Malgré le succès de l’Aide Médicale à la Procréation (AMP), des données récentes suggèrent un lien entre le recours à l’AMP et des pathologies liées à des erreurs épigénétiques. Afin d’évaluer l’impact des procédés in vitro de l’AMP sur la méthylation de l’ADN, nous avons analysé : 1) le profil de méthylation de 2 locus soumis à empreinte, H19DMR et KvDMR1, dans des ovocytes recueillis immatures, vitrifiés, puis mûris in vitro après réchauffement. Nous avons montré pour la première fois que le procédé vitrification/MIV pouvait constituer une alternative prometteuse pour préserver le potentiel procréatif des femmes avant un traitement anticancéreux, puisqu’il n’altérait pas l’empreinte parentale. 2) le profil de méthylation de H19DMR dans des embryons humains en retard de développement ainsi que dans les gamètes des géniteurs. Nous avons mis en évidence des anomalies de l’empreinte dans ces embryons, sans lien apparent avec les indications d’ICSI mais liées à des altérations survenues soit au cours de l’ovogenèse, soit au cours du développement précoce. 3) le profil de méthylation des promoteurs d’OCT4 et NANOG, gènes essentiels à l’expression de la pluripotence, dans des embryons bloqués après culture prolongée. Nous avons montré que le promoteur d’OCT4 était significativement hyperméthylé dans les embryons bloqués, en particulier dans la population de couples présentant uniquement une infertilité masculine, alors que le promoteur de NANOG était hypométhylé / Despite the success of Assisted Reproductive Technologies (ART), recent data suggest a link between the use of ART and diseases related to epigenetic errors. To evaluate the impact of ART on DNA methylation, we analyzed: 1) the methylation profile of 2 imprinted loci, H19DMR and KvDMR1, in immature oocytes which were vitrified and matured in vitro after warming. We have shown for the first time that vitrification/IVM process did not alter the imprinting. Then, this new technology could be a promising alternative to preserve the procreative potential of women before cancer treatment. 2) the methylation profile of H19DMR in human embryos with developmental anomalies and in the gametes of the parents. We have shown that imprinting errors in these embryos have no apparent link with ICSI indications, but were related to alterations in H19DMR occurring either during oogenesis or early development. 3) the methylation profile of the promoters of OCT4 and NANOG, essential genes for the expression of pluripotency in arrested embryos after prolonged culture. We have shown that the promoter of OCT4 was highly methylated in arrested embryos particularly in the population of couples with male infertility only, whereas the NANOG promoter was hypomethylated

La conservation de la biodiversité génétique du cochon d’Inde (Cavia porcellus) est importante en tant qu’animal de consommation endémique de la région andine ainsi qu’en tant qu’animal modèle précieux pour la recherche biomédicale.L’objectif de ce travail était de mettre en place les protocoles qui permettront une conservation ex situ des ressources génétiques de cette espèce par la voie femelle. Les étapes nécessaires à la concrétisation d’un projet de cryobanque sont :- la maîtrise de la production d’embryons grâce à des traitements hormonaux de synchronisation du cycle œstral et de superovulation des femelles,- la cryoconservation dans l’azote liquide des embryons obtenus et leur transfert dans des femelles receveuses.Une méthode standardisée de synchronisation des chaleurs basée sur l’administration d’altrenogest per os pendant 15 jours a été définie. Les chaleurs des femelles donneuses et receveuses d’embryons apparaissent dans les 4 à 5 jours qui suivent l’arrêt du traitement de ce progestagène.Des traitements de superovulation basés sur 3 injections à 24 heures d’intervalle d’hMG, ou 6 injections à 12 heures d’intervalle de FSH-recombinante humaine, permettent une augmentation du taux d’ovulation de l’ordre de fois 3 à fois 4 par rapport à des femelles non-traitées. Toutefois les réponses au traitement restent variables et il faudra réitérer l’expérience sur de plus grands lots d’animaux afin d’ajuster les doses et les moments d’application.La méthode de congélation lente, utilisant l’éthylène glycol comme cryoprotecteur, a permis d’obtenir des taux de survie embryonnaire satisfaisants (70,3%). La méthode de vitrification a également donné de bons résultats, avec un taux de survie embryonnaire de 41,7%.Le premier transfert au monde d’embryons frais réalisé avec succès dans une femelle receveuse préalablement synchronisée a été obtenu lors de ce travail. Les transferts d’embryons décongelés n’ont pas encore donné lieu à des gestations. / The preservation of the guinea pig (Cavia porcellus) genetic biodiversity is important as a native source of protein for many highlanders in the Andean region and as a precious laboratory animal for biomedical research.The aim of this work was to establish the protocols that will enable an ex situ preservation of the genetic resources of this species by the female way.The necessary steps for the achievement of a cryobank project are:- the control of the embryo production thanks to hormonal treatments to synchronize the estrous cycles and to superovulate the females,- the cryopreservation in liquid nitrogen of the obtained embryos and their transfer into recipient females.A standard method for synchronization of heat periods based on the per os administration of altrenogest during 15 days has been defined. The heat periods of the females, donors and recipients of embryos, appears 4 to 5 days after the end of the progestagen treatment. Superovulation treatments, based on 3 injections at 24-hour intervals of hMG or 6 injections at 12-hour intervals of human recombinant-FSH, lead to an increase of the ovulation rate of about 3 to 4 times when compared to untreated females. However, the responses to the treatments remain variable and further studies involving a larger number of animals should be carried out in order to adjust the dose and the moment of application of the treatment.The slow-freezing method, using ethylene glycol as cryoprotectant, enables the attainment of a satisfactory in vitro embryo survival rate (70,3%). The vitrification method also gives good results, with a 41,7% in vitro embryo survival rate.The first successful transfer of fresh embryos into a synchronized recipient female has been achieved in this study. The transfers of frozen-thawed embryos did not yet lead to gestation.

Les traitements anticancéreux utilisés sur la femme jeune conduisent de plus en plus à laguérison, au prix d’une altération de la fertilité par atteinte significative de la réserveovarienne. Ces patientes à risque d’atrésie folliculaire accélérée peuvent bénéficier d’une sauvegarde de leur fertilité, le plus souvent par techniques conventionnelles d’assistance médicale à la procréation, permettant la conservation d’ovocytes et/ou d’embryons. Cependant, ces techniques ne sont pas adaptées aux patientes pré-pubères ou à celles porteuses de pathologies imposant un traitement immédiat ou contrindiquant unestimulation hormonale. Chez ces patientes, la cryoconservation du tissu ovarien est indiquée. A ce jour, au moins 18 enfants sont nés après greffes avasculaires de fragments ovariens cryoconservés, mais ces greffes ont une durée de vie limitée par souffrance ischémique initiale et comportent un risque de réimplantation de cellules malignes. La transplantation micro-vasculaire d’ovaire entier a été proposée pour palier la souffrance ischémique, tandis que l’isolation des follicules primordiaux éviterait la récidive néoplasique induite par la greffe .Dans ce travail scientifique, nous nous sommes d'abord intéressés à l'isolation des follicules primordiaux humains. Par un modèle de xénogreffe, nous avons établi que ces follicules isolés et greffés dans un caillot de fibrine pouvaient poursuivre leur développement jusqu'austade antral. Ces travaux ont été précurseurs aux progrès récents sur la culture in vitro defollicules primordiaux encapsulés. Dans la suite du travail, nous avons contribué à l'étude de la vitrification d'ovaire entier de brebis avec son pédicule vasculaire. Nous avons ainsi établi l'altération de la viabilité dupédicule vasculaire de ces organes entiers vitrifiés, alors que des études thermodynamiques préalables prouvaient que ces pédicules vasculaires étaient bien vitrifiés. Des phénomènes de cristallisation étant survenus au réchauffement de ces organes, avec pour point de départ la zone péri-ovarienne, nous nous sommes intéressés à l'exposition deces ovaires lorsqu'ils sont perfusés par les cryoprotecteurs. Nous avons montré que la perfusion d'ovaires s'accompagne de zones non exposées dans plus de 50% des ovaires perfusés, d'autant plus que l'expérimentateur est novice, que la surface de la tranche ovarienne est petite et qu'il existe un corps jaune visible. Ces zones incomplètement exposées seraient donc responsables de cristallisation lors de la vitrification de l'organe, catalysant une prise en glace globale de l'organe lors du réchauffement. Le problème serait donc plus dans une exposition incomplète aux cryoprotecteurs que dans la nature même de ces cryoprotecteurs. L'équipe lyonnaise avait déjà rapporté l'absence d'efficacité du protocole de vitrification utilisant le cryoprotecteur « VS4 » dans le rétablissement de la fertilité de brebis. Nous avons confirmé que l'utilisation du cryoprotecteur « VM3 » (vitrifiant de manière plus performanteque « VS4 »), ne permettait pas non plus le rétablissement de la fertilité après autotransplantation d'ovaires vitrifiés à la brebis. En revanche, nous avons obtenu une gestation après auto-transplantation d'ovaire de brebis cryoconservé par congélation lente, ce qui est le deuxième cas rapporté au monde. Nos résultats suggèrent que cette vitrification incomplète due à une mauvaise exposition des ovaires est l'un des principaux obstacles à la conservation de la fertilité par vitrification d'ovaire entier avec son pédicule vasculaire. / Anticancer treatments used in young women more and more lead to recovery, but with fertility disturbance due to ovarian reserve insults. These women at risk of accelerated follicle atresia can safe guard there fertility. Most of the time, it is performed with conventional Assisted Reproductive Techniques, allowing ovocytes or embryos banking. However these treatments are available neither for girls before puberty, nor when thedisease requires emergency treatments, nor for hormone dependant disease. In these cases, ovarian tissue cryobanking is indicated. To date, at least 18 babies have been born after cryopreservation and replacement of ovarian cortical strips but these grafts have a short lifespan due to initial ischemic damages and can reintroduce cancer cells on a cured woman. To control ischemic damage, cryopreservation of whole ovaries with their vascular pedicle has been proposed where as isolation of early follicles could manage the cancer reintroduction risk. In this scientific work, we first focused on isolation of early follicles. Using a xenograft model to mice with plasma clot as a vehicle, we showed that human isolated follicles can pursuit their development up to antral stage. This work motivates further progress in in-vitro cultureof encapsulates early follicles. In the second part of this work, we contributed to knowledge on vitrification of whole eweovaries with their vascular pedicle. We thus established impaired vascular viability of whole“VS4” vitrified ovaries, whereas previous calorimetric studies founded these vascular pedicles to be completely vitrified. As warming phase crystallization happened, starting from the area surrounding the ovary, we focused on the ovarian exposition when it is perused with cryoprotectors. We showed that unexposed parts are present in more than 50% of perfused ovaries, as much as the slide surface is small, a corpus luteum is present and the experimenter is inexperienced. These unexposed zones could be responsible for focal freezing during vitrification, these frozen focicatalyzing the whole organ ice crystallization during the warming phase. Hence, whole ovary vitrification failure could be due to improper cryoprotectors exposition of the organ ratherthan the inability of these cryoprotectors to promote proper tissue vitrification.Our team already failed to preserve fertility with “VS4” vitrified ewe ovaries. Neither were we able to preserve fertility with “VM3” vitrified ewe ovaries (this last cryoprotector being amore potent vitrificant solution than “VS4”), suggesting that vitrification is an inappropriate way to cryopreserve whole ewe ovaries for fertility purpose. On the other hand, we obtained a gestation after transplantation of slow frozen ewe ovaries. This gestation is the second reported worldwide. Our results suggest that vitrification of whole ovaries is impaired by improper cryoprotector exposition of ovaries through perfusion route.

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Introdução: A criopreservação de fragmentos de tecido ovariano previamente ao início da terapia oncológica e posterior reimplante do tecido ovariano tem sido sugerido como promissora alternativa para preservação de fertilidade. Neste sentido, um novo sistema de vitrificação denominado Ovarian Tissue Cryosystem (OTC), vem sendo desenvolvido visando aperfeiçoar a conservação do tecido congelado. Objetivo: Avaliar o impacto da criopreservação sobre a viabilidade do tecido ovariano murino vitrificado por três diferentes protocolos, dentre eles o sistema OTC. E avaliar o impacto do reimplante heterotópico do tecido ovariano murino fresco e descongelado pelos mesmos protocolos, sobre a sua viabilidade. Metodologia: Este é um estudo experimental onde foram utilizados tecido ovariano de camundongos C57BL/6. Três protocolos de vitrificação foram testados simultaneamente: protocolo murino (PrM); protocolo humano (PrH); protocolo OTC (PrOTC) em comparação ao grupo frescos (GF). As amostras foram analisadas imediatamente após o descongelamento (Etapa 1) ou após 15 ou 30 dias de reimplante retroauricular (Etapa 2). Para análise da viabilidade utilizou-se imunohistoquímica para proliferação celular (Ki-67), dano celular (NF-kB) e dano oxidativo (4-HNE e Nitrotirosina). Os resultados foram obtidos utilizando-se o teste Q-quadrado para verificar a distribuição entre os grupos e a imunomarcação (% de folículos marcados), sendo que o nível de significância adotado foi p<0,05. Resultados: Etapa 1: Os grupos PrOTC e PrM apresentaram melhor desempenho em relação à proliferação celular. Entretanto, estes mesmos protocolos apresentaram graus variados de dano oxidativo quando analisados pela imunomarcação de nitrotirosina, aonde o PrOTC teve maior marcação do que o GF, portanto maior dano, e o PrM teve maior marcação em relação ao HNE em comparação com os demais protocolos. Não houve nenhuma diferença na marcação do NF-kB entre os grupos descongelados. Etapa 2: O reimplante em si não pareceu comprometer significativamente o tecido, uma vez que as amostras GF e GF reimplantado com 15 e 30 dias tiveram desempenho semelhante em relação à todos os marcadores, com exceção do GF 30 dias que mostrou algum grau de dano oxidativo pela nitrotirosina (p<0,05). E ao se avaliar a somatória de efeitos entre congelamento e reimplante entre os diferentes protocolos apenas o PrH evidenciou dano tecidual imediatamente após o descongelamento e dano progressivo após o reimplante. Conclusão: Os PrM e PrOTC foram semelhantes ao GF na conservação da amostra durante o processo de criopreservação, sendo que o PrOTC causou algum grau de dano oxidativo. O reimplante retroauricular do tecido não impactou sobre a sua viabilidade do mesmo nem no GF e nem nos PrM e PrOTC. O PrH mostrou-se inadequado para a conservação de tecido ovariano murino. / Introduction: The Cryopreservation of fragments of ovarian tissue prior to initiation of oncotherapy and subsequent reimplantation of ovarian tissue has been suggested as promising alternative for fertility preservation. In this sense, a new system of vitrification called Ovarian Tissue Cryosystem (OTC), has been developed in order to improve the frozen ovarian tissue conservation. Objective: To compare the viability of murine ovarian tissue vitrified by three different vitrification protocols and to verify the efficiency of the Ovarian Tissue Cryosystem (OTC). Methods: This is an experimental study using ovarian tissue of C57BL/6 mice. Three vitrification protocols were tested simultaneously: Murine protocol (PrM); Human Protocol (PrH) and Protocol OTC (PrOTC); in comparison to Fresh Tissue (GF). Samples were analyzed immediately after thawing (Step 1) or after 15 or 30 days of retroauricular reimplantation (Step 2). For viability analysis immunohistochemistry for cell proliferation (Ki-67), cell damage (NF-kB) and oxidative damage (4-HNE and Nitrotyrosine) was used. The results were obtained using the Q-square test to analyze immunostaining counted as % of labeled follicles and the level of significance was set at p <0.05. Results: Step 1: The PrOTC and PrM presented the best performance in relation to cell proliferation. However, these same protocols presented varying degrees of oxidative damage when analyzed by the nitrotyrosine immunolabeling, where PrOTC had higher marking than GF, thus greater damage, and PrM had a greater marking in relation to HNE compared to the other protocols. There was no difference in the labeling of NF-kB between the thawed groups. Step 2: The reimplantation procedure did not appear to significantly impair the ovarian tissue quality once day 15 and 30 after fresh tissue engrafment of was similar for all markers except for nitrotyrosine after 30 days (p<0,05). And when assessing the sum of effects of freezing and reimplantation among the 3 different protocols only PrH showed tissue damage immediately after thawing and progressive damage after reimplantation. Conclusion: The PrM and PrOTC were similar to the GF in the preservation of the sample during the cryopreservation process, and PrOTC caused some degree of oxidative damage. Retroauricular reimplantation of the tissue did not impact on its viability in either the GF or PrM and PrOTC. PrH was found to be unsuitable for the cryopreservation of murine ovarian tissue.

O presente trabalho foi composto de dois estudos distintos. O Estudo I, com um foco conservacionista, teve como objetivo a avaliação e comparação de diferentes métodos de criopreservação de sêmen de bugio-preto (Alouatta caraya). Para tanto, o estudo foi dividido em dois experimentos: Experimento I composto de dois ensaios no primeiro ensaio foram comparados dois diluidores comerciais BotuBOV e Test-yolk buffer (TYB) e no segundo ensaio foram comparados dois métodos de criopreservação de sêmen congelação lenta e vitrificação; Experimento II avaliação dos efeitos da adição de DHA e de Trolox (análogo da vitamina E) ao diluidor para criopreservação de sêmen. O diluidor TYB apresentou melhores resultados quando comparados ao BotuBOV. A congelação lenta apresentou melhores resultados quando comparada à vitrificação. Não houve diferença entre o diluidor controle e os diluidores com Trolox, DHA ou combinação dos dois (DHAT), com exceção da integridade de acrossoma, que foi significativamente menor para o diluidor DHAT. Conclui-se que são necessários mais estudos, com utilização de outras doses de DHA e Trolox, além de outros antioxidantes. O Estudo II, com foco em pesquisa biomédica, teve como objetivo a criopreservação de sêmen de macaco-rhesus (Macaca mulata) e avaliação da qualidade pós-descongelação por meio de fecundação in vitro (FIV). Para tanto, o estudo foi dividido em três experimentos: Experimento I avaliação e comparação de dois métodos de criopreservação de sêmen congelação lenta e vitrificação; Experimento II avaliação e comparação de quatro métodos de preparação do sêmen pós-descongelação lavagem simples (LS), swim-up (SU), separação por gradiente de densidade (SGD) e filtragem em lã de vidro (FLV); Experimento III avaliação da qualidade seminal pós-descongelação por meio de FIV. A congelação lenta apresentou melhores resultados que a vitrificação (p<0,05). LS apresentou os melhores resultados, seguido por SGD e SU, enquanto FLV apresentou os piores resultados. LS e SGD foram utilizados para avaliação da qualidade seminal por meio de FIV, utilizando sêmen fresco como controle. As taxas de fecundação (média±EPM%) para oócitos MI inseminados com sêmen fresco (43.5±16.4) foram significativamente maiores (p<0,05) que LS (2.0±2.0), mas não diferiram de SGD (25.1±14.2). Não houve diferença na taxa de blastocistos (média±EPM%) entre os tratamentos (variação de 0 a 11.9±7.9). As taxas de fecundação para oócitos MII inseminados com sêmen fresco (41.4±3.6) também foram significativamente maiores que SGD e LS (18.4±6.9 e 12.7±7.7, respectivamente), assim como a taxa de blastocistos (64.7±13.6; 4.7±4.7; 30.9±13.8, respectivamente). Conclui-se que, espermatozoides criopreservados foram capazes de fertilizar oócitos e os embriões atingiram o estágio de blastocisto. A SGD selecionou espermatozoides pós-descongelação de melhor qualidade para FIV em macacos-rhesus, quando comparada à LS / This work was divided in two studies. The objective of Study I was to test and compare different cryopreservation methods for sperm from black-and-gold howler monkeys (Alouatta caraya), with a focus on species conservation. The study was divided in two experiments. Experiment I composed of two trials the first trial compared two commercial extenders BotuBOV and Test-yolk buffer (TYB), and the second trial compared two cryopreservation methods slow freezing and vitrification; Experiment II evaluation of the effects of DHA and Trolox (vitamin E analog) as additives to the freezing extender. TYB had better results when compared to BotuBOV. Slow freezing had better results when compared to vitrification. There was no difference between control extender (TYB) and extender containing Trolox, DHA or a combination of both (DHAT), except for acrosome integrity, which was significantly lower for DHAT. In conclusion, more studies are necessary, using other doses of DHA and Trolox, as well as other antioxidants. The objective of Study II was to assess the quality of frozen-thawed sperm from rhesus macaques (Macaca mulatta) by in vitro fertilization (IVF). The study was divided in three experiments. Experiment I evaluation and comparison of two cryopreservation methods slow freezing and vitrification; Experiment II evaluation and comparison of four preparation methods for frozen-thawed sperm simple wash (SW), swim-up (SU), density gradient centrifugation (DGC), and glass wool filtration (GWF); and Experiment III evaluation of frozen-thawed sperm quality by IVF. Slow freezing had better results when compared to vitrification (p<0,05). SW had better results, followed by DGC and SU, while GWF had the worse results. SW and DGC were further evaluated by IVF. Fertilization rates (mean±SEM%) with MI oocytes using fresh sperm were significantly higher (43.5±16.4) than with SW (2.0±2.0) and did not differ from DGC (25.1±14.2). There was no difference in blastocyst rates between treatments (range 0 to 11.9±7.9). Fertilization rates with MII ova were also significantly higher with fresh sperm (41.4±3.6) than DGC and SW (18.4±6.9 and 12.7±7.7, respectively), and more blastocysts developed from MIIs fertilized with fresh sperm (64.7±13.6) than SW and DGC (4.7±4.7 and 30.9±13.8, respectively). In conclusion, frozen-thawed sperm were able to fertilize oocytes and embryos reached the blastocyst stage. DGC yielded better frozen-thawed sperm for IVF in rhesus macaques, when compared with SW

O apelo pela conservação ambiental e o significativo aumento no número de organismos cultivados de alto valor genético demandam tecnologias que permitam conservar sua genética, mesmo após a morte do animal. A criopreservação de gametas possibilita a preservação da genética de espécies ameaçadas e de interesse comercial, prolongando sua vida reprodutiva evitando assim a perda de material genético por doenças, catástrofes, transferência de animais ou perda do habitat natural. A criopreservação tem sido aplicada à conservação de ovários e tecido ovariano, no entanto, há muitas controvérsias acerca de qual seria o melhor protocolo a ser utilizado. Tendo isso em vista, o presente estudo teve como objetivo avaliar a morfologia do tecido ovariano de zebrafish criopreservado em cápsula de metal com o uso de diferentes soluções crioprotetoras. As soluções crioprotetoras utilizadas foram: 1,5 M metanol + 4,5 M propileno glicol (SC1); 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO (SC2); 1,5 M metanol + 4,5 M propileno glicol + 0,5 M sacarose (SC3); 1,5 M metanol + 5,5 M Me2SO + 0,5 M sacarose (SC4). Após o descongelamento a integridade de cinco estágios de desenvolvimento folicular foi avaliada em cada grupo. A morfologia celular foi observada através de análise histológica. A análise dos dados mostrou que os folículos em estágio I e II foram os melhores criopreservados em todos os grupos experimentais. Sendo que, os grupos SC4 e SC2 foram os que apresentaram os melhores resultados, respectivamente com 88,26% e 84,2% de folículos sem alterações morfológicas. Já os estágios foliculares mais avançados de desenvolvimento (estágios IV e V) apresentaram-se com alterações em todos os grupos. Portanto, apesar do sucesso na criopreservação dos estágios foliculares mais iniciais (I e II) foi possível identificar alterações morfológicas em todos os grupos avaliados. Dentre as principais alterações identificadas estão a aglutinação do citoplasma e enrugamento e ruptura da membrana do envelope celular. Ao avaliar os resultados pode-se concluir que apesar do uso da capsula de metal em associação com as soluções SC4 e SC2 apresentarem os melhores resultados, as soluções SC1 e SC3 também foram eficientes na manutenção da integridade morfológica de folículos imaturos, e portanto essa metodologia pode ser utilizada com sucesso na criopreservação de folículos imaturos. / The appeal for environmental conservation and the significant increase in the number of farmed organisms with high genetic value demand technologies to allow preserving their genetics, even after the death. Cryopreservation of gametes allows the preservation of genetics of the endangered and commercial species, prolonging their reproductive life. Furthermore, this technology prevents the loss of genetic material caused by diseases, disasters, transfer of animals or loss of natural habitat. Cryopreservation has been applied to the conservation of ovaries and ovarian tissue, however, there are many controversies regarding what would be the best protocol to use. Thus, the aim of this study was to evaluate the morphology of cryopreserved zebrafish ovarian tissue using a metal capsule with four different cryoprotectant solutions. The cryoprotectant solutions used were: 1.5M methanol + 4.5 M propylene glycol (CS1); 1.5M methanol + 5.5 M Me2SO (CS2); 1.5M methanol + 4.5 M propylene glycol + 0.5 M sucrose (CS3); Methanol + 1.5 M 5.5 M 0.5 M sucrose + Me2SO (CS4). After heating the integrity of the five stages of follicular development was assessed in each group. Cell morphology was observed by histological analysis. The thermal gradient inside the capsule and the sample was verified by a thermistor Pt500, model Keithley 2001A. The data analysis shows that the follicles at stage I and II were better cryopreserved among all experimental groups. The treatments CS4 and CS2 showed the best results, respectively with 88.26% and 84.2% of follicles without morphological changes in stage I. The most advanced follicular development stages (stages IV and V) showed changes in all treatments. Therefore, despite the successful cryopreservation of earlier follicular stages (I and II), it was possible to identify morphological changes in all the groups. Among the main changes identified, agglutination of cytoplasm and rupture of cell and wrinkling of the egg envelope could be observed. Despite the use of the metal capsule in association with the CS4 and CS2 solutions showed the best results, CS1 and CS3 solutions were also effective in maintaining the morphological integrity of immature follicles, therefore this method can be successfully used in the cryopreservation of immature follicles.

O presente trabalho foi composto de dois estudos distintos. O Estudo I, com um foco conservacionista, teve como objetivo a avaliação e comparação de diferentes métodos de criopreservação de sêmen de bugio-preto (Alouatta caraya). Para tanto, o estudo foi dividido em dois experimentos: Experimento I composto de dois ensaios no primeiro ensaio foram comparados dois diluidores comerciais BotuBOV e Test-yolk buffer (TYB) e no segundo ensaio foram comparados dois métodos de criopreservação de sêmen congelação lenta e vitrificação; Experimento II avaliação dos efeitos da adição de DHA e de Trolox (análogo da vitamina E) ao diluidor para criopreservação de sêmen. O diluidor TYB apresentou melhores resultados quando comparados ao BotuBOV. A congelação lenta apresentou melhores resultados quando comparada à vitrificação. Não houve diferença entre o diluidor controle e os diluidores com Trolox, DHA ou combinação dos dois (DHAT), com exceção da integridade de acrossoma, que foi significativamente menor para o diluidor DHAT. Conclui-se que são necessários mais estudos, com utilização de outras doses de DHA e Trolox, além de outros antioxidantes. O Estudo II, com foco em pesquisa biomédica, teve como objetivo a criopreservação de sêmen de macaco-rhesus (Macaca mulata) e avaliação da qualidade pós-descongelação por meio de fecundação in vitro (FIV). Para tanto, o estudo foi dividido em três experimentos: Experimento I avaliação e comparação de dois métodos de criopreservação de sêmen congelação lenta e vitrificação; Experimento II avaliação e comparação de quatro métodos de preparação do sêmen pós-descongelação lavagem simples (LS), swim-up (SU), separação por gradiente de densidade (SGD) e filtragem em lã de vidro (FLV); Experimento III avaliação da qualidade seminal pós-descongelação por meio de FIV. A congelação lenta apresentou melhores resultados que a vitrificação (p<0,05). LS apresentou os melhores resultados, seguido por SGD e SU, enquanto FLV apresentou os piores resultados. LS e SGD foram utilizados para avaliação da qualidade seminal por meio de FIV, utilizando sêmen fresco como controle. As taxas de fecundação (média±EPM%) para oócitos MI inseminados com sêmen fresco (43.5±16.4) foram significativamente maiores (p<0,05) que LS (2.0±2.0), mas não diferiram de SGD (25.1±14.2). Não houve diferença na taxa de blastocistos (média±EPM%) entre os tratamentos (variação de 0 a 11.9±7.9). As taxas de fecundação para oócitos MII inseminados com sêmen fresco (41.4±3.6) também foram significativamente maiores que SGD e LS (18.4±6.9 e 12.7±7.7, respectivamente), assim como a taxa de blastocistos (64.7±13.6; 4.7±4.7; 30.9±13.8, respectivamente). Conclui-se que, espermatozoides criopreservados foram capazes de fertilizar oócitos e os embriões atingiram o estágio de blastocisto. A SGD selecionou espermatozoides pós-descongelação de melhor qualidade para FIV em macacos-rhesus, quando comparada à LS / This work was divided in two studies. The objective of Study I was to test and compare different cryopreservation methods for sperm from black-and-gold howler monkeys (Alouatta caraya), with a focus on species conservation. The study was divided in two experiments. Experiment I composed of two trials the first trial compared two commercial extenders BotuBOV and Test-yolk buffer (TYB), and the second trial compared two cryopreservation methods slow freezing and vitrification; Experiment II evaluation of the effects of DHA and Trolox (vitamin E analog) as additives to the freezing extender. TYB had better results when compared to BotuBOV. Slow freezing had better results when compared to vitrification. There was no difference between control extender (TYB) and extender containing Trolox, DHA or a combination of both (DHAT), except for acrosome integrity, which was significantly lower for DHAT. In conclusion, more studies are necessary, using other doses of DHA and Trolox, as well as other antioxidants. The objective of Study II was to assess the quality of frozen-thawed sperm from rhesus macaques (Macaca mulatta) by in vitro fertilization (IVF). The study was divided in three experiments. Experiment I evaluation and comparison of two cryopreservation methods slow freezing and vitrification; Experiment II evaluation and comparison of four preparation methods for frozen-thawed sperm simple wash (SW), swim-up (SU), density gradient centrifugation (DGC), and glass wool filtration (GWF); and Experiment III evaluation of frozen-thawed sperm quality by IVF. Slow freezing had better results when compared to vitrification (p<0,05). SW had better results, followed by DGC and SU, while GWF had the worse results. SW and DGC were further evaluated by IVF. Fertilization rates (mean±SEM%) with MI oocytes using fresh sperm were significantly higher (43.5±16.4) than with SW (2.0±2.0) and did not differ from DGC (25.1±14.2). There was no difference in blastocyst rates between treatments (range 0 to 11.9±7.9). Fertilization rates with MII ova were also significantly higher with fresh sperm (41.4±3.6) than DGC and SW (18.4±6.9 and 12.7±7.7, respectively), and more blastocysts developed from MIIs fertilized with fresh sperm (64.7±13.6) than SW and DGC (4.7±4.7 and 30.9±13.8, respectively). In conclusion, frozen-thawed sperm were able to fertilize oocytes and embryos reached the blastocyst stage. DGC yielded better frozen-thawed sperm for IVF in rhesus macaques, when compared with SW

Introdução: O fuso meiótico dos oócitos de mamíferos pode se despolimerizar quando exposto a pequenas variações de temperatura. Este fato já está bem estabelecido e estudado em oócitos maduros em metáfase II (MII). No entanto, pouco se sabe a respeito da influência da diminuição da temperatura sobre o fuso meiótico dos oócitos imaturos. Desse modo, este estudo tem como objetivos: 1) avaliar a influência da diminuição da temperatura sobre o fuso meiótico de oócitos de camundongas maturados in vitro e 2) avaliar o fuso meiótico em oócitos humanos maturados in vitro submetidos à criopreservação pela técnica de congelação lenta ou por vitrificação quando em estágio de vesícula germinativa. Métodos: Realizaram-se dois experimentos, denominados 1 e 2, sendo o primeiro em oócitos de camundongas e o segundo em oócitos humanos. No experimento 1 oócitos imaturos de camundongas nos estágios de metáfase I (MI), telófase I(TI) e MII foram cultivados nas seguintes temperaturas: 37º C (controle), temperatura ambiente (22oC) e 4º C por 0, 10, 30 e 60 minutos. Após este período de tempo o fuso meiótico oocitário foi avaliado por meio de microscopia de luz polarizada (MLP) (LC-Polscope-Oosight image software) e imunocitoquímica (IC). No experimento 2 oócitos em estágio de vesícula germinativa (GV) coletados de pacientes submetidas à indução da ovulação e fertilização in vitro, foram divididos de forma randômica em três grupos: oócitos a fresco (A), oócitos congelados pela técnica de congelação lenta (B) e oócitos congelados pela técnica de vitrificação (C). Os oócitos a fresco, os descongelados e os aquecidos foram maturados in vitro até estágio de (MII). A análise do fuso meiótico foi realizada por microscópio invertido equipado com uma câmera de vídeo analógica e um sistema de imagens que combina luz polarizada em cristal líquido (ICSI Guard Octax). Resultados: Experimento 1: No tempo 0 e à 37º C, todos os oócitos apresentavam o fuso meiótico visível tanto pela MLP quanto pela IC. À 4º C, o número de oócitos em MI com fuso meiótico visível por meio da MLP foi menor do que com a IC, e descresceu com o tempo, fato que também ocorreu, em menor proporção, com os oócitos em TI. No entanto, a 4º C, o reconhecimento do fuso meiótico dos oócitos em TI foi semelhante tanto para MLP como para IC. Quando os oócitos MII foram expostos à 4º C, a detecção do fuso meiótico teve descréscimo diretamente proporcional ao tempo de cultura quando foi utilizada a MLP, sendo que o mesmo ocorreu para a IC, porém de forma menos pronunciada. À temperatura ambiente houve um pequeno descéscimo na visualização do fuso meiótico tanto por MLP quanto por IC, porém este não foi estatisticamente significativo para os oócitos em TI. Experimento 2: A taxa de sobrevivência imediatamente após o descongelamento/ aquecimento foi de 44,6% para o grupo B e de 79% para o grupo C. Após 24 horas em cultura , estas taxas passaram para 29,2% e 69%, respectivamente. A mediana de tempo para maturação foi de 26 horas para os grupos A e C, e de 27 horas para o grupo B. Ao final da maturação in vitro a porcentagem de oócitos em MII foi menor no grupo B e semelhante nos grupos A e C. Assim como para a detecção do fuso meiótico que foi menor no grupo B e similar nos grupos A e C. Conclusões: Houve diferença na porcentagem de despolimerização do fuso meiótico em resposta à baixa temperatura entre os oócitos de camundongas nos diferentes estágios da divisão meiótica, sendo menor nos oócitos em TI. A porcentagem de despolimerização do fuso meiótico foi diretamente proporcional ao tempo de cultivo, à exceção dos oócitos em TI à temperatura ambiente. Os oócitos hmanos em GV vitrificados apresentaram melhores taxas de sobrevivência quando comparados com oócitos humanos em GV criopreservados pelo congelamento lento. Os oócitos humanos em GV vitrificados apresentaram taxas semelhantes de maturação in vitro e detecção do fuso meiótico polimerizado quando comparados a oócitos a fresco / Introduction: The meiotic spindle of most mammals is sensitive to cooling and depolymerizes even after a slight reduction in temperature. This is well described and studied on matured oocytes at metaphase II (MII). However, little is known about the influence of low temperatures under meiotic spindle of imature oocytes. In this way, we sougth to evaluate: 1) the influence of low temperatures on mice oocyte meiotic spindle matured in vitro e 2) the oocyte meiotic spindle from human oocytes matured in vitro and cryopreserved by slow-rate freezing or vitrification at GV stage. Methods: Two experiments were done: the first one on mice and the second one on women.At experiment 1, immature mice oocytes at metaphase I (MI), telophase I (TI) and MII were cultured at 37º C (control), room temperature (22oC) and 4º C for 0, 10, 30 and 60 minutes and then spindle analysis was made with polarized light microscopy (PLM) (LC-Polscope-Oosight image software) or immunocytochemistry (ICC). At experiment 2, GV oocytes retrieved from women submitted to ovulation induction and in vitro fertilization were randomly divided in three groups: fresh oocytes (A), cryopreserved by slow-freezing (B) and cryopreserved by vitrification (C). Fresh, thawed and warmed oocytes were matured in vitro to metaphase II oocytes (MII). A meiotic spindle analysis was done by polarized light microscopy (ICSI Guard Octax). Results: Experiment 1: At time 0 min and 37º C, all oocytes had polymerized spindles both at PLM or ICC. At 4º C, the number of MI oocytes with detectable spindles at PLM was smaller than those analysed by ICC, and it decreased with time, which had also occured with TI oocytes at a smaller proportion. However, at 4º C, TI meiotic spindle recognition with polarized light microscopy and ICC was comparable. When MII oocytes were cultured at 4º C, the spindle visualization decreased proportionally in correlation with culture time at PLM, and the same happened with ICC in a less pronounced manner. At room temperature there was a little descrease regarding visualization of meiotic spindle, both at PLM and ICC, altought it was not significant for TI oocytes. Experiment 2: Oocyte survival immediately after thawing/warming were 44.6% for group B and 79% for group C. After 24 hours of culture, oocyte survival was 29.2% and 69%, respectively. The median time for maturation was 26 hours for groups A and C, and 27 hours for group B. The percentage of MII after maturation in vitro were smaller in group B and similar between groups A and C. The same oocured for spindle visualization which were lower in group B and similar between groups A and C. Conclusions: There was a difference on the percentages of meiotic spindle depolymerization in response to cooling in mice oocytes at different stages of meiotic division. Spindle depolymerization was lower in TI. Also, meiotic spindle depolimerization was proportional to culture time, except for TI oocytes at room temperature.Vitrified GV oocytes had a better survival when warmed, compared to slow-rate frozen oocytes. Vitrified GV oocytes had similar maturation in vitro rates and polymerized spindles detection when compared to fresh oocytes

Os experimentos tiveram como objetivo determinar a taxa de eclosão dos embriões vitrificados em volumes diferentes de 9,0 M de etileno glicol. Simultaneamente, testou-se dois procedimentos de estocagem dos fios de teflon, denominados caixa de aço inoxidável e globete/raque. No experimento I, os 881 embriões coletados foram distribuídos em 4 tratamentos: tratamento 1 (T1= controle): 307 embriões foram cultivados in vitro em meio PBSm, acrescido de 0,4% de BSA; tratamento 2 (T2): 292 embriões foram expostos à solução de glicerol 10% acrescida de 0,4% de BSA, envasados em palhetas de 0,25 mL e submetidos ao congelamento pelo método rápido em Biocool; tratamento 3 (T3): 138 embriões foram expostos durante 2 minutos à solução de desidratação (10% de EG + 6% BSA em PBSm) e então transferidos para a solução de vitrificação (50% de EG + 6% de BSA em PBSm), onde permaneceram por 30 segundos e foram colocados em volume de 1 μL no interior de um fio de teflon, medindo 0,4 mm de diâmetro, 2,0 cm de comprimento e 0,05 mm de espessura. Os fios foram acondicionados em uma caixa de aço inoxidável para serem armazenados em nitrogênio líquido; tratamento 4 (T4): 144 embriões foram expostos à solução de desidratação (10% de EG + 6% BSA em PBSm) e após 2 minutos, foram transferidos para a solução de vitrificação (50% de EG + 6% BSA em PBSm), onde permaneceram por 30 segundos, sendo após transferidos para um volume de 1 μL no interior do fio de teflon. Os fios de teflon foram estocados em globetes unidos às raques e mantidos em nitrogênio líquido. Após o aquecimento, os embriões foram cultivados em PBSm suplementado com 0,4% de BSA. As taxas de eclosão embrionária observadas foram: T1=76,29% (245/307); T2=41,05% (117/292); T3=37,98% (54/138) e T4=26,78% (37/144). No segundo experimento, 747 embriões foram distribuídos em 3 tratamentos: tratamento 1 (T1= controle): 80 embriões foram cultivados in vitro em meio KSOM acrescido de 0,4% de BSA; tratamento 2 (T2): 334 embriões expostos em solução de glicerol 10% acrescida de 0,4% de BSA, foram envasados em palhetas de 0,25 mL e submetidos ao congelamento pelo método rápido em Biocool; tratamento 3 (T3): 333 blastocistos foram expostos durante 2 minutos à solução de desidratação (10% de EG + 0,4% BSA em PBSm) e então transferidos para tubos eppendorf de 2,0 mL em contato com a solução de vitrificação (50% de EG + 0,4% BSA em PBSm). Após o cultivo in vitro, as taxas de eclosão embrionária observadas nos 3 tratamentos foram respectivamente: 88,75% (71/80), 40,44% (141/334) e 19,70% (66/333). Baseado nesses resultados conclui-se que embriões Mus domesticus domesticus submetidos à técnica de vitrificação após exposição à solução de 9,0 M de etileno glicol e envase em fios de teflon assegurou índices satisfatórios de sobrevivência embrionária. As taxas de sobrevivência dos embriões Mus domesticus domesticus foi independente do procedimento de estocagem em botijão de nitrogênio líquido. A vitrificação em solução de 9,0 M de etileno glicol com envase em tubos eppendorf não foi eficiente para promover altas taxas de sobrevivência embrionária, mas proporcionou segurança biológica aos embriões, durante o armazenamento. / This work was performed with Mus domesticus domesticus embryos to verify the in vitro viability of vitrified embryos using differents volumes of ethylene glycol–based solution. The experiment I consisted of four treatments. The 881 collected embryos were arranged as follows: treatment 1(control): 307 fresh embryos were cultured in vitro in PBSm + 0.4% BSA without being exposed to either dehydration or cryoprotectants agents; treatment 2: 292 embryos were loaded into 0.25 mL french straws containing 10% glycerol + 0.4% BSA in PBSm and after 10 minutes the straws were submitted to the rapid-freezing procedure (Biocool®, controlled freezer); treatment 3:138 embryos were exposed during 2 minutes to a dehydration solution (10% ethylene glycol + 6% BSA in PBSm) and then transferred to the vitrification solution (50% ethylene glycol + 6% BSA in PBSm) in teflon wire with 0.4 mm diameter, 2 cm length and 0.05 mm thickness containing the drop of 1μL volume, and placed into stainless steel box for the storage in LN2; treatment 4:144 embryos were exposed to a dehydration solution (10% ethylene glycol + 6% BSA in PBSm) and after 2 minutes were transferred to the teflon wire, that was previousily loaded with 1μL of the vitrification solution (50% ethylene glycol + 6% BSA in PBSm). Finally, the teflon wires were placed into plastic globets attached to aluminum canes and maintained in LN2. After thawing, the embryos were serially washed in PBSm, and then cultured in PBSm supplemented with 0.4% BSA. The hatched blastocyst rates observed in the treatments were: T1=76.29% (245/307); T2=41.05% (117/292); T3=37.98% (54/138) and T4=26.78% (37/144). In the second experiment, 747 embryos were arranged as follows: treatment 1(control): consisted of 80 fresh embryos cultured in vitro in KSOM medium + 0.4% BSA without being exposed to either dehydration or cryoprotectants agents; treatment 2: 334 embryos were loaded into 0.25 mL french straws containing 10% glycerol + 0.4% BSA in PBSm and after 10 minutes the straws were submitted to the rapid-freezing procedure (Biocool®, controlled freezer); treatment 3: 333 embryos were exposed during 2 minutes to a dehydration solution (10% ethylene glycol + 0.4% BSA in PBSm) and then transferred to the eppendorf tubes loaded with the vitrification solution (50% ethylene glycol + 0.4% BSA in PBSm). After in vitro culture, the hatched blastocysts rates observed were: T1=88.75% (71/80); T2=40.44% (141/334) and T3=19.70% (66/333). Based on these results it is concluded that the embryos of Mus domesticus domesticus submitted to vitrification procedure after being exposed to 9.0 M of ethylene glycol – based solution and loaded in teflon wires were efficient to promote satisfactory embryo survival rates. The survival rate of Mus domesticus domesticus embryos was independent of the LN2 storage procedure. The vitrification procedure after being exposed to 9.0 M of ethylene glycol – based solution and loaded in eppendorf tubes were not efficient to promote high embryo survival rate, but to warrant the embryo’s biologically security during storage in liquid nitrogen.