Sustainability is one of the biggest goals of humankind in the new millennium. An increasing global demand on agricultural products stimulates agricultural expansion in Brazil, especially in the Southwestern Amazon, namely in the Cerrado and Amazon biomes. A better understanding of biogeochemical cycles and their influence on natural and agricultural systems is key to achieve environmental sustainability and improve agricultural efficiency. These biogeochemical cycles are driven by microbes, and the aim of this thesis was to correlate microbial functional group abundances with differences in carbon, nitrogen, and greenhouse gas cycles in response to land use changes in Southwestern Amazon soils. This work was performed at the University of São Paulo, Brazil, and at the University of Massachusetts Amherst, USA, while the candidate was enrolled in Ph.D. programs at both universities. The thesis is composed of five studies. The first study shows that land use change from Cerrado and forest to agriculture (soybean, Glycine max (L. Merrill), in succession with other crops) or pasture (Brachiaria brizantha (Hochst. ex A. Rich.) did not reduce soil microbial diversity but changed microbial structure. The second study, a physicochemical background for this land use conversion, describes the alteration of C and N stocks, soil chemical parameters, and microbiological parameters such as biomass, biological C stocks, and changes in the abundance of prokaryotes and fungi. In the third and fourth studies microcosm experiments depict how the agricultural change to soybean and Brachiaria alter the original microbial structure found in forest or cerrado. These studies focused on abundances of key biogeochemical genes (amoA, nirK, nirS, norB, nosZ, mcrA, and pmoA) and correlated gene copy abundances with C, N, and GHG measurements. In the fifth study, in situ soil surveys and GHG samplings were used to characterize the changes from forest to pasture (B. brizantha, 25 years) or soybean crop system (for 2 years or 25 years in succession). We found correlations between genes and processes, indicating that gene abundances provide important microbial information for the understanding of the targeted biogeochemical cycles. Land use, rather than plant species, promotes alterations in microbial gene abundances and processes. During the survey period, forest exhibited higher microbial activity, resulting in higher nitrate availability and N2O emissions. These processes were correlated with higher abundances of process related genes. Nitrate and N2O emissions were lower in agricultural and pasture soils. CO2 emission was higher in the two-year-old soybean plot. The forest and two-year-old soybean plots acted as a sink for CH4, while the pasture plots represented a source of it. The results validated the use of gene abundance determination as a valuable tool to better understand C, N, and GHG processes. The genes nirK, nosZ, and 16S rRNA presented the best correlations with the processes. A larger temporal and spatial analysis is needed to infer statements on the processes dynamics due to land use change. For the first time gene abundance measurements were used to integrate the C, N and GHG cycles, giving insights into land use changes in Southwestern Amazon / Sustentabilidade é um dos maiores objetivos da humanidade no novo milênio. Uma demanda crescente por produtos agrícolas tem estimulado a expansão agrícola no Brasil, especialmente no Sudoeste da Amazônia, nos biomas Cerrado e Amazônia. Um melhor entendimento dos ciclos biogeoquímicos e suas influências em sistemas naturais e agrícolas é chave para se alcançar sustentabilidade ambiental e aumentar eficiência agrícola. Esses ciclos biogeoquímicos são guiados por microrganismos, e o objetivo dessa tese foi correlacionar abundância de grupos funcionais de microrganismos com carbono, nitrogênio e gases de efeito estufa (GEE) em resposta a mudança do uso da terra em solos do sudoeste da Amazônia. Esse trabalho foi realizado na Universidade de São Paulo e na Universidade de Massachusetts Amherst enquanto o doutorando esteve matriculado nas duas universidades. A tese é composta de cinco estudos. O primeiro estudo mostra que a mudança no uso da terra de Cerrado e floresta para agricultura (soja, Glycine max (L. Merrill), em sucessão com outros cultivos) ou pastagem (Brachiaria brizantha (Hochst. ex A. Rich.) não reduz diversidade microbiana, mas muda sua estrutura. O segundo estudo descreve as alterações nos estoques de C, N, parâmetros químicos e microbiológicos da conversão de Cerrado para agricultura e pastagem. No terceiro e no quarto estudos, microcosmos foram usados para avaliar a influência de soja e braquiária na microbiota dos solos. Genes chaves dos processos biogeoquímicos (amoA, nirK, nirS, norB, nosZ, mcrA, e pmoA) foram quantificados e correlacionados com C, N e GEE. No quinto estudo, coletas in situ de solo e gases foram usadss para caracterizar a mudança do uso da terra de floresta para pastagem (braquiária, 25 anos) e para agricultura (soja, segundo ano, e soja, 25 anos, em sucessão com outras culturas). Correlações entre genes e processos foram encontradas, indicando que abundância gênica fornece importantes informações para o entendimento dos ciclos biogeoquímicos. Mudança no uso da terra como um todo, mais do que a mudança de vegetação, promove as alterações na abundância gênica e processos do solo. Durante o período de coleta, floresta exibiu maior atividade microbiana, resultando em maior disponibilidade de nitrato e emissão de N2O. Esses processos correlacionam com maior abundância dos genes relacionados aos processos. Quantidades de nitrato e N2O foram menores em agricultura e pastagem. As emissões de CO2 foram maiores na área de soja de segundo ano. Os solos de floresta e soja de segundo ano se mostraram como drenos de metano, enquanto que a pastagem foi uma fonte de emissão. Os resultados validam o uso de abundância gênica como uma técnica valiosa para um melhor entendimento dos ciclos do C, N e GEE. Os genes nirK, nosZ, e 16S rRNA apresentaram as melhores correlações com os processos. Uma análise temporal e espacial mais abrangente é necessária para generalizações sobre a dinâmica dos processos na região estudada. Pela primeira vez abundância gênica foi usada para integrar os ciclos do C, N e GEE, colaborando para um melhor entendimento dos processos relacionados à mudança no uso da terra no sudoeste da Amazônia

Le thon obèse (Thunnus obesus), le thon alabore (Thunnus albacares) et le listao (Katsuwonus pelamis) comptent parmi les espèces de thons les plus utilisées en conserve. Lors de la fabrication de conserves de thon, la substitution d'espèce et/ou le mélange de différentes espèces de thon sont interdits par la réglementation européenne. L'authentification des espèces de thon reste complexe à cause du degré de similitude élevé entre les espèces de thon, ou encore, lorsque les caractéristiques morphologiques externes sont éliminées au cours du filetage et lors de la mise en conserve. Par conséquent, des substitutions involontaires ou frauduleuses peuvent se produire. Dans cette étude, le marqueur mitochondrial du gène de la sous-unité 2 de la NADH déshydrogénase a été utilisé pour identifier le thon obèse et le gène de la sous-unité II de la cytochrome c oxydase a été utilisé pour identifier le thon albacore et le listao en utilisant la PCR en temps réel basée sur la technologie TaqMan. Deux méthodes différentes basées sur la qPCR ont été développées pour quantifier le pourcentage de chair de chaque espèce présente au sein d'une boîte de thon. La première a été basée sur la quantification absolue avec standard externe réalisée avec les deux marqueurs. La seconde a été basée sur la quantification relative avec standard externe avec le gène endogène de l'ARN 12S. Sur la base de ces résultats, nous pouvons conclure que notre méthode peut s'appliquer pour quantifier les deux espèces de thon albacore et obèse génétiquement très proches lorsqu'elles sont utilisées dans un mélange binaire en conserve. / Bigeye tuna (Thunnus obesus), yellowfin tuna (Thunnus albacares) and skipjack tuna (Katsuwonus pelanis) are among the most widely used tuna species for canning purposes. Not only substitution but also mixing of tuna species is prohibited by the European regulation for canned tuna products. However, it can be difficult to authenticate the tuna species, due to their high degree of similarity or even when the external morphological characteristics are removed due to filleting before canning. Consequently, involuntary or fraudulent substitutions may occur during the canning process. In this study, the mitochondrial marker from NADH dehydrogenase subunit 2 gene was used to identify bigeye tuna and the mitochondrial marker cytochrome c oxidase subunit II gene was used to identify yellowfin tuna and skipjack tuna, utilizing TaqMan qPCR methodology. Two different qPCR-based methods were developed to quantify the percentage of flesh of each species used for can processing. The first one was based on absolute quantification using standard curves realized with these two markers ; the second one was founded on relative quantification with the universal 12S rRNA gene as the endogenous gene. On the basis of our results, we conclude that our methodology could be applied to authenticate the two closely related tuna species (bigeye tuna and yellowfin tuna) when used in a binary mix in tuna cans.

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2017-04-27T14:37:47Z No. of bitstreams: 1 ROSEMARY DE CARVALHO ROCHA KOGA.pdf: 1840064 bytes, checksum: 5be7272271d61789b6dc93e32af0b7a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-27T14:37:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ROSEMARY DE CARVALHO ROCHA KOGA.pdf: 1840064 bytes, checksum: 5be7272271d61789b6dc93e32af0b7a3 (MD5) Previous issue date: 2017-03-15 / Introduction: Chikungunya fever (FCHIK) is a disease of abrupt onset, transmitted by arthropod mosquitoes intermediate hosts of the Chikungunya virus (CHIKV). The illness has a significant impact on the quality of life of the affected person. Since a disease causes intense and prolonged symptoms of polyarthralgia and myalgia, it requires health care, during a recovery, more than other arboviruses. The objective of this study was to study clinicians and clinicians suggestive of FCHIK, residing in the States of Amapá and Goiás, aiming to correlate the results of laboratory tests with the presented symptomatology. Materials and methods: The study was carried out at the Center for Immunological Studies and Research of the Pontifical Catholic University of Goiás, Goiânia, and in Emergency Care Units in the cities of Macapá, Oiapoque and Santana-AP. The study population consisted of 80 individuals with suspected FCHIK and for investigators of inflammatory markers, the control group consisted of 20 blood samples from healthy donors from Goiana Central de Serologia e Imunohematologia. Viral RNA extraction was performed, followed by RNA detection by Real-Time Polymerase Chain Reaction. In addition to ELISA for detection of IgM and IgG against Chikungunya virus. Participants symptoms were correlated with serology and Creactive protein (CRP), which was evaluated in healthy subjects and in people with FCHIK. Results: No data presented for detection of viral RNA by RT-qPCR for CHIKV, but three samples were positive in this technique for zika virus and one for dengue subtype 1 (DENV1). In an enzyme-linked immunosorbent assay, 26 samples were positive for IgG and 3 for IgM. Regarding the stage of the disease, 10 were in the acute phase, 04 in the subacute phase and 12 in the chronic phase. Correlated the results of the serology with a symptomatology it was observed that the acute phase, all have fever, 90% headache, 70% arthralgia and 60% edema. (100%), myalgia and edema (75%). (100%), arthralgia (92%) and myalgia (75%). When comparing participants with negative serology, n = 54, the most prevalent symptoms were rash, headache, fever, and arthralgia. The CRP levels in individuals infected with more than four symptoms were higher when compared with healthy individuals. Conclusion: The study focused on people with a clinical picture characteristic of FCHIK. The most common symptom in the three phases presented for arthralgia, followed by edema and myalgia, a fever was frequent only in the acute phase. All participants were negative in the evaluation of viral RNA by RT-qPCR for CHIKV, for the virus has a short duration in the body, and this methodology is limited to the time of symptom onset and sample collection, DENV and ZIKV. IG G. Those with negative serology for CHIKV, despite taking into account the joints, symptoms common to other arboviruses. CRP levels have been shown to be high relative to healthy subjects. / Introdução: A Febre Chikungunya (FCHIK) é uma doença de início abrupto, transmitida por mosquitos artrópodes hospedeiros intermediários do vírus Chikungunya (CHIKV). A enfermidade representa um significativo impacto na qualidade de vida da pessoa afetada. Uma vez que a doença causa sintomas intensos e prolongados de poliartralgia e mialgia, requerendo atenção de saúde, durante a recuperação, mais do que outras arboviroses. Objetivou-se estudar aspectos clínicos e sorológicos de indivíduos apresentando quadro clínico sugestivo de FCHIK, residentes nos Estados de Amapá e Goiás, visando correlacionar os resultados de testes laboratoriais com a sintomatologia apresentada. Materiais e métodos: O estudo foi realizado no Núcleo de Estudos e Pesquisa Imunológica da Pontifícia Universidade Católica de Goiás, em Goiânia, e em Unidades de Pronto Atendimento de Saúde das cidades de Macapá, Oiapoque e Santana-AP. A população de estudo foi constituída de 80 indivíduos com suspeita de FCHIK e para comparar os marcadores inflamatórios, o grupo controle foi constituído de 20 amostras de sangue de doadores saudáveis da Central Goiana de Sorologia e Imunohematologia. Foi realizada a extração do RNA viral, seguido de detecção do RNA por meio de Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real. Além de ELISA para detecção de IgM e IgG específicos para o CHIKV. Os sintomas dos participantes foram correlacionados com o resultado da sorologia e da proteína C reativa (PCR), que foi avaliada em indivíduos saudáveis e em pessoas com FCHIK. Resultados: Nenhuma amostra apresentou limiar de detecção do RNA viral por RT-qPCR para CHIKV, porém três amostras foram positivas nessa técnica para vírus zika (ZIKV) e uma para dengue subtipo 1 (DENV1). Em ensaio imunoenzimático, 26 amostras foram positivas para IgG e 3 dessas para IgM. Em relação ao estágio da doença, 10 encontravam-se em fase aguda, 04 em fase subaguda e 12 em fase crônica. Correlacionados os resultados da sorologia com a sintomatologia observou-se que os de fase aguda, todos tiveram febre, 90% cefaleia, 70% artralgia e 60% edema. Enquanto que, os de fase subaguda tiveram: artralgia e cefaleia (100%), mialgia e edema (75%). Os de fase crônica tiveram edema (100%), artralgia (92%) e mialgia (75%). Quando comparados os participantes com sorologia negativa, n=54, os sintomas mais apresentados foram exantema, cefaleia, febre e artralgia. Os níveis de PCR nos indivíduos infectados e que apresentavam mais de quatro sintomas foram maiores quando comparados com indivíduos saudáveis. Conclusão: O estudo focou em pessoas com quadro clínico característico para FCHIK. O sintoma mais comum nas três fases apresentadas foi a artralgia, seguido de edema e mialgia, a febre foi frequente somente na fase aguda. Todos os participantes foram negativos na avaliação do RNA viral por RT-qPCR para CHIKV, pois o vírus tem uma curta duração no organismo, e esta metodologia é limitada ao tempo de início dos sintomas e coleta de amostra, ainda assim foi encontrado RNA viral do DENV e ZIKV. Alguns participantes foram positivos para sorologia IgG. Aqueles com sorologia negativa para CHIKV, apesar de terem dor nas articulações, tinham sintomas comuns a outras arboviroses. Os níveis de PCR demonstraram-se elevados em relação aos indivíduos saudáveis.

Durante o preparo químico-cirúrgico são utilizados instrumentos e substâncias químicas, que constituem um binômio indivisível e necessário para alcançar a modelagem e a sanificação dos canais radiculares. Assim, propõe-se com este trabalho avaliar in vivo, por meio de método molecular de PCR quantitativo, baseado em DNA (qPCR), a eficiência do preparo químico-cirúrgico empregando como agente de irrigação o Hipoclorito de Sódio (NaOCL) a 2,5% ou o Gel de Endo PTC associado ao Hipoclorito de Sódio a 1,0% na redução bacteriana de canais radiculares de dentes portadores de periodontite apical primária. Foram selecionados 30 pacientes portadores de infecção endodôntica primária, totalizando 30 dentes, com rarefação óssea periapical visível na radiografia, sem tratamento endodôntico prévio. Os pacientes foram divididos de forma randomizada em dois grupos distintos, de acordo com a substância química auxiliar utilizada durante a instrumentação, NaOCL 1% + Endo-PTC leve ou NaOCL 2,5%. Em todos os casos empregou-se instrumentos Reciproc R40 ou R50 e as coletas foram realizadas antes (S1) e após o prepare químico-cirúrgico (S2). A análise de aderência foi realizada por meio do teste de Kolmogorov-Smirnov, as análises intragrupo foram realizadas com teste de Wilcoxon para amostras relacionadas e as comparações entre os dois grupos foram realizadas com o teste de Mann-Whitney, para a análise quantitativa de bactérias. Em ambos os grupos, houve diminuição significativa no número de bactérias entre S1 e S2 (p<0,05). No grupo NaOCL 1% + Endo-PTC leve, houve redução de 3,7x105(S1) para 5,7x104 (S2). No grupo NaOCl 2,5%, redução de 1,3x105 (S1) para 1,1x104(S2). Na comparação entre grupos, o NaOCL a 2,5% (91,62%) promoveu maior redução bacteriana do que o grupo NaOCL 1% + Endo-PTC (84,60%) (p<0,05). / During the chemomechanical preparation, instruments and chemical substances are used, which constitute an indivisible and necessary binomial to achieve modeling and sanification. Knowing the auxiliary chemical substances, understanding their mechanisms of action, being able to use them efficiently, is fundamental, so that the chemical-surgical preparation is well performed by the clinician. Thus, the purpose of this study is to evaluate in vivo, the efficiency of the chemomechanical preparation using as the irrigant agent 2,5% sodium hypochlorite and Endo-PTC gel, associated to 1% sodium hypochlorite, to assess the bacterial reduction of root canals of teeth with primary apical periodontitis, using a molecular quantitative method DNA-based - polymerase chain reaction (qPCR). Were selected 30 patients with primary infection totaling 30 teeth, with visible periapical bone rarefaction on the radiography, without previous endodontic treatment. Patients were randomly divided into two distinct groups according to the auxiliary chemical substances used during the instrumentation, 1% sodium hypochlorite associated with Endo-PTC gel or 2,5% sodium hypochlorite. In all cases, reciproc instruments R40 or R50 were used and the samples were taken before (S1) and after chemical surgical preparation (S2). The adherence analysis was performed using the Kolmogorov-Smirnov test, intragroup analysis were performed with Wilcoxon test for related samples and comparisions between the two groups were performed with the Mann-Whitney test for the quantitative analysis of bacteria. In the both groups, there was a significant decrease in the number of bacteria between S1 and S2 (p<0,05), the inicial sample (S1) of the group Endo-PTC, the median 3,7x105, reduced to 5,7x104. In the other group of NaOCl, the median in S1 was 1,3x105 that reduced to 1,1x104 . In the comparision between groups, the 2,5% NaOCl promoted a greater microbial reduction of 91,62%, than the Endo-PTC associated with 1% NaOCl (p<0,05) 84,60%.

Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2018-03-02T13:04:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Carlos Rafael.pdf: 2751688 bytes, checksum: 31c547702ea9189c4ded0e1d56077de5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-02T13:04:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Carlos Rafael.pdf: 2751688 bytes, checksum: 31c547702ea9189c4ded0e1d56077de5 (MD5) Previous issue date: 2017-08-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O conhecimento da dinâmica espacial de doenças de plantas, aliado a quantificação de inóculo e monitoramento das condições meteorológicas é de grande importância para a adoção de estratégias de manejos adequados e com menor impacto ambiental. Sendo assim, os objetivos deste trabalho de pesquisa foram caracterizar a distribuição, variabilidade espacial e possíveis relações entre atributos referentes ao mofo branco e atributos de plantas de soja além de avaliar técnicas de identificação e quantificação de ascósporos de Sclerotinia sclerotiorum durante o florescimento da soja. Foram realizadas amostragens através de uma malha georreferenciada em uma área de 12 hectares (ha) no município de Mauá-da-Serra-PR nas safras 2013/14 e 2014/15 e uma área de quatro hectares no município de Ponta Grossa-PR na safra 2015/16. Foram utilizados quadrats com área útil de 7,2 m² para avaliação das seguintes variáveis: escleródios presentes no solo, estande da cultura, incidência, índice de doença, rendimento, escleródios produzidos na colheita, além da deposição do bioaerossol, partes de folha e flores da soja como uso de Meio Semi-seletivo a Sclerotinia sclerotiorum (MSS) e Reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), em 36 pontos de amostragem na área de Ponta Grossa-PR, em três datas durante o florescimento da soja. Os dados foram analisados com uso de estatística descritiva, ajuste de semivariogramas e matriz de correlação de Pearson. As condições meteorológicas observadas nos três experimentos foram adequadas para o desenvolvimento da cultura da soja e do mofo branco na soja. As variáveis referentes a cultura da soja apresentaram coeficientes de variação baixos ou moderados e as variáveis referentes ao mofo branco apresentaram coeficiente de variação muito elevados. Os ajustes dos semivariogramas apresentaram diferenças nos três experimentos, com efeito pepita puro, ajuste linear, esférico e exponencial. A variável escleródios do solo apresentou efeito pepita puro nos dois experimentos em Mauá-da-Serra. Foram encontradas correlações significativas positivas entre a incidência do mofo branco e a produção de escleródios na colheita, além de correlação negativa com o rendimento nos três experimentos. A identificação de inóculo de mofo branco com incubação em MSS mostrou-se a técnica com maior sensibilidade, mas demanda de até 15 dias para a confirmação de S. sclerotiorum, tanto para bioaerossol, como flores e partes de folhas de soja. Foi possível otimizar o protocolo de extração de DNA e ciclo de reação para qPCR, além de gerar uma curva padrão com DNA oriundo de ascósporos de S. sclerotiorum, com ajuste ao modelo linear (R²=0,99) e eficiência de 92,2%. O uso de qPCR mostrou-se promissor para partes de folhas, sendo possível resultados em um dia de trabalho. / The knowledge of the spatial dynamics of plant diseases, allied with the quantification of inoculum and monitoring of the meteorological conditions, is important for the adoption of adequate management strategies and with less environmental impact. The aim of this work was to characterize the distribution, spatial variability and possible relations between white mold attributes and soybean plants attributes, as well as to evaluate techniques for identification and quantification of ascospores of Sclerotinia sclerotiorum during soybean flowering. Samplings were carried out through a georeferenced grid on a field of 12 hectares (ha) in the municipality of Mauá-da-Serra-PR in the 2013/14 and 2014/15 crop seasons and, on a field of four hectares in the municipality of Ponta Grossa-PR in the 2015/16 crop season. Quadrats with a useful area of 7.2 m² were used to evaluate the following variables: sclerotia in the soil, crop stand, incidence, severity, yield, sclerotia produced at harvest, as well as bioaerosol deposition, soybean leaf parts and flowers on semi-selective medium to Sclerotinia sclerotiorum (MSS) and quantitative polymerase chain reaction (qPCR), at 36 sampling points in the Ponta Grossa- PR field, at three dates during soybean flowering. Data were analyzed using descriptive statistics, semivariogram adjustment and Pearson correlation matrix. The meteorological conditions observed in the three experiments were adequate for the development of soybean crop and white mold disease. The variables related to soybean plants, showed low or moderate coefficients of variation and the variables related to white mold showed a high coefficient of variation. The semivariograms adjustments showed differences in the three experiments, with pure nugget effect, linear, spherical and exponential adjustments. The variable sclerotia of soil showed pure nugget effect on the two experiments in Mauá-da-Serra. Significant positive correlations were found between the incidence of white mold and the production of sclerotia at harvest, in addition to negative correlation to yield in the three experiments. The identification of white mold inoculum with incubation on MSS was shown to be the most sensitive technique, but takes up to 15 days for the confirmation of S. sclerotiorum pathogen for bioaerossol, flowers and parts of soybean leaves. It was possible to optimize the protocol of DNA extraction and reaction cycle for qPCR, besides generating a standard curve with DNA from ascospores of S. sclerotiorum, adjusted to the linear model (R² =0, 99) and efficiency of 92.2%. The use of qPCR showed promise results for leaf parts, being possible achieve concluding results in one working day.

O feijão é importante fonte carboidratos, vitaminas, minerais e fibras. No Brasil, a produtividade desta leguminosa é baixa e um dos fatores é a ocorrência de doenças como a antracnose causada pelo Colletothrichum lindemuthianum, que gera perdas de até 100% da produção. Plantas possuem diversos mecanismos de defesa contra patógenos e relatos apontam que o silício é capaz não só de promover mudanças morfológicas nas folhas, mas também de ativar os genes de resistência. O presente trabalho foi dividido em três estudos que tinham como objetivo: (1) entender a resposta de três cultivares de feijoeiro ao silício disponível na solução nutritiva; (2) identificar a contribuição do Si na expressão de genes relacionados à infecção pelo fungo através da construção de duas bibliotecas subtrativas por supressão (SSH), visando selecionar genes diferencialmente representados durante a infecção da planta com a raça 65 de C. lindemuthianum (a) e durante a infeção da planta na presença de uma maior dose silicato de potássio (75 ppm) no substrato (b); (3) identificar a resposta de dez transcritos selecionados no Estudo 2 para tentar entender a resposta dos mesmos em diferentes períodos (0; 6; 42; 72 h) após a inoculação, com ou sem suplemento de Si. Como resultados, foi observado que para as três cultivares avaliadas o Si começa a ser absorvido 14 dias após o transplante. Também foi identificado por de microscopia de varredura (MEV) que não há diferença significativa entre o número de tricomas e cada cultivar, mas que para o número de estômatos a cultivar IAC-Harmonia destacou-se das demais. Além disso, quando as três cultivares foram suplementadas com Si, houve a formação de uma cera epicuticular descrita como mecanismo de defesa da planta contra fungos; e que através de EDX (Energy-dispersive X-ray spectroscopy) foi possível constatar que plantas tratadas com Si apresentam maior teor deste elemento nas folhas. Através de inoculações com a raça 65 do patógeno verificou-se o efeito do mineral na redução da severidade da doença nas cultivares IAC-Harmonia e Pérola. No segundo estudo, duas bibliotecas de hibridização subtrativa por supressão (SSH), foram construídas visando selecionar os genes diferencialmente expressos entre plantas inoculadas e não-inoculadas (A) e entre plantas inoculadas e tratadas ou não com 75 ppm de Si (B). Foram geradas 991 sequências únicas, anotadas através do GeneOntolgy. Quinze genes de cada biblioteca foram selecionados para os experimentos de validação por RT-qPCR. Para a Biblioteca A, 11/15 genes foram positivamente regulados, e em B, 14/15. No terceiro estudo ficou evidenciado que a inoculação com o patógeno alterou positivamente a expressão de sete genes, enquanto que o tratamento com 75 ppm de Si alterou a expressão de oito genes, em pelo menos um dos tempos avaliados / Beans are an important source of carbohydrates, vitamins, minerals and fibers. In Brazil, this legume still has low productivity and one of the factors involved is the occurrence of diseases such as anthracnose, caused by the fungus Colletothrichum lindemuthianum, which causes losses in production of up to 100%. Plants present several defense mechanisms against pathogens and the reports indicate that silicon does not only promote morphological changes in leaves, but also activates resistance genes. This work was divided into three studies aiming: (1) to understand the response of three bean cultivars to a silicon source in a nutrient solution, (2) to identify the contribution of Si in the expression of genes related to the infection by the fungus by constructing two subtractive suppression libraries (SSH), to select genes differentially represented during infection of the plant with race 65 of C. lindemuthianum (a) and during infection of the plant in the presence of higher dose of potassium silicate (75 ppm) in the substrate (b), (3) to identify the response of ten selected transcripts in Study 2 in various periods (0, 6, 42, 72 h) after inoculation, with or without supplemental Si. As a result, it was observed that for all three cultivars Si begins to be absorbed 14 days after transplantation. Was also identified by microscopy (SEM) that there is no significant difference between the number of trichomes among cultivars, but that the number of stomata for the IAC-Harmonia stood out from the rest. Moreover, when the three cultivars were supplemented with Si, thus forming an epicuticular wax described as a defense mechanism against plant fungi, and that by EDX (Energy-dispersive X-ray spectroscopy) it was found that plants treated with Si have higher content of this element in leaves. Through inoculations with race 65 of the pathogen it was verified the effect of the mineral in reducing disease severity in IAC-Pérola and IAC - Harmonia. In the second study, two libraries from suppression subtractive hybridization (SSH) were constructed in order to select the differentially expressed genes between inoculated and non-inoculated (A) and between plants inoculated and treated or not with 75 ppm of Si (B). In total, 991 unique sequences were generated, those recorded by GeneOntolgy. Fifteen genes from each library were selected for the validation experiments by RT-qPCR. For library A, 11/15 genes were positively regulated, and in B, 14/15. In the third study it is showed that inoculation with the pathogen positively altered expression of seven genes, whereas treatment with 75 ppm of Si changed the expression of eight genes, in at least one of the times analyzed

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marinagobbemoschetta_dissert.pdf: 2656918 bytes, checksum: d63acce15a1feb7170b4c9270fd920d9 (MD5) Previous issue date: 2013-09-16 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo / Introduction: Mammary tumors are the most common type of tumor in dogs, with approximately half of these tumors are malignant. Hypoxia, characterized by oxygen levels below normal, is a known adverse factor to cancer treatment. The transcription factor HIF-1&#945; is the central regulator of pathophysiological response of mammalian cells to low oxygen levels, able to activate transcription of the vascular endothelial growth factor (VEGF), which in turn promotes angiogenesis through its ability to stimulate growth, migration and invasion of endothelial cells, contributing to tumor growth. Objectives: To evaluate the serum concentration and the gene expression of VEGF and HIF-1&#945; linking them with clinicopathological parameters and survival of dogs with mammary tumors in order to infer the possible prognostic value of these factors. Material and Methods: We collected tumor fragments of 30 bitches with mammary tumors to verify protein expression of VEGF and HIF-1&#945; by immunohistochemistry and gene expression by RT-PCR. To determine the serum concentration of VEGF and HIF-1&#945; by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent), serum was collected from 50 bitches control (healthy) and 30 bitches with mammary neoplasia (study group). The results were statistically related to clinicopathological features. Results: The comparison between immunohistochemical staining of the two proteins analyzed showed increased intensity of immunostaining of VEGF (p=0.03). By ELISA, we observed relationship between high serum levels of VEGF and abundant vascularization (p=0.02), metastasis (p=0.003), death rate (p=0.007) and low survival (p<0.0001). In addition, increased serum levels of VEGF in the study group compared to the control group (p=0.03). In contrast, the percentage of serum HIF-1&#945; bitches with mammary neoplasia was 20% lower than the control group of female dogs (p=0.0006). However, bitches with a history of recurrent tumor showed a 15% increase in the percentage of serum HIF-1&#945; (p=0.03). Regarding gene expression, there was a relationship between increased gene expression of VEGFA and tumor abundant vascularization (p=0.02), bitches with a history of recurrence (p=0.01) and death (p=0.02). Moreover, we observed a statistically significant increase in gene expression of HIF-1A with moderate vascularization (p=0.01) and bitches that remained alive during the follow-up period (p=0.003). Conclusions: Our results demonstrate a correlation between VEGF and features of poor prognosis, suggesting that this factor plays an important role in tumor progression and can be used as a potential prognostic marker in clinical practice and is useful in predicting tumor progression in dogs with mammary neoplasia. / Introdução: As neoplasias mamárias são o tipo mais comum de tumor na espécie canina, sendo aproximadamente metade desses tumores de caráter maligno. A hipóxia, caraterizada por níveis de oxigênio abaixo do normal, é um conhecido fator adverso ao tratamento do câncer. O fator de transcrição HIF -1&#945; é o regulador central da resposta fisiopatológica das células de mamíferos para baixos níveis de oxigênio, capaz de ativar a transcrição do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que por sua vez, promove a angiogênese através da sua capacidade de estimular o crescimento, migração e invasão de células endoteliais, contribuindo para o crescimento tumoral. Objetivos: Avaliar a concentração sérica e a expressão gênica do VEGF e do HIF-1&#945; relacionando-os com os parâmetros clínico-patológicos e a sobrevida de cadelas com neoplasia mamária a fim de inferir o possível valor prognóstico desses fatores. Material e Métodos: Foram coletados fragmentos tumorais de 30 cadelas com neoplasia mamária para verificar a expressão protéica do VEGF e do HIF-1&#945; por imuno-histoquímica e a expressão gênica por PCR em Tempo Real. Para determinar a concentração sérica do VEGF e do HIF-1&#945; pelo método de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent), foram coletados soro sanguíneo de 50 cadelas controle (saudáveis) e 30 cadelas com neoplasia mamária (grupo de estudo). Os resultados encontrados foram estatisticamente relacionados às características clínico-patológicas. Resultados: A comparação entre a marcação imuno-histoquímica das duas proteínas analisadas demonstrou aumento da intensidade da imunomarcação do VEGF (p=0,03). Por meio da técnica de ELISA, foi possível observar relação entre altos níveis séricos de VEGF com vascularização abundante (p=0,02), metástase (p=0,003), óbito (p=0,007) e baixa taxa de sobrevida (p<0,0001). Além disso, houve aumento dos níveis séricos de VEGF no grupo de estudo quando comparados ao grupo controle (p=0,03). Ao contrário, o percentual sérico de HIF-1&#945; das cadelas com neoplasia mamária foi 20% menor do que das cadelas do grupo controle (p=0,0006). No entanto, cadelas com histórico de recidiva tumoral demonstraram aumento de 15% no percentual sérico de HIF-1&#945; (p=0,03). Quanto à expressão gênica, houve relação entre o aumento da expressão gênica do VEGFA e tumores com vascularização abundante (p=0,02), cadelas com histórico de recidiva tumoral (p=0,01) e óbito (p=0,02). Por outro lado, foi observado aumento estatisticamente significante da expressão gênica do HIF-1A com vascularização moderada (p=0,01) e cadelas que continuaram vivas durante o período de acompanhamento (p=0,003). Conclusões: Nossos resultados demostram correlação entre o VEGF e as características de pior prognóstico, sugerindo que este fator desempenha um importante papel na progressão tumoral, podendo ser utilizado como um potencial marcador prognóstico na rotina clínica, sendo útil na predição da progressão tumoral em cadelas com neoplasia mamária.

Sustainability is one of the biggest goals of humankind in the new millennium. An increasing global demand on agricultural products stimulates agricultural expansion in Brazil, especially in the Southwestern Amazon, namely in the Cerrado and Amazon biomes. A better understanding of biogeochemical cycles and their influence on natural and agricultural systems is key to achieve environmental sustainability and improve agricultural efficiency. These biogeochemical cycles are driven by microbes, and the aim of this thesis was to correlate microbial functional group abundances with differences in carbon, nitrogen, and greenhouse gas cycles in response to land use changes in Southwestern Amazon soils. This work was performed at the University of São Paulo, Brazil, and at the University of Massachusetts Amherst, USA, while the candidate was enrolled in Ph.D. programs at both universities. The thesis is composed of five studies. The first study shows that land use change from Cerrado and forest to agriculture (soybean, Glycine max (L. Merrill), in succession with other crops) or pasture (Brachiaria brizantha (Hochst. ex A. Rich.) did not reduce soil microbial diversity but changed microbial structure. The second study, a physicochemical background for this land use conversion, describes the alteration of C and N stocks, soil chemical parameters, and microbiological parameters such as biomass, biological C stocks, and changes in the abundance of prokaryotes and fungi. In the third and fourth studies microcosm experiments depict how the agricultural change to soybean and Brachiaria alter the original microbial structure found in forest or cerrado. These studies focused on abundances of key biogeochemical genes (amoA, nirK, nirS, norB, nosZ, mcrA, and pmoA) and correlated gene copy abundances with C, N, and GHG measurements. In the fifth study, in situ soil surveys and GHG samplings were used to characterize the changes from forest to pasture (B. brizantha, 25 years) or soybean crop system (for 2 years or 25 years in succession). We found correlations between genes and processes, indicating that gene abundances provide important microbial information for the understanding of the targeted biogeochemical cycles. Land use, rather than plant species, promotes alterations in microbial gene abundances and processes. During the survey period, forest exhibited higher microbial activity, resulting in higher nitrate availability and N2O emissions. These processes were correlated with higher abundances of process related genes. Nitrate and N2O emissions were lower in agricultural and pasture soils. CO2 emission was higher in the two-year-old soybean plot. The forest and two-year-old soybean plots acted as a sink for CH4, while the pasture plots represented a source of it. The results validated the use of gene abundance determination as a valuable tool to better understand C, N, and GHG processes. The genes nirK, nosZ, and 16S rRNA presented the best correlations with the processes. A larger temporal and spatial analysis is needed to infer statements on the processes dynamics due to land use change. For the first time gene abundance measurements were used to integrate the C, N and GHG cycles, giving insights into land use changes in Southwestern Amazon / Sustentabilidade é um dos maiores objetivos da humanidade no novo milênio. Uma demanda crescente por produtos agrícolas tem estimulado a expansão agrícola no Brasil, especialmente no Sudoeste da Amazônia, nos biomas Cerrado e Amazônia. Um melhor entendimento dos ciclos biogeoquímicos e suas influências em sistemas naturais e agrícolas é chave para se alcançar sustentabilidade ambiental e aumentar eficiência agrícola. Esses ciclos biogeoquímicos são guiados por microrganismos, e o objetivo dessa tese foi correlacionar abundância de grupos funcionais de microrganismos com carbono, nitrogênio e gases de efeito estufa (GEE) em resposta a mudança do uso da terra em solos do sudoeste da Amazônia. Esse trabalho foi realizado na Universidade de São Paulo e na Universidade de Massachusetts Amherst enquanto o doutorando esteve matriculado nas duas universidades. A tese é composta de cinco estudos. O primeiro estudo mostra que a mudança no uso da terra de Cerrado e floresta para agricultura (soja, Glycine max (L. Merrill), em sucessão com outros cultivos) ou pastagem (Brachiaria brizantha (Hochst. ex A. Rich.) não reduz diversidade microbiana, mas muda sua estrutura. O segundo estudo descreve as alterações nos estoques de C, N, parâmetros químicos e microbiológicos da conversão de Cerrado para agricultura e pastagem. No terceiro e no quarto estudos, microcosmos foram usados para avaliar a influência de soja e braquiária na microbiota dos solos. Genes chaves dos processos biogeoquímicos (amoA, nirK, nirS, norB, nosZ, mcrA, e pmoA) foram quantificados e correlacionados com C, N e GEE. No quinto estudo, coletas in situ de solo e gases foram usadss para caracterizar a mudança do uso da terra de floresta para pastagem (braquiária, 25 anos) e para agricultura (soja, segundo ano, e soja, 25 anos, em sucessão com outras culturas). Correlações entre genes e processos foram encontradas, indicando que abundância gênica fornece importantes informações para o entendimento dos ciclos biogeoquímicos. Mudança no uso da terra como um todo, mais do que a mudança de vegetação, promove as alterações na abundância gênica e processos do solo. Durante o período de coleta, floresta exibiu maior atividade microbiana, resultando em maior disponibilidade de nitrato e emissão de N2O. Esses processos correlacionam com maior abundância dos genes relacionados aos processos. Quantidades de nitrato e N2O foram menores em agricultura e pastagem. As emissões de CO2 foram maiores na área de soja de segundo ano. Os solos de floresta e soja de segundo ano se mostraram como drenos de metano, enquanto que a pastagem foi uma fonte de emissão. Os resultados validam o uso de abundância gênica como uma técnica valiosa para um melhor entendimento dos ciclos do C, N e GEE. Os genes nirK, nosZ, e 16S rRNA apresentaram as melhores correlações com os processos. Uma análise temporal e espacial mais abrangente é necessária para generalizações sobre a dinâmica dos processos na região estudada. Pela primeira vez abundância gênica foi usada para integrar os ciclos do C, N e GEE, colaborando para um melhor entendimento dos processos relacionados à mudança no uso da terra no sudoeste da Amazônia

Le bassin d’Arcachon est une lagune semi-fermée qui concentre de forts enjeux économiques grâce à la pratique de l’ostréiculture. Cette activité est affectée depuis une trentaine d’années par des phénomènes de mortalités estivales, et plus récemment par des surmortalités du naissain. Ces travaux se sont intéressés au rôle des polluants majeurs du bassin d’Arcachon dans ce contexte de crise en étudiant leurs effets sur la biologie de Crassostrea gigas. Une approche in situ a d’abord été adoptée afin d’identifier les contaminants les plus présents dans le milieu naturel. Des opérations de transplantation d’huîtres et des prélèvements de sédiments ont permis de quantifier divers contaminants et d’associer leur présence à des réponses biologiques. Les polluants ainsi identifiés ont ensuite été employés en conditions contrôlées au laboratoire. Trois expérimentations ont été réalisées : la première concerne l’étude des voies de contamination par le tributylétain ; la seconde concerne les effets des pesticides et du cuivre ; la troisième concerne l’effet des HAP sur des huîtres diploïdes et triploïdes. Nos résultats indiquent que les organismes transplantés au coeur de la lagune sont plus exposés aux polluants, en lien avec les caractéristiques hydrodynamiques du système. La plupart des paramètres biologiques étudiés sur le terrain ont par ailleurs montré une saisonnalité liée aux processus de gamétogenèse. Au laboratoire, la plupart des contaminants testés ont induit une réponse adaptative chez les huîtres exposées. Notre étude souligne l’importance de coupler approche de terrain et approche expérimentale pour comprendre le fonctionnement des écosystèmes côtiers. / The Arcachon Bay is a semi-enclosed lagoon and represents the core of strong economic stakes through the practice of oyster-farming. This activity has been affected for around thirty years by summer mortality events, and more recently by abnormally high death rates of juveniles. This work focused on the role of the Arcachon Bay’s main contaminants in this crisis, by studying their effects on the cupped oyster’s biology. Firstly, an in situ approach was adopted in order to identify the major pollutants of the bay: caged oysters were transplanted and sediments were sampled. The presence of contaminants in the samples was associated to biological responses. Secondly, the contaminants identified in situ were used in controlled conditions at the laboratory. Three experimentations were performed; the first dealt with the contamination pathways of tributyltin; the second focused on the biological effects of pesticides and copper; the third concerned the effects of PAH towards diploid and triploid oysters. Our results indicate that the inner stations present higher accumulation of metals and PAH, in accordance with the hydrodynamic features of the bay. The bioindicators used in situ exhibited seasonal trends related to the oysters’ gametogenesis. In the laboratory, most of the contaminants used at environmental levels induced an adaptive response of the exposed oysters. Our study highlights the importance of coupling in situ and laboratory approaches in order to understand the functioning of coastal ecosystems.

Des recherches en sciences judiciaires ont montré récemment une possible corrélation entre le temps d’entreposage d’échantillons de fluides corporels et la dégradation de l’ARN dans ceux-ci. Le moment où une tache a été déposée sur une scène de crime peut être important pour déterminer la pertinence d’un échantillon dans une enquête. Dans ce mémoire, nous rapportons les profils de dégradation de quatre ARN différents mesurés par RT-qPCR, soit l’ARN ribosomique 18S et les ARNm de la β-actine, de la glyceraldehyde-3-phosphate déhydrogénase et de la cyclophiline A, obtenus de taches de sang, de salive et de sperme, entreposés à la température de la pièce ou au congélateur à -80°C sur une période de 6 mois. Nos résultats montrent une faible variation interindividuelle pour le sang et le sperme, mais une différence importante entre les donneurs pour la salive. De plus, le profil de dégradation est semblable pour tous les transcrits, mais diffère entre les fluides. La congélation des échantillons stabilise les ARN avant leur analyse. Finalement, la quantité d’ARN détecté est en relation avec le temps d’entreposage et pourrait être utilisée afin d’estimer l’âge des échantillons lorsque l’impact des conditions d’entreposage sur la dégradation de l’ARN sera mieux connu. / Recent studies in forensic science have shown a possible correlation between the degradation rate of some RNA transcripts and the age of bloodstains. The time of deposition of a stain can be of major importance to determine the relevance of a sample in a forensic investigation. In this thesis, we describe the degradation profiles of the 18S ribosomal RNA and the β-actin, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and cyclophilin A mRNAs, measured by RT-qPCR and obtained from dried blood, semen and saliva stains stored at room temperature or frozen at -80°C up to 6 months. Our results showed low inter-individual variation for blood and semen stains, but a high variation was observed between donors for saliva. Moreover, degradation profile of each transcripts was similar, but differed between fluids. Freezing samples prevented RNA degradation over time. Finally, RNA quantity was in relation with the time of storage and could be used to estimate the time since deposition of a stain when the effects of various storage conditions on RNA degradation profiles will be better documented. / Projet de recherche réalisé en collaboration avec la section Biologie/ADN du Laboratoire de sciences judiciaires et de médecine légale (LSJML) de Montréal.