additionnels seraient impliqués dans ce processus. À cet égard, nous apportons des preuves directes que Vpr détourne les fonctions de CRL4A(VprBP) pour induire la polyubiquitination de type K48 et la dégradation protéosomale de protéines cellulaires encore inconnues. Ces événements d’ubiquitination induits par Vpr ont été démontrés comme étant nécessaire à l’activation d’ATR. Finalement, nous montrons que Vpr forme des foyers ancrés à la chromatine co-localisant avec VprBP ainsi qu’avec des facteurs impliqués dans la réparation de l’ADN. La formation de ces foyers représente un événement essentiel et précoce dans l’induction de l’arrêt de cycle cellulaire en G2. Enfin, nous démontrons que Vpr est capable de recruter CRL4A(VprBP) au niveau de la chromatine et nous apportons des preuves indiquant que le substrat inconnu ciblé par Vpr est une protéine associée à la chromatine. Globalement, nos résultats révèlent certains des ménanismes par lesquels Vpr induit des perturbations du cycle cellulaire. En outre, cette étude contribue à notre compréhension de la modulation du système ubiquitine-protéasome par le VIH-1 et son implication fonctionnelle dans la manipulation de l’environnement cellulaire de l’hôte. / Human immunodeficiency virus 1 (HIV-1), the etiologic agent of AIDS, is a complex retrovirus with several accessory proteins. HIV-1 accessory proteins Nef, Vif, Vpr, and Vpu have been implicated in the modulation of viral replication, enhancement of viral fitness, immune evasion, and progression of AIDS pathogenesis. In that regard, viral protein R (Vpr) induces a cell cycle arrest in the G2 phase by activating the canonical ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related)-mediated DNA damage checkpoint, but cellular factors and mechanisms directly engaged in this process remain unknown. To identify novel Vpr-interacting cellular factors, we used tandem affinity purification (TAP) to isolate native Vpr-containing complexes. We found that Vpr hijacks a cellular E3 ubiquitin ligase complex, CRL4A(VprBP), composed of Cullin 4A, DDB1 (DNA damage-binding protein 1) and VprBP (Vpr-binding protein). Moreover, we observed that recruitment of the E3 ligase by Vpr was necessary but not sufficient for the induction of G2 cell cycle arrest, suggesting that additional events are involved. In this context, we provide direct evidence that Vpr usurps the function of CRL4A(VprBP) to induce the K48-linked polyubiquitination and proteasomal degradation of as-yet-unknown cellular proteins. These ubiquitination events mediated by Vpr were necessary for the activation of ATR. Moreover, we show that Vpr forms chromatin-associated foci that co-localize with VprBP and DNA repair factors. Our data indicate that formation of these foci represent a critical early event in the induction of G2 arrest. Finally, we show that Vpr is able to recruit CRL4A(VprBP) on chromatin and we provide evidence that the unknown substrate targeted by Vpr is a chromatin-associated protein. Overall, our results reveal some of the mechanisms by which Vpr induces cell cycle perturbations. Furthermore, this study contributes to our understanding of the modulation of the ubiquitin-proteasome system by HIV-1 and its functional implication in the manipulation of the host cellular environment.

Le virus de l’hépatite C (VHC) est une des principales causes d’hépatite chronique. La protéine F du VHC est codée par un cadre de lecture alternatif du gène de la capside, Core. La protéine F a été découverte après que l’on ait associé Core à plusieurs des fonctions pathogènes du VHC. Nous proposons donc que certaines fonctions biologiques et pathogènes attribuées à la protéine Core résultent de l’activité de la protéine F. Nous avons choisi de développer trois lignées de poissons zébrés (Danio rerio) qui expriment différentes versions de la protéine F afin d’étudier les effets de la protéine F et leur incidence dans la pathogenèse du VHC. Deux versions de la séquence codant pour la protéine F (AF11 et AUG26) et une version mutante du gène core (CoremutI) ont été introduites sur les vecteurs d’un système d’expression répressible spécifique au foie. Ces vecteurs ont été co-injectés dans des embryons unicellulaires de poissons zébrés pour générer les poissons fondateurs des lignées transgéniques. 19, 21 et 36 poissons ont été choisis comme fondateurs pour les lignées AF11, AUG26 et CoremutI respectivement. De ce nombre, 9, 11 et 11 poissons ont atteint la maturité, dans l’ordre pour les mêmes lignées, et seront croisés pour donner naissance à des lignées transgéniques stables. Les résultats de ces expériences nous permettront de mieux cerner les propriétés biologiques de la protéine F et de définir son rôle dans la pathogenèse du VHC. / Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of liver steatosis, fibrosis and hepatocellular carcinoma. HCV F protein is expressed from an alternative reading frame within the Core sequence. F protein was discovered after many of the pathogenic determinants of HCV had been associated with the effects of Core. Hence, we propose that a part of the functions attributed to Core result from the activity of the F protein. We produced and selected 19, 21 and 36 transgenic zebrafish (Danio rerio) to give rise to 3 independent lines expressing different versions of the F protein. Of these founders, 9, 11 and 11 were raised to maturity and will be bred to generate stable transgenic lines. Characterizing the phenotype of these transgenic fish will help determine the precise role of the F protein in the pathogenesis of hepatitis C.