Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

L'infection par le virus de l'hépatite C (HCV) reste aujourd'hui une cause majeure d'hépatite chronique, de cirrhose du foie et de carcinome hépatocellulaire. L'attachement cellulaire et l'entrée de HCV sont médiés par les protéines d'enveloppe E1 et E2. De nouveaux récepteurs ont été récemment identifiés mais l'entrée du virus dans les hépatocytes reste énigmatique et n'a jamais été visualisée. Nous avons tout d'abord caractérisé le modèle des pseudo-particules HCV (HCVpp) encryomicroscopie électronique en transmission (cryo-MET). Ce sont des particules sphériques de 100 nm de diamètre portant à leur surface E1 et E2. Nous avons ensuite visualisé l'entrée des HCVpp dans les hépatocytes en MET conventionnelle en utilisant des lignées d'hépatome et des hépatocytes primaires humains(PHH). Ces derniers maintiennent leur polarité en culture comme en témoigne la persistance de canalicules biliaires, tels que dans les hépatocytes natifs. Après synchronisation à 4°C avec les cellules, les HCVpp sont retrouvées liées aux prolongements cellulaires via des 'piliers', et sont ensuite internalisées à 37°C par endocytose dépendante de la clathrine. Ces 'piliers', actuellement en cours d'identification par immunomarquages, sont internalisés avec les HCVpp dans les hépatocytes au sein de vésicules de clathrine ; ce suivi est effectué par des approches de congélation haute pression et de tomographie électronique. Enfin, les évènements d'endocytose des HCVpp dans les PHH se sont avérés rares, avec une cinétique ralentie comparée aux lignées cellulaires. Ces études en MET soulignent l'importance d'utiliser un modèle cellulaire physiologique polarisé pour l'étude du mécanisme d'entrée de HCV. / Hepatitis C virus (HCV) infection is a major cause of chronic hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Receptor recognition, cell binding and membrane fusion rely on HCV envelope proteins E1 and E2. New receptors were recently discovered; however HCV entry into hepatocytes remains largely unknown and has not yet been visualized. At first, we characterized HCV pseudoparticles (HCVpp) by cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM). They appeared as regular spherical structures of ca. 100-nm, with E1 and E2 at their surface. By conventional TEM, we then visualized HCVpp entry into hepatocytes, using hepatoma cells and primary human hepatocytes (PHH) as a more physiological cell model.PHH maintain their polarity in culture as attested by TEM observation of persistent bile canaliculi. At 4°C, viral particles were primarily found attached to microvilli at the cell surface via molecular bridges and, after warming to 37°C, they were internalized by endocytosis in clathrin-coated pits and vesicles. Using freeze substitution and electron tomographyapproaches, these bridges were found intimately surrounding HCVpp inside the clathrincoated vesicles, suggesting a concomitant internalization. The nature of these bridges is currently under investigation by immunogoldlabeling approaches. Finally, we reproducibly observed less HCVpp internalization events in PHH compared to hepatoma cells, and the kinetics of these events seemed delayed, probably due to PHH polarity. To conclude, ourTEM approach proved powerful to visualize HCV entry, and highlights the importance of studying a physiological cell model to understand HCV entry mechanism.

Les aurones, qui constituent une sous-classe des flavonoïdes, présentent un profil pharmacologique et un spectre d'activités biologiques prometteurs. Au cours de ce travail, nous avons mis à profit ce potentiel pour la modulation de deux cibles thérapeutiques majeures. En premier lieu, depuis la mise sur le marché d'inhibiteurs de la protéase NS3/4A, l'inhibition de la polymérase NS5B du virus de l'hépatite C représente un enjeu primordial dans la lutte contre cette maladie. L'utilisation des aurones contre cette polymérase trouve ici ses premiers développements. L'évaluation de quatre générations de composés a mené à l'identification de plusieurs dérivés actifs, dont certains produits naturels, présentant un IC50 inférieur à 5 μM. L'étude des interactions ligand – récepteur a en outre permis de déterminer que les aurones se fixent probablement sur le site « Thumb I ». En second lieu, si la modulation de la tyrosinase dans un cadre thérapeutique reste actuellement hypothétique, de nombreuses études voient en cette enzyme une cible pour le traitement futur de pathologies difficilement curables, comme le cancer ou la maladie de Parkinson. Les aurones ont fait preuve lors de ce travail d'une grande versatilité face à la tyrosinase, adoptant au gré des substitutions des comportements très différents de substrat alternatif, d'activateur hyperbolique ou d'inhibiteur mixte. Un modèle cohérent a cependant été proposé, qui regroupe et explique ces comportements. Au cours de ce travail, de nombreux dérivés d'aurone diversement substitués ou modifiés ont été préparés, par le biais de méthodes de synthèse adaptées à la structure de chaque produit formé. / Aurones, a subclass of flavonoids, present a favorable pharmacological profile and a wide, promising spectrum of biological activites. During this work, we used this potential for the modulation of two major therapeutic targets. Firstly, since several hepatitis C virus protease NS3/4A inhibitors were recently marketed, the inhibition of the polymerase NS5B is now the focus of research efforts in the fight against HCV. The use of aurones against the HCV polymerase is here reported for the first time. Four generations of compounds were synthesized and evaluated, and several bioactive derivatives were found, including some natural products, with an IC50 below 5 μM. Furthermore, additional investigations regarding inhibitor – receptor interactions allowed to identify the aurones binding site, which is Thumb Site I. Secondly, although the modulation of tyrosinase in a therapeutic aim remains a matter of discussion, a number of studies considers this enzyme as a potential target for future treatments against some hardly curable diseases, such as cancer or Parkinson's disease. During this work, aurones showed a great versatility toward tyrosinase. According to their substitution pattern, the compounds embraced very different behaviours, i.e. alternative substrate, hyperbolic activator or mixed inhibitor behaviour. However a consistent model was proposed, which gathers and explains all of these behaviours. During this study, a large number of widely substituted or modified aurone derivatives were prepared, according to structure-dependant adaptative synthetic methods.

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Les aurones, qui constituent une sous-classe des flavonoïdes, présentent un profil pharmacologique et un spectre d'activités biologiques prometteurs. Au cours de ce travail, nous avons mis à profit ce potentiel pour la modulation de deux cibles thérapeutiques majeures. En premier lieu, depuis la mise sur le marché d'inhibiteurs de la protéase NS3/4A, l'inhibition de la polymérase NS5B du virus de l'hépatite C représente un enjeu primordial dans la lutte contre cette maladie. L'utilisation des aurones contre cette polymérase trouve ici ses premiers développements. L'évaluation de quatre générations de composés a mené à l'identification de plusieurs dérivés actifs, dont certains produits naturels, présentant un IC50 inférieur à 5 μM. L'étude des interactions ligand - récepteur a en outre permis de déterminer que les aurones se fixent probablement sur le site " Thumb I ". En second lieu, si la modulation de la tyrosinase dans un cadre thérapeutique reste actuellement hypothétique, de nombreuses études voient en cette enzyme une cible pour le traitement futur de pathologies difficilement curables, comme le cancer ou la maladie de Parkinson. Les aurones ont fait preuve lors de ce travail d'une grande versatilité face à la tyrosinase, adoptant au gré des substitutions des comportements très différents de substrat alternatif, d'activateur hyperbolique ou d'inhibiteur mixte. Un modèle cohérent a cependant été proposé, qui regroupe et explique ces comportements. Au cours de ce travail, de nombreux dérivés d'aurone diversement substitués ou modifiés ont été préparés, par le biais de méthodes de synthèse adaptées à la structure de chaque produit formé.

Le virus de l'Hépatite C (VHC), de la famille Flaviviridae, est à l'origine d'une pandémiemondiale. L'infection par le VHC provoque le dévelopment d'hépatites chroniques, decirrhoses et de carcinomes hépatocellulaires (CHC). Les fonctions de la majorité des protéinesvirales sont connues, mis à part pour NS5A dont la seule fonction directe attribuée à ce jour,équivaut à celle d'un facteur d'activation transcriptionnelle. Notre laboratoire a montréprécédemment que les variants de quasiespèce de NS5A isolés à partir du sérum d'un mêmepatient présentaient des différences significatives dans leurs propriétés intrinsèques detransactivation. Fort de ces résultats, nous avons analysé des variants de NS5A isolés à partirde tissu hépatique d'un patient chroniquement infecté par le VHC de génotype 1b. Cesanalyses ont révélé une compartimentation génétique et fonctionnelle des variants de NS5Aentre le tissu tumoral et le tissu non-tumoral adjacent. Nous avons donc émis l'hypothèse queles propriétés transactivatrices de NS5A pourraient jouer un rôle dans la pathogenèse ainsique dans la réplication virale, et que la variabilité naturelle de NS5A pourrait influencer sespropriétés transactivatrices. L'objectif de ce travail de thèse était d'analyser le rôle despropriétés transactivatrices de NS5A dans la pathogenèse hépatique viro-induite ainsi quedans la réplication virale. Pour étudier le rôle des propriétés de transactivation de NS5A dans la pathogenèse hépatique,nous avons développé des vecteurs lentiviraux pour exprimer dans les hépatocytes primaireshumains les variants choisis de NS5A portants différents potentiels de transactivation. Enutilisant la technologie RNA-Seq d'Illumina, l'analyse des transcriptomes d'hépatocytestransduits exprimant les variants transactivateurs fort et faible de NS5A, sera utiliser pouridentifier les voies cellulaires ciblées par les propriétés transactivatrices de NS5A. Pour lesétudes in vivo, nous avons lancé le développement des souris transgénique permettantl'activation conditionnelle de l'expression des variants de NS5A avec fort et faible potentielde transactivation, spécifiquement dans le foie. Ces souris transgéniques seront utilisées pourétudier le rôle potentiel des propriétés transactivatrices dans la pathogenèse VHC induite etplus particulièrement dans le développement des cancers. Pour étudier le rôle des propriétés de transactivation de NS5A dans la réplication virale, nousavons utilisé le système de réplicon subgénomique de VHC exprimant les variants de NS5Aprécédemment caractérisés. Pour exercer ses propriétés transactivatrices, NS5A doit êtrelocalisée au moins partiellement dans le noyau. Nous avons démontré qu'une partie de NS5Ase retrouve dans noyau et est recruté sur des promoteurs cellulaires, modulant ainsidirectement l'expression de gènes cellulaires essentiels pour la réplication de l'ARN viral.Nous avons observé que les variants de NS5A avec différents potentiels de transactivation,confèrent différentes capacités de réplication au réplicon subgénomique, et corrèlent avec lepotentiel de transactivation de variant correspondant. En accord avec ces observations,l'inhibition de translocation nucléaire de NS5A entraine une inhibition de la réplication virale,suggerant un rôle potentiel des propriétés transactivatrices de NS5A dans la réplication l'ARNvirale. En conclusion, nous avons démontré que l'activation transcriptionnelle des gènes cellulairespar la NS5A est essentielle pour la réplication de l'ARN du VHC. Cette modulation des gènescellulaires pourrait également être impliquée dans les mécanismes de la pathogenèse viroinduite.Nous confirmerons cette hypothèse grâce aux souris NS5A. Par ailleurs, ces résultatspourraient contribuer au développement de nouvelles thérapies anti-VHC, basées surl'inhibition de translocation nucléaire de NS5A

Le virus de l’hépatite C (VHC) est une des causes majeures de carcinome hépatocellulaire (CHC), dont les traitements ont une efficacité modéré. La transplantation hépatique (TH) est l’option thérapeutique de choix mais est limitée, chez les patients chroniquement infectés par le VHC, par une réinfection systématique du greffon. Nous proposons d’utiliser des lymphocytes génétiquement modifiés (LGM) issus de donneurs sains qui ont fait leurs preuves pour le traitement d’hémopathies malignes et qui,exprimant un gène suicide, peuvent être éliminés en cas d’effets secondaires. Nous montrons maintenant que ces LGM présentent d’une part une activité anti-tumorale vis-à-vis du CHC, et d’autre part un effet anti-viral envers le VHC. L’objectif est la création d’une banque de LGM allogéniques prêts-à-l’emploi, avec des avantages en termes de coût, de logistique et de disponibilité immédiate par rapport aux approches classiques d’immunothérapies, autologues pour la plupart. Parallèlement, nous avons étudié in vivo l’effet anti-viral d’un anticorps monoclonal anti-claudin-1 dirigé contre un co-récepteur duVHC et inhibant l’entrée du VHC dans les hépatocytes humains. Grâce à un modèle d’infection par VHC de souris présentant un foie chimérique humanisé, nous montrons que cet anticorps permet de prévenir efficacement l’infection par le VHC. Nos résultats apportent les preuves de concept de l’utilisation de deux produits, anticorps anti-claudin-1 et LGM, pour la prévention de la réinfection du greffon hépatique par le VHC, les LGM pouvant également être envisagés en association avec les thérapies actuelles du CHC. / The hepatitis C virus (HCV) is a major cause of hepatocellular carcinoma (HCC),whose treatments are of limited efficacy. The liver transplantation (LT) is the optimal therapy but is limited by a very rapid and universal HCV reinfection of the liver graft. We propose to use healthy donor-derived suicide gene modified lymphocytes (GML), known to be efficient for the treatment of hematological malignancies and that can be eliminated in case of adverse events. We show now that GML have a strong anti-tumoral activity against HCC and an anti-viral effect on HCV. Our objective is to create a bank of ready for-use allogeneic GML which could have numerous advantages in terms of costs,logistics and immediate availability, as compared with autologous immunotherapies. In parallel, we have studied the in vivo anti-viral effect of a monoclonal antibody (mAb) directed against an HCV coreceptor, claudin-1, inhibiting HCV entry in human hepatocytes. Using a human liver-chimeric mouse model of HCV infection, we show that this mAb can efficiently prevent HCV infection in vivo. Our results provide the proofs of concept that these two products, anti-claudin-1 mAb and GML, could be used for the prevention of liver graft HCV reinfection, while GML could further be used for the treatment of HCC, in combination with current HCC therapies

Les mécanismes de la fibrogenèse hépatique liée à l'infection chronique par le virus de l'hépatite C (VHC) sont encore mal connus. L'activation de la fibrogenèse semble fortement associée à la réaction inflammatoire locale. Néanmoins le rôle direct du VHC dans le processus fibrogène n'a pas été étudié. Notre hypothèse est que la fibrose peut être au moins en partie directement induite par le VHC, indépendamment de la réponse immune de l'hôte.L'un des aspects inhérents à ce postulat est qu'une relation directe pourrait exister entre les particules du VHC et l'activation des principaux acteurs cellulaires de la fibrogenèse hépatique, les cellules étoilées du foie (CEFs). Ainsi, les objectifs de ce projet ont été d'étudier in vitro, la capacité du VHC à activer les CEFs humaines mais d'abord d'explorer la relation existant entre cette activation et une éventuelle infection de ces cellules par le VHC. Afin d'analyser la permissivité des CEFs à l'infection par le VHC, nous avons combiné plusieurs modèles originaux du VHC, tels que le clone infectieux JFH1, des rétrovirus pseudotypés avec les protéines d'enveloppe du VHC et le réplicon sous-génomique, avec deux modèles cellulaires de CEFs relevant (des cultures primaires humaines et la lignée immortalisée LX2). En conclusion, nous avons démontré que les CEFs humaines sont réfractaires à la fois à l'entrée et à la réplication du VHC. Ces résultats n'écartent cependant pas l'hypothèse d'une interaction directe entre les particules du VHC et la surface des CEFs dans l'activation fibrogénique de ces cellules. Le rôle des protéines d'enveloppe virales sous leur conformation native dans l'activation des CEFs fût étudié en incubant des ppVHC avec les CEFs. Malgré des résultats préliminaires encourageants, la question d'une activation éventuelle des CEFs en culture après contact avec des particules virales du VHC, et ce indépendamment d'une entrée et/ou d'une réplication virale, n'a pu être confirmé et reste encore sans réponse.Un second aspect est que l'expression in vivo de l'ensemble des protéines du VHC dans les hépatocytes pourrait jouer un rôle dans le déclenchement et la progression de la fibrose portale. Nous avons démontré pour la première fois que l'expression hépatocytaire in vivo des protéines du VHC chez des souris transgéniques, les FL-N/35, soumises à un traitement fibrogénique (injection chronique de CCl4) était associée à une fibrose augmentée, et ce de manière indépendante de l'inflammation locale. Cette fibrose augmentée chez les FL-N/35 s'accompagnait d'une production augmentée de d'espèces réactives de l'oxygène intrahépatocytaires, d'une réaction ductulaire caractérisée notamment par une expansion de cellules progénitrices hépatiques (CPHs), et d'une l'inhibition de la prolifération hépatocytaire. On notera également que cette fibrose portale corrélait avec l'expansion des CPHs portales, corollaire implicite de l'inhibition de la prolifération hépatocytaire. Ces observations, également observé chez les patients infectés par le VHC, suggèrent que la RD associée à une altération de la prolifération hépatocytaire jouerait un rôle dans la fibrose portale. Le modèle de souris utilisé présentant une expression intrahépatocytaire des protéines du VHC, nos résultats suggèrent implicitement une perturbation de l'homéostasie hépatocytaire comme point de départ des altérations observées dans cette étude. Afin de caractériser in vivo les altérations de la progression du cycle cellulaire hépatocytaire et d'identifier le mécanisme sous-jacent chez ces souris, un modèle de régénération hépatique, induit par l'injection d'une forte dose de l'hépatotoxique CCl4 a été utilisé. Nos résultats ont mis en évidence une inhibition de la transition G1/S associée à une activation de la voie ATM de réponse aux dommages à l'ADN causés par un stress oxydant exacerbé dans les hépatocytes de souris exprimant les protéines du VHC. / Les mécanismes de la fibrogenèse hépatique liée à l'infection chronique par le virus de l'hépatite C (VHC) sont encore mal connus. L'activation de la fibrogenèse semble fortement associée à la réaction inflammatoire locale. Néanmoins le rôle direct du VHC dans le processus fibrogène n'a pas été étudié. Notre hypothèse est que la fibrose peut être au moins en partie directement induite par le VHC, indépendamment de la réponse immune de l'hôte.L'un des aspects inhérents à ce postulat est qu'une relation directe pourrait exister entre les particules du VHC et l'activation des principaux acteurs cellulaires de la fibrogenèse hépatique, les cellules étoilées du foie (CEFs). Ainsi, les objectifs de ce projet ont été d'étudier in vitro, la capacité du VHC à activer les CEFs humaines mais d'abord d'explorer la relation existant entre cette activation et une éventuelle infection de ces cellules par le VHC. Afin d'analyser la permissivité des CEFs à l'infection par le VHC, nous avons combiné plusieurs modèles originaux du VHC, tels que le clone infectieux JFH1, des rétrovirus pseudotypés avec les protéines d'enveloppe du VHC et le réplicon sous-génomique, avec deux modèles cellulaires de CEFs relevant (des cultures primaires humaines et la lignée immortalisée LX2). En conclusion, nous avons démontré que les CEFs humaines sont réfractaires à la fois à l'entrée et à la réplication du VHC. Ces résultats n'écartent cependant pas l'hypothèse d'une interaction directe entre les particules du VHC et la surface des CEFs dans l'activation fibrogénique de ces cellules. Le rôle des protéines d'enveloppe virales sous leur conformation native dans l'activation des CEFs fût étudié en incubant des ppVHC avec les CEFs. Malgré des résultats préliminaires encourageants, la question d'une activation éventuelle des CEFs en culture après contact avec des particules virales du VHC, et ce indépendamment d'une entrée et/ou d'une réplication virale, n'a pu être confirmé et reste encore sans réponse.Un second aspect est que l'expression in vivo de l'ensemble des protéines du VHC dans les hépatocytes pourrait jouer un rôle dans le déclenchement et la progression de la fibrose portale. Nous avons démontré pour la première fois que l'expression hépatocytaire in vivo des protéines du VHC chez des souris transgéniques, les FL-N/35, soumises à un traitement fibrogénique (injection chronique de CCl4) était associée à une fibrose augmentée, et ce de manière indépendante de l'inflammation locale. Cette fibrose augmentée chez les FL-N/35 s'accompagnait d'une production augmentée de d'espèces réactives de l'oxygène intrahépatocytaires, d'une réaction ductulaire caractérisée notamment par une expansion de cellules progénitrices hépatiques (CPHs), et d'une l'inhibition de la prolifération hépatocytaire. On notera également que cette fibrose portale corrélait avec l'expansion des CPHs portales, corollaire implicite de l'inhibition de la prolifération hépatocytaire. Ces observations, également observé chez les patients infectés par le VHC, suggèrent que la RD associée à une altération de la prolifération hépatocytaire jouerait un rôle dans la fibrose portale. Le modèle de souris utilisé présentant une expression intrahépatocytaire des protéines du VHC, nos résultats suggèrent implicitement une perturbation de l'homéostasie hépatocytaire comme point de départ des altérations observées dans cette étude. Afin de caractériser in vivo les altérations de la progression du cycle cellulaire hépatocytaire et d'identifier le mécanisme sous-jacent chez ces souris, un modèle de régénération hépatique, induit par l'injection d'une forte dose de l'hépatotoxique CCl4 a été utilisé. Nos résultats ont mis en évidence une inhibition de la transition G1/S associée à une activation de la voie ATM de réponse aux dommages à l'ADN causés par un stress oxydant exacerbé dans les hépatocytes de souris exprimant les protéines du VHC.

Le but de notre travail était d'étudier comment des interactions impliquant des acides nucléiques pouvaient réguler le cycle viral du virus de l'hépatite C (VHC). L'ARN génomique du VHC est très structuré au niveau de ses extrémités 5' et 3'. La tige-boucle 5BSL3.2 a été décrite comme interagissant avec la SLIIId, la Seq9110 et la SL2 par génétique inverse et expériences de complémentation de mutations. La résonance plasmonique de surface (SPR) a été utilisée afin de caractériser ces interactions. Cela nous a conduit à développer des méthodes permettant d’étendre l'utilisation de la SPR. Nous avons pu observer, in vitro, une interaction entre la 5BSL3.2 et miR-122, un microARN fortement exprimé dans les hépatocytes. Nos résultats ont également montré que la SL2 était une séquence ARN pouvant former au moins deux conformations. L'une étant capable d'interagir avec la 5BSL3.2 et l'autre pouvant s'auto-associer. L'étude de cette dimérisation sur modèle cellulaire a montré qu'elle était impliquée dans les mécanismes de la réplication virale. Le développement d'une méthode d'analyse des complexes ternaires a permis la caractérisation simultanée du complexe formé entre la boucle interne de la 5BSL3.2 et ses partenaires (Seq9110 et SLIIId) ainsi que du complexe formé entre la boucle apicale et ses partenaires (SL2 et miR-122). Ces résultats ont montré que les deux sites de liaison de la 5BSL3.2 étaient structurellement indépendants. Ces interactions pourraient donc coexister dans un contexte physiologique. Les résultats montrent que la SLIIId et la Seq9110 sont en compétition pour interagir avec la boucle interne de la 5BSL3.2 tandis que la tige-boucle SL2 et miR-122 sont en compétition pour interagir avec la boucle apicale de la 5BSL3.2. La 5BSL3.2 est donc un motif ARN structuré pouvant agir comme une plaque tournante, capable d'interagir avec d'autres régions de l'ARN génomique tandis que la SL2 a montré que les deux interactions qu'elle pouvait former, mutuellement exclusives, étaient importantes pour la prolifération virale. Les mécanismes de compétition observés pourraient être impliqués dans la commutation entre les différentes étapes du cycle viral. / We are interested in understanding how interactions involving nucleic acids regulate the life cycle of the Hepatitis C virus (HCV). The HCV genomic RNA is highly structured at the 5' and 3' ends. The stem-loop 5BSL3.2 was described to interact with the SLIIId, the Seq9110 and the SL2 by reverse genetics and complementation mutation experiments. Surface plasmon resonance (SPR) was used to characterize these interactions. This led us to develop methods to expand the use of this technique. We described in vitro evidences for an interaction between 5BSL3.2 and miR-122, a microRNA highly expressed in hepatocytes. As shown by our results, SL2 is a highly dynamic RNA motif that fluctuates between at least two conformations: one is able to hybridize with 5BSL3.2 and the other one is capable of self-associating. The study of this dimerization in living cells has shown an implication of this phenomenon in viral replication processes. The development of a ternary complex analysis method allowed the characterization of the Seq9110 (or SLIIId) and SL2 (or miR-122) interacting with 5BSL3.2. Our results shown that the two binding sites of 5BSL3.2, the apical and internal loops, are structurally independent, suggesting that these interactions may coexist in a physiological context. SLIIId and Seq9110 were shown to compete to interact with 5BSL3.2 internal loop while SL2 and miR-122 were shown to compete to interact with 5BSL3.2 apical loop. In conclusion, 5BSL3.2 is a structured RNA motif that could act as a molecular hub capable of interacting with other genomic RNA regions while the two interactions of the SL2, mutually exclusives, were shown to be crucial for viral proliferation. The competition mechanisms observed could be involved in the commutation between viral cycle steps.

Les dernières décennies ont été marquées par l’émergence ou la réémergence d’un nombre croissant de virus pathogènes. Malheureusement, les antiviraux actuellement sur le marché ciblent un nombre restreint de virus ; il y a donc un besoin urgent de développer des antiviraux à large spectre. Les cyclophilines sont des protéines cellulaires impliquées dans un grand nombre de processus biologiques, qui possèdent une activité enzymatique peptidyl-prolyl cis-trans isomérase (PPIase). Elles sont également impliquées dans la réplication de virus appartenant à des familles éloignées et constituent donc une cible de choix pour le développement d'antiviraux à large spectre. Toutefois, les inhibiteurs de cyclophilines disponibles possèdent de nombreux inconvénients qui rendent leur utilisation clinique difficile.Par une stratégie de "fragment-based drug design", nous avons généré une nouvelle famille d'inhibiteurs de cyclophilines, les SMCypI ("Small-Molecule Cyclophilin Inhibitors"), complètement différents de tous les inhibiteurs de cyclophilines existants. La cristallographie de ces composés a montré qu'ils se fixaient dans les deux poches voisines du site actif des cyclophilines et qu'ils inhibaient leur activité PPIase. Ces composés n’étaient pas immunosuppressifs et bloquaient in vitro l'infection par le VIH, le VHC et les Coronavirus.L'activité anti-VHC du C31, composé le plus actif sur l'activité PPIase des cyclophilines, a été caractérisée. Le C31 était un inhibiteur pan-génotypique du VHC, doté d’une haute barrière contre la résistance et présentant une activité additive avec les inhibiteurs du VHC approuvés. Nous avons montré que le C31 bloquait l'infection par le VHC en rompant l'interaction entre la protéine virale NS5A et la cyclophiline A de façon PPIase-dépendante. Enfin, le C31 était actif sur la réplication des virus zika, de la dengue, de la fièvre jaune et du Nil Occidental.L'activité des SMCypI a été caractérisée sur l'infection par le Coronavirus 229E. De manière intéressante, l’inhibition de l’activité PPIase était nécessaire, mais pas suffisante pour l’activité antivirale. Une étude de la relation structure-activité des composés a révélé qu'un groupement chimique situé à l'interface entre les deux poches du site actif des cyclophilines jouait un rôle clé dans l'effet anti-coronavirus. Le F836 a été identifié comme le composé le plus actif, qui bloquait l'effet cytopathique et la quantité d'ARN du HCoV-229E avec la même efficacité que l'alisporivir, sans toxicité associée. Ce composé bloquait l'entrée du HCoV-229E après l'attachement du virus à la surface cellulaire, et était également actif sur l'entrée des HCoV-OC43 et du MERS-CoV. Nous avons par la suite démontré l’association de la cyclophiline A avec les particules virales. Par l'utilisation de la technologie CRISPR-Cas9, des cellules invalidées pour la cyclophiline A ont été générées. La cyclophiline A apparaissait nécessaire pour l'infection par HCoV-229E et la cible de l'effet antiviral du F836.Les SMCypI constituent un outil pour la compréhension des mécanismes par lesquels les cyclophilines modulent les infections virales et représentent des candidats crédibles pour le développement futur d'antiviraux à large spectre. / Over the past decades, an increasing number of viruses has emerged or re-emerged in humans. Unfortunately, currently approved antiviral drugs target a small set of viruses. Thus, there is an urgent need for the development of broad-spectrum antiviral drugs.Cyclophilins are cellular proteins involved in a large number of biological processes, and in different viral lifecycles from unrelated families. They appear as a potential target for the development of broad-spectrum antiviral approaches. However, currently available cyclophilin inhibitors have drawbacks which limit their clinical use.By means of "fragment-based drug design", we generated a new class of small-molecule cyclophilin inhibitors (SMCypI), unrelated with those already available. Cristallographic studies revealed that the SMCypIs bind to two close pockets of the active site and inhibit cyclophilin PPIase activity. These compounds do not bear immunosuppressive properties and inhibit the replication of HIV, HCV and coronaviruses in vitro.We characterized the anti-HCV activity of C31, the most potent inhibitor of cyclophilin PPIase activity. C31 had pan-genotypic HCV inhibitor properties, with a high barrier to resistance and additive effects with currently approved anti-HCV agents. C31 blocked HCV replication by disrupting the interaction between the nonstructural viral protein NS5A and cyclophilin A in a PPIase-dependent manner. Finally, C31 was active on zika, yellow fever, dengue and West-Nile virus infections.The antiviral activity of the SMCypIs has then been characterized on HCoV-229E infection. Interestingly, PPIase inhibition was necessary, but not sufficient for antiviral effect. A structure-activity relationship study identified a key moiety in the SMCypIs at the interface between the two cyclophilin pockets. F836 has been identified as the most potent compound which inhibited both the cytopathic effect and the intracellular RNA of HCoV-229E without associated cytotoxicity and as potently as alisporivir. This compound targeted HCoV-229E entry at a post-attachment step and was also active on HCoV-OC43 and MERS-CoV strains. We then demonstrated that cyclophilin A was associated with viral particles. By means of CRISPR-Cas9, cell lines depleted for cyclophilin A were generated. Cyclophilin A was identified as a proviral factor for HCoV-229E and was partially involved in F836 antiviral effect. Cyclophilin A expression level was drastically decreased by infection.SMCypIs represent a unique tool to decipher the cellular and molecular mechanisms by which cyclophilins interfere with viral lifecycles, as well as drugable compounds that could find an indication as broad-spectrum antiviral drugs.