AAbbssttrraacctt:: The mammalian organism is entirely dependent on ATP production by oxidative phosphorylation system (OXPHOS) on the inner mitochondrial membrane. OXPHOS is composed of respiratory chain complexes I-IV, ATP synthase and also include two electron transporters cytochrome c and coenzyme Q. Disorders of mitochondrial energy metabolism caused by OXPHOS defects are characterized by extreme heterogeneity of clinical symptoms, variability of tissues affected and the severity of the defect at the level of individual tissues. The mitochondrial disorders are not always clearly expressed at the level of available tissue or most easily available cultured fibroblasts and/or currently available methods are not capable to detect the defects on the fibroblasts level. The aim of this master thesis was to identify by biochemical methods, especially by high sensitive polarography, OXPHOS disorders in cultured fibroblasts. Cell lines from 10 patients with isolated (SURF21, SCO1 ND1, ND5) or combined defects of OXPHOS complexes whose biochemical defect was confirmed in muscle tissue as well as 14 patients with non- mitochondrial diseases (8 patients with Huntington disease, 6 patients with disorder of sulphur amino acids metabolism) were analysed. Furthermore impact of various cultivation conditions on OXPHOS...

This thesis investigates the effects of low oxygen culture conditions and fibroblast growth factor-2 (FGF2) on adult human dermal fibroblasts. It was previously shown that low oxygen and FGF2 culture conditions lead to an extension of proliferative lifespan, low-level activation of stem cell genes, and global transcriptional changes in adult human dermal fibroblasts. Additionally, an increased in vivo tissue regenerative response can be observed when human muscle-derived fibroblasts grown with FGF2 and low oxygen are implanted into mouse muscle injury, leading to a decrease in collagen deposition and scar formation and increase of functional skeletal muscle regeneration, including formation of Pax7+ muscle stem cells. These findings led to an analysis of key cellular oxygen sensors, hypoxia inducible factors (HIFs) and their role in this regenerative response. Directly linking these factors with the regenerative response, I have shown, with knockdown experiments, that HIF-2α is required for the increased proliferative capability and decreased senescence of human dermal fibroblasts (hDFs) induced by hypoxia. I have also determined that low oxygen causes an early and transient increase of HIF-1α and late and sustained increase of HIF-2α protein accompanied by increased nuclear translocation. Using overexpression and knockdown approaches via lent-virus, I determined that HIF-2α appears to modulate FGF2 signaling through the FGF receptors. First, under low oxygen conditions, exogenous FGF2 led to downregulation of endogenous FGF2, which can be mimicked by overexpression of HIF-2α. In ambient oxygen we didn't see this effect. Second, HIF-2α overexpression appears to lead to increases in FGFR1 phosphorylation and consequently increased ERK1/2 phosphorylation, and increases in the expression of heparan sulfate modifying enzymes (NDST1, NDST2, and EXTL2). Lastly, sustained supplementation with FGF2 in low oxygen inhibits receptor-mediated FGF2 signaling. To understand these effects at the transcriptional level, using microarray technology, we identified oxygen-mediated FGF2 effects on genes involved in cell survival and proliferation. Through bioinformatics analyses, I determined that genes involved in wound healing (extracellular matrix genes, adhesion molecules, cytokines) are upregulated in FGF2 treated fibroblasts grown under low oxygen. By utilizing a gain-of-function approach, we were able to assess the effects of altered HIF-2α activity on the expression of Oct4, Sox2, Nanog, Rex1, and Lin28 in adult hDFs. The results indicate that overexpression of the HIF-2α transcription factor increases Oct4 mRNA, but not Oct4 protein, levels, and had no effect on Nanog and Lin28 proteins. HIF-2α overexpression also mediated FGF2 induction of Sox2 and Rex1 proteins of higher molecular weight. This thesis expands our knowledge about effects of low oxygen and FGF2 on adult human dermal fibroblasts and explains in part, how FGF2 under low oxygen conditions may lead to increased proliferation, extended life span, regenerative competency and increased developmental plasticity of adult hDFs.

The eukaryotic nuclear processes such as replication, DNA damage repair (DDR) and transcription are highly dependent on the regulation of chromatin structure. The dynamic changes in chromatin accessibility are controlled by a class of chromatin-remodeling factors which form multimeric complexes and use ATP as the source of their helicase activity. In this study we have established a mouse embryonic fibroblast in vitro model with conditional inactivation of chromatin remodeling ATPase Smarca5 and used this powerful tool to test the regulation of cell cycle, proliferation and DDR signaling in conditions with low Smarca5 activity. Our results show that decreased dosages lead to decreased proliferation apparent already within few days post induction of Smarca5 deletion that is accompanied with decrease of cells in S and M phases of cell cycle, increasing cell ploidy and accelerated cell senescence. Additionally, the Smarca5 depleted cells upregulated many protein markers associated with DNA damage and cellular stress. Our results thus indicate that Smarca5 has indispensable roles during cell proliferation including in the maintenance of genome integrity during S phase of cell cycle.

Les dommages de l’ADN interfèrent avec sa réplication et sa transcription. Ils sont en général éliminés par des mécanismes de réparation, en particulier par la réparation par excision de nucléotides (NER). Ils peuvent également être tolérés grâce à la synthèse translésionnelle (TLS). Au cours de mon travail de thèse, nous avons étudié l’implication de la voie NER et de l’ADN polymérase η (Polη) associée à la TLS dans la réponse aux lésions de l’ADN induites par les rayons ultraviolet (UV) et par une drogue chimiothérapeutique, la doxorubicine. Les principales lésions induites par les rayons UV sont les dimères de pyrimidine cyclobutane (CPDs) et les pyrimidines (6-4) pyrimidones (6-4PPs) qui sont éliminées par la NER. Les données obtenues sur la formation de régions d’ADN simple brin et celles du cycle cellulaire suggèrent que les lésions 6-4PPs sont tolérées par un mécanisme de réparation post-réplicative dans des cellules XP-C déficientes en NER (xeroderma pigmentosum du groupe C). Dans un second temps, mon objectif a été de déterminer la contribution de Polη dans la prise en charge des lésions induites par les rayons UV dans les cellules XP-C. En effet, il est connu que Polη est responsable de la réplication des CPDs, mais l’absence de Polη dans des cellules proficientes en NER ne les rend pas hypersensibles aux rayons UV. De plus, il a été suggéré que Polη soit impliquée dans la TLS des 6-4PPs. En réprimant par shARN l’expression du gène codant Polη dans les cellules XP-C, j’ai réussi à établir la première lignée stable de fibroblastes humains déficients à la fois en NER et en Polη (XP-C/PolηKD). Cette réduction fonctionnelle de l’expression de Polη dans les cellules XP-C irradiées à faible dose d’UV a entraîné un arrêt irréversible du cycle cellulaire, la génération de cassures simple- et double-brin de l’ADN et une mortalité cellulaire significative. Ces résultats montrent un rôle crucial de Polη dans la survie des cellules déficientes en NER après irradiation UV et suggèrent que Polη puisse participer aussi à la TLS des 6-4PPs.Par ailleurs, nous avons montré que les cellules déficientes en NER ou en Polη ont été sensibilisées par un traitement à la doxorubicine indiquant que la NER et Polη participent également de la prise en charge des lésions induites par cet agent. Donc au cours de mon travail de thèse, j’ai mis en évidence des interconnexions complexes entre Polη et la voie NER en réponses à différents agents génotoxiques. / DNA damages interfere with replication and transcription. They are normally eliminated by repair mechanisms, such as nucleotide excision repair (NER). They can also be tolerated by translesion DNA synthesis (TLS). During my PhD work, we studied the involvement of NER pathway and DNA polymerase η (Polη) associated with TLS in response to DNA damages induced by ultraviolet (UV) and a chemotherapeutic drug, doxorubicin.The main lesions induced by UV irradiation are cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) and pyrimidine (6-4) pyrimidones (6-4PPs) which are removed by NER. Data on the formation of single-stranded DNA regions and those of the cell cycle suggest that 6-4PPs lesions are tolerated by a post-replication repair mechanism in XP-C cells (xeroderma pigmentosum group C, deficient in NER). In a second time, my goal was to determine the contribution of Polη in the tolerance of lesions induced by UV in XP-C cells. Indeed, it is known that Polη is responsible for the replication of CPDs, but in the absence of Polη, NER-proficient cells are not hypersensitive to UV rays. In addition, it was suggested that Polη is also involved in the TLS of 6-4PPs. By knocking down (KD) the expression of the gene encoding Polη in XP-C cells with a shRNA, we established the first stable line of human fibroblasts deficient in both NER and Polη (XP-C/PolηKD). This functional reduction in the expression of Polη in XP-C cells irradiated with low UVC dose resulted in an irreversible cell cycle arrest, the generation of single- and double-strand DNA breaks and significant cell death. These data demonstrate a crucial role for Polη in the survival of NER-deficient cells after UV irradiation and suggest that Polη can also participate in the TLS of 6-4PPs.In addition, we showed that cells deficient in NER or Polη are sensitized by treatment with doxorubicin indicating that NER and Polη also participate in the response of DNA damages induced by this agent.In conclusion, during my PhD work, we highlighted the complex interconnections between Polη and NER pathway in response to different genotoxic agents. / Os danos do DNA interferem com a sua replicação e transcrição. Eles são normalmente removidos por mecanismos de reparo, como o reparo por excisão de nucleotídeos (NER). Lesões não removidas também podem ser toleradas por processos específicos de síntese de translesão (TLS). Durante este trabalho de tese, estudamos a implicação da via NER e da DNA polimerase η (Polη), associada à TLS, na resposta aos danos no DNA provocados pela irradiação ultravioleta (UV) e por um agente quimioterápico, a doxorrubicina.As principais lesões provocadas pela luz UV são os dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs) e as pirimidinas (6-4) pirimidonas (6-4PPs) que são removidas pelo NER. Os resultados obtidos sobre a formação de regiões de DNA simples fita e os dados de ciclo celular indicam que as lesões 6-4PPs são toleradas por un mecanismo de reparo pós-replicativo em células XP-C deficientes em NER (xeroderma pigmentosum do grupo C). Em seguida, buscamos determinar a contribuição da Polη na tolerância de lesões UV em células XP-C. De fato, é conhecido que a Polη é responsável pela replicação dos CPDs, porém a ausência dessa em células proficientes em NER não as torna hypersensíveis à irradiação UV. Além disso, foi sugerido que Polη poderia estar envolvida na TLS dos 6-4PPs. A expressão do gene POLH, que codifica Polη, foi silenciada através de shRNA em células XP-C, sendo assim estabelecida a primeira linhagem estável de fibroblastos humanos deficientes em ambas proteínas XPC e Polη. Essa redução funcional da expressão de Polη em células XP-C provocou, em células irradiadas com doses baixas de luz UV, uma parada irreversível no ciclo celular, a formação de quebras no DNA (incluindo quebras simples e dupla fita) e morte celular. Esses resultados revelam um papel crucial da Polη na sobrevida das células deficientes em NER após irradiação UV e sugerem que Polη possa também participar da TLS de lesões tipo 6-4PP.Por outro lado, participei de trabalho no qual demonstramos que células deficientes em NER ou em Polη são sensibilizadas pelo tratamento com doxorrubicina, o que indica que o NER e a Polη participam da resposta aos danos induzidos por esse agente.Em conclusão, ao longo do meu trabalho de tese, eu coloquei em evidência interconexões complexas entre a Polη e o NER em resposta a diferentes agentes genotóxicos.

Neste trabalho tentamos traçar quais seriam os efeitos funcionais e de expressão gênica de mutações patogênicas no gene TCOF1 em células não embrionárias. A partir do estabelecimento de culturas celulares oriundas de periósteo facial de quatro pacientes portadores da síndrome de Treacher Collins (STC), obtivemos populações celulares com mais de 95% de marcação positiva para antígenos que caracterizam células de origem mesenquimal. Demonstramos que as células-tronco mesenquimais e fibroblastos provenientes de pacientes com STC apresentaram redução da expressão de TCOF1 de aproximadamente 31% quando comparados aos controles. Tal redução se mostrou compatível com a diminuição da expressão dos transcritos portadores de mutação patogênica observada no seqüenciamento do cDNA dos pacientes. Portanto, estes resultados sugerem que há degradação do transcrito mutado, que muito possivelmente deve ser regulada pelo mecanismo de non-sense mediated mRNA decay (NMD) e corroboram o modelo de haploinsuficiência da Treacle. Como o pico de expressão do gene Tcof1 é detectado durante o estágio embrionário de formação das células da crista neural e embriões de camundongos Tcof1+/- apresentam redução da proliferação das células neuroepiteliais, testamos se haveria alteração da capacidade proliferativa de células mesenquimais adultas com mutações no TCOF1. A análise das taxas de crescimento das culturas celulares provenientes de pacientes com STC se mostrou semelhante aos controles normais, indicando que menores níveis de transcritos do gene não interferem na capacidade proliferativa celular. Além disso, avaliamos o potencial de diferenciação óssea in vitro, mostrando que menores níveis de TCOF1 também não parecem influenciar a capacidade de diferenciação celular. Apesar de ainda não termos identificado um fenótipo celular, a deficiência de TCOF1 em células não embrionárias resulta na alteração da expressão gênica, já que a análise da expressão genômica das culturas celulares identificou uma série de genes diferencialmente expressos. Ademais, genes de parada do ciclo celular e apoptose com expressão aumentada em células embrionárias de camundongo Tcof1+/- não apresentaram expressão aumentada nas células humanas com mutações patogênicas no TCOF1, sugerindo que a via da p53 não está ativa nestas células não embrionárias. Dentre os genes diferencialmente expressos encontrados, o aumento dos transcritos de DAXX nas células-tronco mesenquimais com mutações patogênicas no TCOF1 poderia modular as funções da p53 nessas células, constituindo um bom alvo de investigações futuras para a elucidação da função do TCOF1 em células não embrionárias. Os resultados obtidos sugerem que deficiência de TCOF1 em células mesenquimais leva à ativação de outras vias de sinalização, cujo efeito funcional é ainda desconhecido. Quais seriam as funções e em quais vias celulares o TCOF1 agiria, são questões a serem elucidadas a respeito do papel do gene na fase adulta. / In this work we tried to outline the effects of functional and gene expression of pathogenic mutations in the gene TCOF1 in non-embryonic cells. From the establishment of facial periosteum derived cell culture of four patients with Treacher Collins syndrome (TCS), we obtained cell populations that are more than 95% positive for mesenchymal origin characteristic antigens. We demonstrated that mesenchymal stem cells and fibroblasts from patients with TCS showed reduction of approximately 31% in the TCOF1 expression when compared to controls. This reduction was consistent with the decrease in the expression of transcripts carrying the pathogenic mutations observed when sequencing the cDNA of the patients. Therefore, these results suggest that degradation of the mutated transcript occurs and it may possibly be governed by the mechanism of non-sense mediated mRNA decay (NMD), thus corroborating the Treacle haploinsufficiency model. As the peak of TCOF1 gene expression is detected during the embryonic stage of the formation of neural crest cells and Tcof1+/- mice embryos had shown reduction of neuroepithelium cells proliferation rate, we tested if there is a change in proliferative capacity of adult mesenchymal cells with mutations in TCOF1. The analysis of the growth rate of TCS patients cells was similar to normal controls, indicating that lower levels of transcripts of the gene does not interfere with cellular proliferative capacity. Furthermore, we evaluated the bone differentiation potential of these cells in vitro, showing that lower levels of TCOF1 also seem does not influence cell differentiation ability. Although a cellular phenotype has not yet been identified, deficiency of TCOF1 in non-embryonic cells results in gene expression change, since genomic analysis of the expression of cell cultures identified a number of differentially expressed genes. Furthermore, arresting cell cycle and apoptosis related genes with increased expression in embryonic cells of Tcof1+/- mice showed no increased expression in human cells with pathogenic mutations in TCOF1 suggesting that the p53 pathway is not active in these non-embryonic cells. Among the differentially expressed genes found, the increase of DAXX transcripts in mesenchymal stem cells with pathogenic mutations in TCOF1 could modulate the function of p53 in these cells, providing a good target for future investigations to elucidate the function of TCOF1 in non-embryonic cells. The results suggest that deficiency of TCOF1 in mesenchymal cells leads to activation of other signaling pathways, whose functional effects are still unknown. The functions and cellular pathways in which the TCOF1 act, are issues yet to be elucidated concerning the role of the gene during adulthood.

O conhecimento do potencial citotóxico, das reações histológicas e propriedades clínicas é imprescindível para a escolha do material na terapia pulpar de dentes decíduos. O estudo teve como objetivo avaliar o efeito de fármacos desta terapia quanto à citotoxicidade e distribuição in vitro de proteínas da matriz extracelular e do citoesqueleto de fibroblastos da polpa humana. Os grupos foram: pasta Guedes- Pinto, pasta Óxido de Zinco e Eugenol (OZE), Vitapex®, Calen® e Calen PMCC®. Os extratos brutos dos fármacos foram testados na concentração 0,2g/ml de meio DMEM/F12 (ASTM, 1992), nas diluições 10, 100 e 1000x. A citotoxicidade foi analisada pela viabilidade (24hs) e sobrevivência celular (24, 48 e 72hs) que se baseou na atividade mitocondrial de fibroblastos da polpa humana (FP5) pelo método de redução do MTT. O grupo controle foi utilizado como 100% de células viáveis. Os resultados foram submetidos à análise de variância, e teste de Tukey como contraste. O efeito dos fármacos na distribuição in vitro de proteínas da matriz extracelular (fibronectina, tenascina, colágeno I) e de citoesqueleto (vimentina) nas FP5 também foi analisado por imunofluorescência. Os resultados demonstraram que na viabilidade celular, as pastas Guedes-Pinto, pasta OZE, e Calen® foram mais citotóxicas que o grupo controle somente na maior concentração (p<0,05), sendo que esse efeito perdurou para a pasta OZE nas menores concentrações em relação ao grupo controle (p<0,05). As diferenças de citotoxicidade entre os fármacos só foram observadas na maior concentração, onde a pasta Guedes-Pinto teve maior efeito tóxico que a pasta Calen®, Calen PMCC® e Vitapex® (p<0,05), mas similar à pasta OZE. Na análise da sobrevivência celular em 72hs, todos os grupos apresentaram mesma capacidade proliferativa que o grupo controle em 24 e 48hs (p>0,05). As diferenças entre os fármacos foram observadas ao final do tempo experimental quando a Pasta Guedes-Pinto não manteve a mesma capacidade de proliferação celular que o grupo controle na maior e menor concentração (p<0,05). Na imunofluorescência, não houve diferença entre os grupos para a distribuição de proteínas da matriz extracelular e citoesqueleto nas FP5. A vimentina, proteína do citoesqueleto de células mesenquimais, encontrou-se distribuída na forma de filamentos ao longo do citoplasma celular. A fibronectina obteve marcação positiva, formando uma rede reticular no citoplasma. A tenascina e colágeno I apareceram como pequenos pontos (vesículas) distribuídos homogeneamente no citoplasma e na região perinuclear. Concluiu-se que, todos os fármacos estudados foram biocompatíveis em relação à citotoxicidade e à distribuição in vitro de proteínas da matriz extracelular e citoesqueleto de fibroblastos da polpa humana. / When electing a material to be used in deciduous pulp therapy, it is essential to acquire knowledge regarding the materials potential toxicity, histological reactions and clinical properties. This study aims at analyzing the effect of different drugs used in pulp therapy in relation to their cytotoxicity and in vitro protein distribution of extracellular matrix and cytoskeleton from human dental pulp fibroblasts. The groups were: Guedes-Pinto Paste, Zinc Oxide and Eugenol paste (ZOE), Vitapex®, Calen® e Calen PMCC®. The materials were tested using the following concentration: 0.2g/mL of culture medium (DMEM/F12) (ASTM, 1992), diluted in 10x, 100x and 1000x. The cytotoxicity was evaluated by cellular viability (24hs) and survival (24, 48 and 72hs), which was based on mitochondrial activity (MTT reduction test) of human dental pulp fibroblasts (FP5). The control group was considered to have 100% of viable cells. Data were submitted to variance analysis, using Tukey test as contrast. The drugs effect on in vitro expression of extracellular matrix proteins (fibronectin, tenascin, type I collagen) and cytoskeleton (vimentin) from FP5 were also evaluated using immnunofluorescence. The results demonstrated that, concerning cellular viability, Guedes-Pinto paste, ZOE paste, and Calen® were more cytotoxic than the control group only in their highest concentration (p<0.05), an effect observed for ZOE paste in all dilutions (p<0.05). Differences regarding cytotoxicity between groups were only observed in the highest concentration where Guedes-Pinto Paste was more toxic than Calen®, Calen PMCC® e Vitapex® (p<0.05), but was similar to ZOE paste (p>0.05). Cellular survival analysis after 72 h showed that all groups presented a similar proliferative capacity compared to the control group at 24 and 48h (p>0.05). Differences were only observed in the end of experimental period (72hs), when Guedes-Pinto paste did not maintain the same proliferative capacity than the control group in its lowest and highest concentrations (p<0.05). In immnunofluorescence tests, there was no difference between all groups for extracellular matrix and cytoskeleton proteins distribution from FP5. Vimentin, a protein from the cytoskeleton of mesenchymal cells, was distributed as filaments throughout the cytoplasm. Fibronectin was positively marked, forming a reticular net in the cytoplasm. Tenascin and Collagen I appeared punctually (as vesicles) and were homogeneously distributed in the cytoplasm and peri-nuclear region. It was concluded that all studied drugs investigated were biocompatible regarding cytotoxicity and in vitro distribution of extracellular matrix proteins and cytoskeleton proteins from human dental pulp fibroblasts.

O objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade in vitro e in vivo de embriões bovinos reconstruídos com oócitos enucleados em Metáfase II e núcleos de células somáticas (fibroblastos) fetais e adultas. Para tanto, oócitos de ovários colhidos em matadouro foram maturados in vitro por 17 horas e enucleados pela remoção do primeiro corpúsculo polar (CP) e da região do oolema contendo a placa metafásica. Como núcleo doador, foram utilizados fibroblastos de orelha de vaca da raça Nelore e de feto colhido em abatedouro. Para a reconstrução dos embriões, cada célula doadora de núcleo, após indução à G0, foi inserida sob a zona pelúcida de cada oócito enucleado e o complexo citoplasma receptor - núcleo doador (CCN) fundido e ativado por eletrofusão (2 pulsos de 4 KV/cm durante 20µs). Após ativação elétrica, cada CCN foi incubado em solução de ciclohexemide (10µg/ml) e citocalasina D (2,5µg/ml) por 1 hora e, em seguida, em solução de ciclohexemide (10µg/ml) por mais 4 horas. Os embriões reconstruídos e ativados, assim como os fecundados in vitro (controle), foram co-cultivados em monocamada de células da granulosa e TCM 199 acrescido de 10% de SFB por 7-9 dias. Após o co-cultivo por 7-9 dias, parte dos embriões (controle e reconstruídos) foi fixada e corada para determinação do número de células e parte transferida para receptoras. Um total de 668 embriões foram reconstruídos com célula fetal e 569 com fibroblasto adulto. Após eletrofusão, 212 embriões reconstruídos com célula fetal e 181 com célula adulta fundiram e 32 (15,1%) e 30 (16,6%) atingiram o estádio de blastocisto, respectivamente. O número médio de células dos blastocistos foi 129,3, 101,3 e 114,3, respectivamente, para célula fetal, adulta e embriões FIV (controle), não havendo diferença estatística significante entre os grupos (P<0,05). Após a transferência de 18 blastocistos de célula fetal e 21 de célula adulta, as taxas de prenhez aos 90 dias foram 16,7% (3) e 19% (4), respectivamente, não havendo diferença estatística significante entre os grupos (P<0,05). A primeira prenhez com célula fetal deu origem a um bezerro saudável, aos 290 dias, pesando 34kg. Uma das receptoras morreu aos 229 dias de gestação em conseqüência de hidroalantóide e outra abortou aos 252 dias. As prenhezes de embriões reconstruídos com célula adulta ainda estão em andamento. Estes resultados indicam que fibroblastos fetal e adulto podem ser usados como doadores de núcleo com semelhantes taxas de desenvolvimento in vitro e in vivo. / The aim of this study was to evaluate the in vitro and in vivo viability of bovine nuclear transferred embryos from metaphase II oocytes and fetal and adult fibroblasts. Oocytes from ovaries collected at slaughterhouse were matured in vitro for 17 hours and enucleated after aspiration of first polar body (PB) and small volume of cytoplasm containing metaphase plate. Fibroblasts from Nelore cow and foetus collected at slaughterhouse were used as nuclei donor. In Nuclear Transfer, each nuclei donor cell, after serum starvation, was inserted under the zona pellucida of the each enucleated oocyte and the enucleated oocyte- nuclei donor cell complexes were electrofused and activated (2 pulses of 4KV/cm for 20µs). After electrical activation, the couplets were incubated in TCM199 plus 10% FCS supplemented with cycloheximide (10µg/ml) and cytochalasin D (2.5µgml) for 1 hour and cycloheximide alone for further 4 hours. The activated reconstructed embryos, as well as IVF embryos (control group), were co-cultured with granulosa cells in TCM 199 + 10% FCS for 7–9 days. After co-cultured, part of embryos (control and reconstructed) was fixed and the number of cells counted and part was transferred into recipients. A total of 668 couplets were reconstructed from fetal and 569 from adult fibroblasts. After electrofusion, 212 (fetal cells) and 181 (adult cells) embryos got fused and 32 (15.1%) and 30 (16.6%) reached blastocyst stage, respectively. The blastocyst cell number means were 129.3, 101.3 and 114.3, respectively, for fetal, adult and IVF (control) embryos. There was no significant difference (P<0.05) in the number of cells of blastocysts among the groups. After transferring 18 (fetal cells) and 21 (adult cells) blastocysts, pregnancy rates at day 90 were 16.7% (3) and 19% (4), respectively. There was no significant difference (P<0.05) between pregnancy rates. The first pregnancy from fetal cells delivered a healthy male calf at day 290, weighting 34kg. One of the remaining recipients died with hydrallantois at day 229 and the other aborted at day 252. The pregnancies of adult cells reconstructed embryos are still in course. These results indicated that fetal and adult fibroblasts could be used as nuclei donor, with similar rates of in vitro and in vivo developments.

A matriz démica acelular, MDA, figura dentre os biomateriais que têm por objetivo restaurar defeitos mucogengivais. A correção de defeitos mucogengivais a partir de constituintes autógenos são os procedimentos mais comumente usados, no entanto, em decorrência da quantidade insuficiente de tecido doador, esses procedimentos se tornam limitados. Diante disso, o objetivo desse estudo foi avaliar, in vitro, diferentes aspectos relacionados ao cultivo prévio de fibroblastos gengivais humanos em MDA. Fibroblastos gengivais humanos foram cultivados pela técnica do explante a partir de amostras de tecido gengival queratinizado removido de três pacientes saudáveis. A MDA foi cultivada com esses fibroblastos por períodos de 14 e 21 dias para posterior análise dos eventos de: adesão celular, proliferação e viabilidade. Os resultados mostraram que em 7 dias, os fibroblastos estavam aderidos, espraiados e dispersos sobre a superfície externa da MDA, em 14 dias formavam monocamada de células de morfologia alongada e quiescentes (Ki-67 negativos) em sua maioria, sendo apenas ocasionalmente observadas no interior da MDA. Em 21 dias a monocamada exibia menor densidade celular. Os resultados sugerem que o cultivo de fibroblastos em MDA em períodos de 14 dias permite boas condições de adesão e espraiamento das células sobre a matriz, porém, a alta densidade de fibras colágenas parece ser um fator limitante à migração celular. / Acellular Dermal Matrix, ADM, is a biomaterial that has been used in periodontal procedures to treat mucogingival defects. Mucogingival defects can be corrected by autogenous grafts that are the most common procedure used in periodontology, however, because of the limited source of donor\'s tissue this procedure became limited. The aim of this investigation was to verify, in vitro, different aspects related to human gingival fibroblasts seeding on to the ADM. Human gingival fibroblasts were established from explant cultures from the connective tissue of keratinized gingiva collected from three healthy patients. ADM was seeded with gingival fibroblasts for 14 and 21 days, and then cell adherence, proliferation and viability were analyzed. Results revealed that, at day 7, fibroblasts were adherent and spreading on the ADM surface, and were unevenly distributed, forming a discontinuous single cell layer, at day 14, a confluent fibroblastic monolayer lining ADM surface was noticed. At day 21, the cell monolayer exhibited a reduction in cell density. The results suggests that fibroblasts seeding on the ADM for 14 days can allow good conditions for cell adhesion and spread on the matrix, however, because of the high collagen fiber bundle density cell, migration inside the matrix was limited.

A asma alérgica é uma doença inflamatória crônica das vias aéreas que envolve ativação de fibroblastos pulmonares. Esta ativação é induzida por TGF-<font face=\"Symbol\">b e este processo é regulado por moléculas anti-fibróticas. Nosso objetivo foi elucidar mecanismos envolvidos na fibrose das vias aéreas em um modelo de asma. Na primeira parte, investigamos o eixo síntese/resposta da PGE2. A PGE2 e seu análogo forskolina inibiram síntese de colágeno I e proliferação de fibroblastos. Estas células apresentaram perda tempo-dependente na capacidade de sintetizar PGE2 sob estímulo com IL-1<font face=\"Symbol\">b, e menor expressão de COX-2 e mPGEs-1. Na segunda parte, estudamos a relação TGF-<font face=\"Symbol\">b1/BMP-7 na fibrose das vias aéreas. Há predomínio da molécula pró-fibrótica TGF-<font face=\"Symbol\">b1 sobre a molécula anti-fibrótica BMP-7 nos pulmões de animais asmáticos. Em fibroblastos, a BMP-7 inibe a síntese de colágeno tipo I induzida pelo TGF-<font face=\"Symbol\">b1 e as vias de SMAD-2, SMAD-3 e p38. O tratamento dos animais com BMP-7 causou diminuição significativa da fibrose. Os resultados implicam estes mecanismos na fibrose das vias aéreas na asma. / Allergic asthma is a chronic inflammatory disease of the airways that involves activation of lung fibroblasts. This activation is induced by TGF-<font face=\"Symbol\">b and this process is regulated by anti-fibrotic molecules. Our goal was to elucidate mechanisms involved in airway fibrosis in an animal model of asthma. In the first part, we investigated the PGE2 synthesis/response axis. PGE2 and its analog forskolin inhibited collagen I synthesis and proliferation of fibroblasts. These cells showed a time-dependent loss in the ability to synthesize PGE2 under IL-1<font face=\"Symbol\">b stimulation, and downregulated COX-2 and mPGEs-1. In the second part, we studied the ratio TGF-<font face=\"Symbol\">b1/BMP-7 in airway fibrosis. There is predominance of the pro-fibrotic TGF-<font face=\"Symbol\">b1 over the anti-fibrotic BMP-7 in the lungs of asthmatic animals. In fibroblasts, BMP-7 inhibits TGF-<font face=\"Symbol\">b1-induced type I collagen synthesis and the SMAD-2, SMAD-3 and p38 pathways. Treatment of the animals with BMP-7 caused significant decrease in fibrosis. The results implicate these mechanisms in airway fibrosis in asthma.

Avaliamos as causas moleculares da deficiência de C3 ou de FI em 07 pacientes, chegando a caracterizar a causa molecular em cinco deles. As mutações encontradas em cada um dos pacientes foram: C3def3 - C364G troca Arg102Gly; G2481C (Val807); A4956G (Val1632); FIdef2 - G693A, troca Gly162Asp; FIdef3 e -4 - C767T, troca Arg187Stop; FIdef6 e -7 - Inserção 1382<font face=\"Symbol\">DAT, códon de parada prematura 13 bases a montante. Além disso, analisamos se a ausência dessas proteínas levava a alterações na expressão gênica em fibroblastos de pele de pacientes deficientes de C3 ou de FI em relação a indivíduos normais e saudáveis através de ensaios com microarranjos de cDNA. Confirmamos uma tendência à alteração da expressão através de PCR em tempo real dos genes CHNRB1, CAV1, PSMB1, PI4K2B e MASP1 nos deficientes de C3; dos genes SPRY2, PSMA5, PGM2L1, GOLPH3 e JAKMIP3 nos deficientes de FI e o gene ETV6 nos dois grupos de pacientes. Dessa forma, podemos sugerir que deficiências das proteínas C3 e FI podem possivelmente influenciar a expressão de outros genes neste tipo de célula. / We investigated C3 and Factor I deficiency in 07 patients and could characterize the molecular basis in five of them. The mutations found were: C3def3 - C364G change Arg102Gly; G2481C (Val807); A4956G (Val1632); FIdef2 - G693A, change Gly162Asp; FIdef3 e -4 - C767T, change Arg187Stop; FIdef6 e -7 - insertion 1382<font face=\"Symbol\">DAT, Stop codon generation after 13 bp. Furthermore, we analyzed if the absence of these proteins cause alterations in gene expression profiles in skin fibroblasts from C3 and FI deficients compared to fibroblasts from normal individuals by cDNA microarrays. We confirmed a tendency of altered gene expression by Real Time PCR atCHNRB1, CAV1, PSMB1, PI4K2B and MASP1 genes on C3 deficients, SPRY2, PSMA5, PGM2L1, GOLPH3 and JAKMIP3 on FI deficient and ETV6 gene in both groups. Thus, we concluded that C3 and FI deficiencies could affect gene expression profiles in skin fibroblasts.