Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde / A doença da urina do xarope do bordo (DXB) constitui em um distúrbio de herança autossômica recessiva, causada pela deficiência na atividade do complexo α-cetoácido desidrogenase de cadeia ramificada, resultando no acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada (AACR) leucina, isoleucina e valina e de seus respectivos α-cetoácidos de cadeia ramificada e hidroxiácidos correspondentes. Estudos demonstram um grau variável de retardo mental e outros sintomas neurológicos estando relacionados com alterações no estado redox, sugerindo dessa forma, que os danos estejam associados ao estresse oxidativo. Em vista que o Danio rerio, conhecido como peixe-zebra, vem sendo amplamente utilizado como modelo experimental em diversas áreas do conhecimento por apresentar características favoráveis que complementam os modelos experimentais existentes, esse projeto teve como objetivo geral desenvolver um modelo, quimicamente induzido, da Doença da Urina do Xarope do Bordo (DXB) em peixes-zebra, avaliando as concentrações de aminoácidos de cadeia ramificada e possíveis alterações no estresse oxidativo em tecido cerebral. Para isso, utilizou-se peixe-zebra jovens, expostos às concentrações de 1,58 μL/g, 15,80 μL/g e 158,0μL/g, além do grupo controle, por períodos de 1 hora e 24 horas. Ao fim da indução, os animais passaram por um protocolo de eutanásia com tricaína dissolvida em água, tendo seu conteúdo cerebral dissecado e armazenado adequadamente para as análises. Posteriormente, determinaram-se as concentrações de aminoácidos de cadeia ramificada por cromatografia líquida de alta eficiência, e avaliaram-se os parâmetros de estresse oxidativo: dosagem de sulfidrila, medida de oxidação de 2’,7’-diclorofluoresceína, medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, atividades de superóxido dismutase e catalase. Identificaram-se acúmulos significativos de aminoácidos de cadeira ramificada, na exposição de 24 horas, na dose 158,0μL/g, em tecido cerebral de peixe-zebra. Ademais, observou-se que a mesma dose, no mesmo período, foi capaz de ocasionar aumento de espécies reativas e dano lípidico. Assim, sugere-se que o modelo animal para a Doença da Urina do Xarope do Bordo, utilizando peixe-zebra, auxilie na melhor compreensão do perfil de toxicidade da exposição a aminoácidos de cadeia ramificada, além de contribuir para um melhor entendimento da utilização do mesmo em futuras investigações e estratégias relacionadas a estudos fisiopatológicos envolvidos nessas condições.

A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos α- cetoácidos de cadeia ramificada. Como conseqüência deste bloqueio ocorre o acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada leucina, isoleucina e valina, bem como de seus respectivos α-cetoácidos e α-hidroxiácidos de cadeia ramificada. A manifestação clínica da DXB varia da forma clássica severa a formas variantes moderadas. Os principais sinais clínicos laboratoriais apresentados pelos pacientes com DXB incluem cetoacidose, hipoglicemia, recusa alimentar, opistótono, apnéia, ataxia, convulsões, coma, atraso no desenvolvimento psicomotor e retardo mental. No entanto, os mecanismos responsáveis pelos sintomas neurológicos apresentados pelos pacientes com DXB ainda são pouco conhecidos. O tratamento para DXB consiste na restrição da ingestão de proteínas, bem como dos aminoácidos leucina isoleucina e valina, suplementada com uma fórmula semi-sintética contendo aminoácidos essenciais, minerais e vitaminas. Estudos in vitro têm demonstrado que os aminoácidos de cadeia ramificada e seus respectivos α- cetoácidos acumulados na DXB estimulam a lipoperoxidação e reduzem as defesas antioxidantes em córtex cerebral de ratos. O objetivo deste estudo foi investigar se o estresse oxidativo ocorre em pacientes com DXB em tratamento ou ainda não tratados. Inicialmente, foram analisados parâmetros de estresse oxidativo em amostras de plasma de pacientes com DXB obtidas antes do início do tratamento (no diagnóstico). Foi observado um aumento significativo das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e uma diminuição significativa da reatividade antioxidante total (TAR). Em seguida foram avaliados parâmetros de estresse oxidativo em plasma de dois grupos de pacientes com DXB em tratamento dietético com níveis plasmáticos baixos e altos de leucina. Verificou-se um marcado aumento do TBARS e uma diminuição significativa do TAR em ambos os grupos de pacientes tratados, porém a redução do TAR foi mais pronunciada nos pacientes com baixos níveis sanguíneos de leucina. Além disso, não foi observada correlação entre os níveis de leucina, isoleucina ou valina com os parâmetros de estresse oxidativo. Em continuidade ao trabalho, foram estudados os níveis de selênio no plasma de pacientes com DXB antes e durante o tratamento dietético, bem como a atividade de enzimas antioxidantes em eritrócitos de pacientes em tratamento. Foi verificado que os pacientes com DXB apresentam uma deficiência moderada de selênio no momento do diagnóstico (antes do tratamento) da doença e que essa deficiência se agrava com o tratamento dietético. Ainda, verificou-se que a atividade da enzima glutationa peroxidase está diminuída em eritrócitos de pacientes em tratamento. Posteriormente, foram medidos vários parâmetros bioquímicos em plasma de pacientes com DXB tratados, com o objetivo de verificar se havia correlação destes com parâmetros de estresse oxidativo. Foi demonstrado que os pacientes com DXB em tratamento apresentam redução nos níveis séricos de glicose, colesterol total, creatinina sérica e albumina e aumento na atividade enzimática da aspartato aminotransferase e da lactato desidrogenase. (Continua). Entretanto, não foram observadas alterações nos níveis de colesterol HDL, colesterol LDL, triglicerídeos, alanina aminotransferase, creatina quinase, uréia e ácido úrico. Foi ainda verificado um aumento significativo de TBARS e uma diminuição significativa de TAR, bem como uma correlação positiva entre a medida de 3 TBARS e os níveis de triglicerídeos. Concluindo, nossos resultados indicam que existe um desequilíbrio entre a produção de radicais livres (aumento) e as defesas antioxidantes (diminuição) gerando estresse oxidativo em pacientes com DXB não tratados e em tratamento e que esse processo não está correlacionado com os níveis plasmáticos dos aminoácidos leucina, isoleucina e valina acumulados nesta doença. Além disso, verificamos que a deficiência de selênio e a concomitante diminuição da atividade da glutationa peroxidase podem estar associados ao desenvolvimento do estresse oxidativo nesta doença. É, portanto, possível inferir que o dano oxidativo contribua, pelo menos em parte, para a fisiopatologia desta doença, explicando o dano neurológico que ocorre nos pacientes afetados. Portanto, é possível que a administração de antioxidantes possa ser útil na DXB. / Maple Syrup Urine Disease (MSUD) is an inborn error of metabolism caused by a deficiency of the branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex activity. This blockage leads to accumulation of the branched-chain amino acids leucine, isoleucine and valine, as well as their corresponding α- keto acids and α-hydroxy acids. Clinical manifestations are variable, pending on the variants classical severe form to milder variants. The major clinical features presented by MSUD patients include ketoacidosis, hypoglycemia, poor feeding, opisthotonos, apnea, ataxia, convulsions, coma, psychomotor delay and mental retardation. However, the mechanisms of the neurological symptoms presented by MSUD patients are still poorly understood. MSUD treatment consists of a low protein diet and a semi-synthetic formula poor in leucine, isoleucine, and valina and supplemented by essential amino acids minerals and vitamins. Studies have been showed that the branched-chain amino acids and their corresponding brached-chain α-keto acids accumulating in MSUD stimulate in vitro lipid peroxidation and reduce antioxidant defences in cerebral cortex of rats. The objective of the present study was to investigate oxidative stress parameters in MSUD patients treated and non-treated. First, it was analyzed parameters of oxidative stress in plasma from non-treated MSUD patients. It was observed a significant increase of thiobarbituric acid-reactive species (TBARS) and a marked reduction in total antioxidant reactivity (TAR). Parameters of oxidative stress in plasma from two groups of MSUD patients under dietetic treatment with low and high blood leucine levels were also evaluated. It was verified an increase of TBARS and a significant decrease of TAR in both groups of MSUD patients. However, TAR reduction was higher in the group presenting low leucine levels. On the other hand, it was not found a correlation between leucine, valine and isoleucine levels and oxidative stress parameters. Selenium levels in plasma from MSUD patients at diagnosis (nontreated) and under treatment, as well as the activities of antioxidant enzymes in erythrocytes from treated patients were also determined. MSUD patients presented a significant selenium deficiency at diagnosis which becomes more pronounced during treatment and a decrease of erythrocyte glutathione peroxidase activity during treatment. Subsequently, it was evaluated various biochemical parameters in plasma from MSUD patients during treatment in order to verify if there was correlation between these parameters and oxidative stress. It was demonstrated that MSUD patients under treatment present a reduction of glucose, total cholesterol, albumin and creatinine levels and an increased activity of aspartate aminotransferase and lactate dehydrogenase. However, HDL cholesterol, LDL cholesterol, triglycerides, alanine aminotransferase, creatine kinase, urea and uric acid measurements were not altered. Besides, it was verified a significant increase of TBARS and a significant decrease of TAR, as well as a positive correlation between TBARS and triglycerides levels. In summary, our results suggest an imbalance between the production of free radicals and the antioxidant defenses in MSUD patients leading to oxidative stress at diagnosis and during treatment and that this is not correlated with the amino acids leucine, isoleucine and valine accumulating in this disease. Besides, the selenium deficiency and the decrease of erythrocyte glutathione peroxidase activity could be associated to the development of oxidative stress. Finally, it is possible that oxidative damage may contribute, at least in part, to the pathophysiology of this disorder. If that is the case, antioxidants may serve as an adjuvant therapy in MSUD.

A produção de cerveja utilizando mostos super concentrados tem sido objeto de vários estudos. O objetivo deste projeto foi avaliar a utilização de xarope de milho ou de cana, como adjuntos do malte, e analisar a qualidade sensorial das cervejas obtidas com mostos super concentrados. Foi aplicada a metodologia de planejamento experimental para alcançar este objetivo, onde o xarope de milho ou de cana foi utilizado como adjunto em diferentes proporções e as fermentações conduzidas em diferentes temperaturas. Inicialmente foram elaborados mostos puro malte (16°P) em duplicata, em escala de 3L. Na preparação dos mostos foram adicionadas as enzimas Papaína e Termamyl com o objetivo de obter uma maior concentração de nitrogênio amínico livre e auxiliar na filtração do mosto, respectivamente. No processo de fermentação foi adicionado um dos xaropes, com uma concentração de extrato de 65°P, e utilizado o processo de fermentação no regime descontínuo alimentado por pulsos. A levedura Saccharomyces cerevisiae estirpe PPB-01, pertencente ao banco de cepas da EEL-USP foi utilizada por sua reconhecida tolerância às elevadas concentrações de etanol. Foram analisadas as composições físicoquímicas e os parâmetros cinéticos da fermentação dos mostos e das cervejas obtidas na escala de bancada, sendo comparadas entre si. Os mostos obtidos em todas as formulações desenvolvidas no projeto tiveram concentrações de extrato original estimadas maiores que 18°P, concentração esta que por definição nomeados de mostos super concentrados. As eficiências de atenuação dos mostos e os fatores de conversão de substrato em produto obtidos foram acima de 90%, exceto para dois ensaios do planejamento. As cervejas produzidas, foram diluídas até uma concentração equivalente ao de uma cerveja obtida com extrato original de 10°P, e foram refermentadas em garrafas de vidro de 600mL, com objetivo de promover a carbonatação da bebida. Depois de gaseificadas, as cervejas foram submetidas a análise sensorial e a melhor amostra avaliada sensorialmente foi elaborada em escala piloto. O mosto super concentrado, elaborado em escala piloto, foi preparado com 37,5% de xarope de cana e fermentado na temperatura de 15,4°C. Também foi preparado, em escala piloto, um mosto denominado de padrão, que continha 37,5% de xarope de cana, fermentado a 15,4°C, porém com uma concentração de extrato original de 10°P. Foram avaliadas as composições físico-químicas e os parâmetros fermentativos dos mostos assim como das cervejas. As cervejas obtidas foram submetidas a análise sensorial e comparada com uma cerveja comercial do mercado nacional, sendo que a cerveja produzida no laboratório obteve melhores pontuações em diversos atributos, resultando como a preferida, tendo recebido as melhores notas atribuídas pelos provadores. Um levantamento do custo de produção foi estimado e a cerveja produzida com o mosto super concentrado, quando comparada com a cerveja produzida com o mosto padrão proporcionou economia de energia térmica e elétrica. Os resultados demonstraram que é possível aplicar esta tecnologia no processo cervejeiro, porque além de aumentar a produtividade dos equipamentos já instalados, pode gerar benefícios energéticos, econômicos e ambientais. / The production of beer using very high gravity brewing process has been strategies of several researches. The aim of project was the use of corn syrup and sugar-cane syrup as adjunct and to analyze the sensory quality of beer obtained from very hihg gravity brewing process. An experimental desing was developed, where the corn syrup and sugar-cane syrup were used as adjunct in different proportions and were evaluated different temperaturas in fermentation process. Initially, pure malt wort (16°P) were made in duplicate, on a 3L scale, adding Papaína and Termamyl enzymes, to obtain a higher concentration of free amino nitrogen and to assist in the wort filtration, repetitively. Fermentation process were conducted in fed batch regime with the addition of syrup (65 °P) in pulses. The yeast Saccharomyces cerevisiae strain PPB-01, belonging to the strains bank of the EEL-USP, was used because it was already known about its tolerance to high concentrations of ethanol. The physico-chemical compositions and the kinetic parameters of the fermentation, of worts and the beers obtained on the bench scale, were analyzed and compared with each other. The worts obtained in all formulations had the original extract concentrations estimated above 18 °P, which by definition are classified as super concentrated worts. The attenuation efficiencies and the substrate conversion factors in product, of the worts obtained, were above 90%, except for two tests of the statistic design. The beers produced were diluted to original extract concentration of 10 °P, packaged in 600 mL glass bottles, and a new fermentation process was made in order to promote carbonation. After being carbonatation, the beers were submitted to sensorial analysis and the sample better evaluated sensorially, was chosen to be elaborated in the pilot scale. The wort obtained from very high gravity brewing process, on a pilot scale, was prepared with 37.5% cane syrup and fermented at a temperature of 15.4 °C. A standard wort containing 37.5% cane syrup, fermented at 15.4 °C, but with an original extract concentration of 10 °P, was also prepared on pilot scale. Physico-chemical compositions and kinetic parameters of worts and beers were evaluated. The obtained beers were submitted to sensory analysis and compared with a commercial sample of the national market, and the beer produced in the laboratory obtained better scores in several attributes, resulting as the preferred one, having received the best marks awarded by the tasters. Concentrated beer when compared to its standard beer afforded thermal and electrical energy savings. The results showed that it is possible to apply this technology in the brewing process because it can increase the productivity of the equipment installed and obtain energy, economic and environmental benefits.

Este trabalho teve por objetivo a utilização de xarope de milho na elaboração de cerveja super concentrada. Para atingir este propósito foram realizados ensaios em escala de 5 litros, testando três proporções quanto à relação de extrato de malte e de xarope de milho. Para seguir a legislação brasileira de acordo com o Decreto 6.871, de 2009, foram propostos para a realização dos experimentos as proporções de 70/30, 55/45 e 20/80 de malte:xarope de milho. Na proporção 20/80, definida pelo referido Decreto como cerveja de milho foram avaliadas diferentes variantes para obter diferentes concentrações alcoólicas, obtendo resultados inadequados. As fermentações foram conduzidas em regime descontínuo alimentado, com a adição do xarope por cargas, e foi utilizada uma levedura com alta eficiência fermentativa que tem demonstrado alta tolerância a concentrações de álcool, classificada como PPB - 01. Para comparar com os mostos experimentais, foram elaborados mostos padrões nas proporções 70/30 e 55/45. Em escala piloto foi elaborada uma prova de cerveja super concentrada, para as proporções 70/30 e 55/45, malte/milho. Foram avaliados os parâmetros cinéticos dos processos. As eficiências de formação de álcool e de consumo de extrato foram acima dos 90%, o que garantiu um bom processo fermentativo. As cervejas obtidas na escala piloto foram submetidas a análises sensoriais e comparadas com uma cerveja comercial, obtendo ótimos resultados. As duas proporções aprovadas proporcionaram economia de energia térmica e elétrica, quando comparadas com as cervejas padrões. Os resultados obtidos no projeto demonstraram que é possível a aplicação desta tecnologia, aumentando a produtividade utilizando os mesmos equipamentos e obtendo benefícios energéticos, econômicos e meio ambientais. / The aim of this project was the use of corn syrup to develop super concentrated beer. Accomplishing this purpose was made initially two repeat experiments on a scale of 5 liters and testing three variants as regards the relationship of malt extract and corn. Following the Brazilian law in accordance with the Decree 6.871, 2009, was proposed for the realization of experiments the proportions of 70/30, 55/45 and 20/80 from malt and corn. In the proportion 20/80, defined by Decree as corn beer, were evaluated different variants for obtaining different alcohol concentrations, obtaining inadequate results. Fermentations were conducted in fed batch regime with the addition of the syrup in pulses, and was used one yeast with high efficiency of fermentation and tolerating of alcohol high concentrations, classified as PPB - 01. To compare with the experimental worts, were prepared standards worts for proportions 70/30 and 55/45. In pilot scale, were made experiments of super concentrated beer to the proportions 70/30 and 55/45, malt/corn. The kinetic parameters of the processes were evaluated. The efficiencies of formation of alcohol and consumption of extract were above 90%, which ensured a good fermentation. The experimental beers obtained in pilot scale were subjected to sensory analysis compared with a beer sold in trade, getting great results. The two proportions approved had saving thermal and electrical energy, when compared with standards beers. The results obtained in the project demonstrated that it is possible to apply this technology, increasing equipment productivity and getting energy, economic and environmental benefits.

O gênero Eucalyptus, família Myrtaceae, é composto por mais de 400 espécies, das quais a maioria é nativa do continente australiano. Dentre as espécies mais conhecidas, o Eucalyptus globulus tem sido tradicionalmente utilizado pela população no tratamento de doenças respiratórias devido a seus efeitos expectorante, fluidificante e antisséptico. Assim, como para todos fitoterápicos, durante o desenvolvimento de um novo produto é imprescindível que os parâmetros de segurança, eficácia e qualidade sejam devidamente certificados e assegurados. Para tanto, é necessário desenvolver e validar metodologias analíticas para o controle de qualidade e, desta forma, assegurar o efeito terapêutico desejado. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analítica capaz de quantificar com exatidão o teor de 1,8-cineol em óleo essencial, planta desidratada e extratos de E. globulus, bem como em xarope à base de extrato fluido desta espécie. O método analítico foi desenvolvido e validado em cromatógrafo de fase gasosa da marca Hewelett Packard Agilent Tecnologies, Inc, modelo 6890N, equipado com injetor split/splitless e detector de ionização em chama. O injetor operou no modo split (razão 20:1), à temperatura de 250 °C, enquanto o detector operou à temperatura de 270 °C. Como gás de arraste utilizou-se hidrogênio, com fluxo de 2,2 mL/min. Para as análises utilizou-se coluna capilar de sílica fundida HP-5 (5% fenil-metil-siloxano) de dimensões: 30,0 m x 320,0 µm x 0,25 µm. O programa de temperatura do forno iniciou-se em 75 °C e foi concluído a 200 °C, no período de 20 minutos. A identificação dos principais componentes presentes na espécie foi realizada utilizando-se cromatografia gasosa com detecção de massas (CG-EM). Para a análise qualitativa foram obtidos fingerprints de 12 espécies de Eucalyptus, a citar: E. botryoides, E. citriodora, E. elba, E. globulus, E. grandis, E. microcorys, E. paniculata, E. resinifera, E. robusta, E. saligna, E. tereticornis e E. urophylla. O cromatograma do óleo de E. globlulus apresenta um pico majoritário em 5,23 minutos, correspondente ao 1,8-cineol. Já os cromatogramas das outras espécies, possuem diferenças e semelhanças significativas, tanto na presença de metabólitos quanto na quantidade de cada um, o que permite a identificação preliminar de cada espécie por este método. Além da seletividade e linearidade alcançadas, a porcentagem de recuperação ficou situada em 99,8% para as folhas de eucalipto e 100,5% para o xarope. A precisão, determinada pelo desvio padrão relativo de sextuplicatas à concentração do teste para as folhas e xarope foi de 1,86% e 0,92% respectivamente, ou seja, dentro do limite estabelecido ela ANVISA que é de, no máximo 5%. Finalmente, foram determinados os limites de detecção (4,79 g/mL) e quantificação (14,51g/mL) e avaliada a influência dos principais parâmetros modificados deliberadamente na determinação da robustez, através do teste de Yuden. Sendo assim, o método desenvolvido, utilizando padronização interna, se mostrou adequado para a quantificação do marcador 1,8-cineol não só nas folhas, extratos e óleo essencial de E. globulus, mas também em xarope contendo o extrato desta espécie, garantindo a rastreabilidade de todo o processo produtivo. / The genus Eucalyptus, family Myrtaceae, is composed of more than 400 species, most of them native to Australia. From the most known species, Eucalyptus globulus has been traditionally used for the treatment of respiratory diseases because of its expectorant, mucolytic and antiseptic effects. As occurs for all phytomedicines, during the development of a new product, it is indispensable to guarantee and to certify the security, efficacy and quality parameters. For this reason, it is necessary to develop and validate analytical methodologies for the quality control system and to assure the desired therapeutic effect. Therefore, the aim of this work was to develop and validate an analytical methodology capable to quantify, with accuracy, the 1.8-cineol content in E. globulus essential oil, dried leaves, extracts and syrup. The analytical procedure was developed and validated using a Hewlett-Packard 6890N gas chromatograph (Agilent Technologies, Inc.) equipped with a split/splitless injector inlet and a flame ionization detector. The injector operated in the split mode (20:1), at 250 °C, while the detector operated at 270 °C. Hydrogen at a flow rate of 2.2 mL/min was employed as carrier gas. An HP-5 capillary column (30 m of length x 0.32 mm of internal diameter x 0.25 µm of film thickness) was used for the analysis and the non linear increasing temperature gradient was: 75 °C to 200 °C, in 20 min. The identification of the main compounds of E. globulus was made using GC-MS. For the qualitative analysis the fingerprints of 12 Eucalyptus species were obtained: E. botryoides, E. citriodora, E. elba, E. globulus, E. grandis, E. microcorys, E. paniculata, E. resinifera, E. robusta, E. saligna, E. tereticornis and E. urophylla. The chromatogram of E. globulus shows the main peak (1.8-cineol) at 5.23 minutes. The chromatograms of the other species have some significant differences and similarities in the presence and quantity of metabolites, a fact that allows a preliminary identification of each specie by this method. Besides the selectivity and linearity achieved, the recovery was at 99.8% for the leaves and 100.5% for the syrup. The repeatability, determined by the relative standard deviation in six replicates at test concentration, was 1.86% and 0.92%, respectively. This result is in agreement with the Brazilian regulamentation (the maximum value established for ANVISA is 5%). The detection limit was 4.79 g/mL while the quantification limit was 14.51g/mL. Finally, the influence of the main modified parameters for the robustness was determined using the Yuden test. The developed method, with internal standardization, proved to be reliable for the quantification of 1.8-cineol, not only in eucalyptus leaves, extracts and essential oils, but also in syrup formulations containing this plant extract, avowing the rastreability of the entire manufacturing process.

Atualmente o consumo de xarope de maltose vem crescendo devido ao seu uso em cervejarias e está substituindo progressivamente os adjuntos amiláceos. O xarope de maltose é, tradicionalmente, produzido por meio da hidrólise ácida e/ou enzimática de amido ou flocos de milho. Este trabalho teve como objetivo analisar a possibilidade de obtenção de maltose a partir de outras matérias-primas amiláceas como a mandioca e a puba (produto derivado da fermentação da mandioca) pela ação da a-amilase bacteriana e da a-amilase fúngica sem que fosse necessária a extração do amido. Amostras de mandioca e puba com 10, 20 e 30% de sólidos foram incubadas com a-amilase bacteriana termoestável durante 10, 20 e 30 minutos a 80 0 C, adicionando-se em seguida, µ-amilase fúngica e incubando-se as amostras durante 48 horas a 55 0 C. O grau de sacarificação, expresso em dextrose equivalente (DE), foi determinado pelo método DNS em vários intervalos de tempo. Glicose e maltose foram determinadas por HPLC após 48 horas de sacarificação. Os resultados mostraram que o tempo de ação da a-amilase bacteriana não causou diferenças significativas no grau de hidrólise entre as amostras, mas a concentração de sólidos influiu significativamente no grau da liquefação das amostras. O comportamento das curvas do grau de sacarificação foi semelhante para todos os tratamentos tanto da mandioca quanto da puba. O conteúdo de maltose nas amostras variou entre 30-60% e a glicose entre 0-10% caracterizando um xarope com alto teor de maltose. A eficiência de hidrólise ficou abaixo do esperado. Entretanto, esse fato pode ser explicado pela utilização da mandioca sem extração prévia do amido e pelas dificuldades na extração dos sólidos por centrifugação. Pode-se afirmar que tanto a mandioca quanto à puba podem ser utilizadas como matéria prima em substituição ao milho na obtenção de xarope de maltose através da hidrólise enzimática. A puba, porém, é de mais fácil manuseio sendo que o tratamento com 20% de sólidos, exposto durante 10 minutos a a-amilase bacteriana proporcionou maior rendimento, atingindo 4,2 kg de maltose e 0,3 kg de glicose por 100 kg de mandioca fresca além de proporcionar menor quantidade de resíduo sólidos de 13,7 kg. / Nowadays the consumption of maltose syrups is increasing due to its utilization in breweries where it replaces starch adjuncts. Traditionally maltose syrup has been produced from cornstarch or pellets using acid and/or enzymatic hydrolysis. The objective of this work was to evaluate the possibility of obtaining maltose from starch sources other than maize, such as cassava roots or puba, a fermented cassava product, without extraction of the starch, using bacterial a-amylase and fungal a-amylase for starch hydrolysis. Cassava and puba samples with 10, 20 and 30% dry matter were incubated with termostable bacterial a-amylase for 10, 20 and 30 minutes at 80 0 C, followed by the addition of fungal a-amylase. The samples were incubated for 48 hours at 55 0 C. The degree of saccharification, expressed as dextrose equivalent (DE), was determined by the DNS method. The glucose and maltose contents of the hydrolysate were determined after 48 hours by HPLC. The results showed that the time of action of a-amylase did not influence the degree of saccharification of the samples but the solids concentration significantly affected the hydrolysis degree. The saccharification degree curves were similar for both cassava and puba. The maltose content of the samples varied between 30-60% and the glucose content between 0-10%, which characterized them as "High maltose syrups". The hydrolysis efficiency was lower than expected. However, this fact could be explained by the use of cassava without extraction of the starch and by the difficulty of extracting the solids by centrifugation. It was concluded that for replacement of corn starch, both cassava roots and puba could be used as raw materials for maltose syrup production by enzymatic hydrolysis. However the puba was easier to handle than cassava. The puba treatment consisting of 20% of solids and 10 minutes exposure to a-amylase gave the highest yield reaching 4.2 kg of maltose and 0.3 kg of glucose per 100 kg of raw cassava, in addition to a lower solids residue of 13.7 kg.

A doença do xarope do bordo é causada pela deficiência na atividade do complexo desidrogenase dos α-cetoácidos de cadeia ramificada, levando ao acúmulo dos aminoácidos de cadeia ramificada leucina, isoleucina e valina e de seus α- cetoácidos correspondentes nos tecidos e fluidos corporais. Os pacientes podem apresentar atraso no desenvolvimento psicomotor e retardo mental. A patofisiologia da doença não é bem compreendida, contudo, o acúmulo do metabólito tóxico leucina induz alterações metabólicas associadas aos sintomas clínicos. Além disso, a capacidade antioxidante está reduzida nestes pacientes. Creatina, piruvato e taurina são potentes antioxidantes em sistemas biológicos e protegem a célula contra os danos causados pelo estresse oxidativo. Portanto, neste estudo, investigamos os efeitos da administração de leucina e da coadministração de creatina mais piruvato e de taurina em alguns parâmetros da rede de fosforiltransferência e de estresse oxidativo em córtex e hipocampo de ratos. A administração de leucina induziu estresse oxidativo com o aumento de radicais livres, e diminuiu a atividade das enzimas piruvato cinase, adenilato cinase, hexocinase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, creatina cinase citosólica e creatina cinase mitocondrial. A coadministração de creatina mais piruvato e de taurina foi capaz de prevenir as alterações causadas pela administração de leucina sobre o estresse oxidativo e as enzimas tiólicas da rede de fosforiltransferência. As correlações significativas entre alguns parâmetros de estresse oxidativo e as enzimas da rede de fosforiltranferência sugerem que a diminuição na atividade das enzimas ocorre devido ao aumento das espécies reativas. Portanto, é possível sugerir que os efeitos nocivos que a leucina causa no cérebro possa contribuir para a disfunção neurológica observada em pacientes com a doença do xarope do bordo, e é possível que a suplementação com creatina, piruvato e taurina possa ser benéfica a estes pacientes. / Maple Syrup Urine Disease is caused by the deficiency of branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex activity leading to accumulation of the branched-chain amino acids leucine, isoleucine and valine and their corresponding branched-chain α-keto acids in tissues and body fluids. The affected patients may present psychomotor development delay and mental retardation. The pathophysiology of this disease is not entirely understood. However, the accumulation of toxic metabolite leucine induces profound metabolic alterations and impairment of energy homeostasis associated with clinical symptoms. Moreover, the antioxidant capacity is decreased in these patients. Creatine, pyruvate, and taurine plays a critical role in brain function and are potent antioxidants in biological systems, contributing to cellular protection against oxidative stress. In this study, we investigated the effects of leucine administration and coadministration of creatine plus pyruvate and taurine on some parameters of phosphoryl transfer network and oxidative stress in cerebral cortex and hippocampus of rats. Leucine-induced oxidative stress and diminished the activities of pyruvate kinase, adenylate kinase, hexokinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, cytosolic creatine kinase, and mitochondrial creatine kinase. Coadministration of creatine plus pyruvate and taurine prevented the alterations provoked by leucine administration on the oxidative stress and the thiol-containing enzymes of phosphoryl transfer network. Significant correlations between some parameters of oxidative stress and the enzymes of the phosphoryl transfer network suggest that the diminution of the enzymes activities is possible due to increase in free radicals. It is possible that these effects of leucine may contribute to the neurological dysfunction observed in patients affected by Maple Syrup Urine Disease. In this case, it is possible that creatine plus pyruvate and taurine supplementation could benefit to the patients.

Este trabalho teve por objetivo a utilização de xarope de milho na elaboração de cerveja super concentrada. Para atingir este propósito foram realizados ensaios em escala de 5 litros, testando três proporções quanto à relação de extrato de malte e de xarope de milho. Para seguir a legislação brasileira de acordo com o Decreto 6.871, de 2009, foram propostos para a realização dos experimentos as proporções de 70/30, 55/45 e 20/80 de malte:xarope de milho. Na proporção 20/80, definida pelo referido Decreto como cerveja de milho foram avaliadas diferentes variantes para obter diferentes concentrações alcoólicas, obtendo resultados inadequados. As fermentações foram conduzidas em regime descontínuo alimentado, com a adição do xarope por cargas, e foi utilizada uma levedura com alta eficiência fermentativa que tem demonstrado alta tolerância a concentrações de álcool, classificada como PPB - 01. Para comparar com os mostos experimentais, foram elaborados mostos padrões nas proporções 70/30 e 55/45. Em escala piloto foi elaborada uma prova de cerveja super concentrada, para as proporções 70/30 e 55/45, malte/milho. Foram avaliados os parâmetros cinéticos dos processos. As eficiências de formação de álcool e de consumo de extrato foram acima dos 90%, o que garantiu um bom processo fermentativo. As cervejas obtidas na escala piloto foram submetidas a análises sensoriais e comparadas com uma cerveja comercial, obtendo ótimos resultados. As duas proporções aprovadas proporcionaram economia de energia térmica e elétrica, quando comparadas com as cervejas padrões. Os resultados obtidos no projeto demonstraram que é possível a aplicação desta tecnologia, aumentando a produtividade utilizando os mesmos equipamentos e obtendo benefícios energéticos, econômicos e meio ambientais. / The aim of this project was the use of corn syrup to develop super concentrated beer. Accomplishing this purpose was made initially two repeat experiments on a scale of 5 liters and testing three variants as regards the relationship of malt extract and corn. Following the Brazilian law in accordance with the Decree 6.871, 2009, was proposed for the realization of experiments the proportions of 70/30, 55/45 and 20/80 from malt and corn. In the proportion 20/80, defined by Decree as corn beer, were evaluated different variants for obtaining different alcohol concentrations, obtaining inadequate results. Fermentations were conducted in fed batch regime with the addition of the syrup in pulses, and was used one yeast with high efficiency of fermentation and tolerating of alcohol high concentrations, classified as PPB - 01. To compare with the experimental worts, were prepared standards worts for proportions 70/30 and 55/45. In pilot scale, were made experiments of super concentrated beer to the proportions 70/30 and 55/45, malt/corn. The kinetic parameters of the processes were evaluated. The efficiencies of formation of alcohol and consumption of extract were above 90%, which ensured a good fermentation. The experimental beers obtained in pilot scale were subjected to sensory analysis compared with a beer sold in trade, getting great results. The two proportions approved had saving thermal and electrical energy, when compared with standards beers. The results obtained in the project demonstrated that it is possible to apply this technology, increasing equipment productivity and getting energy, economic and environmental benefits.

A doença do xarope do bordo (DXB) é um distúrbio neurometabólico causada pela deficiência na atividade do complexo da desidrogenase dos α-cetoácidos de cadeia ramificada. Os pacientes afetados apresentam sintomas neurológicos severos, tais como coma e convulsões, bem como edema e atrofia cerebral. Os compostos que se acumulam em maiores concentrações na DXB são o ácido α-cetoisocapróico (CIC), o ácido α- hidroxiisovalérico (HIV) e a leucina (Leu). Considerando que os mecanismos neurotóxicos na DXB não estão completamente esclarecidos, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito in vitro do CIC, HIV e Leu sobre diferentes parâmetros da função em cérebro de ratos jovens, no intuito de verificar alterações que possam esclarecer os mecanismos responsáveis pelo dano cerebral apresentados pelos pacientes. Foram analisados os parâmetros respiratórios estados 3 e 4, a razão de controle respiratório (RCR) e a razão ADP/O medidos pelo consumo do oxigênio, o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), o conteúdo de NAD(P)H na matriz mitocondrial, o inchamento mitocondrial, além da atividade das enzimas do ciclo do ácido cítrico α-cetoglutarato desidrogenase, citrato sintase, isocitrato desidrogenase, malato desidrogenase e succinato desidrogenase. Os experimentos realizaram-se na presença de 1 mM e 5 mM de CIC, HIV ou Leu e os substratos respiratórios utilizados foram glutamato/malato (2,5 mM cada), succinato (5 mM) e α-cetoglutarato (5 mM). Observamos que o CIC aumentou o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuiu o RCR com todos os substratos utilizados. Foi também observado que o CIC e a Leu diminuíram o estado 3 da respiração mitocondrial quando foi utilizado α-cetoglutarato como substrato, enquanto que o HIV não modificou nenhum parâmetro respiratório testado. Além disso, o CIC provocou uma redução na razão ADP/O e uma diminuição nos níveis de NAD(P)H mitocondrial utilizando os substratos ligados ao NADH glutamato/malato e α-cetoglutarato. O CIC e a Leu também causaram uma leve redução no ΔΨm quando α-cetoglutarato foi o substrato. Foi também observada uma inibição da atividade da α-cetoglutarato desidrogenase provocada pelo CIC, enquanto que o HIV e a Leu não alteraram a atividade de nenhuma das enzimas estudadas. Por último, os metabólitos testados não foram capazes de induzir o inchamento mitocondrial. Nossos resultados indicam que o CIC, seguido da Leu, sendo estes os compostos que mais se acumulam na DXB, atingindo concentrações plasmáticas de 5 mM, prejudicam a homeostase mitocondrial em cérebro de ratos. Caso os presentes resultados possam ser extrapolados para a condição humana, presume-se que a disfunção mitocondrial pode estar envolvida no dano cerebral observado em pacientes portadores da DXB. / Maple syrup urine disease (MSUD) is a neurometabolic disorder caused by a deficiency of the mitochondrial enzyme complex branched-chain L-2-keto acid dehydrogenase activity. The affected patients present severe neurological symptoms, such as coma and seizures, as well as edema and cerebral atrophy. The compounds that accumulate in higher concentrations in MSUD are α-ketoisocaproic (KIC), α- hydroxyisovaleric (HIV) e leucine (Leu). Considering that the neurotoxic mechanisms in MSUD are not well established, the purpose of the present study was to investigate the in vitro effect of KIC, HIV and Leu on various parameters of the mitochondrial bioenergetics in brain of young rats, in order to verify alterations that could explain the responsible mechanisms by the brain damage found in MSUD patients. It was analysed the respiratory parameters states 3 and 4, the respiratory control ratio (RCR) and the ADP/O ratio measured by oxygen consumption, the mitochondrial membrane potential (ΔΨm), the mitochondrial matrix content of NAD(P)H, the mitochondrial swelling, besides the citric acid cycle enzymes activity α-ketoglutarate dehydrogenase, citrate sinthase, isocitrate dehydrogenase, malate dehydrogenase e succinate dehydrogenase. The experiments were performed in the presence of 1 mM and 5 mM of CIC, HIV and Leu and the respiratory substrates used were glutamate/malate (2,5 mM each), succinate (5 mM) e α-ketoglutarate (5 mM). We observed that KIC increased state 4 respiration and decreased RCR with all the substrates used. It was also observed that KIC and Leu decreased state 3 respiration using α-ketoglutarate as substrate, whereas HIV did not modify any respiratory parameter tested. Furthermore, KIC provoked a reduction in the ADP/O ratio and a decrease in NAD(P)H mitochondrial levels using the NADH-linked substrates glutamate/malate and α- ketoglutarate. KIC and Leu also caused a mild reduction in the ΔΨm when α-ketoglutarate was the substrate. It was also observed an inhibition of α-ketoglutarate dehydrogenase activity provoked by KIC, whereas HIV and Leu did not alter any enzymatic activities studied. Finally, the metabolites tested were not able to inducing mitochondrial swelling. Our results indicate that KIC, followed by Leu, the compounds that most accumulate in DXB, reaching plasma concentrations of 5 mM, impaired the mitochondrial homeostasis in brain of rats. In the case of the present data be extrapolated to human conditions, it may be presumed that the mitochondrial dysfunction might be involved in the brain damage observed in MSUD patients.

A doença da urina do xarope do bordo é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência severa na atividade do complexo enzimático da desidrogenase de α- cetoácidos de cadeia ramificada. Distúrbios neurológicos são comuns em pacientes com esta doença. Apesar de a leucina ser considerada o principal metabolito tóxico, os mecanismos envolvidos na neuropatologia das lesões cerebrais não são bem entendidos. No presente estudo, avaliou-se o possível efeito preventivo da coadministração de creatina e piruvato sobre os efeitos provocados pela administração de leucina a ratas Wistar durante a gestação e lactação sobre alguns parâmetros de estresse oxidativo, bem como sobre as atividades de certas enzimas envolvidas na rede de fosforiltransferência no córtex cerebral e no hipocampo da prole aos 21 dias de idade. A administração de leucina induziu o estresse oxidativo e alterou as atividades das enzimas piruvatocinase, adenilatocinase, creatinacinase citosólica e mitocondrial. A coadministração de creatina e piruvato foi parcialmente eficaz na prevenção de algumas alterações provocadas pela administração de leucina sobre o estresse oxidativo, mas não nas enzimas da rede de fosforiltransferência. Estes resultados sugerem que a hiperleucinemia materna não tratada pode ser tóxica para o cérebro da prole. / Maple Syrup Urine Disease is an inborn error of metabolism caused by severe deficiency in the activity of branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex. Neurological disorders are common in patients with this disease. Although leucine is considered the main toxic metabolite, the mechanisms underlying the neuropathology of brain injury are poorly understood. In the present study, we evaluated the possible preventive effect of the co-administration of creatine plus pyruvate on the effects elicited by leucine administration to female Wistar rats during pregnancy and lactation on some oxidative stress parameters as well as the activities of some enzymes involved in the phosphoryltransfer network in the cerebral cortex and hippocampus of the offspring at 21 days of age. Leucine administration induced oxidative stress and altered the enzymes activities of pyruvate kinase, adenylate kinase, mitochondrial and cytosolic creatine kinase. Co-administration of creatine plus pyruvate was partially effective in the prevention of some alterations provoked by leucine administration on the oxidative stress but not in the enzymes of phosphoryltransfer network. These results suggest that non-treated maternal hyperleucinemia may be toxic to the brain of the offspring.