INTRODUÇÃO: As alterações cromossômicas são a primeira suspeita etiológica em indivíduos com múltiplas anomalias congênitas, atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou deficiência cognitiva. Verifica-se que em alguns pacientes esse fenótipo está associado a alterações pigmentares como as manchas cutâneas. Porém, nem sempre o resultado do cariótipo em sangue periférico para esses pacientes revela alterações cromossômicas. Dessa forma, a análise cromossômica de outro tecido, como a cultura e cariotipagem dos fibroblastos da pele, torna-se importante para verificar a ocorrência de mosaicismo oculto que poderia explicar o fenótipo clínico. OBJETIVOS: Padronizar e implantar um protocolo para cultura de fibroblastos de pele humana, oriunda de manchas cutâneas de pacientes com atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou malformações. Estabelecer o método de cariotipagem molecular de fibroblastos em tecido epitelial e realizar a correlação com o fenótipo. MÉTODOS: Os pacientes foram provenientes do ambulatório de Genética do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (ICR-HCFMUSP). Foram realizados cariótipos de fibroblastos de pele de 15 pacientes com cariótipo de sangue periférico normal, portadores de manchas cutâneas associadas ao atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou malformações. A análise citogenética dos fibroblastos foi feita a partir de biópsia cutânea das manchas, seguida dos seguintes procedimentos: cultura de fibroblastos, processamento, cariotipagem por bandamento G e análise citogenética molecular. RESULTADOS: Dentre os 15 casos estudados, 8 apresentaram isocromosomo de 12p (síndrome de Pallister-Killian), 1 apresentou um mosaicismo sexual atípico e os outros 6 apresentaram resultado normal. CONCLUSÃO: A análise cromossômica de fibroblastos foi imprescindível para o diagnóstico de pacientes com manchas cutâneas associadas à múltiplas anomalias congênitas, atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou deficiência cognitiva. A abordagem diagnóstica adequada é fundamental para conduzir o tratamento de forma apropriada e para definir o prognóstico desses pacientes, sendo também imprescindível para a realização do aconselhamento genético / INTRODUCTION: Chromosomal aberrations are the first suspected etiology in individuals with multiple congenital anomalies, developmental delay and/or intellectual disability. This phenotype is sometimes associated with pigmentary skin anomalies. However, in some cases the peripheral blood cells karyotype is normal. Therefore, the cytogenetic analysis of other tissues such as culture and karyotyping of skin fibroblasts is important to verify the occurrence of cryptic mosaicism that may explain the clinical phenotype. OBJECTIVES: To standardize and set a protocol for culture of human skin fibroblasts. To perform molecular karyotyping of fibroblasts and establish the correlation with phenotype. METHODS: Patients were recruited from the outpatient clinic of the Genetics Unit of Instituto da Criança do Hospital das Clínicas d Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (ICR-HCFMUSP). The karyotypes of skin fibroblasts were performed in 15 patients with normal blood karyotype, presenting with pigmentary skin anomalies associated with developmental delay and/or malformations. The cytogenetic analysis of fibroblasts was made from skin biopsy of the spots, followed by fibroblast culture, processing, karyotyping by G-banding analysis and molecular cytogenetics. RESULTS: Among the 15 cases studied, 8 showed isochromosome 12p (Pallister-Killian syndrome), 1 had atypical sexual mosaicism and the other 6 had normal results. CONCLUSION: The cytogenetic analysis of skin fibroblasts is crucial for the diagnosis of patients with pigmentary skin anomalies associated with developmental delay and/or malformations. The proper diagnosis is fundamental for the appropriate treatment, to define prognosis for these patients and essential for the genetic counselling

O quelóide é um tumor fibroso benigno que ocorre durante a cicatrização da pele em indivíduos geneticamente predispostos. A cicatrização é um processo biológico complexo e depende da interação de diferentes estruturas teciduais e de um grande número de tipos celulares residentes e infiltrativos, que produzem citocinas. A interleucina 8 (IL-8), citocina pró-inflamatória, é super-expressa pelos fibroblastos durante o desenvolvimento do tecido de granulação, acelerando o processo de cicatrização. Como o quelóide resulta de uma reparação tecidual anormal após lesão da pele, o presente estudo teve por objetivo determinar a expressão dos receptores da IL-8, CXCR1 e CXCR2, e a capacidade proliferativa, pelo ciclo celular, dos fibroblastos queloideanos cultivados e extraídos ex vivo, por citometria de fluxo. Fibroblastos de cicatriz queloideana e de pele normal foram obtidos de 21 pacientes da raça negra, com idade variando entre 10 e 40 anos, de lesões com até 2 anos de evolução. Em nosso estudo constatamos expressão reduzida dos receptores para a IL-8, CXCR1(35,7%±11,2) e CXCR2 (27,8%±11,3), em fibroblastos de cicatriz queloideana cultivados, comparando com a pele normal (44,1±16,2 e 46,3±27,1 respectivamente). Entretanto, essa diferença só foi significante para o receptor CXCR2. A baixa expressão desses receptores poderia ser decorrente da atividade de metaloproteinases, que regulam a expressão de proteínas da superfície celular, através de clivagem enzimática, ou a capacidade reduzida de internalização e a reciclagem de receptores, mantida por filamentos de actina do citoesqueleto, que nos fibroblastos do quelóide estão diminuídos. Em relação ao ciclo celular de fibroblastos cultivados do quelóide e da pele normal, verificamos diferenças não significantes da capacidade de replicação (fase S do ciclo celular) e de apoptose. No quelóide observamos significante aumento de células na fase G2/M, indicando aumento da velocidade de divisão celular. Para confirmar esses achados estudamos o ciclo celular de fibroblastos extraídos ex vivo, da porção periférica e central do quelóide e da pele normal. Os fibroblastos da porção periférica apresentaram porcentagem significantemente maior de células com capacidade replicativa, fase S do ciclo (22,9% ± 11,6), em relação à porção central (4,7% ± 2,9) e à pele normal (6,8% ± 4,9), e maior velocidade de divisão celular, fase G2/M (18,6 ± 12,0), em relação à porção central (35,6 ± 7,0) e pele normal (32,3 ± 6,9). Verificamos que a porção central apresentou maior porcentagem de células em apoptose (7,0% ± 2,1), comparado à porção periférica (4,9% ± 1,9) e pele normal (2,0% ± 0,86). Esses dados indicam que as células da porção periférica do quelóide parecem ser responsáveis pela elevada taxa de proliferação, justificando o crescimento expansivo a partir das margens da cicatriz queloideana, com desenvolvimento de lesão semelhante a tumor, bem como a porção central ser responsável pela fibrose, contendo células quiescentes e apoptóticas. Esses resultados sugerem modulação diferencial das reações celulares através das vias de sinalização para proliferação ou morte celular programada. Neste sentido, a baixa expressão dos receptores da IL-8, CXCR1 e principalmente de CXCR2, nos fibroblastos do quelóide sugere capacidade reduzida da IL-8 em promover cicatrização acelerada. A baixa atividade da IL-8 sobre os fibroblastos queloideanos estaria promovendo desregulação da resposta inflamatória e com isso atraindo novas células inflamatórias para o local e produzindo sinais alterados, como grande produção da citocina TGFβ. Essa desregulação do processo de cicatrização, com alteração de citocinas e da matriz extracelular, poderia ser responsável pelas duas populações de fibroblastos, uma proliferativa na periferia e outra quiescente e apoptótica na porção central. Finalizando, podemos concluir que nossos resultados correspondem às alterações histológicas e clínicas do quelóide que se expande nos limites da lesão. / A keloid is a benign fibrous tumor that occurs during wound healing in genetically predisposed individuals. Healing is a complex biological process and depends on the interaction of different tissue structures and a great number of resident and infiltrative cell types. The interleukin-8 (IL-8), a proinflammatory chemokine, showed higher expression in fibroblasts during the development of the granulation tissue, promoting more rapid tissue maturation. Since keloids result from abnormal wound healing, the objective of the present study was to determine the expression of CXCR1 and CXCR2, IL-8 receptors, and the proliferation capacity, throughout the cell cycle, of the keloid fibroblasts extracted ex vivo and those submitted to in vitro cultivation. Normal skin and keloid scar fibroblasts were obtained from 21 African-Brazilian patients, aged from 10 to 40 years, whose lesions had evolved for no longer than 2 years. Expression of receptors and the cell cycle was assessed by flow cytometry. We showed lower expression of the CXCR1 (35,7% ± 11,2) and CXCR2 (27,8%±11,3) in keloid fibroblasts, when compared with normal skin (44,1 ± 16,2 e 46,3 ± 27,1 respectively), but the difference was not significant for the CXCR1 receptor. This lower expression of IL-8 receptors in keloid fibroblasts could be due to the action of metalloproteinases, which regulate the surface protein enzymatically, or fibroblastic cytoskeleton conditions, which influence receptor internalization and recycling. The distribution assessment of cell cycle phases of fibroblasts cultivated from keloid scars and normal skin did not show significant difference in replication capacity and apoptosis. The keloid fibroblasts presented a significantly higher proportion of cells in the G2/M phase, suggesting higher rate of cell division. To confirm these results we studied the cell cycle of fibroblasts extracted ex vivo, now separated by central and peripheral portions of keloid and normal skin. The peripheral fibroblasts showed significant high cell proportions in phase S (22,9% ± 11,6), compared with the central portion (4,7% ± 2,9) and normal skin (6,8% ± 4,9), and higher cells in division phase G2/M (18,6% ± 12,0), compared with the central portion (35,6% ± 7,0) and normal skin (32,3% ± 6,9). The central portion showed higher proportion of apoptosis (7,0% ± 2,1), compared with the peripheral portion (4,9% ± 1,9) and normal skin (2,0% ± 0,86). These results suggest that the keloid peripheral cells could be responsible for the proliferation rate, justifying the expansive keloid growth at the borders of the keloid scar, in a similar fashion to tumor development and the central portion being responsible for fibrosis, with quiescent and apoptotic cells. These results suggest a differentiated modulation of cell reactions by signal pathways for programmed cellular proliferation or death. In this sense, the low expression of the IL-8 receptors CXCR1 and CXCR2 in keloid fibroblasts suggests a diminished capacity of IL-8 to promote accelerated healing. This low expression of IL-8 receptors in keloid fibroblasts could promote the dysregulation of the inflammatory response and thus attract more inflammatory cells to the site, producing different signals, such as a high production of the TGFβ cytokine. This dysregulation of the healing process, with changed cytokine and extracellular matrix expression, could be responsible for two different cell populations of fibroblasts, one proliferation at the periphery and the other fibrotic at the center of the lesion, with apoptotic and quiescent cells. Finally, we conclude that our results correspond to the histological and clinical changes of keloids that grow beyond the wound boundaries.

Os tecidos pulpar e periodontal são frequentemente agredidos por fatores ambientais como calor, trauma mecânico e micro-organismos, sendo estes considerados o fator etiológico principal das periodontopatias e periapicopatias. Dentre as células residentes desses tecidos, especial atenção tem sido dada ao papel dos fibroblastos no desenvolvimento da resposta imune. Fibroblastos são células que respondem à estímulos microbianos e existem evidências do papel de receptores do tipo Toll (TLR) no reconhecimento desses estímulos. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o reconhecimento de Candida albicans por fibroblastos gengivais e pulpares. Para tal, fibroblastos isolados a partir de tecido gengival e pulpar de camundongos do grupo controle e deficientes de TLR2, CD14 e MyD88 foram avaliados quanto à expressão de TLRs e moléculas de superfície, resposta proliferativa e produção de citocinas (TGF-β, IL-1β, TNF-α, IL-13 e IL-6), após a estimulação com agonistas de TLR2, TLR4 e C. albicans. Fibroblastos gengivais e pulpares, apesar de provenientes de tecidos diferentes, apresentaram características morfológicas semelhantes. Contudo, a cinética de crescimento dos fibroblastos gengivais deficientes de MyD88 foi mais lenta, e fibroblastos pulpares demoraram mais tempo para surgir a partir dos fragmentos de tecido. A ausência de TLR2 e da molécula adaptadora MyD88 não afetaram a produção de colágeno Tipo I pelos fibroblastos gengivais. Entretanto, fibroblastos deficientes de CD14 apresentaram baixa produção de colágeno. Ademais, os fibroblastos gengivais expressaram TLR2, TLR3, TLR4, assim como as moléculas de adesão ICAM-1 e CD44. A ausência de TLR2 e CD14 interferiu na resposta proliferativa de fibroblastos gengivais e pulpares, respectivamente. O reconhecimento de C. albicans por fibroblastos gengivais e pulpares modulou a produção das citocinas. A produção de TNF-α foi dependente da sinalização via MyD88, CD14 e TLR2, enquanto que a produção de IL-1β e IL-13 foi dependente de TLR2. / Pulpal and periapical tissue are frequently injured by heat, mechanical trauma and microorganisms, which are considered the main etiological factor of periodontal and endodontic diseases. Among these tissue resident cells, special attention has been given to fibroblasts in the immune response. Fibroblasts are cells that recognize pathogens through Toll like receptors (TLR). The aim of this study was to evaluate the recognition of Candida albicans by pulpal and gingival fibroblasts from TLR2, CD14, MyD88 knockout mice and control group mice. The results were analyzed concerning the expression of TLR(s) and surface molecules, proliferative response and citokynes production (TGF-β, IL-1β, TNF-α, IL-13 e IL-6) after the cells stimulation with TLR2, TLR4 and C.albicans agonists. Gingival and Pulpal fibroblasts, even isolated from different tissue, showed morphological similarities; however, gingival fibroblast deficient of MyD88 show lower proliferative response and pulpa l fibroblasts needed more time to detach from tissue fragments. The production of Type I collagen was affected in gingival cells deficient of CD14. Gingival fibroblasts expressed TLR2, TLR3, TLR4, and the adhesion molecules (ICAM-1 and CD44). The absence of TLR2 and CD14 interfered with the proliferative response of pulpal and gingival fibroblasts, respectively. The recognition of C. albicans by gingival and pulpal fibroblasts modulated the citokynes production. TNF-α production after the recognition of C. albicans was dependent from MyD88, CD14 and TLR2 molecules, whereas the production of IL-1β and IL-13 was dependent of TLR2.

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As E3 ligases MuRF1 e MuRF2 tem sido descritas com importantes papéis na estabilidade de proteínas da estrutura muscular, além de contribuírem para marcação de proteínas que devem ser degradadas. Nosso objetivo foi verificar o papel de MuRF1 e MuRF2 na diferenciação de células miogênicas, além de caracterizar seu papel em fibroblastos. Foram utilizados animais nocautes para MuRF1 e MuRF2 e verificamos o processo de regeneração 28 dias após a injeção de cardiotoxina no tibial anterior. Posteriormente, através de análises in vitro, realizamos o silenciamento de MuRF1 e MuRF2 utilizando RNAis e verificamos a capacidade de diferenciação de células miogênicas. Os resultados mostram que os animais nocautes apresentaram aumento de marcadores adipogênicos. Além disso, as células silenciadas com RNAis apresentaram queda na formação de miotubos e um aumento em marcadores adipogênicos. Em fibroblastos, identificamos as E3 ligases MuRF1 e MuRF2 e o RNAi nessas células prejudicou o processo de migração. Esses resultados realçam a importância de MuRF1 e MuRF2 na diferenciação miogênica além de sugerir um importante papel para a formação correta do citoesqueleto durante a migração celular. / The E3 ligases MuRF1 and MuRF2 has been proposed to act as a linker for myofibril machinery, also by acting as an Atrogene during muscle wasting. Our aim was to verify the role of MuRF1 and MuRF2 during the myogenic differentiation of skeletal muscle and its role on skeletal muscle fibroblasts. We used MuRF1 and MuRF2 knockout mice and analyzed the regenerative process. Using in vitro analyzes, we silenced MuRF1 and MuRF2 expression by siRNA. Our results suggest that knockout mice had an important impairment on skeletal muscle regeneration, showing positive staining to white adipocytes. Moreover, siRNA on myogenic primary cultures showed impaired myotube formation and increase the expression of adipogenic markers. Another interesting finding was that skeletal muscle fibroblasts can express MuRF1 and MuRF2, and its silencing by siRNA impairs the migration capacity of fibroblasts. These results demonstrate the importance of MuRF1 and MuRF2 during myogenic differentiation of skeletal muscle and an important role at intracellular coordination of stress fiber formation of skeletal muscle fibroblasts.

Os fibroblastos são atualmente considerados componentes ativos da resposta imune porque estas células expressam receptores do tipo Toll (TLRs), são capazes de reconhecer padrões moleculares associados a patógenos e mediar a produção de citocinas e quimiocinas durante a inflamação. A resposta imune inata do hospedeiro a lipopolissacarídeos (LPS) de Porphyromonas gingivalis é incomum, já que diferentes estudos relataram que este LPS pode ser um agonista para TLR2 e um antagonista ou agonista para TLR4. A sinalização por TLRs envolve proteínas adaptadoras, como MyD88 e TRAM, que são necessárias para a transdução do sinal até o núcleo para que ocorra a transcrição de RNAm para os mediadores da inflamação. O objetivo deste estudo foi investigar e comparar se a sinalização por meio de TLR2 ou TLR4 poderia afetar a produção de Interleucina (IL)-6, IL-8 e CXCL12 em fibroblastos humanos gengivais (HGF) e fibroblastos humanos de ligamento periodontal (HPLF). Objetivamos também comparar a participação das moléculas adaptadoras MyD88 e TRAM na expressão do RNAm dos mesmos alvos. Material e Métodos: Após silenciamento mediado por RNA de interferência de TLR2, TLR4, MyD88 ou TRAM, confirmado por RT-qPCR, HGF e HPLF, provenientes de três dadores voluntários, foram estimulados com LPS de Porphyromonas gingivalis ou com dois agonistas sintéticos de TLR2, Pam2CSK4 e Pam3CSK4, por 6 horas. A expressão do RNAm e das proteínas IL-6, IL-8, e CXCL12 foram avaliados por qRT-PCR e ELISA, respectivamente. Resultados: A expressão do RNAm de TLR2 foi regulada em HGF, mas não em HPLF por todos os estímulos. O silenciamento de TLR2 diminuiu IL-6 e IL-8 em resposta ao LPS de P. gingivalis, Pam2CSK4 e Pam3CSK4 de maneira semelhante, em ambas as subpopulações de fibroblastos (p<0,05). Por outro lado, a produção de CXCL12 permaneceu inalterada pelo silenciamento de TLR2 ou TLR4. No caso do silenciamento de MyD88 e TRAM, em ambos os subtipos de fibroblastos, o RNAm para os mesmos alvos também teve sua expressão diminuída (p<0,05). Já a expressão constitutiva de CXCL12 foi aumentada com o silenciamento de MyD88 ou TRAM (p<0,05). Conclusão: Estes resultados sugerem que a sinalização por meio de TLR2, por fibroblastos, as células residentes mais numerosas em gengiva e ligamento periodontal, pode controlar a produção de IL-6 e IL-8, que por sua vez contribuem para a patogênese periodontal, mas não interfere nos níveis de CXCL12, uma quimiocina importante no processo de reparação. Concluímos também que o silenciamento de MyD88 ou TRAM é capaz de diminuir o aumento da transcrição gênica de IL-6 e IL-8 provocado por LPS de P. gingivalis, embora a expressão constitutiva de CXCL12 seja regulada positivamente. / Fibroblasts are now seen as active components of the immune response because these cells express Toll-like receptors (TLRs), recognize pathogen associated molecular patterns and mediate the production of cytokines and chemokines during inflammation. The innate host response to lipopolysaccharide (LPS) from Porphyromonas gingivalis is unusual in that different studies have reported that it can be an agonist for TLR2 and an antagonist or agonist for TLR4. TLRs signaling pathway involves adaptor proteins, like MyD88 and TRAM, which are crucial for signal transduction to the nucleus and mRNA expression of inflammatory mediators. This study investigated and compared whether signaling through TLR2 or TLR4 could affect the production of IL-6, IL-8 and CXCL12 in both human gingival fibroblasts (HGF) and human periodontal ligament fibroblasts (HPLF). The role of MyD88 and TRAM on the mRNA expression of the same targets were also evaluated. Methods: After small interfering RNA-mediated silencing of TLR2, TLR4, MyD88 or TRAM, confirmed by RT-qPCR, HGF and HPLF from three volunteer donors were stimulated with P. gingivalis LPS or with two synthetic ligands of TLR2, Pam2CSK4 and Pam3CSK4, for 6 hours. IL-6, IL-8, and CXCL12 mRNA expression and protein production were evaluated by RT-qPCR and ELISA, respectively. Results: TLR2 mRNA expression was upregulated in HGF but not in HPLF by all the stimuli applied. Knockdown of TLR2 decreased IL-6 and IL-8 in response to P. gingivalis LPS, Pam2CSK4 and Pam3CSK4 in a similar manner in both fibroblasts subpopulations. Conversely, CXCL12 remained unchanged by TLR2 or TLR4 silencing. For MyD88 or TRAM silencing, IL-6 and IL-8 mRNA were also decreased, in both fibroblasts subtypes. However CXCL12 mRNA constitutive expression was increased by siMyD88 or siTRAM. Conclusion: These results suggest that signaling through TLR2 by fibroblasts, the most numerous resident cells in gingiva and periodontal ligament, may control the production of IL-6 and IL-8, which in turn contribute to periodontal pathogenesis, but does not interfere with CXCL12 levels, an important chemokine in the repair process. Also, MyD88 or TRAM knockdown may decrease the IL-6 and IL-8 LPS-induced upregulation and increase the constitutive CXCL12 mRNA.

Um dos principais problemas em Periodontia refere-se à redução microbiana subgengival e tornar a superfície radicular biocompatível, a qual pode ser realizada por raspagem e alisamento radicular, tratamentos químicos, laser em alta intensidade ou terapia fotodinâmica. O objetivo dessa pesquisa foi de comparar os efeitos de raízes humanas tratadas por diferentes técnicas como terapia fotodinâmica, Er:YAG, Nd:YAG, raspagem e alisamento radicular e ácido cítrico + tetraciclina, na proliferação de fibroblastos gengivais (FGH) e células de granulação óssea (GO) humanos. Para tal, foram preparados 45 fragmentos radiculares de 25 dentes extraídos por razões periodontais e que foram divididos em 6 grupos: controle com células (CC), controle com fragmento raspado (CD), laser de Er:YAG (ER - 60mJ, 10pps, varredura, distância focal 12mm, 10Hz, 10s, 2940nm), laser de Nd:YAG (ND - 0,5W, contato, 15Hz, 10s, 1640nm), terapia fotodinâmica (PDT - laser de InGaAIP - 30mW, distância focal &#x2264;1mm, 45J/cm2, 30s, 660nm + azul de toluidina O), e ácido cítrico com tetraciclina (AC). As células foram cultivadas em meio DMEM com 10% de soro fetal bovino, 1% de solução antibiótica e 0,5% de anfotericina B. Foram plaqueadas 2 x 103 células, na sexta passagem, em placas de 96 poços. Após 24h o meio foi substituído por meio condicionado pelos fragmentos tratados, com exceção do grupo controle de células (CC), que recebeu meio convencional. A viabilidade celular foi medida através do teste do MTT nos períodos de 24, 48, 72 e 96h. Os dados em forma de densidade óptica e porcentagem de crescimento foram analisados estatisticamente pelo teste ANOVA a três critérios complementado pelo teste de Tukey a um nível de significância de 5% (p<0,05). Não houve diferenças entre os grupos controle CC e CD (p>0,05). Para as células FGH em relação ao controle, houve maior estímulo após 48 e 72h no grupo PDT, após 72h no grupo ND, e após72 e 96h no grupo AC (p<0,05). Para as células GO, em relação ao controle, houve maior crescimento apenas no período de 72h para o grupo ND (p<0,05). Ao comparar os grupos experimentais e ambos os tipos celulares, após transformação em porcentagem de crescimento, houve diferença estatisticamente significante para o grupo ER nos períodos de 72 e 96h para as células FGH (p<0,05). Concluiu-se que todos os tratamentos, com exceção da raspagem e alisamento radicular, estimularam a proliferação de fibroblastos gengivais humanos e somente o tratamento com Nd:YAG estimulou a proliferação de células de granulação óssea humana. / One of the main problems in Periodontics is how to eliminate the subgingival bacteria and to convert the root surface in a biocompatible environment. These results can be achieved by scaling and root planning, chemical treatment, high energy lasers or photodynamic therapy. The aim of this study was to compare the effects of human root fragments treated by different techniques as photodynamic therapy, Er:YAG, Nd:YAG, scaling and root planning and citric acid plus tetracycline on proliferation of human gingival fibroblasts (HGF) and human osseous granulation cells (OG). Forty-five root fragments from 25 human teeth extracted by periodontal indication were divided in six groups: control with cells (CC), scaled fragment control (SC), Er:YAG laser (ER - 60mJ, 10pps, scanning, focal distance 12mm, 10Hz, 10s, 2940nm), Nd:YAG laser (ND 0.5W, contact, 15Hz, 10s, 1640nm), fhotodynamic therapy (PDT InGaAIP, 30mW, 45J/cm2,30s, 660nm, toluidine blue O), citric acid plus tetracycline (CA). The cells were grown in DMEM medium with 10% of bovine fetal serum, 1% of antibiotic solution and 0.5% amphotericin B. In 96-weIl plates 2 x 103 cells in the sixth passage were plated. After 24h the medium was replaced by medium conditioned by the treated fragments with exception of cell control group (CC) which received regular medium. Cell viability was measured by MTT test at 24, 48, 72 and 96h. Data was described in optic density and percentage of growth and was analyzed by ANOVA test complemented by Tukeys test at a significance level of 5% (p<0.05). There was no statistical differences between control groups CC and SC (p>0.05). For HGF cells in relation to control, there was a higher growth after 48h and 72h at PDT group, after 72h at ND group, after 72h and 96h at CA group (p<0.05). For OG cells in relation to control, there was a higher growth only at 72h-period at ND group (p<0.05). After transformation in percentage of growth and comparison among experimental groups and both cell types, there was a statistical significant difference at ER group at 72h and 96h-period (p<0.05). It was concluded that all treatments but scaling and root planning stimulated the proliferation of human gingival fibroblasts and only the Nd:YAG treatment stimulated the proliferation of human osseous granulation cells.

Os hormônios tireoidianos exercem um reconhecido e potente efeito lipolítico no Tecido Adiposo Branco (TAB); no entanto pouco se conhece acerca dos mecanismos moleculares envolvidos nessas ações. Sabe-se que os principais efetores da ação lipolítica nesse tecido são a lipase hormônio sensível (LHS) e a lipase dos triglicerídeos específica dos adipócitos (ATGL), as quais hidrolisam os triglicérides em ácidos graxos e glicerol. Outros componentes envolvidos na atividade lipolítica são os receptores beta adrenérgicos, que ao reconhecerem os seus ligantes, elevam o conteúdo de AMPc intracelular, com subseqüente aumento da atividade da PKA, e as perilipinas, proteínas que envolvem a gota de gordura, formando uma barreira protetora contra a ação da LHS e ATGL, de modo que precisa ser hidrolisada para que a LHS e ATGL possam exercer seu efeito lipolítico. Considerando a importância do tecido adiposo na homeostase energética e que as ações lipolíticas dos HT têm sido pouco exploradas, é objetivo deste estudo e investigar se os HT interferem com a expressão das mesmas. / Thyroid hormones exert a recognized and potent lipolytic effect in white adipose tissue (TAB), yet little is known about the molecular mechanisms involved in these actions. It is known that the main effectors of the lipolytic action in this tissue is hormone-sensitive lipase (HSL) and lipase specific adipocyte triglycerides (ATGL), which hydrolyze triglycerides into fatty acids and glycerol. Other components involved in the lipolytic activity are the beta adrenergic receptors, which recognize their ligands to elevate intracellular cAMP content, with subsequent increased activity of PKA, and perilipin, proteins involving the fat droplet, forming a protective barrier against the action of HSL and ATGL, so that must be hydrolyzed to the HSL and ATGL lipolytic may exert its effect. Considering the importance of body fat for energy homeostasis and that the lipolytic actions of HT have been little explored, and purpose of this study is to investigate whether HT interfere with the expression of the same.

O objetivo deste estudo foi investigar adesão, proliferação, atividade de fosfatase alcalina e de síntese de matriz mineralizada por células derivadas da granulação óssea (células GO-1) e fibroblastos gengivais humanos (FGH-1) em discos de titânio com diferentes tratamentos de superfícies. Discos de titânio comercialmente puro grau IV foram divididos em 4 grupos de acordo com o tratamento de superfície: (1) discos usinados L (controle); (2) discos usinados seguido de jateamento abrasivo (JATO); (3) discos usinados, jateados e tratados por subtração ácida (superfície NeoPoros NP); (4) discos com tratamento superficial para melhora da hidrofilia (superfície Acqua - ACQ). A microtopografia de superfície dos diferentes tipos de disco de titânio foi avaliada por meio de MEV. A composição química dos discos de titânio de superfícies L, JATO, NP e ACQ foi analisada por espectrometria de energia dispersiva de raios-X (EDS). Para determinar a influência dos diferentes tratamentos de superfície sobre a adesão de células de linhagens fibroblásticas gengivais e osteoblásticas, foram cultivadas células GO-1 e FGH-1 sobre os discos de titânio dos diferentes grupos e as células aderidas foram avaliados por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV) após 24h (adesão) e 48 h (proliferação). No ensaio de mineralização os discos de titânio foram corados com vermelho de alizarina para evidenciação dos nódulos de mineralização. Para avaliação da atividade de fosfatase alcalina, as células FGH-1 e GO-1 foram plaqueadas sobre discos de titânio, a atividade da FA foi observada nas células lisadas usando 25 &#x3BC;l da amostra em placa de 96 poços adicionado com 200 &#x3BC;L de fosfato p-nitrofenol (pNPP) e determinada em espectofotômetro. Não houve diferenças entre os grupos para os parâmetros de rugosidade encontrados nas amostras, com exceção do parâmetro Rsk(asimetria), onde diferenças significantes foram observadas do grupo L em relação aos grupos JATO, NP e ACQ (p< 0.05. Os implantes de superfície L e NP apresentaram apenas Ti, a superfície JATO apresentou, além do Titânio, as substâncias Oxigênio e Alumínio enquanto na superfície ACQ foram observados Titânio, Sódio e Potássio. No período de 24 horas após o cultivo celular, houve maior proliferação de células FGH sobre as superfícies L (89,43% ± 9,13;) e JATO (100%), neste período, observou-se que 100% das superfícies JATO e ACQ estavam recobertas por células GO. Apos 48h diferenças significantes entre o percentual de área recoberta por células FGH nas superfícies JATO comparativamente às superfícies NP e ACQ e, para as células GO, entre as superfícies NP comparativamente às superfícies JATO e ACQ. Houve maior percentual de área recoberta pelas células GO do que pelas células FGH. Houve formação de nódulos mineralizados em todas as superfícies, análise comparativa mostrou diferenças estatisticamente significantes para as células GO cultivadas em DMEM sobre as superficies L (31,45% ± 1,51%) e ACQ (54,94% ± 4,80%). A atividade de fosfatase alcalina foi maior em discos com superfície Lisa e hidrófilica(ACQ). Esses resultados sugerem que todas as superfícies favorecem a adesão e proliferação de fibroblastos gengivais e células osteoblásticas humanas. Superfícies moderadamente rugosas favorecem a maior adesão e proliferação de células osteoblásticas, assim como maior atividade de mineralização in vitro. / The objective of this study was to investigate adhesion, proliferation, alkaline phosphatase activity and matrix synthesis mineralized by cells derived from the bone granulation (GO cells) and human gingival fibroblasts (HGF) in titanium disks with different surface treatment. Titanium discs commercially pure grade IV were used, divided into 4 groups according to the surface treatment: (1) machined discs - L (control); (2) machined discs followed by abrasive blasting (JATO); (3) machined discs, sandblasted and treated by acid subtraction (Neoporos surface - NP); (4) disks with surface treatment to improve the hydrophilic (Acqua surface - ACQ). The surface microtopography of different types of titanium disk was evaluated by SEM. The chemical composition of the surfaces of titanium disks, L, JET, NP and ACQ was analyzed by energy dispersive X-ray spectrometry (EDS). To determine the influence of different surface treatments on the cell adhesion of gingival fibroblast and osteoblast lines were cultured GO-1 and FGH-1 cells on titanium discs of different groups and the adhered cells were assessed by electron microscopy (SEM) after 24 (adherence) and 48 h (proliferation). To test the mineralization titanium disks were stained with alizarin red for disclosure of mineralization nodules. To evaluate the alkaline phosphatase activity, the FGH-1 and GO-1 cells were plated on titanium disks, AP activity was observed in cells lysed using 25 &#x3BC;l of sample in a 96 well plate with 200 &#x3BC;l added phosphate p nitrophenol (pNPP) and determined in spectrophotometer. There were no differences between groups for the roughness parameters found in the samples, except for the parameter Rsk(asimetry) where significant differences were observed in the group L compared to JATO groups, NP and ACQ (p <0.05). The L and NP surface implants had only Ti, JATO surface showed, in addition to titanium, oxygen and the substances aluminum, while the ACQ surface were observed titanium, sodium and potassium. Within 24 hours after cell culturing, there was a greater proliferation of FGH on the cell surface L (89.43 ± 9.13%;) and JATO (100%), in this period, it was observed that 100% of the surfaces JATO and ACQ were covered by GO cells. After 48 hours there were significant differences between the percentage of area covered by FGH cells in JATO surfaces compared to NP surfaces and ACQ, and for GO cells, between NP surfaces compared with the JATO and ACQ surfaces. There was a higher percentage of area covered by GO cells than by FGH cells. There mineralized nodule formation on all surfaces, comparative analysis revealed statistically significant differences for the GO cells cultured in DMEM on the surfaces L (31.45% ± 1.51%) and ACQ (54.94% ± 4.80% ). Alkaline phosphatase activity was higher in discs with a smooth and hydrophilic surfaces (ACQ). These results suggest that all surfaces to promote adhesion and proliferation of gingival fibroblasts and human osteoblastic cells. Moderately rough surfaces leads to high adhesion and proliferation of osteoblast cells, as well as higher mineralization activity in vitro.

O excesso de tecido cicatricial (quelóides e cicatrizes hipertróficas) é um defeito do processo de cicatrização das feridas, caracterizado por um aumento na produção da matriz extracelular. Neste estudo, fibroblastos dérmicos humanos tratados com 50 <font face=\"symbol\">mM verapamil apresentaram discreta modificação na distribuição dos microfilamentos e alteraram sua morfologia de fusiformes para estrelados/arredondados. Estes efeitos poderiam estar associados a baixos níveis de cálcio citosólico. Esta hipótese foi confirmada através marcação de fibroblastos tratados com calcium green. Observamos também, que o verapamil inibiu a proliferação celular em 64,4%, aumentou a secreção de MMP1 e diminuiu o colágeno sintetizado pelos fibroblastos, sem aparentes efeitos citotóxicos. O metabolismo celular do cálcio está aparentemente relacionado a produção da matriz extracelular e portanto as patologias hipertróficas da cicatrização (quelóides e cicatrizes hipertróficas) podem responder ao tratamento com bloqueadores do canal de cálcio (verapamil). / Excessive scar tissue (keloids and hypertrophic scars) is a defective wound healing process characterized by overproduction of extracellular matrix. In the present study human dermal fibroblasts treated with 50 <font face=\"symbol\">mM verapamil changed their normal spindle-shaped morphology to stellate/rounded and showed discrete reorganization of microfilaments We hypothesized that these effects would be associated to lower levels of cytosolic Ca2+. Indeed, short time loading with calcium green confirmed that verapamil-treated fibroblasts exhibited lower intracellular calcium levels. We also observed that verapamil decrease cellular proliferation by 64.4%, increase the secretion of MMP1 and decrease synthesis of collagen in cultured fibroblasts. This alterations induced by verapamil are not associated with cytotoxic effects. The cellular calcium metabolism appears to regulate extracellular matrix production and so those hypertrophic disorders of wound healing (keloids and hypertrophic scars) may respond to therapy with calcium antagonist drugs (verapamil).