<p>Post-traumatic arthritis (PTA) is arthritis that develops following joint injury, including meniscus and ligament tears. Current treatments for PTA range from over-the-counter medication to knee replacement; however, in the presence of obesity, the levels of pro-inflammatory cytokines, such as interleukin-1 (IL-1) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α,) are more elevated than in non-obese individuals. The role of fatty acids, obesity, and PTA has been examined, with omega-3 fatty acids showing promise as an anti-inflammatory after injury due to its ability to suppress IL-1 and TNF-α. Due to the difficulty in switching patients’ diets, an alternative solution to increasing omega-3 levels needs to be developed. The Fat-1 enzyme, an omega-3 desaturase that has the ability to convert omega-6 to omega-3 fatty acids, may be a good target for increasing the omega-3 levels in the body. </p><p>In the first study, we examined whether Fat-1 transgenic mice on a high-fat diet would exhibit lower levels of PTA degeneration following the destabilization of the medial meniscus (DMM). Both male and female Fat-1 and wild-type (WT) littermates were put on either a control diet (10% fat) or an omega-6 rich high-fat diet (60% fat) and underwent DMM surgery. Arthritic changes were examined 12 weeks post-surgery. Fat-1 mice on both the control and high-fat diet showed protection from PTA-related degeneration, while WT mice showed severe arthritic changes. These findings suggest that the omega-6/omega-3 ratio plays an important role in reducing PTA following injury, and demonstrates the potential therapeutic benefit of the Fat-1 enzyme in preventing PTA in both normal and obese patients following acute injury.</p><p>Following this, we needed to establish a translatable delivery mechanism for getting the Fat-1 enzyme, which is not present in mammalian cells, into patients. In the second study, we examined whether anti-inflammatory gene delivery of the Fat-1 enzyme would prevent PTA following DMM surgery. In vitro testing of both lentivirus (LV) and adeno-associated virus (AAV) was completed to confirm functionality and conformation of the Fat-1 enzyme after transduction. Male WT mice were placed on an omega-6 rich high-fat diet (60% fat) and underwent DMM surgery; either local or systemic AAV injections of the Fat-1 enzyme or Luciferase, a vector control, were given immediately following surgery. 12 weeks post-surgery, arthritic changes were assessed. The systemic administration of the Fat-1 enzyme showed protection from synovial inflammation and osteophyte formation, while administration of Luciferase did not confer protection. These findings suggest the utility of gene therapy to deliver the Fat-1 enzyme, which has potential as a therapeutic for injured obese patients for the prevention of PTA.</p> / Dissertation

Apesar da aparente acessibilidade, a pele é bem protegida contra a absorção de materiais estranhos. Esta função barreira é exercida principalmente pelo estrato córneo. Dessa forma, a administração cutânea de fármacos precisa transpor esta barreira para atingir uma concentração efetiva. Uma maneira de tornar o tratamento eficaz é o uso de injeções, forma de administração muito invasiva e desconfortável para o paciente. A administração tópica é uma forma simples e confortável para a administração cutânea de fármacos. As doenças cutâneas, em geral, são doenças estigmatizadas. Assim, o desenvolvimento de uma formulação capaz de transpor as barreiras impostas a esta via de administração e um novo tratamento para estas doenças complexas, com componentes genéticos, devem ser estudados. O siRNA veiculado com nanocarreadores foi aplicado a esta via de administração. O nanocarreador possibilita um maior tempo de permanência na superfície da pele devido às propriedades adesivas, além de proteger o siRNA contra a degradação. O siRNA visa o bloqueio específico da expressão de genes, por isso é capaz de agir em diferentes caminhos de uma doença. A maior limitação para o uso de siRNA é a incapacidade de difundir-se através das membranas celulares devido a carga negativa, o que gera uma repulsão eletrostática da membrana celular. Portanto, a complexação com um carreador torna a liberação do siRNA no interior celular mais efetiva. É amplamente aceito que o desenvolvimento de um sistema de liberação eficiente é um dos principais obstáculos para transformar siRNA em terapêutica. Consequentemente, o objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento farmacotécnico de um nanocarreador capaz de liberar o siRNA de maneira efetiva na aplicação tópica cutânea, respeitando as peculiaridades desta via. As formulações de monoleína (MO), polietilenoimina (PEI) e diferentes concentrações de vitamina E TPGS, contendo ou não ácido oléico (AO), foram caracterizadas como fases líquido cristalinas com tamanho de partícula e potencial zeta desejado, mostrando-se eficazes em complexar o siRNA. As nanodispersões desenvolvidas foram efetivas na complexação do siRNA, na estabilização deste ácido nucléico frente a degradação enzimática, e na efetiva internalização celular in vitro em células de fibroblastos de camundongos L929. As nanodispersões contendo maior quantidade de vitamina E TPGS, ou contendo o AO foram as formulações que promoveram um maior aumento da penetração cutânea de siRNA in vitro em peles de modelo animal. Logo, os resultados obtidos permitiram concluir que as formulações desenvolvidas são sistemas de liberação nanotecnológicos, contendo cristais líquidos, promissores para a administração tópica de siRNA, no tratamento de patologias cutâneas na terapia gênica / Despite its apparent easy accessibility, the skin is, in fact, well protected against the absorption of foreing materials. The barrier function is imposed, mainly, by the stratum corneum. Thus, the cutaneous administration of drugs needs to overcome this barrier to reach an effective concentration. One way to make an effective treatment is the use of injections, mode of administration very invasive and uncomfortable for the patient. Topical administration is simple and comfortable for cutaneous administration of drugs. Skin diseases, in general, are stigmatized diseases. Therefore, the development of a formulation capable of overcoming the barriers of this route of administration and a new treatment for these complex diseases, with the genetic components, shall be studied. The siRNA in nanocarriers has been applied to this route of administration. The nanocarrier allows siRNA to stay longer on the skin surface because of its adhesive properties, while also protects siRNA against degradation. The siRNA is directed for producing gene-specific inhibition, so it is able to act in different ways to the same disease. The most critical factor limiting the use of siRNA as therapeutics is delivering siRNA to its intracellular target site due to their negative charge, which cause an electrostatic repulsion of the cell membrane. Therefore, complexation with a carrier makes the release of siRNA inside the cells more effective. It is widely accepted that the development of an efficient delivery system is a major obstacle to change siRNA into therapeutics. Consequently, the objective of this work was the pharmacotechnical development of a nanocarrier capable of releasing the siRNA effectively in topical skin, respecting the peculiarities of this pathway. The formulations of monoolein (MO), polyethylenimine (PEI) and different concentrations of vitamin E TPGS, with or without oleic acid (OA), were characterized as liquid crystalline phases with particles size and zeta potential desired, proving to be effective in complexing the siRNA. The nanodispersions developed were effective for the complexation of siRNA, for the stabilization of nucleic acid against enzymatic degradation, and for the effective in vitro cellular uptake into cells of mouse fibroblast L929. The nanodispersions containing higher amounts of vitamin E TPGS, or containing OA, have been the formulations which promoted a greater increase in skin penetration of siRNA in vitro in animal model skin. Therefore, the results obtained allowed one to conclude that the formulations developed are delivery systems based on nanotechnology, with liquid crystalline phase, promising for topical administration of siRNA, for the treatment of cutaneous diseases in gene therapy

De précédents travaux de recherche ont montré la présence de phénomènes inflammatoires dans les muscles de patients souffrant d’une maladie génétique rare nommée dystrophie musculaire des ceintures de type 2A (en anglais, LGMD2A), et ceci très tôt dans le développement de cette maladie. Il a aussi été observé les mêmes phénomènes chez le modèle animal de la maladie. C’est pourquoi nous avons mené une étude sur l’animal pour tenter d’étudier ces phénomènes afin d’en comprendre leur origine et leur(s) mécanisme(s). En parallèle de ce projet, nous avons développé et testé deux outils de thérapie génique : il s’agit de deux concepts qui vont permettre soit de réparer l’ARN au niveau du transcrit du gène CAPN3 muté responsable de la maladie, soit de permettre aux cellules du muscle de produire une protéine calpaïne-3 fonctionnelle, qui ne peut exercer son rôle correctement à cause des mutations qui la rende non opérationnelle. / Previous research works showed inflammatory phenomena early in muscles of patients affected with a rare genetic disease called Limb Girdle Muscular Dystrophy type 2A (LGMD2A). This very same phenomena have been observed in LGMD2A animal models. For these reasons we conducted an animal-oriented study to apprehend these phenomena from its origin to mechanism(s). In parallel of this project, we designed and evaluated two gene therapy tools: one to repair RNA on CAPN3 gene transcript that is responsible of LGMD2A, another one to help muscle cells to produce a functional calpain-3 protein based on an inter molecular compensation with vector expressing domains of calpain 3

A terapia gênica por interferência de RNA (RNAi) trata-se de um processo de silenciamento pós-transcricional capaz de suprimir a expressão de um determinado gene. A RNAi é uma proposta terapêutica promissora para o tratamento de muitas doenças severas que ainda não possuem cura ou terapias bem definidas. Porém, é necessário o desenvolvimento de sistemas de liberação clinicamente adequados, seguros e eficazes para se viabilizar essa nova terapêutica, uma vez que obstáculos na administração e distribuição in vivo comprometem o uso clínico dos siRNAs (small interfering RNA). Paralelamente, a liberação tópica de siRNAs surge como uma alternativa promissora para o tratamento de patologias cutâneas. Neste contexto, a presente pesquisa teve como objetivo o desenvolvimento de um sistema de liberação baseado em nanotecnologia para a liberação tópica de siRNAs, visando introduzir a terapia gênica como nova abordagem para o tratamento de patologias cutâneas. Como sistema de liberação, foram desenvolvidas nanodispersões líquido-cristalinas aquosas, compostas por monoleína (MO), um lipídeo polar biocompatível, associadas ou não com ácido oléico (AO). Foram incorporados a esses sistemas os adjuvantes catiônicos polietilenoimina (PEI) e oleilamina (OAM) para obtenção das nanodispersões. Dentre as nanodispersões aquosas desenvolvidas, foram escolhidas as preparações com as menores concentrações de adjuvantes catiônicos, a saber: MO e OAM a 0,4%, MO e PEI a 0,4%, MO, AO e OAM a 2,5% e MO, AO e PEI a 1,0%. Estas formulações apresentaram: reduzido tamanho médio das partículas, baixa polidispersividade, valores de potencial zeta positivos (característica interessante para interação com as moléculas de siRNA que apresentam carga negativa), baixa citotoxicidade in vitro e foram capazes de complexar o siRNA na concentração final de 2,5 ?M. A análise de difração de raios X caracterizou a fase líquido-cristalina desses sistemas como hexagonal, exceto a nanodispersão MO e PEI a 0,4% que foi caracterizada como uma mistura de fase hexagonal e cúbica. As nanodispersões obtidas foram capazes de aumentar a penetração cutânea de siRNA in vitro. Face aos resultados obtidos, podemos concluir que as formulações desenvolvidas são sistemas de liberação de base nanotecnológica promissores para administração tópica de siRNA para o tratamento de patologias cutâneas na terapia gênica. / Gene therapy by RNA interference (RNAi) is a post-transcriptional silencing process that can suppress the expression of a particular gene. The RNAi is a promising therapeutic approach for the treatment of many severe diseases that have no cure or well-defined treatments. However, the development of clinically appropriate, safe and effective delivery systems is necessary to enable this new therapy, since obstacles in the in vivo administration and distribution committed the clinical use of siRNAs (small interfering RNA). In addition, the topical delivery of siRNAs appears as a promising alternative for the treatment of cutaneous pathologies. In this context, this research aimed to develop a delivery system based on Nanotechnology for the topical delivery of siRNAs, aiming to introduce gene therapy as a new approach for the treatment of skin disorders. As a delivery system, liquid-crystalline nanodispersions, composed by monoolein (MO), a polar biocompatible lipid, associated or not with oleic acid (OA) were developed. The cationic adjuvants polyethylenimine (PEI) and oleylamine (OAM) were incorporated into these systems to obtain the nanodispersions. Among the aqueous nanodispersions developed, preparations with lower concentration of cationic adjuvant were chosen, these consisting of: MO and OAM at 0.4%, MO and PEI at 0.4%, MO, OA and OAM at 2.5% and MO, OA and PEI at 1.0%. These formulations presented: reduced average particle size, low polydispersity, positive values of zeta potential (an interesting feature for interacting with the siRNA molecules that have a negative charge), low cytotoxicity in vitro and they were able to complex the siRNA at a final concentration of 2.5 ?M. The X-ray diffraction analysis characterized the liquid crystalline phase of these systems as hexagonal, except the nanodispersion MO and PEI at 0.4% which was characterized as a mixture of cubic and hexagonal phases. The nanodispersions obtained were able to increase the skin penetration of siRNA in vitro. With the results obtained, we can conclude that the formulations developed are delivery systems based on nanotechnology, promising for topical administration of siRNA for the treatment of cutaneous diseases in gene therapy.

A terapia gênica consiste em introduzir uma sequência de nucleotídeos, codificante ou não-codificante, que tenha a capacidade de interferir na progressão de uma doença por ativação, inativação ou modulação da expressão de um gene alvo. Uma das rotas de transferência gênica é a ex vivo. Essa rota consiste em realizar a modificação gênica ex vivo de um tipo celular do organismo afetado, seguida do transplante celular no indivíduo para a correção do fenótipo. Dentre os vários vetores virais utilizados para transferência gênica, o sistema lentiviral é considerado um dos mais eficazes, visto que é capaz de manter altos níveis de expressão a longo prazo. Além disso, dentre os vetores virais que se integram no genoma, esse é considerado o mais seguro, tendo apresentado apenas um caso com relatado de efeito colateral sem reação adversa. Uma nova tecnologia utilizada para padronizar sistemas biológicos é a biologia sintética. Essa tecnologia pode ser utilizada como ferramenta para produzir e/ou otimizar sistemas de expressão para produção de proteínas de interesse terapêutico. O objetivo desse trabalho é gerar um vetor lentiviral sintético, para terapia gênica ex vivo, para reposição enzimática. Foram geradas quatro linhagens celulares humanas com produção transiente das proteínas terapêuticas Prot_Ctr e Prot_Mut sob controle dos promotores CMV e HeF1a. Para padronização do ensaio de transfecção, foram geradas duas linhagens celulares humanas que expressão da proteína fluorescente verde (GFP) sob controle dos mesmos promotores citados acima. Como controle negativo das linhagens produtoras da proteína terapêutica, foi gerada uma linhagem como vetor plasmidial vazio pLV_GTW_Mock. O nível de expressão do mRNA relativo às proteínas terapêuticas variou de 3.581,95 ± 1.322 a 10.377,18 ± 2.562 URE, não havendo diferenças significativas entre as linhagens produzidas (p > 0,05). O nível de produção da proteínas terapêuticas variou de 30,98 UI/mL a 241,1 UI/mL. A linhagem com maior produção dessa proteína foi a 293T/HeF1a_Prot_Mut, e essa diferença é significativa (p < 0,05). A partir da transfecção dos plasmídeos auxiliares e plasmídeo portador do cDNA que codifica a Prot-Mut na linhagem celular 293-T foi obtido o vetor lentiviral com título de 1,68x107 pLV/mL. Em conclusão, é possível gerar um vetor lentiviral funcional portador da Prot_Mut para utilização em terapia gênica ex vivo. Espera-se que o produto desse projeto de pesquisa gere uma patente. Para evitar a quebra de novidade, atividade inventiva e suficiência descritiva, requisitos mínimos de patenteabilidade, os resultados foram apresentados sem mencionar a doença e o gene em estudo / Gene therapy involves introducing a nucleotide sequence, coding or non-coding that can to interfere with the progression of a disease by activating, inactivating or modulating the expression of a target gene. One of the gene transfer routes is the ex vivo. This route consists in producing a ex vivo gene modification of a cellular kind of the affected organismo, following the transplant of those cells to correct the fenotype. Among the various viral vectors used for gene transfer, the lentiviral system is considered one of the most effective, since it is able to maintain high levels of long-term expression. Between the viral vectors that integrate into the genome, the lentiviral system is considered the safest, and It has only filed a case with reported side effect without adverse reaction. A new technology used to standardize biological systems is the synthetic biology. This technology can be used as a tool to produce and/or optimize expression systems for production of proteins of therapeutic interest. The aim of this study is to generate a synthetic lentiviral vector for ex vivo gene therapy, for enzyme replacement therapy. It were generated four human cell lines with transient production of therapeutic proteins Prot_Ctr and Prot_Mut under the control of CMV and HeF1a promoters. To standardize the transfection assay were generated two human cell lines expressing green fluorescent protein (GFP) under control of the same promoters cited above. As a negative control of the producing cell lines, It was generated a human cell line with an empty plasmid vector pLV_GTW_Mock. The level of mRNA expression relative to the therapeutic proteins ranged from 3581,95 ± 1322 to 10377,18 ± 2562 REU, there were no significant differences among the produced cell lines ( p > 0.05 ). The production level of therapeutic proteins ranged from 30.98 IU/mL to 241.1 IU/mL. The cell line with the highest production of the therapeutic protein was 93T/HeF1a_Prot_Mut+, and this difference is significant (p < 0.05 ). From the transfection of the plasmid containing the cDNA encoding the Prot_Mut and packing plasmid It was obtained lentiviral vector with the titer 1,68x107 pLV/mL. In conclusion, it is possible to generate a functional lentiviral vector carrying the Prot_Mut for use in ex vivo gene therapy. It is expected that the product of this research project generates a patent. To avoid breaking novelty, inventive activity and descriptive sufficiency, minimum requirements for patentability, the results were presented without mentioning the disease and the gene under study

Este trabalho descreve a remediação simultânea de dois genes supressores de tumor, CDKN2A e p53, em três linhagens celulares derivadas de glioblastoma multiforme: U87 (CDKN2A-/-, p53wt/wt), U251 (CDKN2A-/-, p53mut/mut) e T98G (CDKN2A-/-, p53mut/mut). A entrega gênica foi mediada por vetor adenoviral bicistrônico contendo o cassete CDKN2AIRESp53, capaz de expressar as duas proteínas simultaneamente. Vetores monocistrônicos também foram testados (AdCDKN2A e Adp53). Visando detectar apoptose, as linhagens receberam o sensor de atividade de caspase-3/7 GFP-DEVD-ssGLUC por transdução lentiviral. Este possui Gaussia luciferase (GLUC) C-terminal, que é secretada após ativação de caspases e pode ser dosada no sobrenadante. Após a marcação, realizaram-se ensaios de viabilidade celular, proliferação, formação de colônias, senescência, ciclo celular e dosagem de GLUC após remediação dos genes supressores de tumor nas linhagens GBMDEVD-GLUC. Com ensaio de viabilidade, observou-se efeito citotóxico do vetor bicistrônico AdCDKN2AIRESp53 maior que a soma dos obtidos com cada tratamento monocistrônico. No ensaio de senescência, o vetor AdCDKN2A resultou na maior indução do fenótipo senescente em todas as linhagens, seguido por Adp53, enquanto AdCDKN2AIRESp53 produziu resultados similares a um desses dois perfis em cada linhagem. Dosagem de GLUC no sobrenadante foi usada como indicador para atividade de caspase-3/7 após tratamento com os vetores supressores de tumor. O controle AdLacZ resultou em atividade de GLUC maior que nas amostras sem vírus (mock), enquanto tratamento com AdCDKN2A obteve resultados maiores que o controle em 72 h nas três linhagens. O vetor AdCDKN2AIRESp53 alcançou, inesperadamente, resultados variados em 72 h. Os dados obtidos neste trabalho indicam que a remediação simultânea de CDKN2A e p53 possui notável ação antiproliferativa tumoral, podendo levar à morte ou à senescência celular. Também é apontado que o sensor de caspase-3/7 GFP-DEVD-ssGLUC é robusto, mas detecta não apenas a indução de apoptose, mas a combinação de todos os processos ativadores de caspases em uma amostra. / This thesis describes the simultaneous remedy of two tumor suppressor genes, CDKN2A and p53, in three glioblastoma multiforme (GBM)-derived cell lines: U87 (CDKN2A-/-, p53wt/wt), U251 (CDKN2A-/-, p53mut/mut) and T98G (CDKN2A-/-, p53mut/mut). Gene delivery was mediated by a bicistronic adenoviral vector bearing the sequence CDKN2AIRESp53, which simultaneously expresses both proteins. Monocistronic vectors were also tested (AdCDKN2A and Adp53). To detect apoptosis, the GBM cell lines received caspase-3/7 sensor GFP-DEVD-ssGLUC via lentiviral transduction. This sensor has a C-terminal Gaussia luciferase (GLUC), which is secreted by the cell after caspase activation and can be measured in the supernatant. After sensorization, functional assays were carried out, including cell viability, proliferation, colony formation, cell senescence, cell cycle and GLUC measure after treatment with the tumor suppressor vectors in GBMDEVD-GLUC lineages. Viability assay with the AdCDKN2AIRESp53 vector resulted in a remarkable cytotoxic effect, greater than the sum of the effects with each monocistronic treatment. In the senescence assay, vector AdCDKN2A yielded the highest induction of cell senescence in all lineages, followed by Adp53, while AdCDKN2AIRESp53 induced results that followed one of these two profiles in each cell line. GLUC measure was an indicator of intracellular caspase-3/7 activity after treatment with the tumor supressor vectors. Control vector AdLacZ resulted in higher GLUC activity than mock treatment in all three cell lines, while AdCDKN2A treatment showed results bigger than control at 72 h in all cell lines. Bicistronic vector AdCDKN2AIRESp53 reached, unexpectedly, varied results at 72 h in all cell lines. Data obtained in this study indicate that simultaneous remedy of CDKN2A and p53 has remarkable antiproliferative activity in GBM cells, resulting in cell death or cell senescence. It is also shown that caspase-3/7 sensor GFP-DEVD-ssGLUC is a robust tool, but its results detect not only a single cellular process, such as apoptosis, but the combination of all caspase-activating processes in a cell population.

La maladie de Sandhoff est une maladie génétique rare due à des mutations du gène HEXB. Elle se caractérise par un double déficit en hexosaminidase A (αβ) et B (ββ), responsable d’une accumulation de ganglioside GM2 essentiellement dans le système nerveux central (SNC). Cliniquement, la maladie débute dès les premiers mois de vie et le décès survient vers l’âge de 3 ans. A ce jour, aucun traitement n’est disponible pour cette maladie. Le modèle murin obtenu par invalidation du gène Hexb est un bon outil pour le développement d’approches thérapeutiques, car il présente un phénotype proche de la maladie humaine. Le but principal de mon projet de thèse était d’explorer une approche de transfert de gène dans le modèle murin de la maladie de Sandhoff en utilisant un vecteur scAAV9. Ce vecteur a la particularité de pouvoir traverser la barrière hématoencéphalique et de transduire le SNC après administration intraveineuse (IV). Un vecteur codant la chaîne β des hexosaminidases, appelé scAAV9-Hexb, a précédemment été administré par voie IV à des souris en période néonatale à une dose de 3,5 x 1013 vg/kg. Les souris traitées ont survécu comme les souris normales (>700 jours) sans développer d’atteinte neurologique, ni périphérique alors que les souris Sandhoff non traitées sont décédées vers l’âge de 4 mois. J’ai réalisé toutes les analyses à long terme des souris traitées en utilisant des tests de comportements, ainsi que des analyses tissulaires 24 mois après le traitement. Une analyse lipidique par HPTLC a montré que la surcharge en ganglioside GM2 est totalement absente au niveau du cerveau (4 mois après l'injection), alors que dans le cervelet cette accumulation est non significative, mais pas totalement absente. Aucun symptôme lié à cette surcharge n’a été mis en évidence chez les souris à 24 mois, mais nous nous sommes posé la question d’un possible effet délétère à long terme en cas d’extrapolation à la clinique. Nous avons donc décidé de tester une double administration IV + ICV (intracérébroventriculaire) en utilisant le même vecteur et la même dose globale de façon à mieux corriger le cervelet. Deux groupes de souris ont été injectés en période néonatale en utilisant des doses différentes dans les deux compartiments. Les analyses ont montré que dans le cerveau, à court terme, la restauration de l’activité enzymatique est partielle, mais significative. Par ailleurs, il existe une absence totale de surcharge en GM2, ainsi qu’une correction des biomarqueurs associés à la maladie. Dans le cervelet, l’efficacité du traitement a été montrée seulement pour le groupe traité avec la dose la plus importante en ICV, ce qui suggère qu’une dose minimale en ICV est nécessaire pour atteindre de manière globale le SNC. Ces résultats ont été confirmés par l’analyse à long terme. Concernant le foie, nos résultats ont montré qu’une dose IV minimale est nécessaire pour obtenir une baisse de l’accumulation lipidique. Ce travail a permis de définir les doses minimales nécessaires dans chaque compartiment (IV et ICV) et il montre que la double administration peut être avantageuse pour traiter toutes les régions du SNC et notamment les plus atteintes, comme le cervelet. Il va maintenant nous permettre de traiter de façon optimale les souris adultes. L’autre but de mon projet était d’explorer les défauts de signalisation et la physiopathologie cellulaire dans la maladie de Sandhoff en utilisant des études in vivo et in vitro. Les études in vitro ont été réalisées sur des fibroblastes de patients et des cellules embryonnaires murines (MEF) obtenues à partir des souris Hexb-/- et la surcharge lysosomale a été confirmée dans ces cellules. La voie mTOR (mammalian target of rapamycin) a été analysée et nous avons montré qu’elle était dérégulée. L’activité autophagique a aussi été étudiée et nous avons mis en évidence une augmentation du nombre d’autophagosomes chez les souris Hexb-/- suggérant un défaut de cette voie. (...) / Sandhoff disease (SD) is a genetic disorder due to mutations in the HEXB gene. It is characterized by a double Hex A (αβ) and B (ββ) deficiency, responsible for a GM2 accumulation, mainly in the central nervous system (CNS). Clinically, SD begins in the first months of life and culminates in death around 3 years of age. So far, no specific treatment is available for Sandhoff disease. The murine model obtained by invalidation of the Hexb gene is a useful tool for the development of therapeutic approaches, as it exhibits a phenotype quite close to the human disease. The main aim of my PhD project was to explore a gene transfer approach in Sandhoff mice using a specific scAAV9. This vector has the particularity to cross the blood-brain barrier after intravenous (IV) administration and to transduce brain. A vector encoding the hexosaminidases β chain, called scAAV9-Hexb, has been previously IV injected in neonatal Hexb-/- mice with a dose of 3.5 x 1013 vg/kg. I participated to the long-term analysis of the scAAV9-Hexb treated mice using behavioral tests and analysis of tissues at 24 months post-injection. Mice had a survival similar to normal mice (>700 days) without neurological sign and peripheral damage by comparison with naïve Sandhoff mice (death around 120 days). At 4 months post-treatment, lipid analysis using HPTLC showed that GM2 storage was absent in brain, but it was only decreased in cerebellum of treated mice. Even if no symptom was associated with this residual storage in mice at 2 years, we wondered if it could possibly be pathogenic at longer-term if extrapolated to patients. Therefore, we decide to test a combined way of administration i.e. intravenous (IV) + intracerebroventricular (ICV) using the same vector with the same final dose. Two groups of mice were injected using different doses in both compartments and treatment efficacy was evaluated at short- and long-term. In the cerebrum, at short-term, enzymatic activities were partially but significantly restored, GM2 accumulation was completely prevented and disease biomarkers corrected. In the cerebellum, a significant increase of enzymatic activity was only obtained for the group treated with the highest dose in the ICV compartment. Regarding GM2 analysis and long-term behavioral analysis, we confirmed that this dose is required to cure cerebellum. In liver, our results suggest that IV minimal dose is needed to obtain a decrease of lipid accumulation. Our results showed that minimal doses are required in ICV and IV to obtain a good efficacy in each compartments, and that combined administration permit a widespread correction in the CNS. These data will permit to treat adult mice with the optimal treatment. The other goal of my project was to explore signaling defects and cellular pathophysiology in Sandhoff disease using in vivo and in vitro studies. For in vitro studies, fibroblasts from Tay-Sachs and Sandhoff patients were analyzed and mouse embryonic fibroblasts (MEF) were obtained from the Hexb-/- murine model, lysosomal storage was confirmed. mTOR (mammalian target of rapamycin) pathway was studied showing signaling deregulation. Autophagy was analyzed in vitro and in vivo, as defect in this pathway has been reported in other lysosomal storage disorders. An increase of autophagosomes number was observed in Hexb-/- subjects suggesting a defect in autophagy. These results offer novel biomarkers of Sandhoff pathology which can be useful to test the efficacy of therapeutic approaches. They can also provide new therapeutic targets that could be tested in combination with gene transfer.

A terapia gênica tem sido empregada em estudos pré-clínicos e clínicos, com o intuito de amenizar ou curar uma doença. Vetores retrovirais são uma ferramenta de transferência gênica largamente utilizada. Vetores bicistrônicos são uma alternativa interessante para o tratamento de doenças complexas. Na construção de um vetor bicistrônico pode-se empregar várias estratégias dentre elas a utilização da sequência IRES. A endostatina, fragmento do colágeno XVIII, tem sido muito utilizada na terapia anti-angiogênica devido sua ação inibitória no crescimento de células endoteliais. A imunoterapia tem sido utilizada como tratamento coadjuvante de tumores. Dentre as citocinas utilizadas, a interleucina-2 promovendo a proliferação de linfócitos T, tem sido utilizada em diversos estudos pré-clínicos e clínicos. O objetivo deste projeto foi construir e caracterizar in vitro um vetor retroviral bicistrônico codificando endostatina e interleucina-2 utlizando a sequência IRES. A construção do vetor foi realizada em três etapas, sendo comprovada a construção final por análise de restrição e seqüenciamento. Células de empacotamento foram transfectadas com o vetor, e posteriormente realizada a transdução na célula alvo. A endostatina e a interleucina-2 foram determinadas por Dot blot, seguido de análise da expressão por RT-PCR e ensaio de atividade. O vetor construído apresentou altos níveis de titulação viral, variando de 4.20x105 a 1.53x106UFC/mL. A determinação da endostatina e da interleucina-2 variaram entre 1.08 a 2.08g/106cels.24h e 0.66 a 0.89&mu;g/106cels.24h, respectivamente. A expressão da endostatina no clone NIH3T3-pLend-IRES-IL2SN foi 2 vezes superior á apresentada pelo clone NIH3T3-pLend-IRES-IL2SN. A endostatina produzida promoveu uma inibição da proliferação de 40% das células endoteliais; e a interleucina-2 promoveu uma proliferação de 10.6% de linfócitos CD4 e 8.9% de CD8. Desta forma, a construção obtida neste trabalho representa uma excelente ferramenta para estudos da biologia celular do câncer e novas estratégias terapêuticas. / Gene therapy has been used in preclinical studies and clinical trials in order to alleviate or cure a disease. Retroviral vectors are a tool for gene transfer is widely used. Bicistronic vectors are an attractive alternative for treatment of complex diseases. A variety of options exists to simultaneously express two genes in genetically modified cells. The most common approach relies on bicistronic vectors in which the genes are linked to each other by an internal ribosome entry site allowing co-translational expression of both cistrons. Endostatin, the C-terminal fragment of collagen XVIII, is a potent angiogenesis inhibitor. At present, ES has been widely used in anti-angiogenic in a variety of experimental tumor models, and clinical trials to test it as an anti-tumor agent are already under way. Immunotherapy has been used as adjuvant treatment for tumors and has been used in several preclinical studies and clinical trials. The objective of this project was to construct and characterize in vitro an IRES-based bicistronic retroviral vector encoding endostatin and intereukin-2. The construction of the vector was performed in three stages, the final construction was analyzed by restriction analysis and sequencing. Packaging cells were prepared. The endostatin and interleukin-2 levels were determined by Dot blot. Monocistronic and bicistronic mRNA expression were analyzed by real time RT-PCR. Bicistronic vector showed high levels of virus trites, ranging from 4.20x105 to 1.53x106UFC/mL. Secreted levels of endostatin and interleukin-2 ranged from 1.08 to 2.08&mu;g/106cells.24h and 0.66 - 0.89g/106cells.24h, respectively. The mRNA expression of ES in the NIH3T3 clone pLend-IRES-IL2SN was 2 times higher than the level presented by the NIH3T3 clone pLendSN. The endostatin promoted inhibition (40%) of endothelial cell proliferation. Interleukin-2 promoted a proliferation of 10.6% lymphocytes CD4 and 8.9% of CD8. We conclude that the IRES bicistronic vector provides a powerful tool for studies of cell biology of cancer and new therapeutic strategies.

A miosina Va é uma proteína motora envolvida no transporte e posicionamento de vesículas, organelas e mRNA. Além disso, postulou-se que a miosina-Va atua no seqüestro do fator pró-apoptótico, Bmf, no citoesqueleto de actina. Pesquisas realizadas em nosso laboratório demonstraram que um fragmento da miosina Va (MVaf), que corresponde ao sítio ligante de DLC2-Bmf, é capaz de induzir intensa apoptose em células de melanoma e de carcinoma in vitro. O presente trabalho teve por objetivo principal avaliar o potencial do MVaf como agente antitumoral, através de abordagens de terapia gênica em modelo animal. Foram geradas linhagens estabilizadas e com expressão controlada pelo sistema Tet-ON onde a expressão de EGFP ou EGFP-MVaf é induzida com a adição de doxiciclina. Essas linhagens foram testadas quanto à porcentagem de morte por apoptose e ativação de caspases. Tumores foram induzidos em camundongos C57BL/6 por inoculação subcutânea de células tumorigênicas positivas ou não para a expressão de EGFP-MVaf. Também foram utilizadas linhagens de fibroblasto embrionário murino selvagem (MEFs WT) e nocautes para os fatores Bim/Bmf e Bax/Bak (MEFsBim-/-,Bmf-/-; MEFsBax-/-,Bak-/-) para estudos do mecanismo de ação do fragmento da miosina Va. Observou-se que a adição de butirato de sódio potencializa a expressão de EGFP-MVaf e, conseqüentemente, o efeito pró-apoptótico desse fragmento e que essas células são mais sensíveis aos quimioterápicos etoposídeo e taxol, apresentando maior susceptibilidade à apoptose. Verificou-se que a expressão de EGFP-MVaf em células de tumores de melanoma induzidos em camundongos C57BL/6J dificulta o crescimento desses tumores. Quanto ao estudo com MEFs, observou-se que células nocautes para os fatores pró-apoptóticos Bim/Bmf e Bax/Bak são menos susceptíveis à morte induzida pelo fragmento da miosina Va. Indução da expressão de MVaf desencadeia a liberação da proteína proapoptótica Smac (fusionada ao repórter fluorescente Cherry) do espaço intermembranas da mitocôndria para o citoplasma sugerindo que a morte apoptótica induzida por MVaf requer a permeabilização da membrana mitocondrial externa (MOMP). Concluindo, os dados apresentados aqui nos permitem propor o MVaf como uma molécula promissora para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas contra o câncer. / Myosin Va is a motor protein involved in the transport and positioning of vesicles, organelles and mRNA. Additionally, myosin-Va has been implicated in the sequestering of a proapoptotic factor, Bmf, to the actin cytoskeleton. Research in our laboratory demonstrated that a fragment of myosin Va (MVaf), which corresponds to the binding site of DLC2-Bmf, is capable to induce intense apoptosis in melanoma and carcinoma cells in vitro. Here, our goal was to assess the potential of MVaf as antitumor agent, through gene therapy approaches in animal models. We generated Tet-ON controlled B16-F10 melanoma cells whose expression of EGFP or EGFP-MVaf is induced with the addition of doxycycline. These cells were tested for apoptotic death and activation of caspases, and were used to induce tumors in C57BL/6J mice by subcutaneous inoculation. We also used cell lines of murine embryonic fibroblasts, wild-type (MEFs WT) and knockouts for the proapoptotic proteins Bim/Bmf or Bax/Bak (MEFsBim-/-,Bmf-/-, MEFsBax-/-,Bak-/-), to study the mechanism by which MVaf induces apoptosis. We observed that addition of sodium butyrate to the cultures enhances the EGFP-MVaf expression and, consequently, the pro-apoptotic effect of this fragment. Treated cells were more sensitive to the chemotherapeutic drugs etoposide and taxol, showing a higher susceptibility to apoptosis. Moreover, in vivo induction of EGFP-MVaf expression retards growth of B16-F10 melanoma tumors in mouse model. As for the study with MEFs, we observed that cells knockout for the proapoptotic factors Bim/Bmf or Bax/Bak are less susceptible to death induced by MVaf than wild-type MEFs. Accordingly, we showed that MVaf expression triggers release of the proapoptotic protein Smac (tagged with the fluorescent protein Cherry) supporting the involvement of the mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP) in the MVaf-induced apoptotic death response. In conclusion, these data lead us to propose MVaf as a promising molecule for the development of new therapeutic approaches against cancer.

A doença renal crônica (DRC) é uma afecção frequente em cães idosos, de alta morbidade e mortalidade, sendo definida como uma injúria renal morfo-funcional irreversível, de um ou ambos os rins, que está intrinsecamente associada à degeneração celular. Seu tratamento é paliativo, sendo que nos estágios mais avançados, o animal pode necessitar de hemodiálise ou transplante renal, prática dificultada e muitas vezes inviável na medicina veterinária. As células-tronco mesenquimais derivadas do tecido amniótico caracterizam-se por ser uma população de células de alta plasticidade e de grande potencial imunomodulador, sendo capazes de se diferenciar e produzir diferentes tipos celulares necessários num processo de reparação. Os avanços nos estudos das células-tronco podem tornar a terapia celular uma forma viável de tratamento alternativo ou adjuvante dessa doença, uma vez que estas poderiam restaurar a funcionalidade e manter a integridade do rim. O objetivo deste estudo foi avaliar se o tratamento experimental com células-tronco mesenquimais derivadas do âmnio (CTMAs) canino podem reduzir ou estabilizar a taxa de progressão e o quadro clínico da DRC em cães. Para tanto, células-tronco provenientes da membrana amniótica foram cultivadas até a segunda passagem (P2) e criopreservadas para posterior aplicação. Onze cães domésticos, machos e/ou fêmeas, acometidos pela DRC adquirida em graus II ou III segundo classificação da IRIS e sem outra afecção adjacente receberam duas aplicações de CTMAs nos dias D0 e D30, por via endovenosa. Para avaliar a progressão ou estabilização do quadro clínico foram colhidas amostras de sangue total, soro sanguíneo e urina para exames de hemograma, bioquímica sérica e urinaria e urinálise em quatro momentos: D0, D7, D30 e D60. A análise estatística foi realizada através da aplicação do teste ANOVA, para comparação de médias nas diferentes fases de tratamento, seguida pelo teste de Tukey, para comparação das médias entre os grupos. Do ponto de vista clínico, dois animais apresentaram melhora e se mantiveram estáveis durante todo o período de acompanhamento, dois animais apresentaram melhora nos primeiros 30 dias, apresentando novamente sintomatologia da doença após esse período e os demais apresentaram melhora nos primeiros sete dias de tratamento, havendo uma piora geral do quadro após esse período. Contudo, os exames laboratoriais em todos os casos não revelaram uma melhora significativa com o tratamento. Aparentemente, a utilização de células-tronco de origem amniótica não influencia de forma relevante na melhora da doença devido à extensa lesão renal que cães apresentam. / Chronic kidney disease (CKD) is a common condition in older dogs with high morbidity and mortality and is defined as an irreversible morpho-functional renal injury of one or both kidneys, which is intrinsically associated with cell degeneration. Its treatment is palliative, and in the more advanced stages, the animal may need dialysis or kidney transplantation, a practice that is difficult and often not feasible in veterinary medicine. The mesenchymal stem cells derived from amniotic tissue characterized by being a population of high plasticity and high cell immunomodulatory potential, being able to differentiate and produce different cell types required in a repair process. Advances in stem cell studies may make cell therapy a viable alternative or adjunctive treatment for this disease, since it could restore functionality and maintain kidney integrity. The objective of this study was to evaluate if the experimental treatment with the canine amnio- derived mesenchymal stem cells (AMSCs) can reduce or stabilize the rate of progression, and clinical condition of CKD in dogs. For this purpose, stem cells from the amniotic membrane were grown until the second pass (P2) and cryopreserved for later use. Eleven domestic male and / or female dogs, affected by the CKD acquired in grades II or III according to IRIS classification and without another adjacent disease, received two applications on days D0 and D30 intravenously. To evaluate the progression or stabilization of the clinical condition, whole blood, blood serum and urine samples were collected for hemogram, serum and urinary biochemistry and urinalysis at four moments: D0, D7, D30 and D60. Statistical analysis was performed using the ANOVA test, to compare means in the different treatment phases, followed by the Tukey test, to compare the means between the groups. From a clinical point of view, two animals showed improvement and remained stable throughout the follow-up period, two animals showed improvement in the first 30 days, showing again symptoms of the disease after this period and the other showed improvement in the first seven days of treatment, with a general worsening of the condition after this period. However, laboratory tests in all cases showed no significant improvement with treatment. Apparently, the use of stem cells of amniotic origin does not influence in a relevant way the improvement of the pathology due the extensive kidney lesion presented by dogs.