Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is the causative agent of tuberculosis, one of the top ten causes of death worldwide. One of the genes upregulated in Mtb during macrophage infection is rv2633c, but the structure and function of its gene product remain unknown. Preliminary research has indicated that Rv2633c is a hemerythrin-like protein that exhibits catalase activity and binds two iron atoms using an HHE domain. Additionally, Rv2633c appears to exist as a dimer. The purpose of this project is to identify specific residues outside of the HHE domain that contribute to the protein's iron-binding ability and/or catalase activity, and to determine whether residues on the C terminus are required for dimerization. Conserved residues D37, E42, and E95 were selected due to their proximity in the amino acid sequence to the HHE domain. Each residue was mutated to alanine using site-directed mutagenesis and the mutations were confirmed using Sanger sequencing. The E95A mutant and the C-terminal truncation mutant were expressed in Escherichia coli using the T7 expression system and purified using affinity chromatography. While wild-type Rv2633c eluted as a soluble protein, the C-terminal truncation mutant was not soluble, indicating that the C terminus may be required for Rv2633c folding. The E95A mutant eluted as a soluble protein, but may have lower iron content than wild-type Rv2633c, indicating that this glutamic acid residue could contribute to iron-binding, despite being outside the HHE domain.

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A presente tese trata das reações de sulfenilação de uma série de β-ceto sulfóxidos, em continuidade aos estudos preliminares realizados anteriormente no nosso laboratório pelo grupo de B.Wladislaw. A apresentação e discussão dos resultados das reações de sulfenilação dos β-ceto sulfóxidos é precedida por uma revisão bibliográfica versando sobre β-ceto sulfóxidos e α-sulfinil ésteres, sua obtenção e reatividade. As investigações das reações de sulfenilação dos β-ceto sulfóxidos foram realizadas utilizando-se o método de Fase Homogênea e de Catálise de Transferência de Fase, empregando inicialmente o catalisador não-quirálico (TEBAC) e, posteriormente, o catalisador quirálico cloreto de benzilquinínio (QUIBEC). Todos os três métodos levaram à formação dos compostos monossulfenilados. o Esquema abaixo indica as reações em Fase Homogênea e em Catálise de Transferência de Fase empregando TEBAC (ver arquivo). É digno de nota que no caso do β-ceto sulfóxido terc-butílico (Y=H, R=t-C4H9), o composto sulfenilado correspondente mostrou um alto excesso diastereomérico tanto pelo emprego do método de Fase Homogênea como de Catálise de Transferência de Fase com catalisador não-quirálico (TEBAC). Foi possível compreender esta estereosseletividade através da determinação da configuração do enolato intermediário. Foi considerado como modelo do enolato o enol éter i-propílico (I) correspondente ao β-ceto sulfóxido t-butílico por nós sintetizado, e cuja configuração se mostrou Z através da análise de RMN1H, NOE e Análise de Raio-X (I) (ver arquivo). Devido ao fato do enolato e o enol-éter assumirem a mesma configuração durante o estado de transição, concluiu-se que a configuração do enolato intermediário seria também Z. O modelo espacial relacionado a este tipo de configuração, mostrou que o grupo t-butila ligado à sulfinila assumiria uma conformação tal que impedisse totalmente a aproximação do eletrófilo à uma das faces do enolato intermediário. Concluiu-se portanto que a estereosseletividade encontrada nas reações de sulfenilação do β-ceto sulfóxido terc-butílico era resultante da seletividade diastereofacial provocada pelo impedimento estérico do grupo t -butila no ataque do enolato intermediário ao eletrófilo de enxofre. É apresentado um modelo tridimensional do enolato que permite visualizar tal efeito. No caso de reações de sulfenilação em C.T.F. empregando catalisador quirálico (QUIBEC), verificou-se que tanto o rendimento (55%) como o excesso diastereomérico (4:1), obtidos nos estudos preliminares não se mostraram reprodutíveis (ver arquivo). Foi desenvolvida uma intensa experimentação com a finalidade de estabelecer as condições experimentais tanto para otimização dos rendimentos como para a ocorrência do excesso diastereomérico. Foi verificado que os rendimentos de produtos sulfenilados dependem do tipo de carbonato de potássio empregado como base, tempo da reação, tipo de agitação e porcentagem de água presente na mistura reacional. Entretanto o excesso diastereomérico não depende destes fatores. Foram sugeridas duas possíveis causas da ausência do excesso diastereomérico. 1) Epimerização do produto monossulfenilado contendo um excesso diastereomérico. 2) Ausência de uma interação mais efetiva do tipo \"par-íntimo\" entre o enolato do β-ceto sulfóxido e o catalisador quirálico. A possibilidade de epimerização do produto sulfenilado devido ao aumento de acidez no próton metínico, seja pela base ou pela ação do catalisador, foi eliminada através de experiências de alquilação e testes com emprego do catalisador. Foi considerada como condição essencial para ocorrência do excesso diastereomérico a formação do \"par-íntimo\" entre o enolato do β-ceto sulfóxido e o catalisador quirálico, sugerindo a sua formação através de ponte de hidrogênio da qual participam OH do catalisador, oxigênio enólico e oxigênio sulfinílico. Uma evidência para esta estrutura vem do fato que a condição essencial para a estereosseletividade mostrou ser a ausência completa de água no meio reacional. Portanto, dois processos paralelos, mas antagônicos, causados pelo catalisador quirálico, são evidenciados, um em que ele age como transportador do enolato da interface para a fase orgânica através da atração eletrostática entre as cargas contrárias, outro através da formação do \"par-íntimo\". Presumiu-se que a falta de diastereosseletividade no caso destes compostos seria provocada pelo impedimento estérico dos grupos ligados à sulfinila, os quais dificultariam o contato com o catalisador e consequentemente a seletividade da reação. Finalmente são apresentados os resultados do estudo paralelo de B.Wladislaw e col. com β-ceto sulfóxido opticamente ativo, os quais permitiram elucidar a causa do excesso diastereomérico. / This thesis presents the sulfenylation reactions of a serie of β-keto sulfoxides in continuation to the preliminary studies of B.Wladislaw and al. The presentation and discussion of the results is preceded by a literature revision of the oxo-sulfoxides, such as β-keto sulfoxides and α-sulfinyl esters, mainly the preparation methods and the most important reactivities. The sulfenylation reactions of β-keto sulfoxides were performed by two procedures: the homogeneous one and by C.T.F. In the second case initially the non quiralic catalyst (TEBAC) and later, the chiralic one (QUIBEC) were employed. Scheme below indicates the reactions in the homogeneous phase and by P.T.C. procedure using TEBAC (ver arquivo). It is noteworthy that in the case of the t-butylsulfinyl derivative (Y=H, R=t-C4H9) the corresponding sulfenylated derivative showed a large diastereomeric excess in the homogeneous phase as well as by P.T.C. in the presence of TEBAC. It was possible to understand the reason of this stereoselectivity by determination of the configuration of the intermediate enolate in the sulfenylation of the β-keto t-butyl sulfoxide. It was considered as a model of the enolate the corresponding i-propyl enol ether (I), which showed to be of Z configuration by lHNMR, NOE and X-Ray analysis (ver arquivo). The spacial model related to the Z configuration of th e enolate indicated that the t -butyl group inhibits the approximation of the sulfenylating agent to one of the face of nolate. Therefore, it was concluded that the stereoselectivity in the sulfenylation reaction of the β-keto t-butyl sulfoxide is caused by diastereofacial selectivity due to steric hindrance of the t-butyl group to the attack of the intermediate enolate toward sulfur electrophile. In the case of the sulfenylation reactions by P.T.C. procedure, employing chiral catalyst (QUIBEC), neither yields (55%) or diastereomeric excess (4:1), obtained in preliminary studies could be reproduced (ver arquivo). An intensive experimentation was developed in order to establish the experimental conditions for occurrence of diastereomeric excess. It was verified that the yields of the sulfenylated products depend on the type of potassium carbonate which was employed as base, reaction time, solvent, type of stirring and percent of water in the reaction mixtures. However the diastereomeric excess showed to not be depend on these factors. Two possible reasons for the absence of the diastereomeric excess were suggested 1) epimerization of the sulfenylated product. 2) Absence of a more effective interaction of the type \"tight ion pair\" between enolate and chiral catalyst. The possibility of occurrence of epimerization in the sulfenylated product by action of base, due to increase acidity of the methynic proton or by action of catalyst was eliminated by alkylation experiments and several tests employing chiral catalyst. It was considered essencial for occurrence of diastereomeric excess the formation of a \"tight ion pair\" between the enolate and chiral catalyst. It was suggested that its formation occurs through a hydrogen bonding envolving OH of catalyst, enolic oxygen and sulfinyl oxygen.A strong indication of such bonding is the fact that for the occurrence of stereoselectivity strictly anhydrous condition found to be necessary. It seems reasonable to suggest that two parallel processes, induced by a chiral catalyst, may occur : one in which it acts as transportation of the enolate from the interface to the organic phase trough an electrostatic attraction between two contrary charges, another through formation of a \"tight ion pair\". While the first process has an influence on the sulfenylation rate and, therefore, on the yield of the sulfenylated product, the other is responsible for the diastereomeric excess However, when the experimental conditions established for the diastereoselectivity in the methylsulfinyl acetophenone was applyed to a large serie of keto sulfoxides containing alkyl and aryl sulfinyl groups the corresponding sulfenylated products did not show diastereomeric excess. This fact was attributed to the lack of association whith the chiral catalyst due to steric hindrance.

Com o objetivo de avaliar o desempenho de diferentes doses e produtos fitossanitários utilizados no tratamento de sementes de soja, foi efetuada a caracterização do efeito fisiológico na germinação e no desenvolvimento das plântulas por intermédio dos testes de germinação e de vigor (índice de velocidade de germinação, envelhecimento acelerado, comprimento e massa de matéria seca de plântula, teste de frio e análise computadorizada de imagem) em laboratório, além da determinação do teor de clorofila (por intermédio do valor SPAD), fotossíntese líquida, condutância estomática, transpiração, temperatura foliar, conteúdo de peróxido de hidrogênio, peroxidação de lipídios, atividade da catalase (enzima antioxidante), e teor de proteína e de nitrogênio total. Com base nos resultados obtidos observou-se que todos os tratamentos apresentaram desempenho satisfatório no que diz respeito à germinação. Não se observaram diferenças em termos de índice de velocidade de germinação, envelhecimento acelerado, comprimento e massa de matéria seca de raiz, índice de vigor e de crescimento (análise de imagem) e peroxidação de lipídeos. O tratamento com Fipronil + Piraclostrobina + Tiofanato Metílico apresentou tendência de melhor desempenho em termos de comprimento de parte aérea, enquanto o tratamento Controle apresentou tendência de melhor desempenho, mas não diferiu dos tratamentos: Fipronil + Piraclostrobina + Tiofanato Metílico, Fluxapiroxade e Piraclostrobina em termos de massa de matéria seca de parte aérea. Os tratamentos Fipronil e Fluxapiroxade apresentaram melhor desempenho que o Controle, em termos de relação massa de matéria seca de raiz e de parte aérea. O tratamento com Fipronil apresentou melhor tendência de desempenho pelo teste de frio e juntamente com Fipronil + Piraclostrobina + Tiofanato Metílico e Fluxapiroxade apresentou desempenho melhor que o Controle no de índice de uniformidade. A Piraclostrobina apresentou desempenho melhor que o Controle em termos de teor de clorofila, fotossíntese líquida e temperatura foliar, enquanto o tratamento com Fipronil foi melhor que o Controle e os demais tratamentos em termos de condutância estomática e transpiração. Os tratamentos com Fipronil e Piraclostrobina apresentaram desempenho melhor que o Controle, em termos de conteúdo de peróxido de hidrogênio e os tratamentos com Fipronil + Piraclostrobina + Tiofanato Metílico e Fluxapiroxade e Piraclostrobina apresentaram desempenho melhor que o Controle, em termos da atividade da catalase. O Fluxapiroxade (50 g por 100 kg de sementes) apresentou melhor desempenho, mas não diferiu do Controle e dos tratamentos com Fipronil, Fluxapiroxade (25 e 75 g por 100 kg de sementes) e Piraclostrobina em termos do teor de proteína e nitrogênio total. Com os resultados apresentados, conclui-se que não houve prejuízo ao vigor das plântulas quando realizado o tratamento de sementes. Além disso, pode-se concluir que esta constitui prática agronômica eficiente não só no que diz respeito ao controle de doenças e pragas, mas também apresenta benefícios no que diz respeito à fisiologia das plântulas de soja, sobretudo para tratamento realizado com estrobilurinas. Esses benefícios podem favorecer um melhor estabelecimento das plântulas no campo. / This study aimed to evaluate the physiological effects of soybean seed treatment with different pesticides and doses on germination and seedling development. Germination and vigor tests, such as speed of germination index, accelerated aging, length and dry weight of seedling, cold test and computerized image analysis were performed in the laboratory, besides the determination of chlorophyll content (SPAD value), net photosynthesis, stomatal conductance, leaves transpiration and temperature, content of hydrogen peroxide, lipid peroxidation, catalase (an antioxidant enzyme) activity, protein and total nitrogen. The results obtained revealed that all treatments showed satisfactory performance in germination. No differences in terms of speed index, accelerated aging, root length and dry weight, vigor and growth index (image analysis) and lipid peroxidation were observed. Treatment with Fipronil + Pyraclostrobin + Methyl Tiophanate tended to perform better in terms of shoot, while control treatment tended to perform better, but did not differ from treatments with Fipronil + Pyraclostrobin + Methyl Tiophanate, Fluxapyroxad and Pyraclostrobin in terms of shoot dry matter. Fipronil and Fluxapyroxad treatments performed better than the control in terms of relationship between root and shoot dry weight. Treatment with Fipronil showed better performance trend for the cold test and along with Fipronil + Pyraclostrobin + Methyl Tiophanate and Fluxapyroxad performed better than control on the uniformity index. Pyraclostrobin showed better performance than the control in terms of chlorophyll content, net photosynthesis and leaf temperature, whereas treatment with Fipronil was better than the control and other treatments in terms of stomatal conductance and transpiration. Treatments with Fipronil and Pyraclostrobin performed better than the control in terms of content of hydrogen peroxide and treatments with Fipronil + Pyraclostrobin + Methyl Tiophanate, Fluxapyroxad and Pyraclostrobin performed better than the control in terms of catalase activity. Fluxapyroxad (50 g per 100 kg of seeds) performed better, but did not differ from control, Fipronil, Fluxapyroxad (25 and 75 g per 100 kg of seeds) and Pyraclostrobin in terms of protein content and total nitrogen. With the results presented, we conclude that there was no damage to seedling vigor when seed treatment was applied. Furthermore, it can be concluded that this is an efficient agronomic practice with regard to the control of diseases and pests and it also has benefits to the physiology of soybean seedlings, mainly when treatment is done with Strobilurins. These benefits can favorable to a better seedling establishment in the field.

Avaliou-se neste estudo a influência da exposição precoce ao poluente 1,2-NQ na resposta inflamatória alérgica em camundongos C57BL/6 machos e fêmeas, na juventude. Tanto nas fêmeas quanto em machos a 1,2-NQ não afetou a hiperreatividade (HR) nas vias aéreas. A HR foi maior nas fêmeas alérgicas, na ausência ou presença da 1,2-NQ. Camundongos machos, mas não fêmeas, tratados com 1,2-NQ + OVA/OVA, exibiram eosinofilia significativa no pulmão, sangue e medula óssea em relação aos controles do mesmo gênero ou das fêmeas. Concentrações aumentas de IL-4, IL-5, IL-13 e INF-<font face=\"Symbol\">g foi mensurado no pulmão, e IgE no sangue periférico dos machos 1,2-NQ + OVA/OVA. A atividade da enzima catalase foi maior no grupo de machos 1,2-NQ + OVA/OVA, mas não fêmeas. O aumento da atividade da catalase está associado a ausência de exacerbação da resposta inflamatória em fêmeas jovens, sugerindo que o aumento da catalase constitui um fator anti-oxidante de controle da exacerbação da resposta inflamatória alérgica frente a exposição precoce a 1,2-NQ, o qual deve ser dependente de hormônios sexuais. / This study evaluated the influence of early exposure to the pollutant 1,2-NQ in the allergic inflammatory response in male and female C57BL/6 youth mice. Both females and males mice exposed to 1.2-NQ did not exhibit changes in the airways hyperresponsiveness (HR), while the HR was higher in females allergic, in the absence or presence of 1.2-NQ. Male mice, but not females, treated with 1.2-NQ + OVA / OVA, exhibited a significant eosinophilia in the lung, blood and bone marrow in relation to controls of the same gender or respective female groups. Increased IL-4, IL-5, IL-13 and INF-g levels were measured in the lung, and IgE in peripheral blood of male 1.2-NQ + OVA/OVA. The catalase activity was higher in male 1.2-NQ + OVA / OVA, but not females. The increase of catalase activity is associated with the absence of exacerbation of the inflammatory response in young female mice, suggesting that catalase is an antioxidant factor to control exacerbation of allergic inflammatory response in the face of early exposure to 1.2-NQ, which should be dependent on sex hormones.

Com o objetivo de avaliar o desempenho de diferentes doses e produtos fitossanitários utilizados no tratamento de sementes de soja, foi efetuada a caracterização do efeito fisiológico na germinação e no desenvolvimento das plântulas por intermédio dos testes de germinação e de vigor (índice de velocidade de germinação, envelhecimento acelerado, comprimento e massa de matéria seca de plântula, teste de frio e análise computadorizada de imagem) em laboratório, além da determinação do teor de clorofila (por intermédio do valor SPAD), fotossíntese líquida, condutância estomática, transpiração, temperatura foliar, conteúdo de peróxido de hidrogênio, peroxidação de lipídios, atividade da catalase (enzima antioxidante), e teor de proteína e de nitrogênio total. Com base nos resultados obtidos observou-se que todos os tratamentos apresentaram desempenho satisfatório no que diz respeito à germinação. Não se observaram diferenças em termos de índice de velocidade de germinação, envelhecimento acelerado, comprimento e massa de matéria seca de raiz, índice de vigor e de crescimento (análise de imagem) e peroxidação de lipídeos. O tratamento com Fipronil + Piraclostrobina + Tiofanato Metílico apresentou tendência de melhor desempenho em termos de comprimento de parte aérea, enquanto o tratamento Controle apresentou tendência de melhor desempenho, mas não diferiu dos tratamentos: Fipronil + Piraclostrobina + Tiofanato Metílico, Fluxapiroxade e Piraclostrobina em termos de massa de matéria seca de parte aérea. Os tratamentos Fipronil e Fluxapiroxade apresentaram melhor desempenho que o Controle, em termos de relação massa de matéria seca de raiz e de parte aérea. O tratamento com Fipronil apresentou melhor tendência de desempenho pelo teste de frio e juntamente com Fipronil + Piraclostrobina + Tiofanato Metílico e Fluxapiroxade apresentou desempenho melhor que o Controle no de índice de uniformidade. A Piraclostrobina apresentou desempenho melhor que o Controle em termos de teor de clorofila, fotossíntese líquida e temperatura foliar, enquanto o tratamento com Fipronil foi melhor que o Controle e os demais tratamentos em termos de condutância estomática e transpiração. Os tratamentos com Fipronil e Piraclostrobina apresentaram desempenho melhor que o Controle, em termos de conteúdo de peróxido de hidrogênio e os tratamentos com Fipronil + Piraclostrobina + Tiofanato Metílico e Fluxapiroxade e Piraclostrobina apresentaram desempenho melhor que o Controle, em termos da atividade da catalase. O Fluxapiroxade (50 g por 100 kg de sementes) apresentou melhor desempenho, mas não diferiu do Controle e dos tratamentos com Fipronil, Fluxapiroxade (25 e 75 g por 100 kg de sementes) e Piraclostrobina em termos do teor de proteína e nitrogênio total. Com os resultados apresentados, conclui-se que não houve prejuízo ao vigor das plântulas quando realizado o tratamento de sementes. Além disso, pode-se concluir que esta constitui prática agronômica eficiente não só no que diz respeito ao controle de doenças e pragas, mas também apresenta benefícios no que diz respeito à fisiologia das plântulas de soja, sobretudo para tratamento realizado com estrobilurinas. Esses benefícios podem favorecer um melhor estabelecimento das plântulas no campo. / This study aimed to evaluate the physiological effects of soybean seed treatment with different pesticides and doses on germination and seedling development. Germination and vigor tests, such as speed of germination index, accelerated aging, length and dry weight of seedling, cold test and computerized image analysis were performed in the laboratory, besides the determination of chlorophyll content (SPAD value), net photosynthesis, stomatal conductance, leaves transpiration and temperature, content of hydrogen peroxide, lipid peroxidation, catalase (an antioxidant enzyme) activity, protein and total nitrogen. The results obtained revealed that all treatments showed satisfactory performance in germination. No differences in terms of speed index, accelerated aging, root length and dry weight, vigor and growth index (image analysis) and lipid peroxidation were observed. Treatment with Fipronil + Pyraclostrobin + Methyl Tiophanate tended to perform better in terms of shoot, while control treatment tended to perform better, but did not differ from treatments with Fipronil + Pyraclostrobin + Methyl Tiophanate, Fluxapyroxad and Pyraclostrobin in terms of shoot dry matter. Fipronil and Fluxapyroxad treatments performed better than the control in terms of relationship between root and shoot dry weight. Treatment with Fipronil showed better performance trend for the cold test and along with Fipronil + Pyraclostrobin + Methyl Tiophanate and Fluxapyroxad performed better than control on the uniformity index. Pyraclostrobin showed better performance than the control in terms of chlorophyll content, net photosynthesis and leaf temperature, whereas treatment with Fipronil was better than the control and other treatments in terms of stomatal conductance and transpiration. Treatments with Fipronil and Pyraclostrobin performed better than the control in terms of content of hydrogen peroxide and treatments with Fipronil + Pyraclostrobin + Methyl Tiophanate, Fluxapyroxad and Pyraclostrobin performed better than the control in terms of catalase activity. Fluxapyroxad (50 g per 100 kg of seeds) performed better, but did not differ from control, Fipronil, Fluxapyroxad (25 and 75 g per 100 kg of seeds) and Pyraclostrobin in terms of protein content and total nitrogen. With the results presented, we conclude that there was no damage to seedling vigor when seed treatment was applied. Furthermore, it can be concluded that this is an efficient agronomic practice with regard to the control of diseases and pests and it also has benefits to the physiology of soybean seedlings, mainly when treatment is done with Strobilurins. These benefits can favorable to a better seedling establishment in the field.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / With the growing demand for dental esthetics, some routine procedures on dental clinic brings us questions, like performing restorative procedures after dental bleaching. The proposition of this study was to evaluate in vitro bond strength of enamel samples obtained from permanent human teeth exposed to 10% carbamide peroxide (10% Whitness Perfect - FGM) followed by application of gel-based catalase (Neutralize-FGM).. For this, were used the third molar crowns that were sectioned and used the buccal and lingual / palatal. Specimens were randomly divided into 6 groups ( n = 10): G1 bleached and restored after 24 hours. G2: bleached, applied catalase and restored after 24 hours. G3: bleached and restored after 5 days. G4: bleached, applied catalase and restored after 5 days. G5: bleached and restored after 14 days. G6: bleached, applied catalase and restored after 14 days. The scheme of the bleaching treatment was 6 hours/day of exposure, for 14 days, the remaining time the specimens were stored in deionized water at 37 ° C. At the end of the bleaching treatment , in G2 , G4 and G6 were applied 2 ml of gel based on catalase ( Neutralize ) for 2 min. According to the time slots of each group, were performed the composite resin restorations with the technique of starch tube and after 24 hours the specimens were subjected to 3,000 cycles. Finished the thermocycling , the microshear test was performed in the universal testing machine, using the speed of 1.0 mm / min until failure occurs. The bond strength values were tabulated and analyzed using descriptive statistics in SPSS (Statistical Package for Social Sciences, version 18.0) program. The bond strength values were compared between themselves within every time interval and also in relation to the use or not of catalase by variance analysis and Tukey post hoc test (p < 0.05) . The analysis of variance of two factors, showed that catalase factor (p = 0.027) , time (p = 0.001) and their interaction significantly influenced the bond strength . In comparison between groups of the same time slots, was observed that in G1 and G2 (24 hours) was statistically significant difference , indicating that the G2 had higher bond strength results . As for the other time periods five days (G3 and G4) and 14 days (G5 and G6) there was no significant difference for both groups without and with application to catalase. Comparing the groups with and without catalase in different time intervals was also performed. Covering groups in which catalase was not used, namely, specimens that were only exposed to the bleaching agent, group G5 (14 days) showed higher bond strength results compared to groups G1 and G3 . In the groups that were bleached and treated with catalase, at all time intervals the bond strength values were statistically equal. From the methodology developed and results , it is concluded that the use of neutralizer catalase-based agent increased the bond strength in restorations performed 24 hours after the tooth bleaching with 10 % carbamide peroxide . / Com a crescente demanda pela estética dental, alguns procedimentos rotineiros da clínica odontológica nos trazem questionamentos, como a realização de procedimentos restauradores após o clareamento dental. A proposição desse estudo foi avaliar in vitro, a resistência adesiva de espécimes de esmalte obtidos a partir de dentes humanos permanentes expostos ao peróxido de carbamida 10% (Whitness Perfect 10% - FGM ) seguido da aplicação do gel à base de catalase ( Neutralize- FGM). Para isso, foram utilizados coroas de terceiros molares que foram seccionadas e utilizadas as faces vestibular e lingual/palatal. Os espécimes foram aleatoriamente divididos em 6 grupos ( n=10): G1: clareado e restaurado após 24 horas. G2: clareado, aplicado a catalase e restaurado após 24 horas. G3: clareado e restaurado após 5 dias. G4: clareado, aplicado a catalase e restaurado após 5 dias. G5: clareado e restaurado após 14 dias. G6: clareado, aplicado a catalase e restaurado após 14 dias. O regime do tratamento clareador foi de 6h/dia de exposição, durante 14 dias, no restante do tempo os espécimes permaneceram armazenados em água deionizada em estufa a 37º C. Ao término do tratamento clareador, nos grupos G2, G4 e G6 foram aplicados 2 mL do gel à base de catalase (Neutralize- FGM) durante 2 min. De acordo com os intervalos de tempo de cada grupo, foram realizadas as restaurações com resina composta pela técnica do tubo de amido e após 24 horas os espécimes foram submetidos à 3000 ciclos de termociclagem. Terminada a termociclagem, foi realizado o teste de microcisalhamento na máquina de ensaios universal, utilizando a velocidade de 1,0mm/min até ocorrer a falha. Os valores de resistência adesiva foram analisados por meio de estatísticas descritivas no programa SPSS (Statistical Package for Social Sciences, versão 18.0). Os valores de resistência adesiva foram comparados entre si dentro de cada intervalo de tempo e também em relação ao uso ou não de catalase por meio de Análise de variância e teste post hoc de Tukey (p<0,05). A análise de variância de 2 fatores evidenciou que o fator catalase (p=0,027), tempo (p=0,001) e a interação entre eles influenciaram significativamente a resistência de união. Na comparação entre grupos do mesmo intervalo de tempo observou-se que nos grupos G1 e G2 (24 horas) houve diferença estatisticamente significativa, evidenciando que o grupo G2 obteve maiores resultados de resistência de união. Já para os outros intervalos de tempo (5 dias (G3 e G4) e 14 dias (G5 e G6) não houve diferença significativa tanto para os grupos sem como para os com a aplicação da catalase. Também foi realizada a comparação entre grupos com e sem a catalase nos diferentes intervalos de tempo. Dentro dos grupos em que não foi utilizada a catalase, ou seja, os espécimes que foram somente expostos ao agente clareador, o grupo G5 (14 dias) obteve maiores resultados de resistência de união quando comparado aos grupos G1 e G3. Já nos grupos que foram clareados e tratados com catalase, em todos os intervalos de tempo os valores de resistência de união foram estatisticamente iguais. A partir da metodologia desenvolvida e dos resultados obtidos, conclui-se que a utilização do gel neutralizador à base de catalase aumentou a resistência adesiva em restaurações realizadas 24 horas após o término do clareamento dental com peróxido de carbamida 10%.

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No. of bitstreams: 1 TeseMRL.pdf: 1847541 bytes, checksum: 576104fec459fe5ca5cf29dbd41b2979 (MD5) Previous issue date: 2017-03-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Arterial hypertension (AH) is a multifactorial disease, characterized by increased levels of arterial pressure (AP) that causes an increased risk of coronary disease, stroke and congestive heart failure. Several studies have addressed the possible causes and mechanisms of hypertension in the attempt to seek new treatments for this disease. Studies have already showed the participation of oxidative stress, caused by increased production of reactive oxygen species (ROS) in the development and maintenance of hypertension. ROS like hydrogen peroxide (H2O2) are produced endogenously and may participate in intra- and extracellular signaling, including mediation of angiotensin II (ANG II) responses. Intracerebroventricular injection of H2O2 or the increase of endogenous H2O2 using the catalase inhibitor ATZ reduced the pressor responses to central ANG II in normotensive and hypertensive rats. In the present study, we investigated the effects of acute or chronic subcutaneous (sc) administration of ATZ on mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR) in normotensives, spontaneously hypertensive rats (SHR) and 2-kidney, 1clip hypertensive rats (2K1C). We also studied the possible changes of autonomic modulation of systolic arterial pressure (SAP) and the pulse interval (PI), the renal sympathetic nerve activity, the baroreflex, the genic expression of inflammatory cytokines, components of the renin-angiotensin system (RAS), NADPH oxidase isoforms and microglia activity (CD11) in the hypothalamus in rats treated with sc ATZ. In addition, it was also tested the pressor response to noradrenaline or ANG II injected intravenously (iv), the hypotensive response to the ganglionic blockade with hexamethonium, food and water intake and urinary excretion in normotensive and hypertensive rats treated with sc administration of ATZ. Male normotensive Holtzman, 2K1C hypertensive Holtzman rats and SHR were used. MAP and HR were recorded in conscious, unrestrained rats, except in rats used to record sympathetic activity. The sc injection of ATZ (300 mg/kg of body weight) acutely reduced MAP in SHR (192 ± 4 mmHg pre-injection of ATZ vs. 173 ± 6 mmHg after ATZ) and in 2K1C rats (170 ± 8 mmHg pre-injection of ATZ, vs. 158 ± 13 mmHg after ATZ) for at least 4 h and also slightly reduced HR. Chronic daily treatment with ATZ (600 mg/kg of body weight/day) sc for 9 days also reduced MAP in SHR (ATZ: 172 ± 8 mmHg, vs. saline: 198 ± 2 mmHg) and in 2K1C rats (ATZ: 137 ± 12 mmHg, vs. saline: 181 ± 9 mmHg) without altering HR, the impairment of baroreflex present in hypertensive rats, food and water intake and urinary excretion. The treatment with ATZ sc chronically reduced sympathetic modulation of SAP in SHR (ATZ: 2.6 ± 1.2 mmHg2, vs. saline: 6.3 ± 3.4 mmHg2) and in 2K1C rats (ATZ: 3.2 ± 0.4 mmHg2, vs. saline: 7.6 ± 1.5 mmHg2) and PI, enhanced the parasympathetic modulation of PI in SHR (ATZ: 90.5 ± 4.5 un, vs. saline: 76.5 ± 7.8 un) and 2K1C rats (ATZ: 85.3 ± 2.9 un vs. saline: 68.6 ± 3 un) and improved the sympatho-vagal balance in SHR (ATZ: 0.11 ± 0.05, vs. saline: 0.35 ± 0.17) and in 2K1C rats (ATZ: 0.19 ± 0.05, vs. saline: 0.52 ± 0.09). Chronic treatment with ATZ sc for 9 days in 2K1C hypertensive rats also reduced the mRNA expression of interleukin-6 (IL-6) (ATZ: 0.80 ± 0.06, vs. saline: 2.32 ± 0.36 fold change), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and AT1 receptor (AT1r) (ATZ: 0.74 ± 0, 04, vs. saline: 1.19 ± 0.22 fold change) in the hypothalamus. ATZ chronically in SHR also decreased mRNA expression of IL-6 (ATZ: 1.17 ± 0.07, vs. saline: 1.53 ± 0.11 fold change), AT1r (ATZ: 0.81 ± 0.03, vs. saline: 1.0 ± 0.04 fold change), NADPH oxidase isoform NOX2 (ATZ: 0.85 ± 0.06, vs. saline: 1.52 ± 0.27 fold change) and the microglia activation indicator gene (CD11) (ATZ: 1.47 ± 0.06, vs. saline: 1.79 ± 0.08 fold change) in the hypothalamus. The injection of ATZ (300 mg/kg of body weight) sc in 2K1C hypertensive rats acutely reduced renal sympathetic nerve activity (-51.5 ± 10%) and the hypotensive response to iv injection of the ganglionic blocker hexamethonium (ATZ: -58 ± 5 mmHg; vs. saline: -106 ± 7 mmHg), without changing the pressor responses to noradrenaline or ANG II iv, in rats treated with sc ATZ. Therefore, the present results suggest that increasing the availability of endogenous H2O2 by the acute or chronic administration of ATZ sc produces anti-hypertensive effects due to decreases in sympathetic nerve activity that are associated with a decrease in neuroinflammation, AT1 receptor and NADPH oxidase mRNA and activation the microglia in the hypothalamus. These effects might result from an impairment of the central action of ANG II as demonstrated in a previous study (LAUAR et al., 2010). / A hipertensão arterial (HA) é uma doença multifatorial, caracterizada pelo aumento dos níveis de pressão arterial (PA) que ocasiona um aumento de risco de doenças coronarianas, derrame cerebral e insuficiência cardíaca. Vários estudos visam compreender as possíveis causas e mecanismos da hipertensão na tentativa de se buscar novos tratamentos para esta doença. Estudos já demonstraram a participação do estresse oxidativo, causado pelo aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) no desenvolvimento e a manutenção da hipertensão. As EROs como peróxido de hidrogênio (H2O2) são produzidas endogenamente e podem participar da sinalização intra e intercelular, incluindo a mediação das respostas à angiotensina II (ANG II). Injeções intracerebroventriculares de H2O2 ou o aumento de H2O2 endógeno utilizando o inibidor da catalase, o ATZ, reduziram a resposta pressora produzida pela injeção central de ANG II em ratos normotensos e hipertensos. No presente estudo, investigamos os efeitos da administração subcutânea (sc) aguda ou crônica do ATZ na pressão arterial média (PAM) e na frequência cardíaca (FC) de ratos normotensos, ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e com hipertensão do tipo 2 rins, 1 clipe (2R1C). Estudamos também a modulação autonômica da pressão arterial sistólica (PAS) e do intervalo de pulso (IP), da atividade nervosa simpática renal (ANSr), o barorreflexo, a expressão gênica de citocinas inflamatórias, de componentes do sistema renina-angiotensina (SRA), das isoformas da NADPH oxidase e da ativação da micróglia (CD11) no hipotálamo em ratos normotensos e/ou hipertensos tratados com ATZ sc. Adicionalmente foram testados a resposta pressora da noradrenalina ou ANG II injetadas intravenosamente (iv), a resposta hipotensiva causada pelo bloqueio ganglionar com hexametônio, a ingestão de água e alimento e excreção urinária em ratos normotensos e hipertensos tratados com ATZ sc. Foram utilizados ratos Holtzman normotensos, ratos Holtzman com hipertensão 2R1C e SHR. A PAM e FC foram registradas em ratos conscientes e com livre movimentação, exceto ratos que foram usados para registro de atividade simpática. A injeção sc de ATZ (300 mg/kg de peso corporal) agudamente reduziu por pelo menos 4 horas a PAM em SHR (192 ± 4 mmHg pré-injeção de ATZ, vs. 173 ± 6 mmHg após ATZ) e em ratos com hipertensão 2R1C (170 ± 8 mmHg pré-injeção de ATZ, vs. 158 ± 13 mmHg após ATZ) por pelo menos 4 horas e também reduziu a FC. O tratamento crônico com ATZ (600 mg/kg de peso corporal/dia) sc por 9 dias também reduziu a PAM em ratos SHR (ATZ: 172 ± 8 mmHg, vs. salina: 198 ± 2 mmHg) e em ratos 2R1C (ATZ: 137 ± 12 mmHg, vs. salina: 181 ± 9 mmHg), sem alterar a FC, o comprometimento do barorreflexo presente em animais hipertensos, a ingestão de água e alimento e a excreção urinária. O tratamento com ATZ sc cronicamente reduziu a modulação simpática da PAS em ratos SHR (ATZ: 2,6 ± 1,2 mmHg2, vs. salina: 6,3 ± 3,4 mmHg2) e em ratos 2R1C (ATZ: 3,2 ± 0,4 mmHg2, vs. salina: 7,6 ± 1,5 mmHg2) e do IP, aumentou a modulação parassimpática do IP em ratos SHR (ATZ: 90,5 ± 4,5 un, vs. salina: 76,5 ± 7,8 un) e em ratos 2R1C (ATZ:85,3 ± 2,9 un vs. salina: 68,6 ± 3 un) e melhorou o balanço simpato-vagal em ratos SHR (ATZ: 0,11 ± 0,05, vs. salina: 0,35 ± 0,17) e em ratos 2R1C (ATZ: 0,19 ± 0,05, vs. salina: 0,52 ± 0,09). O tratamento crônico com ATZ sc por 9 dias em ratos com hipertensão 2R1C também reduziu a expressão de RNAm para interleucina 6 (IL-6) (ATZ: 0,80 ± 0,06 número de vezes, vs. salina: 2,32 ± 0,36 número de vezes), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e do receptor AT1 (AT1r) (ATZ: 0,74 ± 0,04 número de vezes, vs. salina: 1,19 ± 0,22 número de vezes) no hipotálamo. ATZ cronicamente em ratos SHR também reduziu a expressão de RNAm da IL-6 (ATZ: 1,17 ± 0,07 número de vezes, vs. salina: 1,53 ± 0,11 número de vezes), AT1r (ATZ: 0,81 ± 0,03 número de vezes, vs. salina: 1,0 ± 0,04 número de vezes), da isoforma NOX2 da NADPH oxidase (ATZ: 0,85 ± 0,06 número de vezes, vs. salina: 1,52 ± 0,27 número de vezes) e da ativação da micróglia (CD11) (ATZ: 1,47 ± 0,06 número de vezes, vs. salina: 1,79 ± 0,08 número de vezes) no hipotálamo. A injeção de ATZ (300 mg/kg de peso corporal) sc em ratos com hipertensão 2R1C reduziu agudamente a atividade nervosa simpática renal (-51,5 ± 10%) e a resposta hipotensiva produzida pela injeção iv do bloqueador ganglionar hexametônio (ATZ: Δ -58 ± 5 mmHg, vs. salina: Δ -106 ± 7 mmHg), sem alterar a resposta pressora da noradrenalina ou ANG II iv, o que sugere que os efeitos anti-hipertensivos do ATZ seriam mais provavelmente causados pela redução da atividade simpática por uma ação central desta droga e não por uma ação vascular direta do ATZ. Portanto, os presentes resultados sugerem que o aumento da disponibilidade de H2O2 endógeno pela administração aguda ou crônica de ATZ sc produz efeitos anti-hipertensivos que são devidos a uma diminuição da atividade nervosa simpática que está associada com a diminuição da neuroinflamação, de receptores AT1, RNAm para NADPH oxidase e da ativação da micróglia no hipotálamo. Estes efeitos podem ser resultados de um bloqueio ou comprometimento das ações centrais da ANG II como demonstrado em estudo anterior (LAUAR et al., 2010). / FAPESP: 2013/05189-4

SOUSA, Rachel Hellen Vieira de. Silenciamento de peroxidase do ascorbato peroxissomal induz mudanças antioxidantes capazes de atenuar estresse oxidativo induzido por excesso de H2O2 na deficiência de catalase. 2014. 93 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2014. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-29T12:54:56Z No. of bitstreams: 1 2014_dis_rhvsousa.pdf: 1853718 bytes, checksum: da11921f6237d61d7d067fa8e43834c7 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:13:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_dis_rhvsousa.pdf: 1853718 bytes, checksum: da11921f6237d61d7d067fa8e43834c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:13:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_dis_rhvsousa.pdf: 1853718 bytes, checksum: da11921f6237d61d7d067fa8e43834c7 (MD5) Previous issue date: 2014 / The ascorbate peroxidase (APX) and catalase (CAT) are the most important enzymes in removing H2O2 of plant cells. Both are present in peroxisomes. In high photorespiration, the amount of H2O2 in peroxisomes is increased, due to greater activity of glycolate oxidase (GO), enzyme producer of H2O2. Catalase has greater involvement in the removal of H2O2 presenting a high Km and the ability to scavenge higher concentrations of H2O2 than APX. The importance of the peroxisomal isoform of APX in antioxidant metabolism of plant cells is still unknown. There are few papers in literature reporting the role of pAPX. Thus, we performed this work with the objective of evaluating the effect of catalase inhibition in rice plants (APX4) silenced in APX’s peroxisomal isoform. Initially, it was performed a characterization work of three lines of APX4 (Lg, Lh and Lj), aiming to select one line for future studies. It was observed lower GO activity and a slight increase in net photosynthesis in the three mutant lines. Based on biochemical, physiological and photosynthetic parameters, APX4-Lg line was chosen. The APX4 silencing resulted in suppression of expression of the other peroxisomal isoform, APX3. Subsequently, experiments were conducted with catalase inhibition by aminotriazole (AT) in plants NT and APX4. Mutant plants had less electrolyte leakage than NT plants when catalase was inhibited. The synthesis of GSH in the absence of CAT was higher in NT plants. After CAT inhibition, GPX activity increase was higher in APX4 than in NT plants. In order to induce a greater effect of the CAT absence, an experiment was performed combining CAT inhibition with light (1000 μmol photons m -2 s -1), in leaf segments. Similar to the results found in plants, APX4 suffered less than NT plants, with catalase inhibition. APX4 plants also showed higher Fv/Fm, lower electrolyte leakage and lower accumulation of H2O2, in AT+light treatment. Experiments with inhibition of GO were also conducted in order to reduce photorespiration. These results show that plants silenced in APX4 exhibited greater tolerance to inhibition of catalase by a new redox homeostasis able to cope with the catalase inhibition. Further studies are needed to elucidate the mechanisms that APX4 plants have developed to provide better acclimation to catalase inhibition. / As enzimas Peroxidase do ascorbato (APX) e catalase (CAT) são as mais importantes na remoção de H2O2 nas células vegetais. Ambas estão presentes nos peroxissomos. Em elevada fotorrespiração a quantidade de H2O2 nos peroxissomos é aumentada, em função de uma maior atividade de glicolato oxidase (GO), enzima produtora de H2O2. A catalase se destaca na remoção de H2O2 por possuir um Km elevado e ser capaz de eliminar maiores concentrações de H2O2 do que a APX. A importância da isoforma peroxissomal da APX no metabolismo antioxidante das células vegetais ainda é desconhecida. Há poucos trabalhos na literatura que estudam a papel da APXp. Para tanto, realizamos esse trabalho com o objetivo de avaliar o efeito da inibição da catalase em plantas de arroz (APX4) silenciadas em uma isoforma peroxissomal de APX. Inicialmente foi realizada uma caracterização de três linhagens de APX4 (Lg, Lh e Lj), com o objetivo de selecionar uma para estudos futuros. Foi observado uma menor atividade de GO e um leve aumento na fotossíntese liquida nas três linhagens mutantes. Com base em parâmetros bioquímicos, fisiológicos e fotossintéticos, foi escolhida a linhagem APX4-Lg. O silenciamento da APX4 resultou em supressão da expressão da outra isoforma peroxissomal, APX3. Posteriormente, foram realizados experimentos inibindo a catalase com aminotriazol (AT) em plantas NT (não transformadas) e APX4. As plantas mutantes tiveram um menor vazamento de eletrólitos do que as NT, com a inibição da catalase. A síntese de GSH (glutationa reduzida), na ausência de CAT, foi maior nas plantas NT. Com a inibição da CAT a atividade de GPX (peroxidade da glutationa) aumentou mais nas plantas APX4. Com o objetivo de induzir uma maior efeito da ausência de CAT, foi realizado um experimento combinando inibição CAT com luz (1000 μmol fótons m-2s-1), em segmentos. Semelhante ao resultados encontrados em plantas, as plantas APX4 sofreram menos com a inibição da catalase. Visto que no tratamento de AT+luz as plantas mutantes, comparadas com as NT, apresentaram maior Fv/Fm, menor vazamento de eletrólitos e menor acumulação de H2O2. Experimentos com inibição de GO também foram conduzidos, com o intuito de reduzir a fotorrespiração. Estes resultados mostram que as plantas silenciadas em APX4 apresentam uma maior tolerância a inibição da catalase através de uma nova homeostase redox capaz de lidar melhor com ausência de catalase. Estudos posteriores são necessários para elucidar quais mecanismos as plantas APX4 desenvolveram para conferir a elas uma melhor aclimatação a ausência de catalase.