Das parodontopathogene Bakterium Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans) exprimiert zahlreiche Virulenzfaktoren. In dieser Studie wurden die Gene für die Virulenzfaktoren Leukotoxin (LtxA), Cytolethal Distending Toxin (CDT) und Fimbriae-assoziiertes Protein (Flp1) in 99 A. actinomycetemcomitans-Isolaten aus der Plaque von Parodontitispatienten aus vier deutschen Universitätskliniken untersucht. Die Proben wurden serotypisiert. Die Entnahme erfolgte mit sterilen Papierspitzen aus der jeweils tiefsten Tasche jedes Quadranten. Es wurden von den Patienten Sondierungstiefe (PD) und Attachmentlevel (AL) an sechs Stellen pro Zahn gemessen und ebenfalls die Tiefen an den vier Entnahmestellen notiert. Außerdem wurden ethnische Herkunft der Eltern, Geschlecht und Raucherstatus erfragt. Lediglich zwei A. actinomycetemcomitans-Isolate aus Frankfurt/Main wiesen das ltx-Gen mit Deletion auf. Diese zeigten signifikant höhere PD an den vier Entnahmestellen. Die übrigen 97 Proben hatten das ltx-Gen ohne Deletion in der DNA-Promotorregion ihrer A. actinomycetemcomitans-Stämme. Probanden mit Genlokus für das cdtB-Gen, mit drei cdt-Genen oder insgesamt fünf Genen für Virulenzfaktoren litten signifikant häufiger an aggressiver Parodontitis. A. actinomycetemcomitans-Isolate mit cdtA-Gen, cdtB-Gen, cdtCGen, drei cdt-Gene oder flp-1-Gen wiesen signifikant häufiger Serotyp b oder c auf. Probanden ohne cdtC-Gen oder flp-1-Gen in der DNA ihrer isolierten A. actinomycetemcomitans-Stämme zeigten am häufigsten Serotyp e. Probanden mit Genlokus für das cdtB-Gen oder drei cdt-Gene in den isolierten A. actinomycetemcomitans-Proben oder mit aggressiver Parodontitis stammten signifikant häufiger aus dem Ausland. Es wurde kein signifikanter Zusammenhang zwischen Vorkommen der Gene für Virulenzfaktoren und PD bzw. AL im gesamten Gebiss gefunden.

Das parodontopathogene Bakterium Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans) exprimiert zahlreiche Virulenzfaktoren. In dieser Studie wurden die Gene für die Virulenzfaktoren Leukotoxin (LtxA), Cytolethal Distending Toxin (CDT) und Fimbriae-assoziiertes Protein (Flp1) in 99 A. actinomycetemcomitans-Isolaten aus der Plaque von Parodontitispatienten aus vier deutschen Universitätskliniken untersucht. Die Proben wurden serotypisiert. Die Entnahme erfolgte mit sterilen Papierspitzen aus der jeweils tiefsten Tasche jedes Quadranten. Es wurden von den Patienten Sondierungstiefe (PD) und Attachmentlevel (AL) an sechs Stellen pro Zahn gemessen und ebenfalls die Tiefen an den vier Entnahmestellen notiert. Außerdem wurden ethnische Herkunft der Eltern, Geschlecht und Raucherstatus erfragt. Lediglich zwei A. actinomycetemcomitans-Isolate aus Frankfurt/Main wiesen das ltx-Gen mit Deletion auf. Diese zeigten signifikant höhere PD an den vier Entnahmestellen. Die übrigen 97 Proben hatten das ltx-Gen ohne Deletion in der DNA-Promotorregion ihrer A. actinomycetemcomitans-Stämme. Probanden mit Genlokus für das cdtB-Gen, mit drei cdt-Genen oder insgesamt fünf Genen für Virulenzfaktoren litten signifikant häufiger an aggressiver Parodontitis. A. actinomycetemcomitans-Isolate mit cdtA-Gen, cdtB-Gen, cdtCGen, drei cdt-Gene oder flp-1-Gen wiesen signifikant häufiger Serotyp b oder c auf. Probanden ohne cdtC-Gen oder flp-1-Gen in der DNA ihrer isolierten A. actinomycetemcomitans-Stämme zeigten am häufigsten Serotyp e. Probanden mit Genlokus für das cdtB-Gen oder drei cdt-Gene in den isolierten A. actinomycetemcomitans-Proben oder mit aggressiver Parodontitis stammten signifikant häufiger aus dem Ausland. Es wurde kein signifikanter Zusammenhang zwischen Vorkommen der Gene für Virulenzfaktoren und PD bzw. AL im gesamten Gebiss gefunden.

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Einleitung: Aviäre Influenzaviren (AIV) gehören zu den Influenza A-Viren (IAV) und sind sehr wandelbar. Die Bandbreite der Erkrankungsverläufe reicht, abhängig von Faktoren wie Virussubtyp und -stamm oder der Wirtstierart, von einer asymptomatischen Erregerausscheidung, z. B. bei Wasservögeln, über ausgeprägte respiratorische Erkrankungen bei vielen Säugern einschließlich des Menschen bis hin zu systemischen Infektionen mit Nekrosen und Entzündungen in vielen Organen und hoher Letalität, häufig bei Hühnern und Puten und in Verbindung mit hochpathogenen AIV (HPAIV). Weltweit und auch in Deutschland dauert aktuell ein AIV-Ausbruch an, sodass eine Gefährdung für die Tiergesundheit und aufgrund des zoonotischen Potenzials auch für den Menschen besteht. Im Gegensatz zu galliformen Spezies steht bei anderen Vogelarten und insbesondere Säugern die Virulenz nicht in besonders enger Verbindung mit dem Vorhandensein einer polybasischen Spaltstelle des Hämagglutinins (HA), wobei die pathogenetische Grundlage dieser Virulenzunterschiede bisher wenig erforscht ist. Die vorliegende Arbeit ist Teil einer größeren tierexperimentellen Versuchsreihe zur näheren Charakterisierung von virulenzdeterminierenden Regionen des AIV-Genoms, insbesondere von Variationen in der Spaltstelle des HA und des Nichtstrukturproteins 1 (NS1), hinsichtlich ihres Einflusses auf Pathogenität, Virulenz und Gewebetropismus. Ziele der Untersuchungen: Die übergreifende Hypothese der Studien war, dass neben der Variation der Spaltstelle des HA weitere, im Genom der IAV kodierte Virulenzdeterminanten existieren, deren Auswirkungen tierartspezifisch unterschiedlich ausgeprägt sind. Ziel der ersten Studie war die Etablierung eines semiquantitativen Scoringsystems für die wichtigsten histopathologischen Veränderungen sowie die Verteilung des Virusantigens in verschiedenen Organen. Ziel der zweiten Studie war die Automatisierung der Messung des Virusantigens, um die Untersuchung einer höheren Probenzahl zu ermöglichen sowie einen schnellen Überblick über die jeweiligen Zielorgane zu erhalten. Ein weiteres Ziel aller vier vorgestellten Studien war die Anwendung der Methoden zur Untersuchung des Einflusses genetischer Variationen, insbesondere der Spaltstelle des HA sowie des NS1, auf den Gewebetropismus und den Grad der Läsionen in experimentellen Infektionen bei Hühnern, Puten und Enten. Tiere, Material und Methoden: In allen Studien wurden Gewebeproben verwendet, die aus verschiedenen, am Friedrich-Loeffler-Institut (Greifswald-Insel Riems) durchgeführten Infektionsexperimenten stammen. Gruppen von Hühnern, Puten und Enten wurden zur Untersuchung unterschiedlicher Fragestellungen mit einer Vielzahl an teilweise genetisch modifizierten AIV oculonasal oder intravenös infiziert: Insbesondere wurden H4-Viren mit Reassortment mit H5N1-Viren, H5N1-, H5N8- und H7N7-Wildtypviren, H9N2-Viren mit modifizierter HA-Spaltstelle sowie H7N1-Viren mit variabler Länge der C-terminalen Effektordomäne des NS1 näher betrachtet. Von einem Teil der infizierten Tiere wurde jeweils ein breites Organspektrum histopathologisch und immunhistochemisch untersucht. Zur Etablierung der semiquantitativen und quantitativen Untersuchungsmethoden sowie zur Analyse der Ergebnisse wurden die verfügbaren Gruppen aufgrund ihrer oft geringen Größe (2 bis 10 histopathologisch und immunhistochemisch untersuchte Tiere pro Gruppe) unter Berücksichtigung der jeweiligen Fragestellung teils zusammenfassend analysiert, wobei zum Teil auch Daten aus vorangegangenen Experimenten reevaluiert und miteinbezogen wurden. Ergebnisse der semiquantitativen Analysen aus verschiedenen Experimenten wurden mittels Kruskal-Wallis- und Mann-Whitney-U-Tests und die quantitativen Daten mittels Mann-Whitney-U- und Friedman-Tests miteinander verglichen sowie Spearman- und Pearson-Korrelationsanalysen durchgeführt. Ergebnisse: Es wurde ein semiquantitatives Scoringsystem zur Erfassung nekrotisierender Läsionen sowie der Virusverteilung in Parenchym- und Endothelzellen etabliert. Bei Anwendung dieses Systems zeigten sich teils signifikante, oft durch genetische Variationen in Virulenzfaktoren bedingte Unterschiede. So waren mit H7N7 HPAIV assoziierte, nekrotisierende Läsionen bei Puten größtenteils stärker ausgeprägt als bei Hühnern. Bei Hühnern zeigte sich zusätzlich ein Endotheltropismus. Dagegen fanden sich bei mit demselben Virus infizierten Enten keine nekrotisierenden Läsionen und kein Virusantigen. H9N2-Viren mit Variationen in der Spaltstelle des HA unterschieden sich insbesondere in der Schwere der klinischen Erkrankung bei Puten sowie im Verhalten in zellkulturbasierten Analysen. Bei einer Infektion von Puten mit H7N1-Viren, die eine variable Länge des NS1 aufwiesen, fand sich für die untersuchten Varianten eine systemische Streuung des Virusantigens mit Nekrosen bzw. nekrotisierender Entzündung und einer Depletion der lymphatischen Organe in ähnlicher Ausprägung. Auch bei weiteren Untersuchungen, z. B. bezüglich des Schweregrads der klinischen Erkrankung sowie der Virusreplikation, zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Zudem wurde eine automatisierte Organauswahl sowie eine anschließende schwellenwertbasierte Messung des Virusantigens für sechs verschiedene Organe entwickelt. Auch hier fanden sich teils signifikante Unterschiede hinsichtlich des Gewebetropismus im Zusammenhang mit dem Infektionsweg. Die Ergebnisse der semiquantitativen und der quantitativen Untersuchungsmethoden zeigten eine signifikante positive Korrelation sowohl untereinander als auch jeweils mit Daten aus einer quantitativen reversen Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Schlussfolgerungen: Die hier vorgestellten semiquantitativen und quantitativen Methoden wurden validiert und zeigten eine Korrelation mit bisher verwendeten Untersuchungsmethoden sowie eine breite Anwendbarkeit, wenngleich eine Erprobung und Etablierung an einer größeren Probenzahl und Gruppengröße der Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein sollte. In den vorgestellten Studien konnte gezeigt werden, dass die polybasische Spaltstelle des HA die wichtigste Determinante für die Virulenz und den Endotheltropismus von H7N7 HPAIV bei Hühnern darstellt, jedoch nicht alle vorhandenen Virulenzunterschiede bei Puten und Enten erklären kann. Zudem weist die untersuchte genetische Variation der Spaltstelle des HA von H9N2 einen quantitativen Effekt auf die Virulenz in Puten auf. Die C-terminale Effektordomäne des NS1 scheint bei Puten hingegen keine wesentliche Rolle für die Virulenz und den Gewebetropismus zu spielen. Auch andere Faktoren wie der Infektionsweg können einen Einfluss auf die Virusverteilung nehmen. Wenngleich in diagnostischen Einzelfällen aufgrund der inhärenten Variabilität der Immunhistochemie eine qualitative Untersuchung das Mittel der Wahl bleibt, weisen die hier vorgestellten semiquantitativen und quantitativen Methoden aufgrund ihrer studienübergreifenden Anwendbarkeit sowie ihrer biometrischen Auswertbarkeit entscheidende Vorteile für den Einsatz im experimentellen Bereich auf.

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Neutrophile Granulocyten wirken als einer der ersten Abwehrmechanismen gegen invasive Mikroorganismen im angeborenen Immunsystem von Mammalia. Aktiviert durch inflammatorische Signale verlassen diese Granulocyten das vaskuläre System und migrieren durch das Gewebe zum Infektionsherd. Dort binden sie die Mikroorganismen, phagozytieren und eliminieren diese schließlich mit hoher Effizienz. Humane Neutrophile Elastase (NE) ist Bestandteil der neutrophilen Granula und spielt eine entscheidende Rolle im Abbau von Virulenzfaktoren enteroinvasiver Bakterien, einschließlich der Shigella Virulenzfaktoren IpaB (invasion antigen plasmid B) und IcsA (intracellular spread A). NE gehört zu der Familie der Chymotrypsin-ähnlichen Serinproteasen, die sich durch Sequenz- und Strukurähnlichkeit auszeichnen, jedoch sehr unterschiedliche biologische Funktionen aufweisen. Cathepsin G (CG) ist wie NE eine Chymotrypsin-ähnliche Serinprotease und ebenfalls in neutrophilen Granula lokalisiert. Allerdings zeigt CG keine Aktivität gegenüber Virulenzfaktoren von Shigella. Obwohl die Kristallstrukturen von CG und NE fast identisch sind, konnten einzelne oder mehrere Aminosäuren in der Substratbindungsspalte identifiziert werden, die zwischen den beiden Enzymen differieren. Dies legte die Vermutung nahe, dass die Spezifität von NE gegenüber Virulenzfaktoren in diesen Unterschieden codiert sein könnte. Daher wurden diese Aminosäuren durch die analogen CG Aminosäuren oder durch Alanin ersetzt. Der Vergleich der funktionellen Eigenschaften der NE Mutanten mit wildtyp NE zeigte, dass die Aminosäuren an den Positionen 98 und 216-224 entscheidend für die Substratspezifität von NE sind. Die NE Mutanten N98A, 216-218 und 216-224 waren nicht mehr in der Lage, die Virulenzfaktoren IcsA und IpaB sowie das NE Peptidsubstrat abzubauen. Stattdessen haben diese Mutanten die Fähigkeit erlangt, das CG Peptidsubstrat abzubauen. Zusammenfassend konnten wir Aminosäuren in NE identifizieren, die sowohl die Spezifität von NE für das Peptidsubstrat als auch für die Virulenzfaktoren von Shigella flexneri determinieren. / Neutrophil granulocytes are one of the first lines of defense of the mammalian innate immune system against invading microorganisms. In response to inflammatory stimuli, neutrophils migrate from the blood stream to infected tissues where they bind, engulf and inactivate microorganisms efficiently. Human neutrophil elastase (NE), a neutrophil granule component, is a key host defense protein that rapidly destroys virulence factors of enteroinvasive pathogens including IpaB (invasion plasmid antigen B) and IcsA (intracellular spread A) from Shigella. NE belongs to the family of chymotrypsin-like serine proteases with sequence and structural similarity but with very different biological functions. Cathepsin G (CG) is another abundant chymotrypsin-like serine protease in neutrophil granules. However, in contrast to NE, CG does not cleave virulence factors of Shigella. The crystallographic structures of NE and CG are very similar but we identified single or multiple residues in the substrate-binding cleft to differ in these two enzymes. We hypothesized that NE specificity for bacterial virulence factors resides within these structural differences. Therefore these specific residues in NE were replaced with the analogous amino acids of CG or with alanine. By comparing the functional properties of these NE mutants to wildtype NE we were able to show that the amino acids at position 98 and 216-224 are crucial for the substrate specificity of NE. The NE mutants N98A, 216-218 and 216-224 did not cleave the virulence factors IcsA and IpaB as well as the NE peptide substrate but cleaved the CG peptide substrate. In summary, we identified residues in NE that determine the specificity of NE for the peptide substrate and for the Shigella flexneri virulence factors.

Hintergrund: Die Pathogenese nicht-familiärer kolorektaler Neoplasien ist heute noch nicht bekannt. Die Besonderheiten der Epidemiologie der Erkrankung sprechen für die Beteiligung von Umweltfaktoren, wie sozioökonomischer Faktoren, der Ernährung oder der bakteriellen Flora des Darmes. Eine intrazelluläre, von E.coli dominierte Flora wurde in Kolonbiopsien dieser Patienten beschrieben. Methoden: Es wurden Virulenzfaktoren von Escherichia coli untersucht, die aus gewaschenen koloskopischen Biopsien von 43 Patienten mit kolorektalen Adenomen und Karzinomen isoliert worden waren. 100 Stämme wurden mittels PCR auf Gene für folgende Virulenzfaktoren untersucht: s-Fimbrien (sfa), pyelonephritisassoziierter Pilus (pap), Hämolysin A (hlyA), hitzestabiles und -labiles Toxin (ST, LT, EAST), Intimin (eae), Verotoxin (stx), Invasionsplasmid (ipa), cytolethal distending toxin (cdt) und cytotoxic necrotizing factor 1 (cnf1). Für die Kontrollgruppe wurden E.coli aus Biopsien von 55 Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) und unspezifischer Kolitis, von 16 Patienten mit Colon irritabile (IBS) und aus Stuhlproben von 29 gesunden Probanden isoliert und untersucht. Ergebnisse: Bei 69% der Patienten mit kolorektalen Karzinomen und bei 58% der Patienten mit kolorektalen Adenomen wurde mindestens einer der Virulenzfaktoren gefunden, dagegen nur bei 25 bis 39% der IBS- und CED- Patienten sowie der gesunden Probanden (p / Background: Pathogenesis of non-hereditary colorectal neoplasia is poorly understood. The differences in regional incidence indicate an influence of environmental factors, as socio-economic conditions, nutrition and intestinal flora. An intracellular flora with a predominance of Escherichia coli in colon biopsies has been described in these patients. Methods: We studied virulence factors of Escherichia coli isolated from washed colonoscopic biopsies of 43 patients with colorectal carcinoma and adenoma. 100 strains of E.coli were isolated and used for detection of a broad range of virulence genes by PCR encoding: s-fimbriae (sfa), pyelonephritis-associated pili (pap), hemolysin A (hlyA), heatstable and heatlable toxins (ST, LT, EAST), verotoxin (stx), invasionplasmidantigen (ipaH), intimin (eae), cytolethal distending toxin (cdt) and cytotoxic necrotizing factor 1 (cnf1). E.coli from biopsies of 55 patients with inflammatory bowel disease (IBD) and non-specific colitis, of 16 patients with irritable bowel syndrom (IBS) and from stool samples of 29 healthy individuals were isolated and examined as controls. Results: The prevalence of virulent strains bearing at least one of the tested genes was 69% in colorectal carcinoma and 58% in colorectal adenoma, but only 25 to 39% of IBD and IBS patients and healthy individuals (p