Les m?canismes de l?emphys?me pulmonaire, caract?ris? par la destruction des alv?oles pulmonaire, sont incompl?tement connus. L?hypoth?se d?fendue par cette th?se est qu?une alt?ration des syst?mes d?alv?olog?n?se et de r?paration alv?olaire port?s par les fibroblastes pulmonaires contribue au d?veloppement des l?sions au cours de cette maladie. Les travaux pr?sent?s ici ont permis d??tablir que les fibroblastes pulmonaires cultiv?s in vitro ? partir de poumon emphys?mateux pr?sentaient un ph?notype alt?r? dans le sens d?une perte de leur capacit? ? participer ? la r?g?n?ration et ? la r?paration des alv?oles : Ces cellules s?cr?taient ? un niveau faible ou non stimulable le Hepatocyte Growth Factor et le Keratinocyte Growth Factor (KGF), qui ciblent les cellules ?pith?liales et endoth?liales de l?alv?ole. De plus, l?expression par ces cellules de l??lastine, le composant majeur de la matrice extracellulaire pulmonaire, n??tait pas induite par l?acide tout-trans r?tino?que, stimulus central de l?alv?olog?n?se, du fait d?une faible expression de Cellular Retinoic Acid Binding Protein 2 (CRABP2). Le r?le du KGF dans l?hom?ostasie de l?alv?ole a ?t? d?montr? dans le mod?le d?emphys?me induit par l??lastase in vivo : Les souris trait?es par le KGF avant l?instillation d??lastase ?taient prot?g?es de l?emphys?me. Les souris dont le g?ne de CRABP2 ?tait inactiv? de fa?on globale n??taient pas sensibilis?es vis-?-vis de l?emphys?me dans ce mod?le. Les donn?es physiopathologiques pr?sent?es dans ce m?moire pourraient contribuer ? l?identification de nouvelles cibles th?rapeutiques pour l?emphys?me. / The mechanisms of pulmonary emphysema, characterized by the destruction of alveolar walls, remain incompletely understood. Our hypothesis is that a deficiency in fibroblast-borne alveolar repair systems accounts partly for the constitution of lesions in this disease. In our experiments, we show that fibroblasts isolated in vitro from human emphysematous lung express the Hepatocyte Growth Factor and the Keratinocyte Growth Factor (KGF), which target alveolar epithelial and endothelial cells, at low or unstimulable levels. Additionally, emphysema fibroblasts did not increase their expression of elastin, the main component of the pulmonary extracellular matrix, in response to retinoic acid, due to a low expression of Cellular Retinoic Acid Binding Protein 2 (CRABP2). The role of KGF In alveolar homeostasis was demonstrated in vivo in the elastase-induced emphysema model: Mice treated with KGF before elastase instillation were protected against emphysema. CRABP2- knockout mice were not protected against emphysema in this model. Our pathophysiological data may help in the identification of novel therapeutic targets for emphysema.

Orientador: Fernanda da Cruz Landim-Alvarenga / Banca: Sony Dimas Bicudo / Banca: José Antonio Visintin / Resumo: O primeiro sucesso na clonagem de eqüídeos através do uso de transferência nuclear foi relatado em maio de 2003 após o nascimento de uma mula clonada a partir de células fetais. Acredita-se que a utilização de células diplóides em fase do ciclo celular G0 ou G1 facilite a coordenação entre o ciclo celular e a reprogramação nuclear após a transferência de núcleo. Sendo assim, este experimento objetivou estudar o comportamento de fibroblastos de eqüinos adultos em cultura, analisando o estado do ciclo celular e a viabilidade das células em cultivo pré- e pós-descongelação. Fragmentos de pele de 6 eqüinos adultos, sendo 3 machos e 3 fêmeas, foram divididos em pedaços de aproximadamente 1mm3 e acondicionados (10 fragmentos/garrafa) no fundo de duas garrafas de cultivo (25cm2) umedecidas com 1mL SFB. As garrafas foram inclinadas para a posição vertical e adicionado 5ml de meio DMEM alta glicose + 10% SFB, 100UI/mL Penicilina / 100æg/mL Estreptomicina e 3,0æg/mL Anfotericina B. Após 30 minutos em estufa com 5% CO2 em ar, as garrafas foram dispostas em posição horizontal, para que o meio de cultivo entrasse em contato com os fragmentos teciduais. Todas as garrafas permaneceram por sete dias em estufa com 5% CO2 em ar até o início do crescimento celular. Com 70% de confluência, foi realizada a tripsinização e a primeira passagem. O mesmo procedimento foi repetido para a segunda passagem. Para os grupos de privação de soro (0,5% de SFB) foram produzidas garrafas de cultivo em duplicata para a análise da viabilidade e do ciclo celular nos períodos de 24, 48, 72, 96, 120, 144 e 168 horas de cultivo. Para os grupos de confluência foram produzidas duas garrafas de cultivo para a análise da viabilidade e do ciclo celular no período em que o tapete celular atingisse a confluência...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The first success in equine cloning, using nuclear transfer, was reported in May of the 2003 after the birth of a cloned mule obtained from fetal cells. Nowadays there is an agreement, in the literature, that diploid cells in phase G0 or G1 of the cell cycle facilitate coordination between the cell cycle and the nuclear reprogramming after the nuclear transfer. This experiment aimed to study the behavior of equine fibroblasts in culture though the analysis of the cellular cycle and the viability of cells pre- and post-freezing. Skin fragments were obtained from 6 adult horses (3 females and 3 males) and divided in pieces of about 1 mm3. For culture, the bottoms of two culture bottles were moistened with 1 mL of FCS, 10 fragments of skin were deposited, and 5 ml of DMEM high glucose + 10% FCS, 100 IU/mL penicillin, 100 g/mL streptomycin and 3 g/ml amphotericin B were added with the bottles raised vertically. After 30 min incubation in 5% CO2 in air, the bottles were moved to a horizontal position allowing the culture media to make contact with the tissue fragments. All bottles were cultured for 7 days in 5% CO2 in air until the beginning of confluence. The complete culture media was replaced weekly and, at 70% of confluence, trypsinization (ATV Vernese, Adolfo Lutz Institute) and the first passage were performed. Two passages were performed before freezing. For the second passage, the culture and trypsinization were repeated. For cells subjected to serum starvation (0.5% FCS), culture bottles were produced in duplicate for viability and cellular cycle analysis at 24, 48, 72, 96, 120, 144 and 168 hours of culture. For the confluence groups bottles were produced for the analysis of viability and cellular cycle at the moment cells achieved confluence...(Complete abstract, click electronic address below) / Mestre

Muitos genes têm sido indicados como responsivos ao estresse genotóxico, mas devido à necessidade de validação, a busca por marcadores gênicos continua. Vários genes são relacionados ao sistema ubiquitina-proteassomo (UPS), o qual é responsável pela remoção seletiva de proteínas, sendo que falhas no UPS têm sido relacionadas a doenças neurodegenerativas e ao câncer. Assim, o presente trabalho teve como objetivo a busca e confirmação de marcadores gênicos de resposta ao estresse genotóxico, por meio do estudo da expressão transcricional e protéica dos genes ERN1, EIF2AK3, GADD153 e TRAF2, visando à confirmação das respostas em linhagens de fibroblastos (GM07492A e AS405) e de glioblastoma (U87MG), sob tratamentos com peróxido de hidrogênio (H2O2) e Bleomicina (Blm). Foram utilizados o Ensaio Cometa, a análise de expressão gênica transcricional por qPCR em tempo real e de expressão gênica ao nível protéico (imunofluorescência). Os resultados mostraram que os tratamentos empregados foram capazes de induzir danos no DNA, sendo que a sensibilidade ao tratamento e a capacidade de recuperação das linhagens foi variável dependendo do agente testado. A análise de expressão gênica mostrou que GM07492A apresentou indução dos genes ERN1 e GADD153 após tratamento com H2O2 (resposta precoce, zero e 2 h) e Blm (durante todo pós-tratamento). A linhagem AS405 exibiu indução de ERN1 e GADD153 para H2O2, enquanto que para Blm foram induzidos os genes EIF2AK3 e GADD153. Para U87MG, a indução de EIF2AK3 pelo H2O2 ocorreu de modo tardio, enquanto GADD153 mostrou-se induzido após ambos os tratamentos. A proteína ERN1 apresentou expressão discreta e pontual, inclusive nos pontos onde não houve indução transcricional, indicando uma expressão basal. Essa proteína se expressou em GM07492A no tratamento com Blm em zero hora, diferentemente de AS405. Para U87MG tratada com H2O2 observou-se discreta expressão de ERN1, sendo mais evidente para Blm. Quanto à proteína GADD153, esta foi expressa em fibroblastos nos vários tempos analisados. No entanto, U87MG mostrou expressão nuclear apenas nas células tratadas, sendo mais evidente para H2O2 comparativamente à Blm. Assim, as alterações observadas nos perfis de expressão gênica são compatíveis com a indução de danos no DNA, indicando o envolvimento de genes do UPS nas respostas celulares ao estresse genotóxico. Em conjunto, os resultados estimulam uma avaliação mais detalhada desses genes como marcadores de resposta ao estresse e evidencia a sua importância no cenário da via UPS. / Many genes have been reported as responsive to genotoxic stress, but due to the need of validation, the search for genetic markers still continues. Several genes are related to the ubiquitin-proteasome system (UPS), which is responsible for the selective removal of proteins, and UPS failures have been associated to neurodegenerative diseases and cancer. Thus, this study aimed the search and confirmation of genetic markers that were responsive to genotoxic stress. For this, we evaluated the transcriptional or protein expression of the genes ERN1, EIF2AK3, GADD153 and TRAF2, seeking confirmation of responses in fibroblast cell lines (GM07492A and AS405) and glioblastoma (U87MG) under treatment with hydrogen peroxide (H2O2) and bleomycin (BLM). We used the Comet Assay, the transcriptional analysis of gene expression by quantitative real-time PCR and protein expression byimmunofluorescence. The results showed that the treatments employed were able to induce DNA damage, and that cell sensitivity to treatments and recovery capability of cell lines varied according to the tested agent. The gene expression analysis showed that GM07492A presented induction of ERN1 and GADD153 genes after treatment with H2O2 (early response, zero and 2 h) and Blm (throughout the post-treatment). The cell line AS405 showed induction of GADD153 and ERN1 after H2O2, whereas with Blm the genes induced were EIF2AK3 and GADD153. For U87MG, the induction of EIF2AK3 by H2O2 occurred at a later stage, while GADD153 was promptly induced after both treatments. The protein ERN1 showed discreet and punctual expression, even at time point without transcriptional induction, indicating a basal expression. This protein was expressed in GM07492A by treatment with Blm at zero hour, differently of AS405. For U87MG treated with H2O2, ERN1 showed a slight expression, being more evident for Blm. Regarding GADD153, protein expression was observed in fibroblasts at all time point. However, U87MG showed nuclear expression only in cells treated with H2O2, being more evident that in BLM-treated cells. Thus, the observed changes in gene expression profiles are consistent with the induction of DNA damage, which indicates the participation of UPS genes in cellular responses to genotoxic stress. Together, the results encourage further evaluation of these genes as markers of stress response, demonstrating its importance in the UPS acting scope.

O uso de irrigação com solução de hipoclorito de sódio a 1% (NaOCl) seguida de irrigação final com solução de clorexidina a 2%(CHX) pode promover uma melhor antissepsia do sistema de canais radiculares do que as abordagens tradicionais. Já foi relatado que estas substâncias quando entram em contato dentro do sistema de canais radiculares produzem subprodutos a partir de sua mistura, que apresentam uma fase líquida e uma fase sólida precipitada que permanece nas paredes do canal radicular. Sua ação citotóxica em cultura de células ainda não foi estudada. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito desta mistura e seus subprodutos in vitro sobre a viabilidade celular. Para avaliar se o grau de diferenciação pode afetar a sobrevivência celular foram escolhidas para o experimento fibroblastos de gengiva humana (FMM1) que são células mais diferenciadas e células-tronco de polpa dentária humana (PDH3) menos diferenciadas. Métodos: partes iguais de soluções de hipoclorito 1% (NaOCl) e digluconato de clorexidina 2% (CHX) foram misturadas e os subprodutos obtidos. Os grupos experimentais testados foram: G1- CHX, G2- NaOCl + CHX(fase líquida), G3- NaOCl + CHX(fase sólida). Quatro(4) diferentes concentrações (100%, 1%, 0,5% e 0,25%) das substâncias de G1 e G2 e do meio de cultivo condicionado pelo G3, foram aplicadas às culturas de células. A viabilidade celular foi mensurada pelo teste de redução do MTT (n=24/concentração/substância/células) e a genotoxicidade através de contagem de micronúcleos apenas para as concentrações das substâncias de 0,5% e 0,25% (número de micronúcleos/1000 células em cada contagem, 2 contagens), ambos em 24 horas após o contato de 15 minutos com as substâncias testadas. Os dados foram analisados por ANOVA complementado por teste de Tukey(p<0,05) para o MTT e qui-quadrado para genotoxicidade. Como resultados da viabilidade celular a dose letal de 50%(DL50) ocorreu apenas nas concentrações menores que 5% no G1, e ao redor de 1% para G2 e G3. Como resultados do teste de genotoxicidade os mesmos números de micronúcleos foram encontrados para todos os grupos em duas contagens de 1000 células. As células PDH3 apresentaram maior viabilidade que a FMM1 com maior número de células em concentrações maiores das substâncias testadas, demonstrando maior resistência de células menos diferenciadas. Como não houve diferença estatística no número de micronúcleos entre os grupos do teste de genotoxicidade inferimos que não houve aumento do número de micronúcleos entre os grupos de teste e o controle. Portanto, a solução de CHX a 2% quando aplicada sobre as células em cultura in vitro não foi biocompatível em concentrações de diluição acima de 0,5%; não foi genotóxica, pois não houve aumento na formação de micronúcleos nem com o grupo da clorexidina nem com a fase líquida da mistura ou com o precipitado. / New antimicrobial therapies have been introduced in Endodontics for periapical lesions and treatment-resistant infections. Alternating irrigating solutions such as 1% sodium hypochlorite (NaOCl) solution and 2% chlorhexidine (CHX) solution has shown promising results. However, inside the root canal system the NaOCl and CHX interact producing byproducts (Bps) represented by a liquid (Liq) and a solid precipitated (Sol) that remain on the canal walls. Objectives: To study the cytotoxicity of such Bps and CHX using cultured fibroblasts (FMM1) and stem cells(PDH3). Two cell lines were chosen to test if different differentiated cell types would present different survival results. Methods: Equal parts of 1% NaOCL and 2% CHX solutions were mixed and the Bps were obtained. Three drug solutions were tested: cell culture medium dilution of CHX, cell culture medium dilution of Liq and cell culture medium conditioned by the Sol byproduct. They were prepared in fresh medium in 4 different concentrations (100%, 1%, 0,5%, 0,25%) and applied to the cells for 15 minutes. In the control wells the cells grew on fresh medium. Cytotoxicity was measured by using the MTT reduction assay in 24 replicates per concentration per solution. Twenty-four hours later cell viability was analyzed. Micronucleus counting was used to check genotoxicity (number of micronucleus/ 1000 cell, 2 counting). Data was evaluated through ANOVA test with post hoc Tukey(p<0,05) for MTT assay and qui-square for genotoxicity. Lethal dose concentration 50%(LD50) was obtained in concentrations less than 0,5% with CHX and around 1% for Liq and Sol. there were obtained same number of micronucleous for all the substances tested. PDH3 cells presented higher survival rate to higher concentrations, so they were more resistant than FMM1. There was no statistical difference between control and tested groups for genotoxicity. 2% CHX solution when applied to cell cultures was not biocompatible in concentrations above 0,5%; there is no increase in micronucleous number with tested substances.

Cecropia obtusa é popularmente utilizada na Amazônia para vários fins medicinais, e possui atividade antioxidante comprovada por diferentes metodologias. Neste trabalho objetivou-se caracterizar o extrato; avaliar o potencial fotoquimioprotetor; separar os constituintes por CLAE; identificar os constituintes majoritários e desenvolver formulações tópicas. O conteúdo de polifenóis e flavonoides totais foi de 371,5 mg EGA/g e 66,68 mg EQ/g, respectivamente, e os IC50 para os radicais DPPHo, O2 o- e 1O2 foram, respectivamente1,83, 0,34 e 0,55 ?g/mL, respectivamente. Para o radical OHo, 125 ?g/mL de extrato foi capaz de inibir a formação do radical em 35,48%. O extrato demonstrou fotoestabilidade e capacidade de absorver a radiação UVB e UVA-II. O FPS calculado pela metodologia de Mansur e estimado pelo experimento de fotoproteção em cultura de células foi de 16. O método analítico cromatográfico apresentou boa resolução e separação, sendo linear para o intervalo de 5 a 125 ?g/mL e apresentando coeficientes de variação que variaram de 3,12% a 4,51%. Através da espectrometria de massas foi possível sugerir a presença do ácido clorogênico e três flavonas-C-heterosídicas (duas luteolinas-C-heterosídicas e uma apigenina-C-heterosídicas). Em cultura de células HaCaT submetidas à radiação UVA, o extrato diminuiu a produção de espécies reativas do oxigênio, protegeu contra o processo de peroxidação lipídica e contra a depleção da glutationa reduzida induzidos pela radiação, além de proteger contra a diminuição da atividade das enzimas catalase e superóxido dismutase. Em cultura de fibroblastos humanos submetidos à radiação UVA/UVB, o tratamento com o extrato forneceu maior proteção do que o ácido clorogênico contra o aumento da proteína carbonilada. O extrato foi capaz de retornar o conteúdo de ácido hialurônico ao nível basal enquanto o tratamento com ácido clorogênico foi capaz de aumentar acima do nível basal. Em relação ao conteúdo de colágeno, tanto o extrato quanto o ácido clorogênico foram capazes de retornar os valores ao nível basal da célula. O extrato também foi capaz de diminuir a atividade da enzima metaloproteinase enquanto o ácido clorogênico não exibiu efeito. Em relação às formulações desenvolvidas, as mudanças mais significativas nos parâmetros de estabilidade avaliados foram para as formulações incubadas a 40?C: o decréscimo da atividade antioxidante em aproximadamente 40% entre 0 e 2 meses, a diminuição do pH abaixo do limite de estabilidade do agente de viscosidade e, para a reologia, o aumento da área de histerese entre 4 e 6 meses. A formulação com oleato de isodecila dobrou a quantidade de extrato penetrada na pele em 12 e 6 horas, em comparação com as outras duas formulações, além de ter mantido a atividade de absorção da radiação. O extrato apresentou atividade fotoquimioprotetora e a formulação promoveu a penetração do extrato e manteve a atividade de absorção da radiação, sugerindo a incorporação do extrato de C. obtusa em formulações contendo filtros, visando aumentar o espectro de absorção e promover um efeito atenuador do estresse oxidativo na pele. / Cecropia obtusa is commonly used in Amazon with different medicinal purposes and the antioxidant activity of this specie has been proved by different methodologies. The aim of this work was: to characterize the purified extract of C. obtusa; to evaluate the photochemoprotective effect in cell culture; develop an HPLC methodology to separate the extract\'s compounds; suggest the identification of the major compounds, and develop a stable formulation that would be able to penetrate on the skin to exert the antioxidant effect, besides absorbing the radiation. The contents of total polyphenols and flavonoids were 371.5 mg GAE/g and 66.68 mg QE/g, respectively, and the IC50 for the radicals DPPHo, O2 o- and 1O2 were respectively 1.83, 0.34 and 0.55 ?g/mL. For the OHo radical, 125 ?g/mL of extract was able to inhibit the radical formation by 35.48%. The extract was photo stable and exhibited the ability to absorb UVB and UVA-II radiation. The SPF calculated by the Mansur methodology and confirmed by the photoprotection experiment in cell culture was 16. The HPLC method exhibited good resolution and separation, being linear from 5 to 125 ?g/mL and presenting coefficients of variation ranging from 3.12% to 4.51%. By employing mass spectrometry, it was possible to suggest the presence of chlorogenic acid and three C-heterosidic flavones (two Cheterosidic luteolins and one C-heterosidic apigenin). In HaCaT culture exposed to UVA radiation, the extract decreased the production of reactive oxygen species, protected against the lipid peroxidation process and against the depletion of the reduced glutathione. In addition, extract also protected against the decrease in the activity of the enzymes catalase and superoxide dismutase. In human fibroblasts exposed to UVA/UVB radiation, the treatment with the extract provided higher protection than chlorogenic acid against the increase in the production of carbonyl protein. The extract was able to return the content of hyaluronic acid to the basal level while the treatment with chlorogenic acid was able to increase above the basal level. Regarding the collagen content, both the extract and the chlorogenic acid were able to return the values to the basal level of the cell. The extract was also able to decrease metalloproteinase activity, while chlorogenic acid had no effect. Regarding the developed formulations, the most significant changes in the stability parameters were for the formulations incubated at 40°C: the decrease in the antioxidant activity, which was, approximately, 40% between 0 and 2 months, and the increase of hysteresis area and decrease of the pH below the limit for the viscosity agent, between 4 and 6 months. The formulation with isodecyl oleate doubled the amount of extract penetrated into the skin in 12 and 6 hours compared with the other two formulations. The extract exhibited photochemoprotective effect, and the formulation penetrated on the skin, besides absorbing the UV radiation, which suggests the incorporation of C. obtusa extract in formulations containing filters, aiming to increase the absorption spectrum and to attenuate the oxidative stress in the skin.

A luz intensa pulsada é amplamente utilizada para o tratamento do fotoenvelhecimento e de lesões vasculares congênitas e adquiridas, porém, seus efeitos biológicos ainda não são completamente esclarecidos. Neste estudo, foram avaliadas as respostas proliferativas e de síntese em fibroblastos e células endoteliais humanas após a irradiação com a luz intensa pulsada. As culturas de fibroblastos e células endoteliais foram irradiadas com luz intensa pulsada com variação de comprimento de onda entre 420 e 1110 nm e fluências de 10, 16 e 20 J/cm2. Os experimentos foram realizados após 24 e 48 horas da irradiação e analisados os seguintes parâmetros: 1-alterações morfológicas; 2- determinação da capacidade proliferativa e citotóxica; 3- produção de radicais livres; 4- fases do ciclo celular; 5- expressão dos marcadores do ciclo celular e apoptose; 6- avaliação do potencial elétrico da membrana mitocondrial; 7- análise da atividade mitocondrial por microscopia confocal; 8- biossíntese de colágeno e 9- microscopia eletrônica de varredura dos fibroblastos e matriz extracelular. Os resultados demonstraram que, nos fibroblastos, a luz intensa pulsada promoveu aumento da densidade celular e da capacidade proliferativa; aumento na produção de radicais livres diretamente proporcional à intensidade de energia; estímulo na fase de síntese; estímulo na síntese de colágeno mais significativo em 10 e 16 J/cm²; induziu apoptose pela via extrínseca, dependente da intensidade de energia; a microscopia eletrônica de varredura demonstrou detalhes da organização e síntese da matriz extracelular, bem como o colágeno recém sintetizado. Nas células endoteliais a luz intensa pulsada não provocou mudanças morfológicas; promoveu aumento na produção de radicais livres, induziu citotoxicidade e apoptose pela via extrínseca e diminuiu a capacidade proliferativa, proporcional à intensidade de energia. Este estudo permitiu a determinação in vitro dos mecanismos biológicos envolvidos após a interação da luz intensa pulsada com os fibroblastos e células endoteliais humanas / Intense pulsed light is widespread used in the treatment of intrinsic and extrinsic photo damaged skin and congenital or acquired vascular diseases but its biological effects have not yet been clearly demonstrated. This study assessed the proliferative and synthesis responses of fibroblasts and endothelial cells. The fibroblasts and endothelial cells cultures were irradiated with intense pulsed light, with wavelength ranging from 420 to 1110 nm, fluencies of 10, 16 e 20 J/cm2 and pulse delay 10 ms. Experiments were performed 24 and 48 hours after irradiation and the following parameters were analyzed: 1- morphological changes; 2- measurement of proliferative capacity and citotoxicity; 3- free radical production; 4- cell cycle phases; 5- expression of cell cycle and apoptosis markers; 6- electrical potential of mitochondrial membrane; 7- mitochondrial activity by confocal microscopy; 8- collagen synthesis; 9- Scanning electron microscopy of fibroblasts and extracellular matrix. The results evidenced that intense pulsed light on fibroblasts increased cell density and proliferative capacity; stimulus on synthesis phase and collagen synthesis more significant at fluences of in 10 and 16 J/cm²; increase of free radical formation, citotoxicity and apoptosis through the extrinsic pathway proportional to the energy intensity. The scanning electron microscopy evidenced the organization details of extracellular matrix and new collagen fibers. Regarding the endothelial cells, intense pulsed light did not cause morphological changes; increased free radicals formation, induced citotoxicity and apoptosis through the extrinsic pathway and decreased the proliferative capacity proportionally to the intensity of energy. This study allowed the in vitro determination of the biological mechanisms involved after the interaction of intense pulsed light and human fibroblasts and endothelial cells

La cicatrisation de ligaments est un processus complexe qui consiste en la prolifération et la migration cellulaire, ainsi que la synthèse de la matrice extracellulaire. Ce phénomène est influencé par des facteurs biochimiques et/ou environnementaux. Les propriétés spécifiques des cellules ligamentaires permettrent de répondre aux facteurs de croissance et aux contraintes mécaniques. Le but de nos travaux a été de définir les conditions de reconstruction in vitro d’un tissu ligamentaire. Nous avons tenu compte d’une part des paramètres biochimiques, d’autre part des paramètres mécaniques afin d’étudier l’ensemble des facteurs agissant sur la synthèse d’un nouveau tissu. Dans un premier temps, nous avons montré l’influence des facteurs de croissance, tels que le PDGF-AB et le TGF-b1 sur la prolifération et sur la synthèse de composants de la matrice extracellulaire (collagènes des types I et III). Il semble que ces deux facteurs de croissance aient une action, mais il n’agissent pas sur le même mode du point de vue temporel et mécanistique. Dans un deuxième temps, nous avons étudié l’effet de la contrainte mécanique spécifique du ligament, l’étirement. Nous avons montré que l’action des contraintes mécaniques est essentielle pour la différentiation des cellules cibles et leur évolution en cellules ligamentaires, en promouvant la synthèse de molécules spécifiques, telles que la ténascine, et les collagènes. Cependant, bien que ces résultats, restent insuffisants pour la reconstruction d’un bio tissu, ils nous ont néanmoins permis de définir les protocoles à suivre pour la suite de ces projets d’ingénierie tissulaire / The process of ligament healing is complex, which consists of the proliferation and the cellular migration, as well as the synthesis of the extra cellular matrix. This process is influenced by the biochemical and/or environmental factors. The specific properties of the ligament cell permit their responses to growth factors and to mechanical stress. The aim of our work was to define the conditions of in vitro reconstruction of ligament tissue. We take into account the biochemical, as well as the mechanical parameters in order to study the factors acting on the synthesis of a new tissue. Firstly, we investigated the influence of the growth factors such as PDGF-AB and TGF-b1 on the cell proliferation and the matrix synthesis (collagens types I and III) respectively. It seems that these two growth factors act on the different mode on the temporal and mechanistic aspects. Secondly, we studied the effect of the specific mechanical stress the stretching on the ligament. It was showed that the action of the mechanical stretching was essential for the differentiation of the target cells and their evolution in the ligament cell, by promoting the synthesis of the specific molecules, such as tenascin, and collagens. Although these results remain insufficient for the reconstruction of neotissue, they allowed us to define the protocols to be followed for the projects of tissue engineering

O objetivo deste estudo foi analisar a expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em culturas tridimensionais na presença ou não de partículas de vidro bioativo. Fibroblastos derivados do ligamento periodontal humano (hPDLF) e células osteogênicas da calvária de rato recém-nascidos foram plaqueadas em superfícies bidimensionais - lamínulas de plástico ThermanoxTM (controle); superfícies colágenas bidimensionais - ThermanoxTM revestidas por colágeno I sem partículas de vidro bioativo (2D) e com partículas de vidro bioativo (2D+VB); e em gel colágeno tridimensional sem vidro bioativo (3D) e com partículas (3D+VB). Foram avaliados: Viabilidade celular (MTT) nos tempos 3, 7 e 10 dias; Atividade de fosfatase alcalina (ALP) normalizada pelo conteúdo de proteína total em 7 e 14 dias; Immunolocalização de proteínas da matriz não-colágena (ALP e OPN em células hPDLF aos 7 e 14 dias e OPN e BSP em células osteogênicas aos 7 dias) por imunofluorescência indireta; Expressão quantitativa (PCR em tempo real) dos genes Periostina (PRT), Calcium-Binding Protein (S100A4) e Fibromodulina (FBM), marcadores do fenótipo fibroblástico, em células hPDLF e Fosfatase Alcalina (ALP), Osteopontina (OPN), Sialoproteína Óssea (BSP), Osteocalcina (OC), Colágeno I (COL I) e Runx2, marcadores osteoblásticos, em ambos os tipos celulares; e Mineralização (coloração por vermelho de Alizarina). Os resultados obtidos nas culturas de hPDLF mostraram que aos 3 dias a viabilidade celular em 2D+VB foi maior que no controle (p<0,05) e nenhuma diferença significante entre os grupos foi observada aos 7 e 10 dias. O conteúdo de proteína total aos 7 e 14 dias foi maior nas culturas 3D e 3D+VB, sendo aos 7 dias significantemente diferente de 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05) e aos 14 dias observou-se diferença significativa entre 3D e 2D. A atividade de ALP aos 7 dias foi maior nos grupos 2D e 2D+VB comparados com 3D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05); e em 3D+VB menor que no controle (p<0,05). Entretanto, aos 14 dias 3D e 3D+VB apresentaram maior atividade de ALP que o controle (p<0,05). Imunomarcações para OPN e ALP foram observadas nas células em 3D em ambos os períodos avaliados, e em 2D, 2D+VB, e controle apenas aos 14 dias. A expressão de RNAm para PRT aos 7 dias apresentou um perfil upregulated em 3D e 3D+VB comparados ao controle (p<0,05); para FBM a expressão gênica foi maior em 3D e 2D que em 3D+VB (p<0,05), e menor em 3D+VB comparado ao controle (p<0,05). As células em 2D exibiram maiores níveis de expressão de RNAm para S100A4 que as cultivadas em 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05). Os níveis de RNAm para COL I e ALP em 2D+VB e 3D, para RUNX2 e OPN em 3D e 2D, e para OC em 2D apresentaram-se upregulated em relação ao controle (p<0,05). Em 2D o nível de expressão de OC foi maior que em 2D+VB (p<0,05). Aos 14 dias houve uma diminuição da expressão de todos os genes analisados em relação às análises de 7 dias. Células em 3D+VB expressaram menores níveis de PRT que em 2D+VB (p<0,05). A expressão de RNAm para FBM foi maior em 2D e 2D+VB e para S100A4 maior em 2D comparado com 3D (p<0,05), nos quais os níveis de S100A4 ficaram downregulated com relação ao controle. COL I e ALP apresentaram-se downregulated em 3D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05) em relação ao controle. Entre 2D+VB e 3D+VB também foi observada diferença significativa para ALP. A expressão de RUNX2 foi maior em 3D que em 3D+VB (p<0,05) e de OC maior no controle. Nos grupos com VB foi observada maior formação de matriz calcificada aos 10 e 14 dias. Aos 10 dias não foram observadas áreas coradas por Alizarina através da microscopia, mas a quantidade de mineralização em 2D+VB e 3D+VB foi significativamente maior que no controle (p<0,05), 2D (p<0,05) e 3D (p<0,05). Aos 14 dias marcações mais extensas foram observadas nas culturas com VB, porém os nódulos mineralizados apresentavam-se independentes das partículas. 2D+VB e 3D+VB foram significativamente diferentes do controle (p<0,05) e 2D (p<0,05). As culturas de células osteogênicas mostraram que aos 7 dias as células crescidas sobre os arcabouços 3D+VB e 3D exibiram menores índices de viabilidade. Diferenças significativas foram observadas quando 3D+VB foi comparado aos grupos 2D+VB (p<0,05) e controle (p<0,05); e entre 2D e 3D (p<0,05). Aos 3 e 10 dias não foram encontradas diferenças significativas na viabilidade celular entre os grupos. O conteúdo de proteína total foi maior em 3D+VB que em 2D+VB (p<0,05) e no controle (p<0,05) aos 7 e 14 dias. Diferenças significantes também foram observadas entre 3D e 2D (p<0,05) aos 14 dias. A atividade de ALP aos 7 dias foi maior em 2D+VB e 3D+VB. Diferenças significantes foram encontradas entre 2D e 2D+VB (p<0,05), 3D e 3D+VB (p<0,05) e entre 3D e controle (p<0,05). Entretanto, aos 14 dias, 3D e 3D+VB apresentaram os menores valores de atividade de ALP, sendo a significantemente diferentes de 2D (p<0,05) e 2D+VB (p<0,05). Imunomarcações para OPN e BSP foram observadas aos 7 dias em 2D, 2D+VB, 3D e controle. Aos 7 dias os níveis expressão do RNAm para ALP, COL I e RUNX2 foram maiores em 3D e 3D+VB. Os genes OPN, OC e BSP exibiram níveis de expressão mais altos em 2D+VB. A expressão de COL I foi maior em 3D+VB que em 2D+VB (p<0,05). As células em 2D+VB apresentaram maiores níveis de expressão de OPN e OC que em 2D (p<0,05) e 3D+VB (p<0,05), nos quais a expressão desses genes e de BSP estavam downregulated em relação ao grupo controle. Aos 10 e 14 dias áreas coradas por vermelho de Alizarina foram observadas em todos os grupos, sendo mais extensas nos grupos que continham VB. Aos 10 dias a quantidade de cálcio em 3D+VB foi maior que no controle (p<0,05); e maior em 2D+VB comparado com 2D (p<0,05) e controle (p<0,05). Aos 14 dias 2D+VB e 3D+VB apresentaram uma quantidade de cálcio significativamente maior que no controle (p<0,05) e em 2D (p<0,05). Em conclusão, este estudo demonstrou que os arcabouços tridimensionais colágenos são capazes de suportar a viabilidade, proliferação e diferenciação celular se in vitro de hPDLF e células osteogênicas derivadas de calvária de rato recém-nascidos e de favorecerem a expressão dos fenótipos fibroblástico e osteoblástico em hPDLF. As partículas de VB em ambos os tipos celulares também contribuiram para viabilidade, diferenciação, formação de matriz mineralizada e expressão fenotípica. / The aim of this study was to analyze the fibroblastic and osteoblastic phenotypes expression on three-dimensional cultures in the presence or not of bioactive glass particles. Fibroblasts derived from human periodontal ligament (hPDLF) and osteogenic cells from newborn rat calvaria were cultured on bi-dimensional surfaces - plastic coverslips ThermanoxTM (control), bi-dimensional collagen surfaces - ThermanoxTM coated with collagen I without bioactive glass particles (2D) and with bioactive glass particles (2D+BG), on three-dimensional collagen gel without bioactive glass (3D) and with particles (3D+BG). Were evaluated: Cell viability (MTT) in 3 days, 7 and 10 days; Phosphatase alkaline activity (ALP) normalized by total protein content at 7 and 14 days; Immunolocalization of non-matrix proteins collagen (ALP and OPN in hPDLF at 7 and 14 days, OPN and BSP in osteogenic cells at 7 days) by indirect immunofluorescence; Genes expression (real-time PCR) for Periostin (PRT), Calcium-Binding Protein (S100A4) and Fibromodulin (FBM): fibroblastic markers in hPDLF, and Alkaline phosphatase (ALP), Osteopontin (OPN), Bone sialoprotein (BSP), Osteocalcin (OC), Collagen I (COL I) and RUNX2: osteoblastic markers in both cell types; and Mineralization (staining with Alizarin red). The results obtained on hPDLF cultures showed that cell viability on 2D+BG was higher than on control at 3 days (p<0.05), and no significant difference between groups was observed at 7 and 10 days. The total protein content at 7 and 14 days was higher on 3D and 3D+BG cultures compared those on 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05) at 7 days. Significant difference was also observed between 3D and 2D at 14 days. The ALP activity at 7 days was higher on 2D and 2D+BG compared with 3D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), it was also lower on 3D+BG than on control (p<0.05). However, at 14 days 3D and 3D+BG showed higher ALP activity than control (p<0.05). Immunolabeling for OPN and ALP were observed in cells on 3D at both periods and on 2D, 2D+ BG and control only at 14 days. At 7 days, the expression of mRNA for PRT was upregulated on 3D and 3D+BG compared with control (p<0.05), for the FBM it was higher on 3D and 2D than on 3D+BG (p<0,05), but it was lower on 3D+BG than on control (p<0.05). Cells on 2D exhibited higher levels of S100A4 mRNA expression than those grown on 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05). The mRNA levels expression for COL I and ALP on 2D+BG and 3D, and for RUNX2 and OPN on 3D and 2D, and for OC on 2D presented upregulated compared with control (p<0.05). Also, cells on 2D showed the level expression of OC higher than those on and 2D+BG (p<0.05). At 14 days, there was a decrease in all evaluated genes expression compared with 7 days analyses. Cells on 2D+BG expressed higher levels of PRT than on 3D+BG (p<0.05). 2D and 2D+BG showed the highest levels of mRNA expression for FBM. Gene expression of S100A4 on 2D was higher than on 3D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), in which the levels of S100A4 were downregulated compared to control. COL I and ALP were downregulated on 3D (p<0.05) and on 3D+BG (p<0.05) compared with control. There was also a significant difference between 2D+BG and 3D+BG for mRNA ALP expression. RUNX2 expression was higher on 3D than on 3D+BG (p<0.05), and OC expression was higher on control. Calcified matrix formation was observed on BG cultures at 10 and 14 days. At 10 days, areas stained by Alizarin were no observed by microscopy, but the amount of mineralization on 2D+BG and 3D+BG was significantly higher than on control (p<0.05), 2D (p<0.05) and 3D (p<0.05). At 14 days, more extensive staining was observed on cultures with BG, but the mineralized nodules formation was independent of the particles. Calcium content on 2D+BG and 3D+BG was significantly higher than control (p<0.05) and 2D (p<0.05). Osteogenic cell cultures showed that cells grown on 3D and 3D+BG surfaces exhibited the lowest levels of cell viability. Significant differences were observed when 3D+BG was compared with 2D+BG (p<0.05) and control (p<0.05) and also between 2D and 3D (p<0.05). At 3 and 10 days, there were no significant differences for cell viabililty between the cultures. The total protein content was higher on 3D+BG than on the control (p<0.05) and 2D+BG (p<0.05) at 7 and 14 days. Significant differences were also observed between 3D and 2D (p<0.05) at 14 days. ALP activity at 7 days was higher on 2D+BG and 3D+BG. Significant differences were found between 2D and 2D+BG (p<0.05), 3D and 3D+BG (p<0.05), and between 3D and control (p<0.05). However, at 14 days 3D and 3D+BG had the lowest levels of ALP activity, significantly different from 2D (p<0.05) and 2D+BG (p<0.05). Immunolabeling for OPN and BSP were observed at 7 days on 2D, 2D+BG, 3D and control. At 7 days, the expression levels of mRNA for ALP, COL I and RUNX2 were higher on 3D and 3D+BG. OPN, BSP and OC exhibited higher expression levels on 2D+BG. COL I expression was higher on 3D+BG than on 2D+BG (p<0.05). Cells on 2D+BG showed higher expression levels of OPN and OC than those on 2D (p<0.05) and 3D+BG (p<0.05), in which both of these genes and BSP expression were downregulated compared with control. At 10 and 14 days areas stained with Alizarin red were observed all evaluated groups, especially on BG cultures. At 10 days the amount of calcium on 3D+BG was higher than on control (p<0.05), and it was also higher on 2D+BG compared with 2D (p<0.05) and control (p<0.05). At 14 days, 2D+BG and 3D+BG showed greater calcium amount than control (p<0.05) and 2D (p<0.05). In conclusion, this study demonstrated that in vitro 3D cultures of hPDLF and osteogenic cells from newborn rats calvaria were able of support cell viability, differentiation, and to contribute to expression of fibroblastic and osteoblastic phenotype in hPDLF. The BG particles also favored the viability, differentiation, mineralized matrix formation and phenotypic expression in both cell types.

A cicatrização de feridas crônicas e de defeitos complexos representam desafios para a cirurgia plástica reconstrutiva. Novos tratamentos emergiram com a utilização de células tronco mesenquimais, com especial interesse para as derivadas de tecido adiposo (CTMs-TA), por possuir algumas vantagens em relação às derivadas da medula óssea. Algumas doenças poderiam se beneficiar com o uso das CTMs-TA, em particular, as feridas de pacientes portadores de anemia falciforme que ainda representam um desafio terapêutico. Neste estudo, investigou-se a existência de possíveis áreas doadoras preferenciais de CTMs-TA no tecido adiposo (TA) por meio da comparação de aspectos qualitativos e quantitativos das CTMs-TA derivadas de cinco diferentes áreas corporais. Posteriormente, analisou-se a influência do sobrenadante dessas células, rico em citocinas e fatores de crescimento, sobre a migração de fibroblastos de indivíduos normais e de portadores de anemia falciforme in vitro. Não foram observadas diferenças qualitativas entre as CTMs-TA das cinco áreas analisadas. A região do dorso apresentou número maior de CTMs, com diferença significativa em relação à região das coxas. A adição de sobrenadante produzido por CTMs-TA demonstrou aumento da velocidade de migração dos fibroblastos de forma similar para os normais e os falciformes. O microambiente desfavorável presente nas feridas falciformes parece exercer importante influência sobre esses fibroblastos, pois uma vez corrigido o microambiente com os meios de cultivo apropriados, as células apresentaram taxa de duplicação e velocidade de migração semelhante à dos fibroblastos normais in vitro. / The healing of chronic wounds and complex defects represents challenges for reconstructive plastic surgery. New treatments have emerged with the use of multipotent mesenchymal cells, with special interest for the adipose-derived stem cells (ADSCs) as it has some advantages over the bone marrow-derived. Some diseases could benefit from the use of ADSCs, in particular, the wounds of patients with sickle cell anemia that still represent a therapeutic challenge. In this study, we investigated the existence of possible preferential donor areas of ADSCs in adipose tissue by comparing qualitative and quantitative aspects of ADSCs derived from five different body areas. Later, we analyzed the influence of the supernatant of these cells, rich in cytokines and growth factors, on the migration of fibroblasts from healthy individuals and from patients with sickle cell anemia in vitro. No qualitative differences were observed among the ADSCs of the five areas analyzed. The dorsum presented a higher number of ADSCs, with a significant difference in relation to the thigh. Addition of supernatant produced by ADSCs has been shown to increase the rate of migration of fibroblasts in a similar way to healthy and sickle cells. The unfavorable microenvironment present in sickle wounds seems to exert a significant influence on these fibroblasts because once the microenvironment was corrected with the appropriate culture media, the cells had a doubling rate and migration rate similar to normal fibroblasts in vitro.

A terapia com laser em baixa intensidade, conhecida como Low-intensity laser therapy (LILT), tem sido alvo de pesquisas que buscam esclarecer os mecanismos pelos quais o laser age na cicatrização de feridas. Este processo é dependente da transmissão de sinais entre epitélio e conjuntivo, os quais influenciam a proliferação e a migração celular, onde participam fatores de crescimento. O objetivo desta pesquisa foi verificar os efeitos da radiação com lasers vermelho e infravermelho em baixa intensidade na produção de fatores de crescimento por fibroblastos in vitro. Foi obtida uma cultura primária de fibroblastos gengivais humanos (linhagem FGH). As células foram cultivadas em placas de 96 poços (5 x 103 células /poço), em estado de quiescência (meio de cultura suplementado com 1% de soro fetal bovino) e irradiadas com lasers de diodo (AlGaAs - 660nm, e AlGaInP - 780nm). O laser em modo contínuo, foi aplicado em contato e na forma pontual. A potência utilizada foi de 40mW numa área de 0,042cm2 e com densidades de energia de 2, 3, 4, 5 e 6J/cm² com respectivos tempos de aplicação de 2, 3, 4, 5 e 6s. As culturas foram irradiadas duas vezes com 6h de intervalo. Os grupos controle positivo e negativo foram cultivados com 10% e 1% de soro fetal bovino, respectivamente e não receberam irradiação. A produção do fator de crescimento de queratinócitos (KGF) e do fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) foi analisada e quantificada por ensaio imunoenzimático (método ELISA) no meio condicionado pelas células. Os dados foram comparados estatisticamente pela análise de variância e teste de Kruskal-Wallis complementados pelos testes de Tukey e Dunn, respectivamente (p<0,05). Culturas de todos os grupos produziram KGF e bFGF. Controles positivos produziram maior quantidade de KGF e bFGF que controles negativos. A produção de KGF foi similar em todos os grupos experimentais. A produção de bFGF foi significativamente maior nos grupos tratados com o laser infravermelho nas densidades de energia de 3J/cm2 e 5J/cm2 quando comparados com os controles. Baseados nas condições deste estudo, concluiu-se que a LILT não influencia a produção de KGF, porém, influencia positivamente a produção de bFGF de maneira dependente do comprimento de onda e da densidade de energia empregados. O infravermelho, nas densidades de energia de 3J/cm2 e 5J/cm2, é capaz de aumentar a produção deste fator de crescimento. Portanto, a utilização da LILT nestes parâmetros poderá constituir papel relevante na cicatrização de feridas. / Low-intensity laser therapy (LILT) has been the subject of researches to understand the mechanisms by which the laser acts stimulating wound healing. This process is dependent of a signaling transfer between epithelium and connective tissue and it influences cellular proliferation and migration. Growth factors are directly involved in these mechanisms. The aim of this study was to analyze the effects of red and infrared low-level laser on production of fibroblast growth factors by human gingival fibroblasts in vitro. The cells were obtained by primary culture (FGH cell line). They were grown in 96 wells plates (5x10³ cells / well) in a quiescence environment (1% fetal bovine serum) and then they were irradiated with a diode laser (GaAlAs - 660nm, and InGaAlP - 780nm). The continuous laser was applied in contact and in a punctual mode. The power was 40mW, the area of irradiation was 0,042cm2, the energy densities were 2, 3, 4, 5 and 6J/cm² with 2, 3, 4, 5 and 6s of time application, respectively. The cultures were irradiated twice with 6 h-interval. The positive and negative control groups were grown in 10% and 1% of bovine fetal serum, respectively and didn?t receive any irradiation. The production of keratinocyte growth factor (KGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) was analyzed and quantified by immunoenzymatic test (ELISA) in the conditioned medium. The data were compared statistically by analysis of variance and Kruskal-Wallis, complemented by Tukey?s and Dunn?s tests, respectively (p<0,05). Positive controls produced more KGF and bFGF than negative controls. The KGF production was similar in all experimental groups. The bFGF production was significantly higher in groups treated with infrared laser with energy densities of 3J/cm² and 5J/cm² when compared to controls. Based on these study conditions, authors concluded that LILT doesn?t influence KGF production although it positively influences bFGF production in a dependent manner from wavelength and energy density. Infrared laser with energy densities of 3J/cm² and 5J/cm² is capable of improving the production of this growth factor. Therefore the LILT in these parameters can constitute a relevant role on wound healing.