Spermatogenesis in fish is a remarkable example of a rapid and extreme form of cellular differentiation. Protamines, the small basic proteins associated with DNA in the spermatozoa of certain fish, are perhaps the most characteristic of the sperm-specific macromolecules. A study of the synthesis of these unusual proteins was initiated using suspensions of cells from the testes of both naturally maturing Pacific salmon (Oncorhynchus spp.) and immature Salmo gaird-nerii in which spermatogenesis had been induced by the injection of salmon pituitary extracts. Protamine, easily characterized by polyacrylamide gel electrophoresis, was only present in the acid extract of testis tissue at a late stage of spermatogenesis. The incorporation of arginine-H³ into protamine was studied in this testis cell suspension system. The inhibition of protamine synthesis by puromycin, cycloheximide and chloramphenicol indicated that in spite of their small size and unusual amino acid composition, protamines were synthesized by a mRNA, tRNA, ribosomal system Actinomycin D, however, did not inhibit this synthesis of protamine. Protamines from several different species of salmonoid fish were purified by a two step chromatography procedure utilizing gel filtration on Sephadex G-25 and Biogel P-10. The amino acid compositions of these protamines were compared, the N and C-terminal amino acids of the Salmo gairdnerii protamine determined, and fractionation of the components of Oncorhynchus tshawytscha (chinook salmon) protamine, by chromatography on both carboxymethyl Sephadex and alumina, attempted. During the late stages of maturation, the testis cells from S. gairdnerii, which are synthesizing protamine, have been shown to incorporate phosphate-P³² into both histone and protamine fractions. The site of this phosphorylation of protamine was identified as seryl residues, and a number of radioactive phospho-peptides were isolated from the tryptic digest of protamine-P³². The major phospho-peptide was identified as val-serP-arg; however phosphorylation of other serine sequences in protamine was indicated by the presence of the peptides (ala,serP,arg)arg, (ser,serP)arg and arg-serP-serP-arg. This phosphorylation of protamine proceeded independently of the amino acid incorporation during synthesis of protamine; however, parallel incorporation of phosphate-P³² and serine-C¹⁴ into protamine showed that all newly incorporated seryl residues were phosphorylated. Since the total content of o-phosphoserine in protamine fell during the later stages of testis maturation, a rapid turnover of phosphate in protamine was indicated. This view was confirmed by the almost complete absence of phosphate in protamine prepared from mature spermatozoa of naturally spawning salmonoid fish. The phosphorylation of protamine may play a role both in the synthesis and intracellular transport of protamine, and in the control of gene expression in these testis cells. / Medicine, Faculty of / Biochemistry and Molecular Biology, Department of / Graduate

Histones are the basic proteins complexed with DNA in the chromosomes of eukaryotic organisms. A previously undescribed histone (histone T.) was discovered in chromatin prepared from rainbow trout (Salmo gairdnerii) testes. Histone T was purified by selective extraction and ion-exchange chromatography on CM-cellulose. The homogeneity of this protein was examined by polyacrylamide disc gel electrophoresis, SDS disc gel electrophoresis, urea starch gel electrophoresis and gel filtration chromatography. Histone T was homogeneous as judged by the above different criteria. The molecular weight was found to be 14,500 by the mobility of formylated or acetylated histone Ton SDS gel electrophoresis. The amino acid composition and the N-terminal amino acid were determined. Peptide maps of the tryptic peptides of histone T and the major histones indicated that histone T is not a degradation product of the major histones. Details of the mechanism of initiation of protein synthesis in eukaryotes have only recently been discovered. Protamines are the small, highly basic proteins complexed with DNA in the mature sperm cells of most higher animals. The synthesis of protamine in trout testes was studied. Cell suspensions prepared from trout testes at the protamine stage of differentiation were incubated in vitro and were found to incorporate intact, isotopically labelled methionine into the N-terminal sequence, Met-Pro-Arg..., methionine residue is removed from protamine after chain completion. Enzymatic activity capable of cleaving the dipeptide, Met-Pro, was found in testis cell fractions. The amino group of methionine incorporated into ribosome-bound nascent protamine was not blocked. Methionine incorporation was extremely sensitive to inhibition by cyclo-heximide. The evidence obtained indicates a role for methionine in the initiation of protamine biosynthesis in the trout, a eukaryote / Medicine, Faculty of / Medical Genetics, Department of / Graduate

No description available.

At a late stage of spermatogenesis a sperm-specific protein, protamine, is synthesized in the testis of salmonid fish and progressively replaces histones in combination with DNA. Protamine has a molecular weight near 5,000 and contains 2/3 of its total amino acid residues as arginine. Studies on the biosynthesis of protamine have been made on the rainbow trout (Salmo gairdnerii) testis. Successive column chromatography on Bio-Gel P-10 and CM- cellulose has been employed to isolate and characterize newly synthesized labelled protamine. Newly synthesized protamine is phosphorylated and is eluted earlier from the CM-cellulose column than mature protamine. However, the two forms of protamine chromatograph coin-cidentally when newly synthesized protamine is first treated with alkaline phosphatase. Protamine is separated into three components on CM-cellulose and the amino acid compositions of the components are very similar. The relative amounts of the components present in the testis nuclei are different at different stages of spermatogenesis and the synthesis of each component appears to be independently controlled. This suggests that the components, while chemically very similar, are the products of separate structural genes and may have different functions. By pulse labelling testis cell suspensions for different lengths of time and analyzing the amount of ¹⁴C- protamine found in the cytoplasm and in the nucleus, the site of protamine synthesis can be shown to be in the cytoplasm. Further, a cell-free, isolated post-mitochondrial cytoplasmic fraction can incorporate ¹⁴C-arginine into whole protamine molecules, while both an isolated nuclear fraction and high-speed supernatant were relatively inactive. This indicates that protamine synthesis occurs on cytoplasmic microsomes. Sedimentation analysis of pulse-labelled testis ribososes indicates that protamine is synthesized on a class of small polysomes, the disomes, sedimenting at 120S. While dimeric ribosomes investigated in various tissues have been shown to be inactive artefacts formed during isolation, the disomes in trout testis have been demonstrated to be a functional class of polysomes. They are not dissociable at 1 mM Mg⁺⁺ ion concentration, are not the breakdown product of larger polysomes, nor are they produced by interaction with free protamine. These disomes contain the major quantity of nascent protamine and increase in number in the testis cells during the active protamine synthesizing stage of development. The probable function of protamine is for the packaging of DNA into the sperm head. The phosphorylation of protamine and the protamine components may serve to regulate this packaging process. / Medicine, Faculty of / Biochemistry and Molecular Biology, Department of / Graduate

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2000. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 103-112).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1997. / Vita. Includes bibliographical references (leaves [126]-149).

Les gènes du chromosomeX sont majoritairement inactivés au cours de la méiose mâle. Chez la souris, seulement 6% d’entre eux sont réactivés au cours des stades post-méiotiques. Parmi eux le gène Uba1X codant pour l’enzyme activatrice de l'ubiquitine, UBA1 qui produit trois transcrits dont deux sont ubiquitaires mais le troisième prédomine dans les cellules post¬-méiotiques : les spermatides. Nos travaux montrent que les 5’UTR, seul différence entre ces trois transcrits, déterminent la localisation et la dose relative des isoformes nucléaire et cytoplasmique de la protéine UBA1. Nous avons mis en évidence chez la souris que le transcrit spermatide-spécifique code pour l'isoforme nucléaire, exprimée fortement dans les spermatides suggérant un rôle de la protéine UBA1 dans la dégradation des histones lors du remodelage chromatinien. Nous avons détecté deux mutations dans la région spermatide-spécifique du gène : une délétion de 13pb et une transition G>A, chacune portée par un patient infertile, et non retrouvée dans notre population témoin. Les analyses ont montré que la délétion de 13pb induit un épissage anormal du transcrit spermatide-spécifique et que la transition G>A pouvait réduire le taux d’expression du transcrit spermatide-spécifique. Ces mutations pourraient induire l'infertilité des deux patients. En parallèle nous avons pu démontrer que les mutations dans le gène codant pour la protamine PRM1 décrites dans la littérature c.102G>T et c.-107G>C ne sont pas liées à l'infertilité masculine et que le variant est un polymorphisme fréquemment retrouvé dans la population congolaise. / The majority of genes on the X chromosome are repressed during meiosis and only 6% of them are expressed in post meiotic germ cells. One of these genes is Ubal, encoding the ubiquitin-activating enzyme UBA1. Ubal produces three different transcripts, two of which are ubiquitously expressed while the third is predominant in the post meiotic germ cells: the spermatids. Our study shows that the 5’UTR, which is the only difference between these transcripts, determines the localization and the relative dose of the nuclear and cytoplasmic isoform of the UBA1 protein. The spermatid-specific transcript encodes for the nuclear isoform in the spermatids in the mouse suggesting that the UBA1 protein is implicated in chromatin remodeling during spermiogenesis. We have detected two mutations in the spermatid-specific region of the UBA1 gene in two infertile men: a deletion of 13bp and a G>A transition, neither of which was found in our cohort of fertile men. The deletion of 13bp diminishes the correct splicing of the spermatid-specific transcript and that the G>A transition may reduce expression of the spermatid-specific transcript. These results show that the UBA1 gene is involved in spermiogenesis, and reactivated in spermatids by its spermatid-specific transcript and that the mutations identified may induce infertility by reducing UBA1 levels in spermatids. We have also demonstrated that two variants described in the protamine codant gene PRM1C.102G>T and c.-107G>C are clearly not associated with male infertility and that the c.-107G>C is polymorphism frequently found in the congolese population.

The knowledge of the proteins that are present in the spermatozoa is an essential step towards the comprehension of their normal function and their potential alterations associated to infertility. Although many studies have been performed in human male infertility, many of the causes still remain unknown, partly due to the fact that the proteins and the mechanisms involved in spermiogenesis and in sperm function are not known in detail. Therefore, the proteomic study of the human spermatozoa through mass spectrometry is relevant both, towards improving our fundamental knowledge and the mechanisms involved in the normal sperm physiology, as well as towards a better understanding of the male infertility. This doctoral thesis has contributed to the identification of the human sperm proteome through two-dimensional gels and mass spectrometry. Moreover, it has identified new correlations between the abundance of certain proteins and the seminal parameters related to male infertility such as the protamine content, DNA damage and sperm motility giving rise to the identification of potential diagnostic markers. In addition, the potential correlations between the protamine content and the presence of the protamine 2 precursors in the sperm cell from patients and the assisted reproductive outcomes have also been studied. Another point studied in the present thesis has been the determination, through immunofluorescent techniques, of the presence of nucleosomes and other proteins with a potential epigenetic function present in spermatozoon fractions selected through density gradients. Moreover, a protocol for the isolation of human sperm nuclei has been implemented to further identify, through mass spectrometry, minor nuclear proteins that may be important for normal sperm functioning or the embryo development.KEYWORDS: Spermatozoon, Protamines, Proteome, Male infertility, Epigenetics / El coneixement de les proteïnes que formen part de l'espermatozoide és un aspecte clau per comprendre el seu funcionament normal i les seves possibles alteracions associades a la infertilitat. Tot i la gran quantitat d'estudis sobre la infertilitat humana masculina, moltes de les seves causes es troben encara desconegudes degut, en part, a que les proteïnes i els mecanismes implicats en l'espermatogènesi i la funció de la cèl·lula espermàtica no es coneixen en detall. Per tant, l'estudi proteòmic de l'espermatozoide humà a través de l'espectrometria de masses és rellevant tant pel coneixement d'aspectes fonamentals com pel millor enteniment de la infertilitat masculina. Aquesta tesi doctoral ha contribuït a la identificació del proteoma de l'espermatozoide humà a través de gels bidimensionals i espectrometria de masses. Addicionalment s'han identificat relacions entre la abundància de certes proteïnes i paràmetres seminals relacionats amb la infertilitat masculina tals com el contingut de protamines, el dany al DNA o la motilitat dels espermatozoides donant lloc a la identificació de potencials marcadors diagnòstics. A més, s'han buscat les possibles correlacions entre el contingut de protamines i la presència de precursor de protamina 2 als espermatozoides de pacients amb els resultats de reproducció assistida. Un altre aspecte tractat ha estat la determinació, mitjançant tècniques immunofluorescents, de la presència de nucleosomes i altres proteïnes presents a fraccions d'espermatozoides seleccionades a través de gradients de densitat amb una funció potencial epigenètica. A més, s'ha implementat un protocol per aïllar nuclis d'espermatozoides humans per tal de poder identificar a través d'espectrometria de masses proteïnes nuclears minoritàries possiblement importants pel desenvolupament embrionari i el funcionament de l'espermatozoide no patològic. / RESUMEN EN CASTELLANO:El conocimiento de las proteínas que forman parte del espermatozoide es un aspecto clave para la comprensión de su funcionamiento normal i de sus posibles alteraciones asociadas a la infertilidad. A pesar de la gran cantidad de estudios sobre la infertilidad humana masculina, muchas de sus causas se encuentran aún desconocidas. Esto es debido, en parte, a que las proteínas y los mecanismos implicados en la espermatogénesis i la función de la célula espermática no se conocen en detalle. Por lo tanto, el estudio proteómico del espermatozoide humano a través de la espectrometría de masas es relevante tanto para el conocimiento de aspectos fundamentales como para el mejor entendimiento de la infertilidad masculina. Esta tesis doctoral ha contribuido en la identificación del proteoma del espermatozoide humano a través de geles bidimensionales i espectrometría de masas. Adicionalmente se han identificado relaciones entre la abundancia de ciertas proteínas i parámetros seminales relacionados con la infertilidad masculina tales como el contenido de protaminas, el daño en el DNA o la movilidad de los espermatozoides dando lugar a la identificación de potenciales marcadores diagnósticos. Además, se han buscado posibles correlaciones entre el contenido de protaminas i la presencia de precursor de protamina 2 en los espermatozoides de pacientes con los resultados de reproducción asistida. Otro aspecto tratado ha sido la determinación, mediante técnicas inmunofluorescentes, de la presencia de nucleosomas i otras proteínas presentes en fracciones de espermatozoides seleccionadas a través de gradientes de densidad con una función potencial epigenética. Además, se ha implementado un protocolo de aislamiento de núcleos de espermatozoides humanos con el objetivo de poder identificar a través de espectrometría de masas proteínas nucleares minoritarias posiblemente importantes para el desarrollo embrionario i el funcionamiento del espermatozoide no patológico. PALABRAS CLAVE: Espermatozoide, Protaminas, Proteoma, Infertilidad masculina, Epigenética

En aquest treball es caracteritzen les proteïnes espermàtiques bàsiques (PEB) que condensen el DNA de l'espermatozoide de diferents grups de deuteròstoms, tant procordats (tunicats o urocordats i cefalocordats) com vertebrats (agnats, peixos cartilaginosos i peixos ossis), fent especial èmfasi en el cas dels peixos ossis. L'objecte d'aquesta anàlisi ha estat l'intent d'obtenir més informació sobre l'evolució molecular de les PEB en els deuteròstoms, ja que no hi havia informació fins al moment referent als urocordats, cefalocordats i agnats.Concretament, dins dels tunicats s'han estudiat extensivament dues espècies del gènere Styela (classe Ascidiacea) així com 7 espècies més pertanyents també a aquesta classe i una pertanyent a la classe Thaliacea. Els resultats mostren que la PEB característica dels ascidiads és la proteïna que hem anomenat PI, apareixent en el gènere Styela una proteïna específica adicional P2. Aquestes proteïnes (PI, P2), malgrat ser totes dues altament bàsiques (50-70%), presenten característiques diferents tant en la mida, mobilitat electroforètica, composició i estructura. L'estudi de la PI à'Styela alicata mostra que es tracta d'una proteïna relacionada amb la histona HI o proteïnes afins; així presenta un nucli resistent a la tripsina la composició aminoacídica del qual és molt similar al d'aquesta família de proteïnes. Igualment, l'estudi de la seqüència parcial d'aquesta proteïna (extrem N-terminal, zona globular central i part de l'extrem C-terminal) mostra una estreta relació entre ambdós tipus de proteïnes. Una peculiaritat de la PI és el presentar un braç Nterminal extraordinàriament reduït, consistent només en dues arginines. Per la seva banda, la P2 es mostra com una molècula més especialitzada, de mida menor, menor diversitat aminoacídica i major basicitat (per un major acúmul d'Arg). La composició de la P2 recorda molt la de la PI, fet que fa pensar en un possible origen d'aquesta proteïna a partir de la PI.L'única espècie estudiada d'entre els cefalocordats, Branchiostoma floridae, mostra al nucli del seu espermatozoide una proteïna molt especialitzada que substitueix pràcticament la totalitat de les histones al llarg de l'espermiogènesi. Aquesta proteïna consta només de 6 tipus diferents d'aminoàcids destacant-ne els aminoàcids bàsics (24.7% de Lys, 25.3% d'Arg). Hem estudiat la seqüència aminoacídica parcial de l'extrem N-terminal d'aquesta proteïna descobrint la presència del motiu alternant Arg-Ser (que es troba també en altres PEB de grups no relacionats).Durant l'espermiogènesi de Petromyzon marinus (agnat cefalaspidomorf) les histones no es veuen substituïdes per cap altra proteïna específica de l'espermatozoide sinó que es mantenen com a úniques proteïnes responsables de la condensació de la cromatina del nucli espermàtic.Dins dels peixos cartilaginosos, hem estudiat les PEB d'Hydrolagus colliei (condricti de la línia dels holocèfals) i hem vist que malgrat el "model" de contingut de proteïnes espermàtiques bàsiques és el mateix (una proteïna no queratinosa més dues de queratinoses), les característiques de les molècules en sí difereixen substancialment. Així, l'estudi de la seqüència parcial de la proteïna no queratinosa R3 d'aquesta espècie mostra diferències importants respecte a la corresponent proteïna trobada als elasmobranquis i amb la protamina típica dels peixos ossis, amb qui sovint se l'ha relacionada.Entre els osteïctis hem estudiat les PEB de 32 espècies representants de 24 famílies corresponents a 9 ordres diferents de teleostis. Es disposa de la caracterització electroferètica de totes, l'anàlisi composicional de 16, i s'han estudiat les estructures primàries de dues espècies més. En aquest grup hem trobat una gran varietat de continguts de proteïnes espermàtiques bàsiques: a) protamines típiques; b) histones sense cap altra proteïna addicional; c) histones somàtiques amb un increment de l'Hi; d) histones amb proteïnes específiques addicionals; e) proteïnes específiques diferents de les protamines típiques (però que també substitueixen les histones). La distribució d'aquests diferents tipus de continguts no mostra una relació amb la classificació filogenètica de les espècies implicades (no obstant, el model de PEB presentat és consistent dins de cada família). Tenint en compte aquesta distribució, així com consideracions de tipus funcional, es discuteixen les posibles explicacions d'aquesta "esporadicitat" observada.Hem seqüenciat les PEB de dos peixos representants dels dos casos generals de substitució de les histones al nucli espermàtic que hem trobat. Així, hem seqüenciat completament la PEB de Dicentrarchus labrax (protamina típica) i parcialment la de Mullus surmuletus (proteïna específica de l'espermatozoide diferent de les protamines típiques). Aquesta última proteïna es mostra relacionada amb la família de les histones HI o afins. Així, consta d'uns extrems N i C-terminals enriquits en aminoàcids bàsics i una zona central resistent a la tripsina on s'acumulen els residus hidrofòbics. Tant l'anàlisi de la seva estructura primària parcial (extrem N-terminal, zona globular i part de l'extrem C-terminal) com de l'estructura secundària predida mostren una gran similitud amb les corresponents de les histones HI, especialment en la zona globular central, que és el domini més conservat en les His.Hem classificat les diferents PEB trobades als grups estudiats en dos tipus generals de molècules: a) proteïnes relacionades amb histones (generalment l'Hi); i b) proteïnes especialitzades. Les primeres correspondrien a molècules grans amb una zona més hidrofòbica resistent a la tripsinització, i un o dos extrems molt bàsics i no resistents (ex. PI dels ascidiacis, PEB del Mullus ï altres proteïnes específiques addicionals trobades en peixos ossis). Les molècules que anomenem especialitzades correspondrien a proteïnes menors i amb baixa proporció o sense aminoàcids hidrofòbics, sent l'Arg i la Lys els aminoàcids que constitueixen la major part de la molècula (ex. P2 d'Sty ela, P de l'amfiox, R3 d'H. colliei, protamines típiques dels peixos ossis).No sembla existir una relació d'homologia entre les proteïnes bàsiques del nucli de l'espermatozoide trobades en cada un dels grups de deuteròstoms estudiats sinó que més aviat es tracta de solucions a un mateix problema adoptades amb independència (encara que per camins similars en alguns casos).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2002. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 127-139).