Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-28Bitstream added on 2014-06-13T19:51:00Z : No. of bitstreams: 1 mattoso_crs_me_botfmvz.pdf: 741864 bytes, checksum: 4f4908ca9c565d80c40053bc4cacf8bb (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O fator de von Willebrand (FvW) realiza sua função promovendo a adesão plaquetária ao local de injúria vascular e funcionando como um estabilizador funcional para o fator VIII. As células endoteliais são o maior local de síntese e armazenamento do FvW. Também existe produção pelos megacariócitos, porém, as plaquetas caninas praticamente não armazenam o FvW. A doença de von Willebrand (DvW) é o distúrbio hemostático hereditário mais comum em homens e cães. Estudos mostram uma prevalência de 1 a 2% em humanos, sendo o tipo 1 o mais freqüente (60-80%), seguido pelo tipo 2 (15-30%) e pelo tipo 3 (5-10%). Em cães, a DvW já foi diagnosticada em mais de 54 raças, sendo encontrada com alta prevalência em Dobermanns. Os sinais clínicos mais comuns da DvW são sinais de alteração em hemostasia primária. Em cães, a DvW pode ser dividida em três tipos, de acordo com a fisiopatologia. A doença do tipo 1 é definida como uma deficiência parcial quantitativa do FvW. O tipo 2 consiste em perda desproporcional das formas multiméricas de alto peso molecular e o tipo 3 resulta de uma deficiência quantitativa grave do FvW. Os testes diagnósticos mais utilizados para a DvW são tempo de sangria, dosagem do antígeno do FvW, atividade de cofator da ristocetina, agregação plaquetária induzida pela ristocetina e análise multimérica do FvW. O objetivo deste estudo foi determinar e padronizar o teste padrão para diagnóstico de Resumo cães com Doença de von Willebrand. Os testes estudados foram: Tempo de sangria da mucosa oral (TSMO), Agregação plaquetária induzida pela Ristocetina (RIPA) e Antígeno do fator de von Willebrand (FvW:Ag) ELISA... / von Willebrand factor (vWF) perform its function promoting platelet adhesion to the local of vascular injury and is important for the maintenance of FVIII stability and function. Endothelial cells are the major synthesis and storage site. Megakariocytes may also produce vWF, but canine platelets practically don t store vwF. Clinical signs more commonly seen in vWD are associated to primary hemostatic alterations. von Willebrand disease (vWD) is the most common inherited hemostatic disease in human and dogs. Studies had demonstrated a prevalence of 1 to 2% in human beings, being the type I the most common (60-80%), followed by type 2 (15-30%) and type 3 (5-10%). In dogs, vWD had already been diagnosed in more than 54 breeds, with a high prevalence in Dobermann Pinchers. In dogs, vWD may be divided in three types, according to the pathophysiology. Type 1 is defined as a quantitative partial deficiency of vWF. Type 2 consists of a disproportional loss of high molecular weight multimeric forms and type 3 results from a severe quantitative deficiency of vWF. The most used test for the diagnosis of vWD are the buccal mucosa bleeding time, measurement of vWF antigen, ristocetin cofactor activity test, platelet aggregation induced by ristocetin and multimeric analysis of vWF. The purpose of this work was to establish and standardize the gold standard test for screening test of dogs with von Willebrand disease. The following tests were studied: Buccal mucosa bleeding time (BMBT), Ristocetin induced platelet aggregation Abstract (RIPA) and von Willebrand factor Antigen (FvW:Ag) ELISA...(Complete abstract, click electronic address below)

A hipóxia é capaz de alterar muitos mecanismos bioquímicos nas células endoteliais. Dentre eles, a indução da expressão endotelial de moléculas de adesão, como o fator de von Willebrand (FVW) que, em resposta ao estímulo, é secretado em sua forma mais ativa na interação com as plaquetas, o que pode resultar em trombose. Nas condições fisiológicas, o padrão multimérico do FVW no plasma é essencialmente determinado pela ADAMTS-13 (uma desintegrina e metaloproteinase com domínios trombospondina). Este estudo teve como objetivo verificar se a atividade da enzima ADAMTS-13, assim como as características do FVW relacionáveis a ela, poderiam estar alteradas na presença de hipoxemia comparativamente à condição de oxigenação normal. Este estudo longitudinal envolveu 56 pacientes portadores de cardiopatias congênitas cianogênicas, em idades entre um e sete anos, candidatos ao tratamento cirúrgico. Os pacientes foram avaliados no pré-cirúrgico (basal), no pós-operatório imediato (pós 48 horas) e após 30 dias de cirurgia, e foram divididos em dois grupos (A e B) baseado na saturação periférica de oxigênio (SpO2) no momento pós 30 dias. Foram determinados o antígeno do FVW e a análise das suas subunidades, a atividade da ADAMTS-13 e a presença de inibidores da ADAMTS-13. Os pacientes de ambos os grupos apresentaram aumento significante da SpO2, da concentração antigênica do FVW e da atividade da ADAMTS-13 nos momentos pós 48 horas e pós 30 dias em comparação com o momento pré (basal). As densidades normalizadas da subunidade principal do FVW (225 kDa) e do fragmento de 176 kDa apresentaram tendência ao aumento nos momentos pós 48 horas e pós 30 dias nos dois grupos. A razão entre a atividade da ADAMTS-13 e o FVW estava menor do que 1 no momento pós 48 horas, indicando consumo da enzima; entretanto, no momento pós 30 dias a razão fica 1:1, e o FVW se aproxima dos valores de referência. Verificamos ainda que 29% destes pacientes apresentaram inibidores contra a ADAMTS-13 no momento pré-operatório. Ainda explorando as variáveis SpO2, FVW:Ag, atividade da ADAMTS-13 e a composição das subunidades do FVW, foi feito um estudo de correlação linear entre estas variáveis. Observamos uma baixa correlação entre a enzima ADAMTS-13 e o FVW:Ag, e da enzima com os fragmentos do FVW de 176 e 140 kDa, principalmente no grupo B. No grupo A, esta correlação no momento pós 48 horas mostrou tendência a ser negativa. A maioria dos pacientes apresentou melhoras na saturação periférica de oxigênio. O aumento das variáveis estudadas no pós-operatório imediato pode ter ocorrido em função da cirurgia, que provavelmente ocasionou um quadro de lesão endotelial com inflamação, indicando que pode existir um equilíbrio entre o FVW e a ADAMTS-13 em níveis fisiológicos. Entretanto, este equilíbrio pode ser quebrado quando ocorre aumento do FVW, provavelmente por consumo da enzima. Parece-nos, portanto, que a ADAMTS-13 pode funcionar como um mecanismo de proteção a estes pacientes com tendência à trombose / Hypoxia has been shown to alter several biochemical mechanisms in endothelial cells. In addition, hypoxia induces the endothelial expression of adhesion molecules, including von Willebrand factor (VWF). Increased release of high-molecular-weight VWF multimers is associated with higher risk for thrombotic events. In physiological conditions, the multimeric pattern of plasma VWF is essentially determined by the action of ADAMTS-13 (a desintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 domains). The aim of this study was to investigate if ADAMTS-13 activity and VWF subunit fragments were altered by hypoxia in cyanotic congenital heart disease. Fiftysix patients (age 1 to 7 years) with cyanotic congenital heart disease admitted to the Heart Institute for heart surgery were included in this longitudinal study. Patients were evaluated before (baseline) corrective surgery, postoperative 48 hours and postoperative 30 days. Patients were classified in two groups (A and B) based on the peripheral oxygen saturation after 30 days surgery. VWF antigenic concentration, VWF subunit composition, ADAMTS-13 activity and presence of ADAMTS-13 inhibitors were determined. Peripheral oxygen saturation, VWF:Ag and ADAMTS-13 activity were all increased significantly in both groups, in postoperative 48 hours and postoperative 30 days in comparison with baseline moment. Normalized density of VWF main subunit (225 kDa) and proteolytic fragment with 176 kDa tended to increase in postoperative 48 hours and postoperative 30 days in both groups. The rate between ADAMTS-13 activity and VWF:Ag was lower than 1 in postoperative 48 hours, an indicating of enzyme consumption; however, in the postoperative 30 days the rate was 1:1 and VWF:Ag values were near those of reference. 29% of patients presented ADAMTS-13 inhibitors at the baseline moment. A study of correlation among variables as peripheral oxygen saturation, VWF:Ag, VWF subunit composition and ADAMTS-13 was done. It was observed that ADAMTS-13 correlated slightly positively with VWF:Ag and with VWF fragments 176 and 140 kDa, mainly in group B; in group A, the correlation at postoperative 48 hours tended to be negative. Most of the patients improved their peripheral oxygen saturation. The increased value of variables observed in postoperative 48 hours can be explained by the endothelial injury and inflammation caused by the surgery itself. This indicates an equilibrium between VWF:Ag and ADAMTS-13 in physiological conditions. However, this equilibrium could disappear when VWF is increased, probably by enzyme consumption. We conclude that ADAMTS-13 can act as a protective mechanism in these patients with thrombotic tendency

A doença pulmonar obstrutiva crônica é uma doença que leva à obstrução pulmonar geralmente irreversível e está intimamente relacionada com o hábito de fumar. Ao longo dos anos, ocorre destruição dos septos alveolares com a degradação das fibras elásticas e depósito do colágeno que compõe estes septos. Muito tem se discutido sobre a existência de inflamação sistêmica no paciente com DPOC e sobre as suas possíveis manifestações extra-pulmonares . O processo de aterosclerose pode fazer parte deste espectro inflamatório a partir da presença de dano endotelial. O fator de Von Willebrand é um marcador de dano endotelial e pode ser dosado de forma quantitativa e qualitativa. Este trabalho demonstra uma diferença estatisticamente significativa, qualitativa e quantitativamente, entre os níveis de fator de Von Willebrand em tabagistas e em pacientes com DPOC, quando comparados ao grupo controle. Ao analisarmos os pacientes com DPOC dividindo-os em subgrupos considerando quatro classificações distintas: GOLD 2006 (Anexo A), GOLD 2011 (Anexo B), grau de sintomatologia a partir da escala de dispneia MRC modificada (Anexo C) e número de exacerbações no último ano. Observamos uma diferença estatisticamente significativa, em relação ao nível qualitativo do fator de von Willebrand, apenas quando comparamos pacientes com DPOC sintomáticos e não sintomáticos. Demonstramos ainda uma correlação inversa entre o percentual predito de volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF1%) com os níveis qualitativos de fator de von Willebrand. Desta forma, o fator de von Willebrand está aumentado no paciente com DPOC, sendo um possível marcador sérico de sintomatologia relacionado a esta doença. Apesar de não se conseguir definir gravidade dos pacientes com DPOC pelo GOLD, o fator de von Willebrand estabelece uma correlação inversa com os níveis de VEF1%, sugerindo algum tipo de participação na progressão da doença. / Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is an entity that leads to pulmonary obstruction generally irreversible. This is closely related to the smoking habit and leads to alveolar septal destruction with elastic fibres degradation and collagen fibres degradation. There are many argues about the presence of systemic inflammation in the COPD patients. The atherosclerosis process can be part of this inflammation spectrum from the presence of endothelial damage. The von Willebrand factor is a marker of endothelial damage and may be measured in a quantitative and qualitative form. This study demonstrates a significant statistically difference in both qualitative and quantitative form of von Willebrand factor in smokers and COPD patients compared to the control group. When analyzing subgroups in COPD patients considering four different classifications: GOLD 2006, GOLD 2011, degree of symptoms from the MRC dyspnea scale and number of exacerbations in the last year. We observed a significant statistically difference in the level of qualitative von Willebrand factor only in the subgroup of the degree of symptoms. Inverse correlation was observed with the percent of forced expiratory volume in one second (FEV1%) and the qualitative von Willebrand factor. Thus, the von Willebrand factor is increased in COPD patient and could be a possible serum marker of the presence of symptoms in this patient. We cannot identify the severity of COPD patients in GOLD classification using von Willebrand factor, but we established a inverse correlation between qualitative von Willebrand factor and FEV1%, what may suggest a participation in the progression of the disease.

Von Willebrand factor (VWF) promotes platelet adhesion and aggregation at sites of vascular damage. This function is directly related to the multimer size of VWF. The VWF-specific metalloprotease ADAMTS13 decreases VWF multimer size by cleaving at Y1605-M1606 in the VWF A2 domain. This thesis examined the sensitivity of ADAMTS13 cleavage to mutagenesis of the full-length multimerized VWF substrate, and a small VWF A2 domain fragment, VWF115. The ADAMTS13 cleavage site at Y1605-M1606 was mutated with the most severe loss of cleavage observed in Y1605A/M1606A. In addition, 4 single nucleotide polymorphisms were examined, with D1472H, Q1571H, P1601T proteins all showing increased resistance to cleavage. In contrast, G1643S has enhanced cleavage in the full-length VWF substrate but shows cleavage resistance in VWF115. Three von Willebrand disease mutations were also examined. In patients, R1597W has enhanced ADAMTS13 cleavage and a loss of high molecular weight multimers, while R1205H has enhanced protein clearance resulting in very low VWF levels and Y1584C patients have moderately low VWF levels. R1597W has enhanced cleavage of full-length VWF, while a slight cleavage increase is observed in VWF115 for Y1584C, and no change is seen with R1205H. The VWF mutations R1597W, Y1605A/M1606A, R1205H and Y1584C were further examined in the VWF knockout mouse using recombinant VWF protein infusion and hydrodynamic delivery of VWF cDNA to determine the effects these mutations produce on VWF antigen levels, multimer structure, secretion, clearance and function in a thrombotic injury model. All four mutations had different pathogenic mechanisms. R1597W showed accelerated clearance with loss of multimer structure, and greatly increased time to thrombotic occlusion. Y1605A/M1606A showed accelerated clearance with normal or supranormal multimer structure, a loss of thrombotic occlusion but increased platelet accumulation. Y1584C showed no change in protein clearance, with decreased VWF antigen level, reduced multimer structure, and reduced thrombotic potential. R1205H demonstrated a synthetic defect in vitro and in vivo increased clearance with a decrease in VWF antigen levels and normal multimer structure and a variable thrombotic potential. These results validate the use of the genetically-modified VWF knockout mouse model for evaluating the pathogenic mechanisms of putative VWF mutations. / Thesis (Ph.D, Pathology & Molecular Medicine) -- Queen's University, 2010-07-28 10:24:40.654

A doença pulmonar obstrutiva crônica é uma doença que leva à obstrução pulmonar geralmente irreversível e está intimamente relacionada com o hábito de fumar. Ao longo dos anos, ocorre destruição dos septos alveolares com a degradação das fibras elásticas e depósito do colágeno que compõe estes septos. Muito tem se discutido sobre a existência de inflamação sistêmica no paciente com DPOC e sobre as suas possíveis manifestações extra-pulmonares . O processo de aterosclerose pode fazer parte deste espectro inflamatório a partir da presença de dano endotelial. O fator de Von Willebrand é um marcador de dano endotelial e pode ser dosado de forma quantitativa e qualitativa. Este trabalho demonstra uma diferença estatisticamente significativa, qualitativa e quantitativamente, entre os níveis de fator de Von Willebrand em tabagistas e em pacientes com DPOC, quando comparados ao grupo controle. Ao analisarmos os pacientes com DPOC dividindo-os em subgrupos considerando quatro classificações distintas: GOLD 2006 (Anexo A), GOLD 2011 (Anexo B), grau de sintomatologia a partir da escala de dispneia MRC modificada (Anexo C) e número de exacerbações no último ano. Observamos uma diferença estatisticamente significativa, em relação ao nível qualitativo do fator de von Willebrand, apenas quando comparamos pacientes com DPOC sintomáticos e não sintomáticos. Demonstramos ainda uma correlação inversa entre o percentual predito de volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF1%) com os níveis qualitativos de fator de von Willebrand. Desta forma, o fator de von Willebrand está aumentado no paciente com DPOC, sendo um possível marcador sérico de sintomatologia relacionado a esta doença. Apesar de não se conseguir definir gravidade dos pacientes com DPOC pelo GOLD, o fator de von Willebrand estabelece uma correlação inversa com os níveis de VEF1%, sugerindo algum tipo de participação na progressão da doença. / Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is an entity that leads to pulmonary obstruction generally irreversible. This is closely related to the smoking habit and leads to alveolar septal destruction with elastic fibres degradation and collagen fibres degradation. There are many argues about the presence of systemic inflammation in the COPD patients. The atherosclerosis process can be part of this inflammation spectrum from the presence of endothelial damage. The von Willebrand factor is a marker of endothelial damage and may be measured in a quantitative and qualitative form. This study demonstrates a significant statistically difference in both qualitative and quantitative form of von Willebrand factor in smokers and COPD patients compared to the control group. When analyzing subgroups in COPD patients considering four different classifications: GOLD 2006, GOLD 2011, degree of symptoms from the MRC dyspnea scale and number of exacerbations in the last year. We observed a significant statistically difference in the level of qualitative von Willebrand factor only in the subgroup of the degree of symptoms. Inverse correlation was observed with the percent of forced expiratory volume in one second (FEV1%) and the qualitative von Willebrand factor. Thus, the von Willebrand factor is increased in COPD patient and could be a possible serum marker of the presence of symptoms in this patient. We cannot identify the severity of COPD patients in GOLD classification using von Willebrand factor, but we established a inverse correlation between qualitative von Willebrand factor and FEV1%, what may suggest a participation in the progression of the disease.

Orientador: Joyce Annichino-Bizzacchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T01:42:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bittar_LuisFernando_M.pdf: 1309049 bytes, checksum: 8d7bbcbc4a659300d128bc58336cbb88 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Níveis elevados de fator VIII (FVIII) são um fator de risco independente e prevalente para trombose venosa profunda (TVP), e tem influência do FvW. A ADAMTS13 é responsável pela modulação do tamanho molecular do FvW, clivando os multímeros de altíssimo peso molecular. Alterações moleculares no gene da ADAMTS13 têm correlação com sua atividade. Neste estudo avaliamos a prevalência do polimorfismo A4751G no gene do FvW (região de ligação com a ADAMTS13), os polimorfismos C1797T e C1852G e a mutação C4006T no gene da ADAMTS13 em 435 pacientes com TVP (156M/279F; idade mediana=37) e 580 controles (170M/410F, idade mediana=35). Investigamos a relação entre os genótipos e a dosagem de FVIII e FvW no plasma e o risco de TVP. A dosagem de FVIII:C foi realizada por método coagulométrico de um estágio, e as dosagens de FVIII:Ag e FvW:Ag por método imunoenzimático. As alterações moleculares foram determinadas por PCR e digestão com enzimas específicas, ou SSCP e sequenciamento para confirmação. Pacientes com TVP mostraram níveis significantemente aumentados de FVIII:C (203.7 UI/dl vs. 127 UI/dl; p<0.001), FVIII:Ag (109.6 UI/dl vs. 82.4 UI/dl; p<0.001) e FvW:Ag (154.2 UI/dl vs. 108 UI/dl; p<0.001) quando comparados com o grupo controle. Não houve diferença significativa entre os grupos na prevalência das alterações moleculares estudadas. Os indivíduos com genótipo AG (FvW A4751G) apresentavam níveis significativamente reduzidos de FVIII:C (p=0.04). Embora também tenha demonstrado uma discreta associação com níveis diminuídos de FvW:Ag, esta não foi estatisticamente significativa (p= 0.07). Os indivíduos com genótipo CG (ADAMTS13 C1852G) apresentavam níveis significativamente aumentados de FVIII:Ag (p=0.05) e FvW:Ag (p= 0.01). Apesar da relação com diminuição do FVIII o polimorfismo A4751G não mostrou um efeito protetor para TVP. O polimorfismo ADAMTS13 C1852G está associado à diminuição desta metaloprotease, e sua associação com níveis aumentados de FVIII:Ag e FvW:Ag neste estudo favorece essa hipótese. / Abstract: Elevated levels of factor VIII (FVIII) are a prevalent and independent risk factor for deep venous thrombosis (DVT), and are affected by von Willebrand factor (vWF) levels. ADAMTS13 is responsible for the modulation of the molecular size of vWF, cleaving the ultra large multimers. Mutations and polymorphisms in the ADAMTS13 gene are related with its activity. This study evaluated the prevalence of polymorphism A4751G in the vWF gene, polymorphisms C1797T, C1852G and the mutation C4006T in the ADAMTS13 gene in 435 patients with DVT and 580 healthy controls. Subsequently, we investigated the relationship between the genotypes and plasma levels of FVIII and vWF and DVT risk. FVIII:C was measured by a one-stage clotting method, and FVIII:Ag and vWF:Ag were measured by chromogenic method. The molecular changes were determined by restriction endonucleases or single strand conformation polymorphism followed by sequencing. Statistical test:U Mann-Whitney, = 0.05. Patients with DVT had higher plasma levels of FVIII:C (mean 203,7 UI/dl vs. 127 UI/dl; p<0.001), FVIII:Ag (mean 109,6 UI/dl vs. 82,4 UI/dl; p<0.001) and vWF:Ag (154,2 UI/dl vs. 108 UI/dl; p<0.001) when compared to controls. We observed no statistical difference in the prevalence of all molecular changes studied between patients and controls. A4751G heterozygotes had significantly reduced levels of FVIII:C (p=0,04). Althought there was a slight association with reduced levels of vWF: Ag, this association was not statistically significant (p= 0,07). C1852G heterozygotes had significantly elevated levels of FVIII:Ag (p=0.05) and vWF:Ag (p= 0,01). Despite the relative decline of FVIII:C with the A4751G polymorphism there was no protective effect for DVT. The C1852G polymorphism is associated with a reduction of ADAMTS13, and its association with increased levels of FVIII: Ag and vWF: Ag observed in this study supports this hypothesis. / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Margareth Castro Ozelo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T13:42:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Damian_GuilhermeBenedini_M.pdf: 1979799 bytes, checksum: 8b7242b6fe37a1f5f52bc6f26ca9d829 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A doença de von Willebrand (DVW) é a doença hemorrágica hereditária mais freqüente. Dentre os subtipos relacionados à DVW, o tipo 2N apresenta exclusivamente diminuição da afinidade do fator de von Willebrand (FVW) ao fator VIII (FVIII). Como conseqüência, esses pacientes apresentam redução do FVIII plasmático. Por essa razão, comumente esses casos são diagnosticados erroneamente como portadores de hemofilia A. Em um recente estudo brasileiro, foi observado que cerca de 10% dos casos de hemofílicos A leve sem antecedente familiar prévio para a doença, na verdade tratavam-se de DVW tipo 2N (SIMON & ROISENBERG, 2004). Para o diagnóstico de certeza da DVW tipo 2N, a avaliação molecular é o método mais utilizado, uma vez que os testes laboratoriais confirmatórios não apresentam boa reprodutividade. Esse estudo tem como objetivos fazer a investigação molecular de casos previamente diagnosticados ou com suspeita de DVW tipo 2N baseados na história clínica, familiar e dados laboratoriais. Além disso, pacientes diagnosticados com hemofilia A moderada e leve, foram investigados para a presença das quatro mutações mais freqüentes relacionadas à DVW tipo 2N. Esse estudo avaliou oito casos não relacionados de paciente com suspeita ou diagnóstico de DVW tipo 2N, acompanhados no Hemocentro da UNICAMP (Campinas, SP) e no Hemocentro do Espírito Santo (Vitória, ES). Os oito casos foram investigados para mutações presentes na região que corresponde ao local do sítio de ligação do FVIII ao FVW, localizada entre os éxons 18 a 27 do gene do FVW. Apenas um caso foi conclusivo, com a presença da mutação em homozigose R816W no gene do FVW Essa mutação corresponde à 11% dos casos de DVW tipo 2N. Os outros sete casos foram exaustivamente investigados para mutações nessa região, incluindo o seqüenciamento do DNA genômico e codificante da região entre éxon 18 a 27 do gene do FVW e não foram conclusivos. Esses mesmos casos foram investigados através do seqüenciamento do gene do FVIII, para avaliar a presença de mutação associada à hemofilia A. Em um dos casos do sexo feminino, foi possível a identificação de uma mutação em homozigose G265 +1 G>T no íntron 3 do gene do FVIII. Trata-se de uma mutação não descrita no local de um sítio doador de splice. Foram avaliados ainda 67 pacientes não relacionados com diagnóstico de hemofilia A leve ou moderada para as quatro mutações mais freqüentes relacionadas à DVW tipo 2N. Em nenhum desses casos essas mutações estavam presente, nem mesmo em heterozigose. Em conclusão, na avaliação de oito casos não relacionados com suspeita de DVW tipo 2N, em apenas um caso esse diagnóstico foi confirmado. Em outro caso do sexo feminino foi confirmado o diagnóstico de hemofilia A grave/moderada. Ao contrário do que foi observado em outra população brasileira estuda, entre os pacientes diagnosticados com hemofilia A leve e moderada aqui estudos, as quatro mutações mais freqüentes na região do sítio de ligação do FVIII ao FVW estavam ausentes em todos os casos. O diagnóstico de certeza entre a DVW tipo 2N e hemofilia A é de extrema importância para o tratamento correto desses casos e para o aconselhamento genético. A investigação molecular continua sendo a melhor maneira para a diferenciação desses casos / Abstract: The von Willebrand disease (VWD) is the most frequently hemorrhagic disease. Among the different types of VWD, the type 2N VWD is characterized by a markedly decreased affinity of von Willebrand factor (VWF) to factor VIII (FVIII). As consequence, the clearance of FVIII is accelerated and these patients while maintaining the concentration of VWF and its ability to normal platelet aggregation have reduced plasma FVIII. Frequently these cases are misdiagnosed as carriers of hemophilia A (HA). In a recent Brazilian study, it was observed that about 10% of cases of mild hemophilia A with no family history, it was actually type 2N VWD (SIMON & ROISENBERG, 2004). The molecular investigation is the best method to confirm the diagnosis of type 2N VWD once the confirmatory test, VWF:FVIII binding assay (VWF:FVIIIB) it is not reproducible. This study aims investigate the molecular diagnosis of cases previously diagnosed or with suspect of type 2N VWD, based on clinical and family history, and laboratorial data. Furthermore, patients diagnosed with mild or moderate hemophilia A, were investigated for the presence of the four most frequent mutations related to type 2N VWD. The study evaluated eight unrelated cases with suspect or diagnosis of type 2N VWD followed at Hemocentro UNICAMP (Campinas, SP) and Hemocentro do Espírito Santo (Vitória, ES). The eight cases were investigated for mutations in the region that corresponds to the location of the binding site of FVIII to VWF, located between exons 18 to 27 of the VWF gene. Only one case was conclusive, with the presence of the R816W mutation in the VWF gene. This mutation corresponds to 11% of type 2N VWD. The other seven cases were repeatedly investigated for mutations in this region, including the sequencing of genomic DNA and the coding region of exon 18 to 27 of the VWF gene and were not conclusive. These same cases were investigated by sequencing of the FVIII gene to assess the presence of mutations associated with hemophilia A. In one female case, it was possible to determine the presence in homozigose of a mutation G265 +1 G>T, a donor splicing region in the intron 3 of the FVIII gene. This mutation was not previously described. In addition, we evaluated 67 unrelated patients with diagnosis of mild or moderate hemophilia A for the four most frequent mutations related to type 2N VWD. None of these cases showed the presence of these mutations, even in heterozygosis. In conclusion, the evaluation of eight unrelated cases for type 2N VWD showed that just one case this diagnosis was confirmed. Different to what was observed in another Brazilian population studied, among mild and moderate hemophilia A followed at the Hemocentro UNICAMP, the four mutations in the binding site of FVIII to VWF were absent in all the cases. The confirmatory diagnosis between type 2N VWD and hemophilia A is extremely important for the correct treatment and the appropriate genetic counselling. The molecular investigation remains the best way to differentiate these cases / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

Understanding the differential bonding mechanics underlying bleeding disorders is of crucial importance to human health. In this research insight is provided into how four of these bleeding disorders (each with somewhat similar clinical characteristics), work at the molecular bond level. The bleeding diseases studied here can result from defects in the platelet glycoprotein (GP) Ibα the von Willebrand factor (vWF) molecule, or the ADAMTS-13 enzyme. Types 2B and 2M von Willebrand Disease (VWD) result in excess bleeding, yet type 2B has increased binding affinity between platelet GPIbα and vWF, while type 2M has decreased binding affinity between these two molecules. Platelet type VWD (pt-VWD) causes mutations in the GPIbα molecule and has similar characteristics to type 2B VWD. Further, in thrombotic thrombocytopenic purpura, bleeding results when there is a lack of active ADAMTS-13 enzyme. Each disease results in patient bleeding, but due to different mechanisms. This dissertation will explore the bonding mechanics between GPIbα and vWF and how they are altered in each disease state. To observe the GPIbα-vWF bonding mechanics, rolling velocities, transient tethering lifetimes, and tether frequency were determined using a parallel plate flow chamber. Data from these experiments suggest that wt-wt interactions are force dependent and have biphasic catch-slip bonding behavior. The data show that the shear stress at which the maximum mean stop time occurs differs between gain-of-function and loss-of-function mutations. Using similar methods, we study the changes resulting from pt-VWD mutations in GPIbα, and find that the catch bond seen for wt-wt interactions is lost for these mutations. Further, the data suggest that interactions with gain-of-function GPIbα mutations may be transport rather than force dependent. Finally, how the GPIbα-vWF tether bond changes for thrombotic thrombocytopenic purpura was also investigated to show that the bond lifetime in the absence of the enzyme is increased presenting a possible rationale for why bleeding occurs in this disease. Overall, the data show how the bonding mechanics of the GPIbα-vWF tether bond differ in four bleeding diseases. Further, these observations offer potential explanations for how these changes in the bonding mechanism may play a role in the observed patient bleeding.

Orientador: Regina Kiomi Takahira / Banca: Raimundo Souza Lopes / Banca: Paulo Ricardo de Oliveira Paes / Resumo: O fator de von Willebrand (FvW) realiza sua função promovendo a adesão plaquetária ao local de injúria vascular e funcionando como um estabilizador funcional para o fator VIII. As células endoteliais são o maior local de síntese e armazenamento do FvW. Também existe produção pelos megacariócitos, porém, as plaquetas caninas praticamente não armazenam o FvW. A doença de von Willebrand (DvW) é o distúrbio hemostático hereditário mais comum em homens e cães. Estudos mostram uma prevalência de 1 a 2% em humanos, sendo o tipo 1 o mais freqüente (60-80%), seguido pelo tipo 2 (15-30%) e pelo tipo 3 (5-10%). Em cães, a DvW já foi diagnosticada em mais de 54 raças, sendo encontrada com alta prevalência em Dobermanns. Os sinais clínicos mais comuns da DvW são sinais de alteração em hemostasia primária. Em cães, a DvW pode ser dividida em três tipos, de acordo com a fisiopatologia. A doença do tipo 1 é definida como uma deficiência parcial quantitativa do FvW. O tipo 2 consiste em perda desproporcional das formas multiméricas de alto peso molecular e o tipo 3 resulta de uma deficiência quantitativa grave do FvW. Os testes diagnósticos mais utilizados para a DvW são tempo de sangria, dosagem do antígeno do FvW, atividade de cofator da ristocetina, agregação plaquetária induzida pela ristocetina e análise multimérica do FvW. O objetivo deste estudo foi determinar e padronizar o teste padrão para diagnóstico de Resumo cães com Doença de von Willebrand. Os testes estudados foram: Tempo de sangria da mucosa oral (TSMO), Agregação plaquetária induzida pela Ristocetina (RIPA) e Antígeno do fator de von Willebrand (FvW:Ag) ELISA...(Resumo completo, clicar eletrônico abaixo) / Abstract: von Willebrand factor (vWF) perform its function promoting platelet adhesion to the local of vascular injury and is important for the maintenance of FVIII stability and function. Endothelial cells are the major synthesis and storage site. Megakariocytes may also produce vWF, but canine platelets practically don’t store vwF. Clinical signs more commonly seen in vWD are associated to primary hemostatic alterations. von Willebrand disease (vWD) is the most common inherited hemostatic disease in human and dogs. Studies had demonstrated a prevalence of 1 to 2% in human beings, being the type I the most common (60-80%), followed by type 2 (15-30%) and type 3 (5-10%). In dogs, vWD had already been diagnosed in more than 54 breeds, with a high prevalence in Dobermann Pinchers. In dogs, vWD may be divided in three types, according to the pathophysiology. Type 1 is defined as a quantitative partial deficiency of vWF. Type 2 consists of a disproportional loss of high molecular weight multimeric forms and type 3 results from a severe quantitative deficiency of vWF. The most used test for the diagnosis of vWD are the buccal mucosa bleeding time, measurement of vWF antigen, ristocetin cofactor activity test, platelet aggregation induced by ristocetin and multimeric analysis of vWF. The purpose of this work was to establish and standardize the gold standard test for screening test of dogs with von Willebrand disease. The following tests were studied: Buccal mucosa bleeding time (BMBT), Ristocetin induced platelet aggregation Abstract (RIPA) and von Willebrand factor Antigen (FvW:Ag) ELISA...(Complete abstract, click electronic address below) / Mestre

von Willebrand disease (VWD) is the most common autosomal bleeding disorder. It is divided into type 1, 2 and 3. Type 2 VWD shows qualitative defects in VWF and is further sub-classified into type 2A, 2B, 2M and 2N, each having different functional defects in VWF. Most of the associated mutations are located at the exons in VWF which encode for the affected functional domains. Diagnosis of VWD is currently based on history and phenotypic tests, which can be difficult often times. Therefore, molecular diagnosis of type 2 VWD is an attractive alternative. There are only a few genotypic characterisation studies of type 2 VWD in Chinese. This study aims to provide genetic data of type 2 VWD in Hong Kong. Archive DNA samples of 21non-type 2N type 2 VWD patients (Group 1), 15 type 2N/mild haemophilia A (HA) patients (Group2) and 35 control subjects were recruited. VWF exon 27, 28 and exon 18, 19, 20, 23, 24 were Sanger sequenced in Group 1 and Group 2 subjects, respectively. All seven exons were sequenced in the control subjects. Seven of 21 Group 1 subjects were found to have pathogenic mutation sin exon 28, with 2being novel. Only 1 Group 2 subject was found to be heterozygous for a novel non-synonymous variation at exon 23, the significance of which could not be ascertained. Sixteen benign polymorphisms were detected from exons sequenced in patients and controls. The low pathogenic mutation detection rate may suggest that the pattern of mutation in Chinese is different from other populations. The possibility of misdiagnosis in a proportion of these patients cannot be excluded in view of the known difficulty in patient ascertainment in VWD and the limited phenotypic diagnostic tools available in Hong Kong. Further studies of other exons are indicated to document the mutation spectrum of type 2 VWD in our Chinese population. RNA work and functional studies are required to fully characterise novel sequence variations found. High throughput mutation detection platforms and better phenotypic characterisation will facilitate the introduction of VWD genotyping into routine clinical diagnostics. / published_or_final_version / Pathology / Master / Master of Medical Sciences