Los metales pesados aparecen en los suelos agrícolas de forma natural procedentes, mayoritariamente, de la meteorización del material originario. Sin embargo, el sistema agrario puede verse afectado por las actividades antrópicas desarrolladas en las proximidades de estos suelos y por las mismas prácticas agrícolas que incorporan diversos contaminantes al suelo. Debido a la diversidad de fuentes que pueden incrementar el contenido de metales pesados en los suelos agrícolas, se requieren estudios que evalúen el contenido y la distribución de estos elementos, para estimar la calidad ambiental y productiva de estos suelos y evitar su continuo deterioro. Además, a la hora de abordar un estudio para la caracterización de la contaminación del suelo por metales pesados, resulta también necesario establecer estándares de calidad de suelo, es decir, niveles de fondo y valores de referencia, con el fin de discernir entre suelos con contenidos normales y suelos contaminados.El objetivo general de esta Tesis Doctoral consiste en caracterizar el estado actual de los suelos agrícolas con cultivos hortícolas de la provincia de Alicante (Comunidad Valenciana). Para alcanzar este objetivo, se han planteado diferentes objetivos específicos: (1) analizar las propiedades y características edáficas de estos suelos agrícolas; (2) determinar el contenido total y extraíble de nueve metales pesados (Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb y Zn) en 54 muestras de suelos seleccionadas aleatoriamente; (3) determinar el contenido de los metales pesados anteriormente mencionados en algunos cultivos hortícolas, especialmente en aquellas parcelas que presentan altos contenidos en suelo; (4) estudiar las relaciones estadísticas (correlaciones, regresiones, análisis factorial y análisis clúster) entre las diferentes variables analizadas; y (5) realizar una propuesta de niveles de fondo y valores de referencia para metales pesados en este tipo de suelos.Los resultados indican que los contenidos totales y extraíbles de metales pesados son similares a los encontrados en la bibliografía consultada, a excepción de algunas parcelas que presentan altos contenidos totales de Cr, Cu y Pb, y una elevada fracción extraíble para el Cd, Cu y Pb. En cuanto a los contenidos de metales pesados en los cultivos hortícolas, la mayoría de las muestras analizadas no superan los contenidos máximos admisibles establecidos por la legislación vigente, a excepción de algunas muestras que presentan altos contenidos de Cd. Estos resultados recomiendan llevar a cabo estudios adicionales para evaluar el riesgo que supone la presencia de estas concentraciones sobre la salud humana y el medio ambiente, especialmente en el caso del Cd. Finalmente, se han propuesto niveles de fondo y valores de referencia para metales pesados que son de utilidad para la aplicación de la Ley 10/1998 y el Real Decreto 9/2005 para la declaración de suelos contaminados bajo un uso hortícola de regadío. El estudio comparativo de las parcelas analizadas con los valores propuestos indica que no existen suelos fuertemente contaminados por actividades humanas contaminantes, mientras que el 37% de las parcelas superan los valores de referencia propuestos, por lo que sería recomendable llevar a cabo investigaciones adicionales. Finalmente, el 63% de las parcelas presentan contenidos de metales pesados por debajo de los valores de referencia establecidos y, por tanto, reflejan una calidad aceptable. / Heavy metals appear naturally in agricultural soils according to both the parent rock and pedogenic processes. However, the agroecosystem can be affected by human activities developed in the proximities of these soils and agricultural practices, which can release contaminants such as heavy metals to the environment. Scientific studies are required to assess the content and distribution of heavy metals in soils due to the diversity of sources that can increase the heavy metal content, particularly in agricultural soils, and avoid their degradation. In addition, it is also necessary to establish soil quality standards to distinguish between soils with normal levels of heavy metals and contaminated soils. The general aim of this Doctoral Thesis is to characterise the present condition of agricultural soils with vegetable crops in the province of Alicante (Valencian Community). To achieve this purpose, different specific objectives have been proposed: (1) to analyse properties and characteristics of these agricultural soils; (2) to determine the total and extractable content of nine heavy metals (Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb and Zn) in soil samples; (3) to determine heavy metal content in some vegetable crops, specially in those crops cultivated in soils with high content; (4) to study statistical relations (correlation, regression, factorial analysis and cluster analysis) between different variables; and (5) to establish background and reference values of heavy metals for agricultural soils within the Valencian Mediterranean region.The total and extractable content of heavy metals in agricultural soils are similar to other Mediterranean soils, with the exception of some plots that present high total levels of Cr, Cu and Pb, and a high extractable fraction for the Cd, Cu and Pb. On the other hand, the heavy metal content in vegetable crops do not exceed the permissible maximum level established by the European legislation, with the exception of some samples that show high Cd content. Finally, background and reference values for heavy metals have been proposed. The comparative study indicates the 37% of soils exceed the reference values proposed, whereas the 63% of soils show heavy metal content below the reference value and, therefore, they reflect an acceptable quality.

El objetivo general de este trabajo Tesis Doctoral se basó en la caracterización fisiológica, bioquímica y molecular de la enzima xiloglucano endotransglucosilasa/hidrolasa. Para ello, se utilizaron plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.) de dos variedades y plantas transgénicas que tenían modificada la expresión de SlXTH1. De modo que estudiamos la participación de la XET en el crecimiento de plantas, elongación y expansión celular y su implicación en el crecimiento y ablandamiento de los frutos. Se evaluó el papel de las enzimas implicadas en el metabolismo de la pared celular de frutos durante la infección por un patógeno fúngico y en particular, de la XET. Además, estudiamos la posible regulación de las XTHs por etileno. Las conclusiones más relevantes fueron las siguientes: 1. Las dos modificaciones génicas realizadas en el gen SlXTH1 en Solanum lycopersicum L. provocaron un aumento y disminución de la expresión génica de este isoenzima que se correspondió, con el aumento y disminución de la actividad XET. Es la primera vez que se han descrito plantas transgénicas que tienen aumentados los niveles de expresión de SlXTH1 y muestran un aumento de la actividad XET. 2. En plántulas, la sobre-expresión de SlXTH1 provocó cambios irreversibles y permanentes en los enlaces del xiloglucano con el resto de los componentes, que posiblemente, fueron los responsables del aumento de la extensibilidad en la zona apical, y de la alteración del fenotipo. Esto sugiere que la XET está implicada en el crecimiento, y más concretamente, la isoenzima codificada por SlXTH1.3. En las plantas que tienen disminuida la expresión de SlXTH1, se encontraron cambios en el fenotipo (plantas más delgadas y pesaron menos), aunque no presentaron cambios en el crecimiento en altura. La expresión de SlXTH1 y la actividad XET total fue particularmente importante en los tejidos vasculares. Nuestros resultados sugieren que el gen SlXTH1 podría estar implicado en la diferenciación de los haces vasculares.4. Los frutos de las plantas que sobre-expresaron el gen SlXTH1 cuentan con una mayor masa molecular del xiloglucano y fueron mas duros, presumiblemente por los cambios encontrados en la estructura del xiloglucano provocados por la actividad XET, lo que sugiere que esta enzima es clave para el mantenimiento de la estructura del xiloglucano y de la pared celular. 5. La respuesta a los estreses abióticos ensayados de las plantas que tenían reprimida la expresión del gen SlXTH1, fue una disminución del crecimiento, sugiriendo la implicación del gen SlXTH1 en las modificaciones del xiloglucano, ocasionando diferencias en la estructura de la pared celular que alterarán la respuesta a estos estreses.6. En la respuesta de los frutos a los estreses bióticos, la expresión génica de todas las SlXTHs estudiadas y de la actividad XET se redujo. Por lo tanto, si la actividad XET es inhibida durante la infección, el papel mantenedor de la estructura del xiloglucano se anula, ocasionando el ablandamiento del fruto y el avance de la infección fúngica. En este caso, se sugiere la posibilidad de que se produjera una regulación de origen fúngico a nivel molecular de los genes SlXTHs.7. El etileno exógeno aplicado a frutos, indujo un aumento de la expresión de todas las SlXTHs estudiadas, mientras que la actividad XET total disminuyó. Por lo tanto, la disminución de la expresión génica de las SlXTHs, durante los procesos de la maduración e infección fúngica, no parece ser debida al aumento del etileno endógeno. De modo que, no podemos explicar qué implicaciones fisiológicas tiene el aumento de la expresión de los genes SlXTHs provocado por el etileno exógeno, lo que hace necesario seguir investigando los procesos de regulación de esta enzima. / The main object of this Thesis doctoral work was based in the physiological, biochemical and molecular characterization of the xyloglucan endotransglucosilase / hidrolase enzime. To achieve this, we have worked with tomato plants (Solanum lycopersicum L.) as a model system of Money Maker and Canario variety and transgenics plants, which have over-expression and repression level of expression of SlXTH1. On the one hand, our purpose was the study of the participation of XET in the plants growing, elongation and cellular expansion. After that, the second partial objective, was based on clarifying the implication of XET in fruits growing and softening. Moreover, it was to assess the paper of enzimes implicated in the cell wall metabolism of fruits during infection by fungus pathogen and in particulary, the implication of XET. Finally, we had studied the possible regulation of XTHs by ethylene. The most relevant conclusions were the following items:1. This is the first time that transgenics plants which have increased the levels of expression of XTH gene and show an increase in the enzimatic XET activity have been described.2. In seedling, the sobre-expression of SlXTH1 gene, mainly increases the XET soluble activity, which implies irreversible and permanent changes in the links of xyloglucan with the rest of components, facts that were responsible of an increase of extensibility in epycotils. These results suggest that XET is implicated in growing. 3. In plants that have a decrease on the expression of SlXTH1 gene, changes in the fenotype it were found (plant slimmer and lighter), although these plants reached the same height. These results suggest that SlXTH1 gene would be implicated in vascular veins differentiation. 4. The fruits of plants that have sobre-expression SlXTH1 gene were harder and had higher molecular mass that wild fruits, due to changes in xyloglucan structure caused by XET activity. This suggests that XET is implicated in supporting the structure of cell wall.5. The genetic expression of SlXTHs and activity XET decreased in fruits which suffer from biotic stress (fungus infection). In this case, we suggest the possibility of a fungus molecular regulation in SlXTHs genes.

La vitamina E es un nutriente esencial que actualmente está recibiendo una considerable atención pública. Sus potentes propiedades antioxidantes -principalmente como inhibidor de la peroxidación lipídica- han puesto de manifiesto su importancia en la prevención y tratamiento de enfermedades en las que el estrés oxidativo interviene como componente destacado en su etiología o desarrollo; entre estas enfermedades se encuentran alteraciones tan importantes en la actualidad como son los trastornos cardiovasculares, el cáncer, la inflamación crónica y los trastornos neurodegenerativos. La deficiencia severa en vitamina E raramente ocurre en humanos como consecuencia de una deficiencia dietética. Sin embargo, esta deficiencia puede producirse como resultados de anormalidades genéticas en la -TTP y como resultado de determinados síndromes de malabsorción. Además de estas alteraciones, conviene destacar que el incremento de población envejecida, cuyos requerimientos antioxidantes son más elevados, así como la tendencia actual a consumir dietas bajas en grasas conlleva que gran parte de la población no llegue a consumir los requerimientos mínimos de vitamina E. A pesar de que numerosos trastornos hepáticos tales como fibrosis y cirrosis, entre otros, cursan con deficiencia en vitamina E, la mayoría de modelos de deficiencia in vivo han basado su estudio en tejidos como el sistema nervioso central y el músculo, cuya afectación es aparentemente la responsable de gran parte de la sintomatología de la deficiencia, mientras que el hígado ha sido relativamente poco estudiado, desconociéndose en gran medida los procesos moleculares que tienen lugar en este tejido como consecuencia de la depleción de vitamina E. En este contexto de alteraciones hepáticas, el factor de transcripción sensible al estado redox NF-kappaB (NF-B) ha sido implicado como mediador en procesos de daño hepático inducido por el estrés oxidativo. El propósito de este estudio es determinar la actividad de unión de NF-B al DNA hepático y la respuesta de genes diana sensibles al estado redox y genes moduladores del ciclo celular en un modelo in vivo de deficiencia crónica en vitamina E. Para ello, se alimentaron ratas Wistar con una dieta control o deficiente en vitamina E hasta los 60 o 90 días tras el nacimiento. Las ratas deficientes en vitamina E mostraron un incremento progresivo en los niveles de malondialdehído y un descenso en la concentracion de glutatión tanto en hígado total como en mitocondria aisladas de hígado. La deficiencia en vitamina E incrementó la actividad de unión de NF-B al DNA en el hígado (determinada mediante análisis por EMSA) y provocó un incremento de la expresión de los genes -glutamilcisteina sintetasa subunidad catalitica(-GCSC), -glutamilcisteina sintetasa subunidad reguladora (-GCSM), ciclina D1, ciclina E y un descenso de la transcripción de p21. Mediante el ensayo de inmunoprecipitación de fragmentos de cromatina (ChIP assay) observamos que NF-B está directamente regulando la transcripcion de -GCSC , -GCSM y ciclina D1, a través de la unión de NF-B a sus respectivos promotores, que se produce en animales deficientes en vitamina E. Estos hallazgos sugieren que la deficiencia crónica de vitamina E induce importantes procesos moleculares relacionados con el daño celular hepático, con una alteración de la expresión de genes marcadores de estrés oxidativo y genes que controlan el ciclo celular y demuestran que NF-B está implicado en esta respuesta. Los resultados obtenidos enfatizan la importancia de mantener un adecuado consumo de vitamina E, no sólo para prevenir el daño oxidativo hepático sino también para modular la correcta transducción de señales. / Vitamin E is an essential antioxidant nutrient that is receiving considerable public attention. Interest in vitamin E is high because new scientific data suggest optimal intake can help delay or prevent the onset of cancer, atherosclerosis, cataracts and other major diseases. Such degenerative diseases have been linked to damage from free radicals originated in body processes of oxidative stress. The redox-sensitive transcription factor Nuclear Factor-kappaB (NF-B) has been implicated as mediator in process of liver injury induced by oxidative stress. The purpose of this study was to determinate liver DNA-binding activity of NF-B and the response of target redox-sensitive genes and cell-cycle modulators in an in vivo model of oxidative stress induced by chronic vitamin E deficiency. Rats were fed either control diet or vitamin E free diet until 60 or 90 days after birth. Liver from 90 days vitamin E-deficient rats and isolated liver mitochondria from 60 or 90 days vitamin E deficient rats showed an increase in malondialdehyde (MDA) levels and a decrease in glutathione (GSH) concentration when compared with values found in its respective control rats. Vitamin E deficiency enhanced liver DNA-binding activity of NF-B (EMSA analysis) and up-regulated gamma-glutamylcysteine synthetase ( GCSC; GCSM), cyclin D1 and cyclin E. We also showed down-regulation of p21(Waf1/Cip1) transcription. Moreover, chromatin inmunoprecipitation (ChIP) assay demosntrated that NF-B directly regulates transcription of GCS (both subunits) and cyclin D1 through the binding of NF-B to the corresponding gene promotors, which was enhanced in vitamin E-deficiency. These findings show that vitamin E-deficiency induces significant molecular events related to liver cell damage with altered expression of either gene markers of oxidative stress and genes that control the cell cycle and demonstrate that liver NF-B is envolved in this response. Our results emphasize the importance of maintaining an adequate vitamin E consumption not only to prevent liver oxidative damage but also in modulating signal transduction.

En la glándula mamaria, al final de la lactancia, la acumulación de leche y el descenso de las hormonas lactogénicas inician una cascada de señalización que conduce a la muerte de las células secretoras por apoptosis y a la regresión de tejido mamario. Esta muerte celular se caracteriza por la liberación de citocromo c al citosol, donde activa las caspasas, responsables de los cambios observados en la apoptosis. Uno de ellos es la fragmentación del ADN internucleosomal, por activación de una endonucleasa. Además también existen cambios a nivel genético: el destete de 2 horas produce una inducción temprana de p53, mientras que otros genes como c-Jun o JNK no aumentan hasta 8 ó 24 horas de destete. La expresión y los niveles de proteína de p21cip1 y p27kip1, ambos inhibidores de las quinasas dependientes de ciclinas, que favorecen la detención del ciclo celular, también está significativamente aumentada tras el destete.Todos los cambios anteriores se reproducen en la glándula mamaria cuando disminuye la disponibilidad de GSH, bien con propargilglicina (PPG), un inhibidor de la transulfuración hepática con lo que disminuye la síntesis hepática de GSH y con ello su disponibilidad plasmática, o bien con butionina sulfoximina (BSO), inhibidor de la síntesis de GSH. Estos resultados sugieren que el flujo intertisular de GSH es un mecanismo muy importante para abastecer de L-cisteína a la glándula mamaria y resaltan la importancia de este proceso fisiológico en el mantenimiento de la lactancia.El óxido nítrico (NO) también está implicado en la apoptosis. A altas concentraciones forma derivados más reactivos que pueden inducir la apoptosis por: i) alteración mitocondrial; ii) activación de la vía de las MAP quinasas y iii) daño al ADN y acumulación de p53. En la glándula mamaria de rata lactante se expresan las tres isoformas de la enzima encargada de la síntesis de NO (NOS). No obstante, la expresión de la isoforma endotelial (eNOS) y de la inducible (iNOS) se modifican tras el destete o tras el tratamiento con BSO: los niveles de eNOS disminuyen tras un destete de 24 horas o tras el tratamiento con BSO, mientras que los de iNOS están aumentados con respecto al control y este incremento depende del tiempo de destete. Como consecuencia, la producción de NO en la glándula mamaria está aumentada durante la involución y este aumento induce la apoptosis y genera peroxinitrito, capaz de nitrar residuos de tirosina en las proteínas alterando su función. Podemos concluir que el NO juega un papel importante en la inducción de la apoptosis en la glándula mamaria.Por último, realizamos un estudio comparativo de los patrones de expresión génica en acini aislados del tejido mamario de ratas lactantes control, sometidas a un destete de 8 horas o tras el tratamiento con PPG mediante Microarray chip. De los, aproximadamente, 9000 genes comparados, sólo encontramos diferencias significativas en un 1-2% y establecimos dos patrones que se reproducían en ambas condiciones: el primero de ellos incluía genes implicados en la apoptosis celular: incrementaba la caspasa-6, la metaloproteinasa MMP-14, JunD o el antígeno CD14. El segundo patrón incluía enzimas implicados en el metabolismo glucídico y lipídico. Durante la lactancia la glándula mamaria es uno de los tejidos más activos en la captación de nutrientes; prácticamente el 50% de la glucosa captada será transformada en lípidos mediante la lipogénesis de novo. Sin embargo, en la involución se inhibe está síntesis de lípidos, por lo que los genes que codifican enzimas de esta vía disminuyen: piruvato deshidrogenasa, piruvato carboxilasa, acetil-CoA carboxilasa, ácido graso sintasa, etc. La disminución de GSH mimetiza los cambios encontrados durante el destete a nivel de la expresión génica. / In the lactating mammary gland, weaning produces mitochondrial cytochrome c release and nuclear DNA fragmentation. This is followed by a significant decrease in milk production and the decline of lactation. Weaning for 2h produces an early induction of p53, whereas c-Jun and JNK are elevated after 24h of weaning. The expression of p21cip1 and p27kip1, both cyclin-dependent kinase inhibitors, is significantly higher in weaned rats when compared to control lactating rats. All the changes mentioned above also happen in the lactating mammary gland when PPG, an inhibitor of the liver trans-sulfuration pathway, is administered. This effect is partially reversed by N-acetylcysteine (NAC) administration. The administration of buthionine sulfoximine (BSO), an irreversible inhibitor of -glutamyl cysteine synthetase, to lactating rats produces a decrease in GSH levels and changes in protein levels and gene transcripts similar to the rats with impaired trans-sulfuration pathway. These data suggest that the intertissue flux of glutathione is an important mechanism of L-cysteine delivery to the lactating mammary gland and emphasizes the importance of this physiological event to maintain gene expression required to keep lactation.Once characterized the apoptosis in the mammary gland we used this model to study "in vivo" the role of nitric oxide during cell death. The three isoforms of the nitric oxide synthase (NOS) are constitutively present in the acini of the lactating mammary gland. The amount of iNOS and NO production are increased during weaning when compared to control lactating glands, but the protein levels of the eNOS isoform are diminished. Western blot analysis demonstrated that protein nitration was increased in the weaned mammary gland, althought limited to a few specific tyrosine-nitrated proteins. A decrease of GSH in the mammary tissue at the peak of lactation partially mimics these findings and emphasizes the role of NO as a potential signal that triggers involution.

En plantas, la señalización a través de las cascadas de MAP quinasas dalugar a un amplio número de respuestas celulares que incluyen la división ydiferenciación celular, así como respuestas a estrés de origen abiótico o biótico(Mishra et al., 2006).Las MAP quinasas de plantas pueden ser clasificadas, en base a lasimilitud de la secuencia de aminoácidos, en cuatro grupos (A-D), cada grupose ha clasificado a su vez en dos subgrupos (1 y 2). Se dispone de muy pocainformación acerca de los miembros del subgrupo C1 (Nakagami et al., 2005).Dentro de este grupo se encuentran Ntf3 de tabaco, PhMEK1 de petunia yPsMAPK2 de guisante. En Arabidopsis, el subgrupo C1 está constituido pordos genes de MAP quinasas: AtMPK1 (At1g10210) y AtMPK2 (At1g59580). Lafunción de estos genes no se conoce, aunque hay algún dato que indica unaposible relación entre esos genes y respuestas de estrés. Se ha descrito quelos niveles del ARNm de AtMPK1 y AtMPK2 aumentan ligeramente tras untratamiento de salinidad (Mizoguchi et al., 1996), y que disminuyen a las 24horas tras un tratamiento a baja temperatura (Vogel et al., 2005). Además,resultados obtenidos mediante análisis de micromatrices indican que laexpresión de AtMPK1 es mayor en plántulas crecidas en oscuridad que enplántulas crecidas en presencia de luz (Ma et al., 2005). El análisis de los datosde expresión depositados en bases de datos de acceso público indican que losniveles de expresión de estos genes son muy bajos y que no hay cambiosrelevantes tras las diferentes condiciones ensayadas (Zimmermann et al.,2004). No hay ningún dato sobre la regulación de la actividad quinasa de lasMAP quinasas del subgrupo C1.La presente Tesis aborda el estudio de la función de PsMAPK2(guisante), AtMPK1 y AtMPK2 (Arabidopsis), genes que codifican MAPquinasas del subgrupo C1. Para emprender dicho estudio, se han realizadodiferentes aproximaciones: 1- Se ha analizado la expresión de estas MAPKsen distintos órganos de la planta; 2- Se han obtenido plantas transgénicas deArabidopsis que expresan distintas versiones mutantes de PsMAPK2; 3- Se haanalizado la actividad quinasa de estas MAPKs en respuesta a distintasseñales de estrés.Según resultados obtenidos por RT-PCR, PsMAPK2 se expresa en todoslos órganos de guisante y principalmente en anteras. Por otro lado la expresiónde las distintas versiones de PsMAPK2 en Arabidopsis da lugar a un fenotipode esterilidad masculina, debido a que no se produce la dehiscencia de lasanteras y la posterior liberación del polen. Estos resultados sugieren unaposible función de PsMAPK2 en el desarrollo de las anteras.AtMPK1/2 se expresan en todos los órganos de Arabidopsis. Además, elanálisis de la expresión de ambas MAPKs en plántulas indica que la luzdisminuye su expresión tanto en plántulas crecidas con ciclos de luz/oscuridadcomo en plántulas etioladas cuando se transfieren a la luz. El estudio de larespuesta a la luz de plántulas etioladas del doble mutante Atmpk1 Atmpk2revela que estas plántulas presentan una inhibición de la desetiolización conrespecto a la línea silvestre, sugiriendo la participación de AtMPK1/2 en elproceso de desetiolización.Por último, en la presente Tesis se ha demostrado por primera vez laregulación de la actividad de PsMAPK2 y AtMPK1/2 en respuesta a una señal.Se ha detectado un aumento en la actividad quinasa de PsMAPK2 y AtMPK1/2en respuesta al daño mecánico y al ácido jasmónico. Además, otras moléculasseñalizadoras de estrés como el ácido abscísico y el peróxido de hidrógenotambién regulan la actividad quinasa de PsMAPK2 y AtMPK1/2. / Mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades link extracellular stimuli withseveral cellular responses. These cascades are evolutionary conservedsignalling modules present in all eukaryotes. MAPKs are serine/threoninekinases that are activated by dual phosphorylation of the threonine and thetyrosine residues at a TXY activation motif. These phosphorylations areperformed by a MAPK kinase (MAPKK), which is in turn activated by anupstream MAPKK kinase (MAPKKK).In Arabidopsis thaliana, twenty MAPKs have been identified and classifiedaccording to their sequence homology into four major groups (A to D). A largeamount of information about MAPKs in group A and B is available but very littleis known about MAPKs of subgroup C1. Specific changes in transcript levelsduring pollen or ovule development have been reported for two members of C1subgroup, ntf3 from tobacco and PMEK1 from Petunia. In Arabidopsis,subgroup C1 is constituted by two MAPK genes: AtMPK1 (AT1G10210) andAtMPK2 (AT1G59580). The function of these genes remains mostly unknown,regardless of data which indicate a possible relationship between these genesand some stress responses. It has been reported that the mRNA levels ofAtMPK1 and AtMPK2 increased slightly under salt stress and are downregulatedafter 24 h of cold treatment, respectively. Gene expression datadeposited in public microarray repertories indicate a very low expression of thecorresponding mRNAs and few and no relevant changes in their expressionunder a large variety of tissues and conditions. No data about the regulation ofthe kinase activity of subgroup C1 MAPKs is available. In this manuscript, weshow that the two Arabidopsis MAPKs of subgroup C1 (AtMPK1 and AtMPK2)and one Pea MAPK of subgroup C1 (PsMAPK2) are activated by wounding, JA,ABA and H2O2.Meanwhile, transgenic Arabidopsis plants expressing PsMAPK2, PsMAPK2-LOF (loss-of-function mutation) or PsMAPK2-GOF (gain-of-function mutation)exhibited severe male sterility due to defects in anther development.

Los factores de transcripción pertenecientes a la familia SREBP (sterol regulatory element binding protein) regulan la homeostasis lipídica del organismo controlando la expresión de numerosos enzimas necesarios para la síntesis de colesterol, ácidos grasos, triglicéridos y fosfolípidos. Esta familia está constituida por tres isoformas que intervienen en procesos específicos: SREBP1c que está implicado en la síntesis de ácidos grasos, en la homeostasis del tejido adiposo y en el metabolismo glucídico inducido por insulina principalmente en el hígado. SREBP2 es relativamente específico de la síntesis de colesterol y la isoforma SREBP1a que, aunque su expresión in vivo es muy reducida parece estar implicada tanto en la síntesis de ácidos grasos como de colesterol [1]. La alteración en el metabolismo de los ácidos grasos es un factor común a muchos fenómenos característicos de la diabetes tipo 2 (DM2), como son la resistencia periférica a insulina, el aumento de la gluconeogénesis hepática, pérdida de secreción de insulina inducida por glucosa y obesidad [2]. Por tanto, genes implicados en la homeostasis lipídica parecen buenos candidatos para condicionar la susceptibilidad a DM2 [3-5]. En este trabajo se ha examinado si variantes en el gen SREBF1 (codifica las proteínas SREBP1a y SREBP1c) o variantes en el gen INSIG2 (insulin induced gen 2), implicado en la regulación de SREBP1, están asociadas con DM2 o con fenotipos relacionados con esta enfermedad. Para ello se analizó el gen SREBF1 por SSCP en un grupo de pacientes con DM2 y controles sanos, identificando distintas mutaciones y polimorfismos. Para el estudio de INSIG2, se realizó una búsqueda en las bases de datos del genoma humano y se seleccionaron los SNP que potencialmente podrían modificar la expresión de esta proteína.Tras la identificación de estas variantes, se realizó un estudio genético de asociación con DM2 encontrándose distintas variantes en ambos genes que condicionaban el riesgo de desarrollar la enfermedad. El estudio se completó con la caracterización molecular de dichas variantes para evaluar su efecto sobre la expresión y/o función de estas proteínas y por tanto su posible implicación en patologías metabólicas humanas.BIBLIOGRAFÍA1.- Eberle D, Hegarty B, Bossard P, Ferre P, Foufelle F. : SREBP transcription factors: master regulators of lipid homeostasis. Biochimie 86(11):839-48, 2004. Review.2.-Weyer C, Bogardus C, Mott DM, Pratley RE: The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes. J Clin Invest 104 :787 -794,1999 3.-Sinha R, Dufour S, Petersen KF, LeBon V, Enoksson S, Ma YZ, Savoye M, Rothman DL, Shulman GI, Caprio S: Assessment of skeletal muscle triglyceride content by (1)H nuclear magnetic resonance spectroscopy in lean and obese adolescents: relationships to insulin sensitivity, total body fat, and central adiposity. Diabetes 51 :1022 -1027,2002 4.-Lupi R, Del Guerra S, Fierabracci V, Marselli L, Novelli M, Patane G, Boggi U, Mosca F, Piro S, Del Prato S, Marchetti P: Diabetes: lipotoxicity in human pancreatic islets and the protective effect of metformin. Diabetes51 (Suppl 1) :S134 -S117,2002 5.-Lam TK, van de Werve G, Giacca A: Free fatty acids increase basal hepatic glucose production and induce hepatic insulin resistance at different sites. Am J Physiol Endocrinol Metab 284 :E281 -E290,2003 / The sterol regulatory element-binding protein (SREBP) family of transcription factors controls cholesterol and lipid metabolism and plays critical roles during adipocyte differentiation and insulin-dependent gene expression. This family consists of three different SREBP proteins, SREBP1a and SREBP1c/ADD1 encoded by SREBF1 gene, and SREBP2, encoded by SREBF2 gene. Dysregulated fatty acid metabolism is an underlying factor of the most T2D traits such as peripheral insulin resistance, increased hepatic gluconeogenesis, loss of glucose-induced insulin secretion and habitually obesity and seems to be an early marker of insulin resistance. Thus SREBF1 and INSIG2, a gene encoding INSIG2 protein, involved in SREBPs regulation, seem to be attractive candidates for susceptibility genes to metabolic disorders such as dislipidemia, obesity and type 2 diabetes (T2D). We performed a molecular screening of SREBF1 gene by SSCP in T2D patients, describing 18 variants within this gene. We further genotyped the most frequent variants in a case-control study in Spanish T2D patients and non diabetic non-insulin-resistant controls. In addition we performed different in vitro approaches to characterize the functional implications of variants identified in SREBF1 gene. In this study we found a modest but significant increased risk of T2D associated with a single variant and several haplotypes within SREBF1 gene. In addition we have identified a common deletion in 3´untranslated region and a rare new variant in 5´untranslated region of SREBF1 gene that modifies SREBP1c expression in vitro and could be involved in severe phenotypes of insulin resistance. To investigate whether mutations in INSIG2 gene might also contribute to diabetes, six single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in the human INSIG2 gene were tested in Spanish subjects for association with T2D. Association analysis and functional studies showed that rs7589375:T alele caused a decrease of INSIG2 promoter activity which could lead to a dysregulation of SREBPs and ultimately of the lipid metabolism.Taking together these results our conclusion is that genetic variants in SREBF1 and INSIG2 genes might influence type 2 diabetes risk in Spanish population.

La deficiencia de vitamina A (VAD) es un problema importante de salud pública, que afectaclínicamente a más de 5 millones de personas al año. En países en vías de desarrollo afectagravemente a niños aumentando la morbilidad y mortalidad de diferentes infecciones yenfermedades del tracto respiratorio.Los retinoides, metabolitos activos de la vitamina A, son necesarios en mamíferos para eldesarrollo pulmonar y la diferenciación de células pulmonares, y su deficiencia altera la estructuray función de los pulmones. Las membranas basales (MBs), que están asociadas al epitelio yendotelio alveolar y forman parte de la pared alveolar, también están implicadas en estos procesos,y el ácido retinoico, principal forma biológicamente activa de la vitamina A, modula la expresiónde macromoléculas de la matriz extracelular.Por este motivo, el propósito de nuestro trabajo ha sido analizar los efectos de la deficienciacrónica de vitamina A en la estructura y composición de la MB pulmonar durante el desarrollopostnatal de los pulmones, y el del tratamiento posterior con ácido all-trans-retinoico sobre lasalteraciones encontradas. Crías macho, recién destetadas, fueron alimentadas con dieta completa odeficiente en vitamina A hasta que cumplieron 60 días de vida. Y un grupo de crías VAD fueronrecuperadas con inyecciones intraperitoneales de ácido all-trans-retinoico durante 10 días. Elanálisis concreto de la MB alveolar, cuya integridad es de gran importancia para el intercambio degases durante la función respiratoria, mostró en la deficiencia un engrosamiento de la misma,deposiciones ectópicas de fibrillas de colágeno I en su interior, un aumento del contenido total delos colágenos I y IV, y cambios en su composición en cadenas α. Además, la deficiencia de vitaminaA produjo una disminución en el contenido de las cadenas de laminina mayoritarias en las MBspulmonares, y modificó la actividad proteolítica de la MMP2 y MMP9, encargadas de ladegradación y renovación de las MBs, disminuyéndola. También observamos que la privación devitamina A durante este periodo del desarrollo provocó un aumento del factor fibrogénico TGF-β1, un incremento del estrés oxidativo y una respuesta inflamatoria leve en los pulmones. Por otrolado, también demostramos que la mayoría de estas alteraciones, al menos parcialmente,revirtieron al estado control tras tratar con ácido all-trans-retinoico. Interesantemente, lacapacidad de recuperación por parte del ácido retinoico ocurre aún existiendo un estrés oxidativoaumentado. En conclusión, la deficiencia de vitamina A ocasiona alteraciones en la estructura ycomposición de la MB alveolar que probablemente estén mediadas por el TGF-β1 y el ácidoretinoico es capaz de revertirlas. Estas alteraciones podrían contribuir a un mal funcionamientopulmonar y predisponer a diferentes enfermedades pulmonares. / Vitamin A deficiency (VAD) is an important public health problem, affecting clinically more than 5millions of persons per year. Particularly, VAD affects children of developing countries, increasingthe morbidity and mortality of several respiratory tract infections and illnesses.Retinoids, active metabolites of Vitamin A, are essential for lung development and pulmonary celldifferentiation and its deficiency results in alterations of lung structure and function. Basementmembranes (BMs), that are associated with the alveolar epithelium and endothelium andconstitutes part of the air-blood barrier, are also involved in those processes, and retinoic acid, themain biologically active form of vitamin A, influences the expression of extracellular matrixmacromolecules.Therefore, the aims of our work have been to analyze the ultrastructure and collagen content oflung alveolar BM in growing rats deficient in vitamin A and the recovering effect of all-transretinoic acid. Alveolar BM, which is very important for the gas exchange and lung function, wasenlarged in VAD rats (doubled its thickness) and contained irregularly scattered collagen fibrils.Immunocytochemistry revealed that these fibrils were composed of collagen I. Total content ofboth collagen I protein and its mRNA was greater in vitamin-deficient lungs. In agreement withthe greater size of the BM the amount of collagen IV was also increased. VAD altered the α chaincomposition of collagen I and IV, and also reduced the content of the main laminin chains of lungBMs. Moreover proteolitic activity of MMP2 and MMP9 were decreased in VAD animals.Proinflammatory cytokines, IL-1α, IL-1β and TNF-α, did not change, but myeloperoxidase andTGF-β1 were increased. Treatment of VAD rats with retinoic acid reversed to the control statenearly all the alterations, at least partially. Interestingly, retinoic acid recovering activity occurredin the presence of increasing oxidative stress. In conclusion, vitamin A deficiency results inalterations of the structure and composition of the alveolar BM which are probably mediated byTGF-β1 and reverted by retinoic acid. These alterations could contribute to the impairment oflung function and predispose to pulmonary disease.

El norfloxacino es una fluorquinolona de uso frecuente en la descontaminación intestinal selectiva en pacientes con cirrosis hepática, como profilaxis secundaria de la peritonitis bacteriana espontánea. Su utilización prolongada se ha demostrado que favorece la aparición de cepas de E. coli resistentes a quinolonas en heces. Sin embargo, en estos pacientes se ha observado que el desarrollo de episodios infecciosos por este tipo de bacterias no es tan frecuente como cabría esperar, debido, probablemente, a la alteración de la capacidad de adherencia bacteriana a las células epiteliales intestinales inducida por el norfloxacino.El objetivo principal de nuestro proyecto fue estudiar in vitro la capacidad de adherencia bacteriana a células epiteliales de las cepas de E. coli aisladas en pacientes con cirrosis, tanto en presencia como en ausencia de concentraciones subinhibidoras de norfloxacino en el medio, y valorar así la utilidad del tratamiento prolongado con esta quinolona. Además se evaluó la presencia de tres de los factores de adherencia más importantes y su influencia en la adherencia al epitelio. Se estudiaron 59 cepas de E. coli (22 resistentes y 37 sensibles a quinolonas) obtenidas mediante escobillado rectal en pacientes con cirrosis, que se incubaron con células epiteliales bucales, con y sin concentraciones subinhibidoras de norfloxacino en el medio. La presencia de los tres factores de adherencia: fimbrias tipo I, adhesina afimbrial e intimina, se estudió mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como resultado del ensayo de adherencia, se observó que ambos fenotipos bacterianos (sensibles y resistentes a quinolonas), mostraron una capacidad de adherencia similar. Esta capacidad de adherencia a su vez, disminuyó significativamente en todos los casos al añadir concentraciones subinhibidoras de norfloxacino al medio. La presencia de factores de adherencia bacteriana fue menos frecuente en las cepas resistentes a quinolonas que en las sensibles. El 18% de las cepas analizadas en su conjunto carecieron de los factores de adherencia estudiados. Aunque no encontramos diferencias significativas entre ambos fenotipos bacterianos, la presencia conjunta de varios factores de adherencia se correlaciona con un ligero aumento de la adherencia bacteriana.Por tanto, podemos concluir que la capacidad de adherencia bacteriana a células epiteliales de cepas de E. coli sensibles y resistentes a quinolonas es similar, y disminuye significativamente en ambos casos al añadir norfloxacino al medio de cultivo. Estos resultados apoyarían el uso continuado de norfloxacino en estos pacientes a pesar de la selección de cepas resistentes a quinolonas en heces.Por otro lado, las cepas resistentes a quinolonas muestran una menor presencia de factores de adherencia, lo que respaldaría la conclusión anterior y sugiere la existencia de una pérdida de factores al adquirir la resistencia. Asimismo, podría asociarse a una posible disminución de la capacidad infectiva, ya que el fitness de la bacteria se resiente al desarrollar mecanismos de resistencia.Estos datos, a su vez, sugieren que el desarrollo de cepas resistentes a quinolonas en la luz intestinal no es un factor determinante para inducir la traslocación bacteriana. Cabe considerar que otros factores tales como el sobrecrecimiento de estas cepas, pueda ser el factor que favorezca su traslocación. / Prolonged use of norfloxacin as secondary prophylaxis of spontaneous bacterial peritonitis entails an appearance of 40% of E.coli quinolone-resistant in stools. However, the development of infections caused by this resistant bacteria is not so frequent as expected. Our aim was to asses bacterial adherence of either quinolone-sensitive or resistant strains in presence/absence of subinhibitory concentrations of norfloxacin and to evaluate the influence of some relevant adherence factors presence on adherence to cells. Fifty-nine strains of E.coli obtained from rectal swabs of cirrhotic patients were incubated with oral epithelial cells in presence/absence of sub-MIC of norfloxacin. Bacterial adherence was measured by the percentage of epithelial cells with attached bacteria (marked with fluorescein). Adherence factors were determined by PCR of specific sequences for type I fimbriae, intimin and afimbrial adhesin. Type I fimbriae expression was also measured by agglutination inhibition with mannose. Twenty-two resistant and 37 quinolone-sensitive strains were isolated. Bacterial adherence was similar in both series (78.2% vs 80.6%), and these percentages were similarly and significantly reduced when norfloxacin was added (48.5% vs 45.0%). The most frequent factor was type I fimbriae (71%), which expression was shown in 52.3%. The 18% of the strains lacked the adherence factors studied. Adherence factors presence was less frequent in quinolone-resistant strains than in sensitive ones. Adherence observed is independent of the presence/absence of the adherence factor studied. The joint presence of various adherence factors is correlated with a slightly increase in bacterial adherence, independently of the sensitivity to quinolones. Therefore, bacterial adherence ability of E.coli is independent of its sensitivity to quinolones, and subminimal concentrations of norfloxacin decreases bacterial adherence in both bacterial phenotypes in the same degree. This results would support the continuous use of norfloxacin in this patients, in spite of the selection of resistant strains in stools.Quinolone-resistant strains showed a diminished adherence factors presence, which could be associated to a less infective ability, probably because of the bacterial fitness impairment produced by the resistance development.This results suggest that quinolone-resistant strains development is not as determinant factor in bacterial traslocation as the overgrowth of this bacterial phenotype.

Desde hace una década, el tratamiento farmacológico de la trombosis venosa profunda se realiza con heparinasde bajo peso molecular (HBPM) (3-9 kD).La administración transdérmica de fármacos presenta ventajas frente a las vías convencionales, como laeliminación del efecto de primer paso intestinal y hepático; la posibilidad de administrar a velocidad constantemedicamentos de forma no invasiva, etc. Pero esta vía de administración no es generalizable a todos los fármacos,puesto que deben reunir una serie de características para que las cantidades que penetran, proporcionenconcentraciones plasmáticas eficaces.Se ha seleccionado la Bemiparina (HBPM de PM medio=3.6 kD), porque a priori, se piensa que el estudiopuede proporcionar resultados útiles para la prevención de la enfermedad tromboembólica, con todas las ventajasque la nueva vía de administración aportaría en este campo terapéutico.Los objetivos son:- Determinación de la capacidad de penetración cutánea in vitro e in vivo de Bemiparina,- Valoración de las muestras a través del método que figura en la Farmacopea Española 2002 y búsqueda de dosmétodos alternativos.La metodología a seguir fue la siguiente:- "Ensayos in vitro": el sustrato biológico es piel humana. Los ensayos se realizan en células de difusiónestandarizadas, de dos compartimentos, dado y receptor, entre los cuales se dispone la membrana. En el dador sedispone la formulación de Bemiparina a analizar. En el compartimento receptor se dispone una solución al 0.9% deNaCl.- "Estudios in vivo": se aplicará una capa de aproximadamente 1 mm de espesor de la formulación seleccionadaen la fase 1 en una zona dorsal del animal (rata Wistar macho de 250-300 g de peso).A los animales se les implanta una cánula de silicona en la vena yugular, que permite la toma de muestras desangre.La valoración de las muestras se realizará mediante la determinación de la actividad anti-Xa (método que figuraen la Farmacopea Española 2002).Como alternativa se estudia la posibilidad de dos métodos de CLAE:1. Determinación de Bemiparina sódica por detección UV2. Determinación de Bemiparina sódica por fluorescencia, a través del disacárido producido por unadigestión enzimática. / For a decade, the pharmacologic treatment of deep vein thrombosis (DVT) consists inthe administration of low molecular weight heparin (LMWH) (3-9 kD).Transdermal administration of xenobiotics has some advantages in comparison to theconventional routes, althought this route isn´t generalizable for all xenobiotics.We have select the BEMIPARIN (3.6 kD) out of all LMWH, because at the beginning,we thik the study can get useful results for the prevention of thromboembolic disease,with all advantages that the new administration way could contribute at this therapeuticfield.The objectives of this study are:- Determination of the capacity of Bemipain´s cutaneous penetration in vitro e invivo.- Analyzation of the samples by the method of the King Spanish Pharmacopeia,2002, and search of two alternating methods.For the in vitro trials, we employ human skin as biologic membrane. The experimentscarry out in standarizaded diffusion cells. These cells have two compartiments, donorand receptor.For the in vivo trials, the animal employed is Wistar male rat (250-300 g of weight). Weapply on the back zone a cape of 1 mm of thickness, of the formulation selected in thein vitro trials. Previous the day of experiment, we implant a cannula of silicone in thejugular vein for the taking of blood samples.The samples are analyzated by the determination of anti-Xa activity (method of KingSpanish Pharmacopeia, 2002), and as alternative we study the possibility of employ twomethods of high performance liquid chromatography (HPLC):1. Determination of sodic Bemiparin by ultraviolet deteccion.2. Determination of sodic Bemiparin by fluorescence, through of dissaccharideproduced by an enzymatic digestion.

El acamprosato, comercializado en varios pa¨ªses de la Uni¨®n Europea yautorizado recientemente en EE.UU., est¨¢ indicado en la terapia de mantenimiento dela abstinencia en pacientes dependientes al alcohol sometidos a tratamientodeshabituador. Este f¨¢rmaco presenta como principal problema su bajabiodisponibilidad oral en humanos (aproximadamente un 10%) cuando se administraen forma de comprimidos con recubrimiento gastrorresistente. A pesar de losnumerosos estudios realizados, en el momento de la realizaci¨®n de la presentememoria se desconoc¨ªan aspectos relevantes de su farmacocin¨¦tica, como son losmecanismos y rutas utilizados para su absorci¨®n intestinal.Por este motivo y con la finalidad de identificar posibles causas de su escasabiodisponibilidad oral, el principal objetivo de este proyecto ha sido el estudio delmecanismo de absorci¨®n intestinal del acamprosato en el tramo medio del intestinodelgado de rata, utilizando para ello una t¨¦cnica in vitro. Adem¨¢s, se ha estudiado si lainfluencia de otros factores como son el alcoholismo, el tipo de dieta o la existencia deciertos amino¨¢cidos pueden influir en su absorci¨®n.Los estudios realizados indican que la absorci¨®n del acamprosato en el tramomedio del intestino delgado de la rata se realiza mayoritariamente mediante difusi¨®npasiva en el amplio ¨¢mbito de concentraciones estudiadas. Por tanto, la absorci¨®n delf¨¢rmaco a nivel intestinal se podr¨ªa realizar, bien por difusi¨®n a trav¨¦s de la membranalip¨ªdica (v¨ªa transcelular) o bien a trav¨¦s de las uniones estrechas existentes entre losenterocitos (v¨ªa paracelular).Adem¨¢s, en nuestras condiciones de experimentaci¨®n, factores como elalcoholismo y el tipo de dieta utilizada (l¨ªquida frente a s¨®lida) no afectan desde elpunto de vista pr¨¢ctico a la absorci¨®n del f¨¢rmaco.Por ¨²ltimo, los estudios de inhibici¨®n de la velocidad de absorci¨®n realizadoscon determinados amino¨¢cidos inhibidores (glicina, prolina, GABA y taurina) indicanque los transportadores de imino¨¢cidos presentes en el intestino delgado de rata,podr¨ªan estar implicados en la absorci¨®n del f¨¢rmaco a nivel intestinal. Sin embargo,su participaci¨®n en el proceso global de absorci¨®n ser¨ªa cuantitativamente pocoimportante y predominante solo a bajas concentraciones del f¨¢rmaco (¡Ü100 ¦ÌM). / Acamprosate was approved in different countries of the European Union andrecently, the FDA has approved in the USA and is indicated for the maintenance ofabstinence from alcohol in patients with alcohol dependence who are abstinent attreatment initiation as a part of a comprehensive management program that includespsychosocial support. One of the main problems of this drug is its low bioavailability inhuman (around 10%) when it is administered as enteric coated tablet. At the moment ofthe preparation of this thesis, and despite the great amount of studies done, relevantaspects of its pharmacokinetics properties as the intestinal routes of absorption wereunknown.With the purpose of identified the reason of its poor oral bioavailability, the mainaim of this study was to caracterize the intestinal absorption mechanism ofacamprosato in the rat jejunum, using an in vitro technique. Other objectives was tostudy the influence of different factors, as alcoholism, diet or the present of somestructurally related compounds in the intestinal lumen, in the intestinal absorption ofacamprosato.Intestinal acamprosate absorption was found to occur mainly by passivediffusion in the rat mid-jejunum in the wide concentration of acamprosato used. Andthis diffusion of the drug could take place by the transcelular route (across the intestinalmembrane) or by the paracellular using the tight junction.Moreover, neither chronic ethanol intake nor the type of diet (liquid vs. solid)seems to alter the intestinal absorption of the drug, so in this type of experiment it ispossible to use animals fed a solid diet.The results of the inhibition studies with structurally related aminoacids (GABA,taurine, proline, and glycine) suggest that acamprosate in the rat jejunum, could betransported, in part, by a carrier system. However, its repercussion in the overallprocess would be not quantitative important.