Die humane Yersiniose wird durch Lebensmittel tierischen Ursprungs übertragen und stellt aufgrund der jährlich gleichbleibend hohen Zahl übermittelter Krankheitsfälle sowie der wahrscheinlich weitaus höheren Dunkelziffer ein Problem des gesundheitlichen Verbraucherschutzes dar. Die intermittierende Ausscheidung des Erregers Yersinia enterocolitica beim klinisch unauffälligen Reservoirtier Schwein und die aufwändige Kultivierung erschweren den direkten Erregernachweis. Hier könnte der serologische Nachweis, in der Humanmedizin bereits seit langem etabliert, eine wertvolle diagnostische Hilfe sein. Die Erkennung serologisch positiver Bestände ähnlich dem Salmonellen-Monitoring und daran anschließende Hygienemaßnahmen, vor allem vor und während der Schlachtung, können den Eintrag des Erregers in die Lebensmittelkette vermindern. So wurde im Rahmen dieser Arbeit ein hochspezifisches serologisches Nachweissystem entwickelt, das durch die Verwendung rekombinanter und ausschließlich bei pathogenen Yersinien vorkommender Antigene eine hohe Sensitivität und Spezifität garantiert. Neun ausgewählte Yersinia Outer Proteins (Yops) wurden kloniert und mit spezifisch auf jedes Protein abgestimmten Bedingungen zur optimalen Expression gebracht. Durch die Evaluierung verschiedener Aufreinigungssysteme konnten schließlich reproduzierbare hochreine Antigene auch in großen Mengen hergestellt werden. Mit Blick auf eine sichere Auswertbarkeit bei der Verwendung des Testsystems in Laboratorien wurden die Antigene nicht elektrophoretisch aufgebracht, sondern mittels Sprühverfahren auf eine Nitrozellulosemembran aufliniert. Das gebrauchsfertige Testsystem, Blotstreifen von 2,5 mm Breite mit neun auflinierten, rekombinant hergestellten und Virulenzplasmid-basierenden Yersinia-Antigenen, eignet sich zur Diagnostik serologisch positiver Schweine. Mit Hilfe dieses Testsystems wurde die isotypspezifische Antikörperantwort von Schweinen im Infektionsmodell gegen den Erreger Y. enterocolitica ausgewertet. Nach zwei Vorversuchen mit jeweils zwei Schweinen wurden im Hauptversuch neun Ferkel experimentell mit einer Infektionsdosis von 5x1011 KBE per Magenschlundsonde infiziert, wobei die Tiere nach leichtem und kurzfristigem Durchfallgeschehen den Erreger symptomlos mit dem Kot ausschieden. Weitere neun Ferkel stellten eine Kontrollgruppe nicht infizierter Tiere dar. Vom Tag der Infektion bis zum Tag der Tötung (Tag 33) wurde regelmäßig bei den achtzehn Schweinen Blut, Speichel und Tränenflüssigkeit gewonnen, am letzten Tag zusätzlich Gelenkflüssigkeit und Darmsekrete. Die Auswertung der Seren im zeitlichen Verlauf zeigte deutlich die Immunogenität der Yops. Bei dominierenden Yops wie YopO, YopH, LcrV, YopD und YopE ließ sich das Einsetzen der Antikörperbildung (IgG und IgA) mit nachfolgendem Anstieg bei allen infizierten Tieren feststellen. Die früheste Bildung von Immunglobulin G konnte am Tag 10 gegen YopD verzeichnet werden, Immunglobulin A wurde gegen YopD bereits am Tag 7 gebildet. Die nicht infizierten Kontrolltiere waren im Immunoblot durchgehend negativ. In den Darmsekreten, der Gelenk- und Tränenflüssigkeit und vor allem im Speichel liessen sich mit dem entwickelten Test ebenfalls spezifische Yop- Antikörper detektieren. Der Test kann somit zur Diagnostik von Beständen mit Yersinia-Problematik herangezogen werden; er eignet sich als kompletter Kit sowohl für Labore als auch für veterinärmedizinische Praxen.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 2007. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2003. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Sveriges lantbruksuniversitet, 2005. / Härtill 5 uppsatser.

University, Diss., 2000--München.

Techn. University, Habil.-Schr., 2006--München.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-12-08Bitstream added on 2014-06-13T20:00:43Z : No. of bitstreams: 1 cangiani_ee_dr_arafcf.pdf: 879107 bytes, checksum: bd2b88a537298b5f3ad944c986ece870 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Yersinia enterocolitica é um enteropatógeno que pode levar ao desenvolvimento de artrite reativa. Um dos mecanismos imunomoduladores usados pelos patógenos artritogênicos é a ativação policlonal de linfócitos. O objetivo deste estudo foi verificar se ocorre ativação policlonal de linfócitos B e comparar o padrão isotípico de imunoglobulinas produzidas durante a infecção com Y. enterocolitica O:8 em linhagens de camundongos suscetíveis (BALB/c) e resistentes (C57BL/6), bem como analisar o padrão de secreção de citocinas pró-inflamatórias e regulatórias pelas populações de células T CD4+ e CD8+. / Yersinia enterocolitica is an enteropathogen that can lead to the development of reactive arthritis. One of the immunomodulating mechanisms used by arthritogenic pathogens is the polyclonal activation of lymphocytes. The objective of this study was to verify if the polyclonal activation of B-lymphocytes occur and to compare the different immunoglobulin (Ig) isotypes produced during the infection with Y. enterocolitica O:8 in susceptible (BALB/c) and resistant (C57BL/6) mice strains. We also analyzed the production of pro-inflammatory and regulatory cytokines in T CD4+ and T CD8+ lymphocytes populations.

The lcrF gene of Yersinia pestis, the etiological agent of plague, encodes a transcription activator responsible for inducing expression of several virulence-related proteins (Yops) in response to temperature. The mechanism of this thermoregulation was investigated. Using a yopE::lacZ reporter fusion, lcrF-mediated thermal regulation was observed in Y. pestis and Escherichia coli. The lcrF gene was sequenced, the 30.8 kDa. LcrF protein identified and purified, and LcrF-dependent yopE-specific DNA binding activity was detected. A sequence similarity search revealed that LcrF exhibits 98% homology to VirF of Yersinia enterocolitica and significant homology to the carboxy termini of other members of the AraC family of transcription activators. During localization studies, a significant proportion of LcrF was found associated with the membrane fraction in E. coli. However, pulse-chase experiments indicated that this result is an artifact of fractionation. lcrF-mediated thermal induction of the yopE::lacZ reporter fusion remains intact in a Shigella flexneri virR mutant. The virR mutation is known to affect thermal induction of Shigellavirulence genes, which are also controlled by an activator in the AraC family. As a first step toward identifying the temperature-sensitive step in the regulation of yop expression, lcrF::lacZ transcriptional fusions were constructed and analyzed in Y. pestis and E. coli. The activity of the fusions was not affected by the native pCD1 virulence plasmid, an intact lcrF gene, or temperature. Thus, induction of lcrF transcription is not essential for temperature-dependent activation of yopE transcription. To confirm these results, attempts were made to identify both the native lcrF message in Y. pestis, and a lcrF-lacZ hybrid message in Y. pestis and E. coli. These attempts were unsuccessful. Examination of LcrF protein production revealed temperature-dependent expression in Y. pestis. Surprisingly, high-level T7 polymerase-directed transcription of the lcrF gene in Escherichia coli also resulted in temperature-dependent production of the LcrF protein. Pulse-chase experiments showed that the LcrF protein was stable at both 26 and 37°C, suggesting that translation rate or message degradation is thermally controlled. Comparison of the amount of LcrF protein produced per unit of message at 26 and 37°C in E. coli indicated that the efficiency of translation of lcrF message increased with temperature. mRNA secondary structure predictions suggest that the lcrF Shine-Dalgarno sequence is sequestered in a stem-loop. A model in which decreased stability of this stem-loop with increasing temperature leads to increased efficiency of translation initiation of lcrF message is presented.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-28T16:55:13Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1163157 bytes, checksum: 3778d489d49b57163f5cb7d9bcbc68f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-28T16:55:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1163157 bytes, checksum: 3778d489d49b57163f5cb7d9bcbc68f2 (MD5) Previous issue date: 2017-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A carne suína é um dos produtos de origem animal mais consumido no mundo. O Brasil tem destaque nesse cenário, já que está entre os principais países produtores de suínos e com grande potencial de exportação dos produtos derivados da carne suína, além de um grande mercado interno para ser explorado. A pesquisa de Yersinia enterocolitica é extremamente importante nessa cadeia produtiva, por estar frequentemente associada a esses animais. No homem, Y. enterocolitica causa uma gastroenterite denominada yersiniose, que se caracteriza por diarreia aguda e febre (principalmente em crianças), dor abdominal, linfadenite mesentérica aguda simulando apendicite, com complicações em alguns casos como eritema nodoso, artrite pós-infecciosa e infecção sistêmica. O objetivo desse trabalho foi realizar o rastreamento da contaminação por Y. enterocolitica na cadeia produtiva de carne suína, assim como caracterizar o potencial patogênico e perfil de resistência a antimicrobianos dos isolados. Amostras das baias e de diferentes etapas do abate de suínos e do processamento de carne suína (ambiente, carcaças, tonsilas palatinas, linfonodos mesentéricos, utensílios, equipamentos e produtos finais; n = 870) foram obtidas de duas granjas de criação de suínos em fase de terminação e de um matadouro-frigorífico localizados na região de Viçosa, Minas Gerais, Brasil. As amostras foram submetidas à detecção de Y. enterocolitica conforme ISO 10273:2003 e os isolados obtidos foram submetidos sorotipagem. a testes Os fenotípicos isolados e moleculares identificados como Y. para identificação enterocolitica e foram submetidos a macro-restrição com XbaI e eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), a reações de PCR para detecção de genes associados a patogenicidade, e caracterizados quanto ao seu perfil de resistência a 17 antimicrobianos, pela técnica do breakpoint e por PCR. Y. enterotocolitica foi identificado em 8 amostras, sendo cinco de tonsilas palatinas, duas de linfonodos mesentéricos e uma de carcaça suína após a sangria, das quais foram obtidos 16 isolados. Todos os isolados foram identificados como pertencentes ao bio-sorotipo 4/O:3, envolvido em vários surtos de yersiniose pelo mundo. Considerando os perfis genéticos obtidos por PFGE, os isolados apresentaram identidade entre 60% e 80%, demonstrando o alto grau de indentidade, além de identificação de tonsilas palatinas como potencial fonte de contaminação. Vários genes de virulência relevantes para a patogenicidade de Y. enterotocolitica foram detectados nos isolados. Todos os isolados apresentaram altas frequências de resistência a antimicrobianos (15 substâncias), além da presença dos genes emrD, yfhD e marC, relacionados a resistência múltipla a antimicrobianos. Os isolados apresentaram sensibilidade apenas a ciprofloxacina e kanamicina. Esse estudo demonstrou a importância dos suínos na disseminação de Y. enterotocolitica na cadeia produtiva de carne suína, ressaltando a importância do controle e monitoramento desse patógeno nas etapas iniciais da produção, que deve ser realizado com auxílio das ferramentas disponíveis atualmente, para a garantia de um alimento inócuo e de qualidade. / Pork is the main animal origin protein consumed around the world, and Brazil is one of the main world producer of swines, presenting a large potential for exportation and consumption of pork products. Yersinia enterocolitica is a relevant foodborne pathogen in pork products, once swines are reservoirs of this pathogen and work as sources of contamination in slaughterhouses. Y. enterocolitica is responsible for human yersiniosis, a gastroenteritis that causes acute diarrhea and fever (especially in children), abdominal pain, acute mesenteric lymphadenitis, mimicking appendicitis, with complications in some cases as erythema nodosum, post-infectious arthritis and septicemia. This study aimed the tracking of Y. enterocolitica contamination in the pork production chain, and to characterize the pathogenic potential and antimicrobial resistance profiles of isolates. Samples from different steps of pork production (environment, carcasses, palatine tonsils, mesenteric lymph nodes, utensils, equipment, and end products; n = 870) were obtained from two finishing pig farms and one slaughterhouse located in Viçosa region, Minas Gerais, Brazil. Samples were subjected to Y. enterocolitica detection according ISO 10273:2003, and the obtained isolates were subjected to phenotypical and molecular analysis for identification and serotyping. Y. enterocolitica isolates were subjected to XbaI macrorestriction and pulsed filed gel electrophoresis (PFGE), PCR to detect virulence related genes, and to breakpoint and PCR to characterize their antimicrobial resistance profiles against 17 substances. Y. enterocolitica was isolated in 8 samples, specifically palatine tonsils (5), mesenteric lymph nodes (2) and carcasses after bleeding (1), and 16 isolates were obtained. All isolates were identified as belonging to bio-serotype 4/O:3, associated to various yersiniosis cases and outbreaks around the world. PFGE demonstrated 60 to 80% identify indexes among isolates, and alloed the identification of palatine tonsils as relevant contamination sources in the pork production chain. The isolates presented different virulence related genes, demonstrating the pathogenic potential of Y. enterocolitica. All isolates presented high frequencies of antimicrobial resistance (to 15 substances), despite the presence of emrD, yfhD and marC, related to multi-drug resistance. Only ciprofloxacin and kanamicin were effective agains all isolates. The present study demonstrated the relevance of swines in the distribuiton of Y. enterocolitica in the pork production chain, highlighting the need for proper control of contamination and tracking of this foodborne pathogen in the initial steps of production, what must be conducted with the support for available tools to assure the quality and safety of pork products.

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:43:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000063.pdf: 1337362 bytes, checksum: fdc0d841069eb0184e4ae777bec25b84 (MD5) Previous issue date: 2007 / A Yersinia pestis é o agente causador da peste, doença infecciosa transmitida através da picada de pulgas infectadas. O homem se contamina acidentalmente ao entrar em contato com roedores ou outros animais infectados (raposas, cães e gatos) e suas pulgas. A Y. pestis é uma espécie muito homogênea, fenotipicamente, apresentando um sorotipo, um fagotipo e três biotipos. Diferentes métodos moleculares foram utilizados em estudos epidemiológicos para discriminar cepas bacterianas. No entanto, para Y. pestis isoladas em focos do Nordeste do Brasil, a maioria dos marcadores estudados não conseguiram discriminar as cepas originadas de diferentes hospedeiros, períodos e locais de isolamento. A eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) é caracterizada pela separação de fragmentos de DNA obtidos por digestão dos cromossomos com endonucleases de restrição. Essa técnica é considerada o padrão ouro dos métodos de tipagem molecular, sendo altamente discriminatória e válida para muitos patógenos bacterianos, inclusive Y. pestis de outros focos do mundo. O objetivo deste trabalho foi realizar tipagem molecular de cepas brasileiras de Y. pestis através do PFGE. Das 43 cepas de Y. pestis, 36 foram usadas para padronização da técnica e 22 cepas, obtidas antes e durante um surto de peste ocorrido no Estado da Paraíba, para avaliação do PFGE. De acordo com padrões encontrados com a endonuclease de restrição AscI, 19 perfis foram gerados. Esses genótipos foram enquadrados em oito grupos (A-H) geneticamente relacionados. A técnica do PFGE mostrou se capaz de diferenciar as cepas de Y. pestis obtidas em diferentes municípios, antes e durante o surto de peste. De acordo com a variabilidade dos padrões de restrição e o alto poder discriminatório, a técnica PFGE pode ser utilizada para diferenciação e análise de novos isolados. A padronização do protocolo do PFGE para genotipagem das cepas brasileiras de Y. pestis pode ser útil na compreensão e controle da expansão da peste