Objetivos: avaliar o papel da Candida albicans (ATCC 90028) no potencial cariogênico e acidogênico de biofilmes in vitro de Streptococcus mutans (UA159). Métodos: biofilmes de dupla-espécie (C. albicans + S. mutans) e de espécie única (S. mutans ou C. albicans) foram cultivados sobre a superfície hígida de blocos de esmalte bovino com dureza inicial conhecida na presença de meio de cultura suplementado com glicose 20 mM e sacarose 3 mM por 24, 48 e 72 horas. O meio foi substituído diariamente e seu pH foi registrado. Blocos de esmalte foram então coletados ao final de cada período experimental e contagens de células viáveis foram realizadas. A desmineralização foi avaliada através da porcentagem de alteração de microdureza superficial (% SMC) e análise de microradiografia transversal (perda mineral integrada e profundidade de lesão). Resultados: o pH do meio de cultura permaneceu constante nos biofilmes de espécie única de C. albicans causando quase nenhuma desmineralização no esmalte. Não houve diferença no potencial acidogênico dos biofilmes de espécie única de S. mutans ao longo dos períodos experimentais sendo estes valores de pH sempre menores quando comparados ao pH relacionado aos demais biofilmes (p < 0.01) A % SMC dos biofilmes de espécie única de S. mutans aumentou significativamente com o tempo. Além disso, lesões de cárie após 72 horas de crescimento de biofilme bacteriano apresentaram maior perda mineral integrada e foram mais profundas do que lesões de cárie relacionadas a biofilmes de dupla-espécie (p < 0.01). O pH do meio de cultura relacionado a biofilmes de dupla-espécie foi baixo no primeiro dia, mas aumentou no decorrer do tempo para valores acima do pH crítico para desmineralização do esmalte. Em consequência, a % SMC permaneceu a mesma depois de 48 horas de crescimento de biofilmes de dupla-espécie e foi significantemente menor do que os valores relacionados a S. mutans em espécie única (p < 0.01). Conclusões: os presentes dados sugerem que a C. albicans apresenta um baixo potencial de desmineralização de esmalte e esse micro-organismo parece reduzir tanto o potencial cariogênico quanto acidogênico de biofilmes de S. mutans pela modulação do pH extracelular durante o crescimento in vitro de biofilmes de dupla-espécie. / Aim: evaluate the role of Candida albicans (ATCC 90028) on the cariogenic and acidogenic potentials of Streptococcus mutans (UA159) in vitro biofilms. Methods: dual-species (C. albicans + S. mutans) and single-species (S. mutans or C. albicans) biofilms were grown on the surface of sound bovine enamel slabs with known baseline hardness in the presence of culture medium supplemented with 20 mM glucose and 3 mM sucrose for 24, 48 and 72 hours. The medium was replaced daily and its pH was recorded. Enamel slabs were collected at the end of each experimental period and counts of viable cells were performed. Demineralization was evaluated through percentage of surface microhardness change (% SMC) and transversal microradiography analysis (integrated mineral loss and lesion depth). Results: spent medium pH remained neutral in C. albicans single-species biofilms causing almost no enamel demineralization. No difference in acidogenic potential of S. mutans single-species biofilms was found among experimental periods and its pH was always lower than pH related to other biofilms (p < 0.01). The % SMC in S. mutans single-species biofilms significantly increased with time. In addition, caries lesions after 72 hours of S. mutans biofilm growth had higher integrated mineral loss and were deeper than caries lesions related to dual-species biofilms (p < 0.01). Spent medium pH related to dual-species biofilms was low in the first day, but increased with time to values above critical pH for enamel demineralization. As a consequence, the % SMC remained the same after 48 hours of dual-species biofilm growth and was significantly lower than S. mutans single-species related values (p < 0.01). Conclusions: the present data suggest that C. albicans has low enamel demineralization potential and may decrease both the cariogenic and acidogenic potentials of S. mutans by modulating extracellular pH during in vitro dual-species biofilm growth.

Os tecidos pulpar e periodontal são frequentemente agredidos por fatores ambientais como calor, trauma mecânico e micro-organismos, sendo estes considerados o fator etiológico principal das periodontopatias e periapicopatias. Dentre as células residentes desses tecidos, especial atenção tem sido dada ao papel dos fibroblastos no desenvolvimento da resposta imune. Fibroblastos são células que respondem à estímulos microbianos e existem evidências do papel de receptores do tipo Toll (TLR) no reconhecimento desses estímulos. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o reconhecimento de Candida albicans por fibroblastos gengivais e pulpares. Para tal, fibroblastos isolados a partir de tecido gengival e pulpar de camundongos do grupo controle e deficientes de TLR2, CD14 e MyD88 foram avaliados quanto à expressão de TLRs e moléculas de superfície, resposta proliferativa e produção de citocinas (TGF-&#x3B2;, IL-1&#x3B2;, TNF-&#x3B1;, IL-13 e IL-6), após a estimulação com agonistas de TLR2, TLR4 e C. albicans. Fibroblastos gengivais e pulpares, apesar de provenientes de tecidos diferentes, apresentaram características morfológicas semelhantes. Contudo, a cinética de crescimento dos fibroblastos gengivais deficientes de MyD88 foi mais lenta, e fibroblastos pulpares demoraram mais tempo para surgir a partir dos fragmentos de tecido. A ausência de TLR2 e da molécula adaptadora MyD88 não afetaram a produção de colágeno Tipo I pelos fibroblastos gengivais. Entretanto, fibroblastos deficientes de CD14 apresentaram baixa produção de colágeno. Ademais, os fibroblastos gengivais expressaram TLR2, TLR3, TLR4, assim como as moléculas de adesão ICAM-1 e CD44. A ausência de TLR2 e CD14 interferiu na resposta proliferativa de fibroblastos gengivais e pulpares, respectivamente. O reconhecimento de C. albicans por fibroblastos gengivais e pulpares modulou a produção das citocinas. A produção de TNF-&#x3B1; foi dependente da sinalização via MyD88, CD14 e TLR2, enquanto que a produção de IL-1&#x3B2; e IL-13 foi dependente de TLR2. / Pulpal and periapical tissue are frequently injured by heat, mechanical trauma and microorganisms, which are considered the main etiological factor of periodontal and endodontic diseases. Among these tissue resident cells, special attention has been given to fibroblasts in the immune response. Fibroblasts are cells that recognize pathogens through Toll like receptors (TLR). The aim of this study was to evaluate the recognition of Candida albicans by pulpal and gingival fibroblasts from TLR2, CD14, MyD88 knockout mice and control group mice. The results were analyzed concerning the expression of TLR(s) and surface molecules, proliferative response and citokynes production (TGF-&#x3B2;, IL-1&#x3B2;, TNF-&#x3B1;, IL-13 e IL-6) after the cells stimulation with TLR2, TLR4 and C.albicans agonists. Gingival and Pulpal fibroblasts, even isolated from different tissue, showed morphological similarities; however, gingival fibroblast deficient of MyD88 show lower proliferative response and pulpa l fibroblasts needed more time to detach from tissue fragments. The production of Type I collagen was affected in gingival cells deficient of CD14. Gingival fibroblasts expressed TLR2, TLR3, TLR4, and the adhesion molecules (ICAM-1 and CD44). The absence of TLR2 and CD14 interfered with the proliferative response of pulpal and gingival fibroblasts, respectively. The recognition of C. albicans by gingival and pulpal fibroblasts modulated the citokynes production. TNF-&#x3B1; production after the recognition of C. albicans was dependent from MyD88, CD14 and TLR2 molecules, whereas the production of IL-1&#x3B2; and IL-13 was dependent of TLR2.

A incidência de infecções por fungos oportunistas na população de pacientes imunocomprometidos tem aumentado nos últimos anos, e estas são, principalmente, causadas por Candida albicans. Este patógeno oportunista pode crescer em diferentes formas, variando de levedura, pseudohifa e hifa e essa transição morfológica está associada com a virulência. Na transição de levedura para hifa, genes hifa-específicos são expressos e muitos deles codificam proteínas que possuem uma molécula de GPI (glicosilfosfatilinositol), mas a maioria (66%) das proteínas preditas ancoradas por GPI (PGAs), ainda possuem função desconhecida. Portanto, o objetivo deste trabalho, foi iniciar a caracterização funcional dos genes PGA13 e PGA58 através de análises in silico, da expressão diferencial dos RNAm sob condições ambientais diversas, e nos mutantes nulos TUP1 e EFG1, e a obtenção e caracterização fenotípica dos mutantes de PGA13: homozigoto nulo e de superexpressão. Os estudos realizados in silico indicam que PGA13 e PGA58 são reguladas pelos fatores transcricionais Efg1, Tec1 e Nrg1 e que possuem sítios potenciais de glicosilação. A análise transcricional desses genes mostra que ambos são regulados por Tup1 e que respondem aos estímulos NaCl (Cloreto de sódio), H2O2 (Peróxido de hidrogênio), etanol, cafeína, HCl (Ácido Clorídrico) e às condições hipo e hiperosmótica. Os mutantes nulos e de superexpressão de PGA13 e PGA58 foram obtidos e as linhagens que perderam o gene PGA13 tiveram um padrão de crescimento da colônia diferente da linhagem CAI-4 e foram mais sensíveis aos compostos SDS, Higromicina B e pH ácido, enquanto o mutante que superexpressava foi mais resistente. Estes resultados sugerem que Pga13 deve ter papel importante na parede celular, visto que a falta dela ocasionou maior sensibilidade a compostos que agridem a parede celular. / The incidence of opportunistic fungal infections in immunocompromised patients has increased in the last years. Candida albicans is the most commonly isolate in immunocompromised patients. C. albicans may grow in distinct morphologies: yeast, pseudohyphal and true hyphal. The switch between yeast and filamentous forms is strongly associated with virulence. During the transition, hyphal-specific genes are expressed and many of these genes encode glycophosphatidylinositol (GPI)- anchored proteins. The majority (66%) of predited GPI proteins has unknown functions. The purpose of this work was to functionally characterize the novel PGA13 and PGA58 genes. To accomplish this task, we have made in silico promoter analysis, mRNA differential expression analysis under some environmental conditions. We have also verified whether those genes are regulated by Tup1 and Efg1 transcriptional regulators. We have knocked out PGA13 and have done phenotypic analysis of the resulting PGA13 null mutant strain and a Pga13 overexpressing strain. The in silico promoter analysis indicates that PGA13 and PGA58 may be regulated by the transcriptional factors Efg1, Tec1 and Nrg1. PGA13 and PGA58 aminoacid sequence analysis revealed that they have potential glycosylation sites. The transcriptional analysis has shown that both genes are regulated by the morphogenesis negative regulator Tup1. PGA13 and PGA58 genes have differential expression in response to salt, hydrogen peroxide, ethanol, caffein, and acid stresses, and also to hypo and hyperosmotic shocks. The phenotypic analysis shows that the pga13/pga13 mutant was more sensitive to SDS, Hygromycin B and acid pH in a plate dilution sensitivity test. Interestingly, the overexpressing mutant strain was more resistant to the same compounds. Taken together these results suggest that PGA13 may have an important role in the cell wall since its absence leads to higher sensitivity to compounds that affect this organelle.

Orientadores: Rafael Leonardo Xediek Consani, Janaína Sardi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-17T12:33:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Macedo_AnaPatriciaFernandesde_M.pdf: 1264842 bytes, checksum: 40d361272850e04ae60d9a96e01e285b (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O objetivo neste estudo in vitro foi avaliar o efeito da desinfecção por microondas em biofilmes de Candida sp formados em resinas acrílicas Clássico, Onda-Cryl e QC-20. Para isso foram confeccionados 30 corpos-de-prova (20mm de diâmetro por 2mm de altura), de cada resina, esterilizados com óxido de etileno. Após a obtenção do inóculo da levedura (Candida albicans, Candida tropicalis e Candida dubliniensis), os corpos-de-prova foram contaminados individualmente com 200 ?L de uma cultura ajustada a 108 unidades formadoras de colônias (UFC/mL). Os espécimes foram colocados em meio de cultura específicos e incubados por 24 horas a 37ºC em aerobiose para a formação do biofilme. Para cada resina e cada microorganismo avaliados, 03 corpos-de-prova foram irradiados por microondas com potência de 650 W durante 3 minutos, 01 corpo-de-prova controle não foi irradiado e outro corpo-de-prova controle sem microorganismos. Após esse processo, os corpos-de-prova foram lavados em solução salina e plaqueados em meio de cultura (Sabouraud dextrose Ágar) para análise do número de UFC/mL. Para análise estatística foi empregado o método de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Student-Newman-Keuls. O grupo controle (não irradiados) apresentou crescimento microbiano após 48 horas de incubação a 37ºC. O grupo experimental apresentou diminuição significativa no número de colônias viáveis para todos os biofilmes formados pelas espécies de Candida analisadas. Os resultados demonstraram efetiva esterilização do biofilme de Candida após irradiação a 650 W por 3 minutos, para a maioria dos corpos-de-prova. O procedimento demonstrou ser um método capaz de diminuir consideravelmente a quantidade destes microrganismos / Abstract: The objective of this in vitro study was to evaluate the effect of microwave disinfection in biofilms of Candida sp. immersed in acrylic resin specimens (Clássico, Onda-Cryl and QC-20). For the study, 30 specimens (20mm X 2mm) were fabricated, for each resin, and subjected to ethylene oxide sterilization. After obtaining the inoculum of yeast (Candida albicans, Candida tropicalis and Candida dubliniensis), the specimens were infected individually with 200?L of a culture adjusted to 108 CFU / mL, placed in specific media and incubated for 24 hours to 37ºC aerobically for biofilm formation. For each resin and microorganism, 03 specimens were irradiated by microwave for 3 minutes at 650 W, and a control non-irradiated and a control without microorganisms. After this process, the specimens were washed with saline and then plated in Sabouraud dextrose agar for analysis of the number of colony forming units (CFU / mL). For statistical analysis was used the method of Kruskal-Wallis test followed by Student-Newman-Keuls. The control group (not irradiated) showed microbial growth after 48 hours incubation at 37ºC. The experimental group showed a significant decrease in the number of viable colonies for all the biofilms formed by Candida species analyzed. Thus, the results demonstrated an effective sterilization of Candida biofilm after 3 minutes of irradiation at 650W for most of the specimens. The procedure proved to be able to significantly decrease the amount of microorganisms / Mestrado / Protese Dental / Mestre em Clínica Odontológica

Orientadores: Altair Antoninha Del Bel Cury, Alfredo Julio Fernandes Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-15T07:28:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Straioto_FabianaGouveia_D.pdf: 1136819 bytes, checksum: 94255ae316940aec09bc64b1ad3b35c2 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Resinas acrílicas são materiais amplamente empregados na Odontologia, especialmente os polímeros a base de polimetilmetacrilato (PMMA) para confecção de próteses. Dentre as vantagens deste material estão à estabilidade de cor, propriedades ópticas, estética satisfatória, estabilidade dimensional, fácil manipulação e propriedades físicas adequadas para aplicações odontológicas. Entretanto, como desvantagem deste material, está à susceptibilidade à aderência e desenvolvimento de biofilme por microrganismos presentes na cavidade bucal, como fungos e bactérias. A aderência de microrganismo é o primeiro evento para o desenvolvimento do biofilme o qual está relacionado ao estabelecimento de quadros clínicos patológicos como estomatite protética. Recentemente, a adição de modificadores na composição da resina acrílica tem sido proposta com o objetivo de melhorar as características de superfície, e conseqüentemente controlar a aderência de microrganismos. Entretanto, a mudança na composição da resina acrílica não deverá comprometer as propriedades físicas. Politetrafluoretileno (PTFE) tem sido usado como modificador para confecção de stents e cateteres devido a biocompatibilidade, alta resistência a agentes químicos e baixa energia de superfície. Assim, o objetivo neste estudo foi avaliar as propriedades físicas, características de superfície, aderência de microrganismos e formação de biofilme de suas resinas acrílicas, uma polimerizada em água quente com ciclo longo e a outra polimerizada pelo ciclo curto, contendo 2% de PTFE em sua composição e comparar com as mesmas resinas sem adição de PTFE. Para isto, três estudos foram realizados: 1- Propriedades físicas da resina acrílica - espécimes das resinas foram confeccionados de acordo com a norma ISO 1567:1999 (n=10) para cada teste mecânico: dureza de superfície, resistência ao impacto, resistência a flexão e o módulo de elasticidade e carga máxima foram calculados; 2 - Características de superfície da resina acrílica e aderência de Candida albicans: espécimes retangulares (n=10) para cada resina foram confeccionados e avaliados quanto à rugosidade, ângulo de contato, energia livre de superfície e aderência de Candida albicans. As células aderidas foram expressas por unidade formadora de colônia por área da superfície; 3- Biofilme formado na resina acrílica e sua composição: discos de resina acrílica (n=6) foram usados para formação de biofilme de Streptococcus mutans UA159, Streptococcus sanguinis ATCC 10556 e Actinomyces naeslundii ATCC 12104. A composição de polissacarídeos e unidades formadoras de colônia foram comparadas. Em todos os estudos, os resultados foram submetidos à análise variância a dois fatores e comparados pelo teste de Tukey (p=0,05). Os resultados não mostraram diferença estatisticamente significante para os valores de dureza de superfície (p>0,05). Entretanto, para os valores de resistência ao impacto e flexão para os grupos experimentais, contendo PTFE, apresentaram resultados significantemente menores (p<0,05) quando comparados aos grupos não adicionados de PTFE. Os valores de módulo de elasticidade da resina acrílica adicionada com 2% de PTFE polimerizada com o ciclo longo apresentaram os maiores valores comparados aos demais grupos (p<0,05). Não houve diferenças significativas para rugosidade, ângulo de contato e energia livre de superfície (p>0,05); houve uma tendência de redução de células de C. albicans no grupo com PTFE, mas não foi estatisticamente significante. Em relação, a formação e composição de polissacarídeo os resultados não apresentaram diferenças entre os grupos de resina acrílica (p>0,05). Os resultados sugerem que 2% de PTFE adicionada à resina acrílica não foi suficiente para promover mudanças nas propriedades mecânicas, aderência e composição do biofilme. / Abstract: Acrylic resins have been widely used in Dentistry, especially polymers of poly (methyl methacrylate) for fabricating dentures. This material has as advantages stable color and optical properties, satisfactory esthetic and dimensional stability, it is easy to be processed, and its physical properties have been proven adequate for dental applications. However, as disadvantage acrylic resins surface is susceptible to adherence and biofilm development of oral microorganism, such as fungi and bacteria. Microorganism's adherence is the first step to biofilm development, and it is related to pathogenic condition, leading to denture stomatitis. Recently, it had been proposed addition of modifiers to acrylic resin composition that could be able to improve its surface properties, and consequently controlling microorganisms' adherence. However, this change in composition of acrylic resin should not compromise its physical properties. Polytetrafluorethylene has been used as modifiers to fabricate medical devices such as stents and catheters because it is a biocompatible material, high resistance to chemical reagents and low surface energy. Thus, the aim of this study was to evaluate the physical properties, surface characteristics, adherence of microorganisms and biofilm formation of two acrylic resins, one polymerized by long and other polymerized by short cycle, with 2% (w/w) of PTFE added and to compare with the same resins with no PTFE added. For this, three studies were conducted: 1 - Physical properties of acrylic resins - specimens were prepared for each acrylic resin according to the ISO standard 1567:1999 (n=10) for each mechanical test: surface hardness, impact strength, flexural strength and flexural modulus and peak load were calculated; 2 - Characteristics of acrylic resin surface and adherence of Candida albicans: rectangular specimens (n=10) of each resin were prepared and evaluated for surface roughness, contact angle, surface free energy and C.albicans adherence. Adhered cells were expressed in colony forming units per surface area; 3- Biofilm formed on acrylic resins and its composition: acrylic resin discs (n=6) were used to Streptococcus mutans UA 159, Streptococcus sanguinis ATCC 10556 and Actinomyces naeslundii ATCC 12104 biofilm formation. Polysaccharide composition and colony forming units were compared. For both three studies the results of were analyzed by Two-Way ANOVA and Tukey test (P<.05). The results showed no statistical significant differences for surface hardness (P>0.05). However, impact and flexural strengths values for experimental groups, with PTFE added were significantly lower (P<.05) when compared to the groups with no PTFE added. The flexural modulus values of acrylic resin containing 2% PTFE polymerized by long cycle was higher than other resins (P<0.05). No statistical differences were found for roughness, contact angle, surface free energy (P>.05); there was a reduction trend in C. albicans adherence in acrylic resin with PTFE added, but it was not statistically significant. Regarding, the formation and composition of polysaccharide matrix the results showed no differences among the acrylic resin groups (P>0.05). The results showed that the 2% of PTFEE incorporated to acrylic resins was not enough to affect the mechanical properties, adherence and composition of biofilm. / Doutorado / Protese Dental / Doutor em Clínica Odontológica

A utilização de soluções químicas para desinfecção de próteses totais constitui atualmente uma das opções para a manutenção da limpeza e saúde na cavidade oral de pacientes portadores de dentaduras. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de duas soluções desinfetantes (Hipoclorito de sódio 1% e Gluconato de clorexidina 4%), na hidrofobicidade superficial e adesão de Candida albicans ATTC 90028 sobre resina acrílica termopolimerizável, inicialmente e após 1, 7, 15 e 30 ciclos de desinfecção química, além de verificar o efeito da formação da película adquirida salivar sobre as duas variáveis avaliadas através de mensuração de ângulo de contato e microscopia de fluorescência. Para a mensuração da hidrofobicidade superficial 18 espécimes (10 x 25 x 2 mm) foram confeccionados em resina acrílica termopolimerizável e desinfetados, simulando a implementação de um protocolo de desinfecção diária durante 30 dias. Após completar o número de desinfecções de cada um dos períodos avaliados, mensurações de ângulo de contato foram feitas antes e depois da formação da película adquirida salivar. Para os testes de adesão de C. albicans à resina acrílica termopolimerizável, 180 espécimes (5 x 5 x 1 mm) foram confeccionados em resina acrílica termopolimerizável e desinfetados e divididos em vários períodos (Inicial-1-7-15-30 ciclos de desinfecção). Após completar o número de desinfecções de cada um dos períodos avaliados, foram feitos ensaios de adesão de C. albicans utilizando o fluorocromo laranja de acridina para posterior visualização mediante o uso de microscópio de fluorescência. Os dados de hidrofobicidade superficial foram analisados através do teste paramétrico ANOVA medidas repetidas e T-Student. Para os resultados de adesão de C. albicans foi utilizado o teste não paramétrico Kruskall Wallis e teste de Dunn. Para correlacionar as variáveis foi utilizado o teste de Pearson. Os resultados obtidos demonstraram que a imersão da resina acrílica em soluções desinfetantes diminui a adesão de C. albicans e os valores de hidrofobicidade superficial em todos os grupos após 30 desinfecções químicas. A formação da película adquirida salivar diminui a adesão de C. albicans e hidrofobicidade Resumo superficial, em todos os grupos após 30 desinfecções químicas. Não existe correlação entre os valores de adesão de C. albicans e hidrofobicidade superficial da resina acrílica termopolimerizável após desinfecção química, exceto para os grupos controle e Gluconato de clorexidina 4% prévio a formação da película adquirida salivar. / The use of chemical solutions for dentures disinfection currently constitutes one of the options for the maintenance of the cleanness and oral health of dentures users. The objective of this study was to evaluate the effect of two disinfecting solutions (Sodium Hypochlorite 1% and Gluconate chlorhexidine 4%), on the acrylic resin surface hydrophobicity and adhesion of Candida albicans ATTC 90028 on the heat-cure acrylic resin before and after 1, 7, 15 and 30 chemical disinfectant cycles. Furthermore to verify the effect of the formation of the acquired salivary pellicle on the variables, evaluated through contact angle measurements and fluorescence microscopy. For the surface hydrophobicity assay, 18 specimens (10 x 25 x 2 mm) had been confectioned in heat cure acrylic resin and disinfected, simulating the implementation of a daily dentures chemical disinfection protocol, during 30 days. After each disinfection period, contact angle measurements were made before and after the acquired salivary pellicle formation. For C. albicans adhesion assay, 180 specimens (5 x 5 x 1 mm) had been confectioned in heat cure acrylic resin, chemically disinfected and divided in: Initial, 1, 7, 15 and 30 disinfection cycles. After completed each period of chemical disinfection C. albicans adhesion analysis had been made using, fluorocrome acridine orange for posterior visualization by the use of fluorescence microscope. The data of acrylic resin surface hydrophobicity had been analyzed through parametric test ANOVA repeated measures and T-Student. For the C. albicans adherence results, Kruskall Wallis no parametric test and Dunns test were used. To correlate the variables Pearson test were used. The results had demonstrated that the immersion of the heat cure acrylic resin in disinfecting solutions diminishes the adhesion of C. albicans and the values of acrylic resin surface hydrophobicity, in all the groups, in a period of 30 cycles. The formation of the acquired salivary pellicle diminishes the adhesion of C. albicans and acrylic surface hydrophobicity in all the groups in a period of 30 cycles. Correlation does not exist Abstract between the values of C. albicans adhesion and acrylic surface hydrophobicity after chemical disinfection, except for the Control group and Gluconate chlorhexidine 4% group before the formation of the acquired salivary pellicle.

Apesar das evidências sobre o efeito de bactérias probióticas sobre Candida albicans, os mecanismos envolvidos nesta interação não estão totalmente esclarecidos. Visando contribuir com o entendimento sobre os mecanismos pelos quais bactérias probióticas interferem na colonização por C. albicans, o presente estudo testou a hipótese de que Lactobacillus probióticos interferem na resposta de macrófagos humanos induzida por C. albicans e inibem o desenvolvimento do biofilme de C. albicans. Macrófagos humanos THP-1 foram pré-tratados com Lactobacillus rhamnosus LR32, Lactobacillus casei L324m e Lactobacillus acidophilus NCFM, e desafiados com C. albicans e/ou lipopolissacarídeos (LPS) de Escherichia coli, em ensaio de co-cultura. Após incubação, foram determinados o perfil de citocinas por ELISA, a transcrição relativa do gene clec7a por RT-qPCR. Biofilmes de C. albicans ATCC SC5314 e 75 (isolado clínico) em fase de adesão inicial, colonização inicial e maturação foram tratados com suspensão de Lactobacillus probióticos. Além disso, os biofilmes de C. albicans foram tratados com meio condicionado com L. rhamnosus após diferentes períodos experimentais. O efeito dos probióticos foi avaliado por contagem de células de C. albicans viáveis e avaliação da morfologia celular por microscopia confocal e eletrônica de varredura. O pré-tratamento com bactérias probióticas promoveu alteração no perfil de citocinas produzidas por macrófagos desafiados com LPS e C. albicans, induzindo um aumento nos níveis de IL-10 e redução de IL-12 (p<0,05). Além disso, o pré-tratamento com probióticos provocou redução do nível de transcritos de clec7a, que codifica o receptor Dectina-1 (p<0,05), indicando a redução da expressão de Dectina-1 nestas células. A interação entre cepas de Lactobacillus e C. albicans promoveu significativa redução (p<0,05) no número de células de C. albicans no biofilme (25,5-61,8%), na dependência da cepa probiótica e da fase do biofilme de C. albicans. Todos os Lactobacillus testados impactaram negativamente na diferenciação levedura-hifa de C. albicans e na formação do biofilme. Análises microscópicas revelaram que as suspensões de L. rhamnosus reduziram a diferenciação de Candida em hifas, levando a uma predominância de crescimento em levedura. O meio condicionado com L. rhamnosus não exerceu efeito significante sobre biofilme maduro (p>0,05), mas promoveu redução significativa do número de UFC de C. albicans quando utilizado nos estágios iniciais da formação do biofilme (p<0,01). Os resultados sugerem que Lactobacillus probióticos são capazes de interferir na expressão de receptores de macrófagos para o reconhecimento de C. albicans e reduzir a resposta de citocinas pró-inflamatórias. Além disso, os resultados indicam que Lactobacillus probióticos são capazes de inibir a diferenciação de C. albicans de leveduras para hifas, e o desenvolvimento de biofilme de C. albicans, particularmente na fase de colonização inicial da levedura, por interações célula-célula e secreção de exometabólitos. O conjunto de dados deste estudo contribui para elucidar os mecanismos pelos quais Lactobacillus atuam como probióticos, dando suporte para o seu uso como terapia suplementar contra infecções de mucosas por C. albicans. / The infection rates of Candida albicans in human may be reduced by probiotics. However, the mechanisms involved in the interaction between C. albicans and probiotic bacteria are largely unknown. The present study comprised two parts. The first aimed to test the hypothesis that probiotics may impair the signaling induced by C. albicans in human macrophages, thus lowering the inflammatory challenge. The second aimed to evaluate the inhibitory effects of Lactobacillus on different phases of C. albicans biofilm development. In the first part, macrophages were pretreated with a probiotic strain (Lactobacillus rhamnosus LR32, Lactobacillus casei L324m and Lactobacillus acidophilus NCFM) and challenged with C. albicans and/or lipopolysaccharide (LPS) of Escherichia coli in a co-culture assay. After incubation, cytokine profile of macrophage\'s supernatant was assessed by ELISA and the expression of clec7a gene was determined by RT-qPCR. Probiotic strains altered the cytokine profile of macrophages stimulated with LPS and C. albicans, leading to increased levels of IL-10 and reduced levels of IL-12 (p<0.05), and reducing the relative expression of clec7a gene encoding Dectin-1 receptor (p < 0.05). In the second part, quantification of biofilm growth and microscopic analyses were performed on C. albicans biofilms treated with Lactobacillus cell suspensions and their supernatants. Lactobacilli induced a significant reduction (p<0,05) in the number of biofilm cells (25.5-61.8%) dependent on the probiotic strain and the biofilm phase. L. rhamnosus supernatants had no significant effect on the mature biofilm (p>0.05), but significantly reduced the early stages of Candida biofilm formation (p<0.01). Microscopic analyses revealed that L. rhamnosus suspensions reduced Candida hyphal differentiation, leading to a predominance of budding growth. All lactobacilli negatively impacted C. albicans yeast-to-hyphae differentiation and biofilm formation. The inhibitory effects of Lactobacillus on C. albicans involved both cell-cell interactions and secretion of exometabolites. To conclude, the probiotic lactobacilli reduce inflammation by impairing the recognition of C. albicans by macrophages and altering the production of proinflammatory cytokines. It was also clarified, for the first time, the mechanics of how the Lactobacillus species antagonize C. albicans colonization, particularly in the critical, early colonization phase of the yeast. Taken all together, our data elucidated the inhibitory mechanisms of lactobacilli that define their probiotic candicidal activity, supporting the use of these probiotics as a supplemental therapy against mucosal infections by C. albicans.

Orientador: Marta Cristina Teixeira Duarte / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-26T04:57:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Matsumura_LauraYumeRodrigues_M.pdf: 1312693 bytes, checksum: 7afc440e71f8e63ffdb4e0f57d78115f (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As leveduras causam deterioração de uma grande variedade de produtos alimentícios e nas indústrias de bebidas, além de serem resistentes a muito conservantes químicos. Os óleos essenciais e extratos de plantas têm surgido como alternativas seguras para substituir conservantes sintéticos. Contudo, os mecanismos de ação de óleos essenciais sobre micro-organismos são complexos e não estão completamente elucidados. Neste trabalho, foi investigada a ação de 14 óleos essenciais e 2 extratos diclorometânicos provenientes de plantas medicinais e aromáticas pertencentes à CPMA (Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas) do CPQBA/UNICAMP sobre leveduras do gênero Candida e sobre Pichia guilliermondii de importância em alimentos. Foi determinada a concentração mínima inibitória (MIC) e os efeitos sobre a lise da membrana celular, sobre os carboidratos de reserva trealose e glicogênio, sobre a depleção de ATP e sobre a biossíntese de ergosterol. Os resultados demonstraram que o óleo essencial de Cinnamomum burmanni foi o que apresentou melhor potencial para controle das leveduras, sendo o cinamaldeído e o acetato de cinamila os compostos majoritários presentes neste óleo. A investigação dos possíveis mecanismos de ação do óleo essencial de C. burmanni sobre Candida albicans ATCC 10231 demonstrou que este afetou a viabilidade da levedura a partir da concentração de 0,5 mg/mL (5MIC), e ocasionou a lise da membrana celular, havendo liberação de proteínas e lipídios para o meio extracelular, além de depleção de ATP. No caso dos carboidratos de reserva, os resultados demonstraram que o óleo essencial de C. burmanni ocasionou acúmulo de trealose, possivelmente pelo estresse ocasionado às células. Nenhum efeito foi observado sobre a reserva de glicogênio e sobre a inibição da síntese de ergosterol. Os resultados indicam a ação inibitória do óleo essencial de C. burmanni e mostram que este apresenta potencial para controle de leveduras de importância em alimentos / Abstract: Yeasts cause deterioration of a wide variety of food and drink industries, besides being very resistant to chemical preservatives. Essential oils and plant extracts have emerged as safe alternatives to synthetic preservatives. However, the mechanisms of action of essential oils on microorganisms are complex and not fully elucidated. In this work, was investigated the action of 14 essential oils and 2 dichloromethane extracts from medicinal and aromatic plants belonging to the Collection of Medicinal and Aromatic Plants - CPMA at CPQBA/ UNICAMP on Candida species and Pichia guilliermondii of importance in foods. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined and the effects of the essential oil on the cell membrane lysis, the carbohydrate reserves trehalose and glycogen, depletion of ATP and ergosterol biosynthesis were evaluated. The results showed that the essential oil from Cinnamomum burmanni presented the best potential to control the Candida spp. being the cinnamaldehyde and cinnamyl acetate the major compounds present in this oil. The investigation of the possible mechanisms of action of the C. burmanni essential oil on Candida albicans ATCC 10231 showed that the oil affected the viability of the yeast from 0.5 mg/mL (5MIC), and caused lysis of the cell membrane, with release of proteins and lipids into the extracellular environment, as well as ATP depletion. In the case of carbohydrate reserves, the results showed that the essential oil of C. burmanni caused accumulation of trehalose, possibly due to the cellular stress. No effect was observed on the synthesis of glycogen and ergosterol. The results indicate the inhibitory action of the essential oil from C. burmanni and show its potential to control yeasts of importance in foods / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestra em Ciência de Alimentos

Orientador: Altair Antoninha Del Bel Cury / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-19T16:58:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Custodio_William_D.pdf: 6418945 bytes, checksum: f47ba0f315d5085af1b6afa2e2734527 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O desenvolvimento de biofilme de Candida albicans pode ser mediado pela expressão diferencial de sítios de ligação protéicos na película adquirida formada sobre as superfícies das próteses dentais. Assim, objetivo geral deste estudo foi verificar a influência das proteínas de origem salivar e plasmática na formação dos biofilmes de C. albicans. No primeiro capítulo foi revisado o estado da arte de metodologias aplicadas para análise de proteínas. A partir do conhecimento das metodologias, a pesquisa foi realizada com objetivo de caracterizar os perfis protéicos de películas adsorvidas (ADP) à superfície de espécimes de poli(metilmetacrilato), na presença de saliva ou saliva acrescida de plasma sanguíneo. A composição da ADP foi analisada utilizando a técnica de espectrometria de massas, cujo resultado demonstrou diferenças significativas nos proteomas obtidos entre os grupos. Ainda, foi verificada a influência destas películas na energia livre de superfície (SFE) e expressão de fatores de virulência de biofilmes de C. albicans. Os achados demonstraram que a ligação de proteínas plasmáticas determinou aumento de ambas variáveis. A partir desses dados estudou-se o efeito individual de algumas das proteínas identificadas na ADP no desenvolvimento de biofilmes de C. albicans. Com esse objetivo, biofilmes de C. albicans foram desenvolvidos (90 min, 24, 48 e 72 h) sobre películas mono protéicas de albumina, mucina I e II, lactoferrina, fibrinogênio, C3b, IgA e histatina 5. Em cada um dos tempos foi avaliada a atividade metabólica da célula fúngica (teste de XTT), a organização estrutural do biofilme (microscopia confocal por varredura à laser) e a expressão de fatores de virulência por meio dos testes de produção enzimática. Baseado nas evidências geradas por estes trabalhos, podese concluir que proteínas salivares e plasmáticas adsorvidas como integumentos protéicos mantêm sua função biológica e, assim, exercem uma influência modulatória no desenvolvimento de biofilmes de C. albicans / Abstract: The development of Candida albicans biofilms may be mediated by a differential expression of proteic ligand sites in the acquired pellicle formed onto the oral prosthesis surfaces. Therefore, the main objective of this study was to evaluate the influence of salivary and plasmatic-derived proteins on the development of C. albicans biofilms. In the first chapter the state-of-the-art was reviewed for methodologies applied to the analysis of proteins. From the knowledge of the methodologies, the research was realized aiming to characterize the protein profile of acquired pellicles (ADP) on poly(methylmetacrilate) surfaces' specimens in the presence of saliva or saliva supplemented with blood plasma. ADP composition was analyzed by mass spectrometry techniques, which results demonstrated a significant difference in the obtained proteome between the groups. Moreover, the influence of these pellicles was evaluated for the surface free energy (SFE) and expression of virulence factors by C. albicans biofilms. The findings demonstrated that the binding of plasmatic proteins in the ADP determined increases in both experimental variables. From these data, the individual effect of some identified ADP proteins was evaluated on C. albicans biofilm development. With this objective, C. albicans biofilms were developed (90 min, 24, 48 and 72 h) over mono-protein pellicles of albumin; mucin I and II; lactoferrin; fibrinogen; C3b; IgA and histatin 5. For each time point, biofilms were analyzed for metabolic activity (XTT assay), structural biofilm conformation (Confocal scanning laser microscopy) and, expression of virulence factors by means of enzymatic activity assays. Based on the generated evidences of these studies, we can conclude that adsorbed salivary and plasmatic proteins as proteic integuments keep their biological function, and thus exert a modulatory influence on C. albicans biofilm development / Doutorado / Protese Dental / Doutor em Clínica Odontológica

Orientador: Altair Antoninha Del Bel Cury / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-21T19:13:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lucena_SilviaCarneirode_D.pdf: 2411404 bytes, checksum: 60623a707d801134f36a5179acd0d512 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A adequada higienização das próteses dentais removíveis é fundamental para prevenir o acúmulo de biofilme, que funciona como reservatório de microorganismos que podem levar a infecções locais e sistêmicas. Apesar de a escovação constituir um método bem estabelecido para tal fim, limitações visual e motora de alguns pacientes reduzem sua eficácia. Assim, o uso de limpadores químicos (LQ) tem sido indicado como método complementar para remoção do biofilme. Frente ao exposto, os objetivos deste trabalho foram (i) avaliar in vitro o efeito da imersão diária em LQ sobre biofilmes multiespécies desenvolvidos em resina para base de próteses removíveis e (ii) avaliar in vivo o efeito do LQ no controle do biofilme de próteses parciais removíveis (PPR). Para o estudo in vitro, foram confeccionados discos de resina acrílica sobre os quais foram desenvolvidos biofilmes multiespécies (Candida albicans, Veillonella dispar, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Fusubacterium nucleatum e Actinomyces naeslundii). Após 64,5 horas de desenvolvimento do biofilme, os espécimes foram aleatoriamente distribuídos em grupos controle e experimental. Os espécimes do grupo experimental foram submetidos a imersões diárias de 3 minutos na solução de LQ (Polident® 3 minute) por sete dias consecutivos; o biofilme do grupo controle foi desenvolvido durante o mesmo período sem tratamento. O biofilme de ambos os grupos foi coletado após 1, 4 e 7 dias experimentais (n=16) e analisados quanto ao número de células viáveis e concentração de polissacarídeos. Adicionalmente, a topografia superficial do biofilme e a morfologia celular foram analisadas através de microscopia eletrônica de varredura e confocal a laser. Para a avaliação in vivo, foram selecionados 25 voluntários usuários de PPR. Estes foram instruídos a complementar a higienização das próteses imergindo-as na solução do LQ (Polident® 3 minute) diariamente, por 3 minutos, durante 15 dias. O biofilme presente nas próteses foi coletado imediatamente antes e após o período experimental e o número de micro-organismos totais, estreptococos totais e Candida spp. foi quantificado. No estudo in vitro, foi observado que a imersão diária no LQ reduziu significativamente o número de micro-organismos totais quando comparado ao grupo controle nos três períodos avaliados (Análise de variância a dois fatores, p<0,05). Esta redução também foi observada para as bactérias individualmente e F. nucleatum e V. dispar não foram detectadas nos biofilmes expostos ao LQ. Observou-se um aumento gradativo na contagem de células de C. albicans no grupo experimental, comportamento inverso ao grupo controle no qual houve redução do número de células fúngicas viáveis. A concentração de polissacarídeos extracelulares no biofilme foi maior no grupo experimental após sete dias de limpeza quando comparado ao controle (Análise de variância a dois fatores, p<0,05). As imagens de microscopia revelaram elevada quantidade de hifas de C. albicans no grupo experimental. No estudo in vivo, observou-se uma redução significativa do número de micro-organismos totais e estreptococos totais após o período experimental (Teste-t pareado, p<0,05). Entretanto, não houve diferença para as contagens de Candida spp.. Conclui-se que a exposição diária ao limpador químico reduziu significativamente os micro-organismos totais viáveis em biofilmes multiespécies mas não apresentou eficácia sobre Candida / Abstract: The maintenance of adequate denture hygiene is of paramount importance to prevent biofilm accumulation which acts as a reservoir of microorganisms that can cause local and systemic infections. Although brushing is a well established method for denture cleaning, visual and manual limitations of some patients can reduce its efficacy. Therefore, the use of denture cleansers (DC) has been indicated as a complementary method for denture hygiene. Considering this, the aims of this study were to (i) evaluate, in an in vitro model, the effect of daily immersion in DC on a multispecies biofilm develop on denture-base acrylic resin and (ii) assess the effect of DC on controlling biofilm from removable partial dentures (RPD) surfaces. For the in vitro study, specimens were fabricated using acrylic resin on which it was develop a multispecies biofilm (Candida albicans, Veillonella dispar, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Fusubacterium nucleatum e Actinomyces naeslundii). After 64.5 hours of biofilm growth, the specimens were randomized into control and experimental groups. The specimens of experimental group were submitted to 3-minutes immersions on DC solution daily for seven consecutive days; the biofilms of control group were developed for the same period without any treatment. The biofilms from both groups were collected after 1, 4 and 7 experimental days (n=16) and analyzed for viable cells and polysaccharides concentration. Additionally, the biofilms topography and cellular morphology were analysed by scanning electron microscopy ) and confocal microscopy. For in vivo evaluation of DC, 25 volunteers that used RPD were selected. They were instructed to complement their dentures hygiene by immersing them on DC solution, for 3 minutes, during 15 days. The biofilm present on RPD was collected immediately before and after the experimental period and the number of total microorganisms, total streptococci and Candida spp. were quantified. In the in vitro study, it was observed that daily immersion on DC significantly reduced the total microorganisms in comparison to control group, in all periods evaluated. (Two-way Anova, p<0.05). This reduction was also observed for individual bacteria and F. nucleatum and V. dispar were not detected on biofilms exposed to DC. It was observed a gradual increase of C. albicans count in biofilms of experimental group while, in control group, Candida counts decreased and it was not observed viable cells after seven experimental days. Additionally, extracellular polysaccharides concentration was significantly higher in experimental group after 7 days of treatment (Two way Anova, p<0.05). The microscopy images revealed a remarkable presence of hyphae in experimental group. In clinical study, it was observed a reduction on total microorganisms and total streptococci. However, no difference was observed in Candida spp. counts (paired t-test, p<0.05). It can be concluded that daily exposure to DC reduced total microorganisms on multispecies biofilms but did no demonstrated efficacy on Candida / Doutorado / Protese Dental / Doutora em Clínica Odontológica