Les pertes de la fonction et de la masse des cellules beta pancréatiques jouent un rôle central dans le diabète de type 2 (DT2). Les beta-arrestines 1 et 2 (ARRB1 et ARRB2), sont impliquées dans la sécrétion et/ou la survie des cellules beta pancréatiques.Dans une première étude, afin de caractériser précisément la fonction d’ARRB1 dans les cellules beta pancréatiques, nous avons eu pour objectif de générer des souris invalidées spécifiquement dans ces cellules en utilisant le système Cre/lox sous le contrôle du promoteur Ins1. Des études avaient été publiées à partir des deux lignées Ins1Cre-/+ et Arrb1f/f. Nous avons généré et travaillé sur les souris Arrb1f/f :Ins1Cre-/+. Le phénotype des souris Arrb1f/f :Ins1Cre-/+ était faible et surtout non reproductible comparé aux souris Arrb1f/f :Ins1Cre-/- utilisées comme témoins. Le faible niveau d’expression d'Arrb1 dans les cellules beta et le manque d'anticorps spécifique pour l'immunocytochimie ont rendu difficile la vérification de l'absence d'expression de ARRB1 dans ces cellules. Après séquençage du gène modifié Arrb1 des souris “floxées“, nous avons pu montrer que l'insertion du premier site loxP avait induit un décalage du cadre de lecture introduisant un codon stop et, par conséquent, la non-expression du gène Arrb1. Étant donné que les souris Arrb1 “floxées“ utilisées comme témoins étaient déjà knockout (KO), le projet utilisant ces souris a dû être arrêté.Notre équipe a rapporté l'implication d'ARRB2 dans la régulation de la masse des cellules bêta pancréatique, mais son rôle dans la signalisation du récepteur du Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1R), une cible thérapeutique majeure du DT2, n'avait pas encore été exploré.Nous avons montré, dans une deuxième étude, une meilleure tolérance orale au glucose ainsi qu’une augmentation de la sécrétion d’insuline chez les souris Arrb2 KO par rapport aux souris témoins sur les îlots en présence des concentrations physiologiques circulantes de GLP-1. Ceci est corrélé à une production d’AMPc et un recrutement de la PKA plus élevés dans les cellules beta Arrb2 KO. A l’inverse, l’activation des kinases ERK1/2 est diminuée indiquant un recrutement majeur des ERK1/2 par ARRB2 au GLP-1R. En parallèle, j’ai montré que les taux de ARRB1 et ARRB2 des îlots pancréatiques sont altérés par des conditions diabétogènes et diabétiques. Mes résultats démontrent clairement un rôle critique de ARRB2 dans la signalisation du GLP-1R. Un défaut d’expression de la protéine pourrait participer au déficit des mécanismes de compensation de la masse fonctionnelle des cellules beta conduisant au DT2. / The loss of function and mass of pancreatic beta-cells play a central role in type 2 diabetes (T2D). Beta-arrestin 1 and 2 (ARRB1 and ARRB2) are involved in insulin secretion and/or beta-cell survival. In a first study, in order to characterize the role of ARRB1 in beta-cells, we aimed to invalidate the Arrb1 gene specifically in these cells using the Cre/lox system under the control of the Ins1 promoter. Studies had been published with both Ins1Cre-/+ and Arrb1f/f lines. We generated Arrb1f/f:Ins1Cre-/+ mice. The phenotype of Arrb1f/f :Ins1Cre-/+ mice was weak with a lack of reproducibility compared to Arrb1f/f :Ins1Cre-/- mice used as controls. The low expression level of Arrb1 in beta-cells and the lack of specific antibody for immunocytochemistry made it difficult to verify the absence of expression of ARRB1 in these cells. After sequencing the modified Arrb1 gene of the “floxed” mice, we observed that the insertion of the first loxP site induced a shift in the reading frame introducing a stop codon and, consequently, the non-expression of the Arrb1 gene. Since the “floxed“ Arrb1 mice used as controls were already knockout (KO), the project using these mice was stopped.Our team has reported the involvement of ARRB2 in the regulation of beta-cell mass, but its role in Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1) receptor signaling, a major therapeutic target for T2D, remained to be explored. In a second study, we showed a better glucose tolerance and an increase in insulin secretion from isolated islets in Arrb2KO compared to control mice in the presence of physiological circulating concentrations of GLP-1. This was correlated with higher cAMP production and PKA activation in Arrb2KO beta-cells. By contrast, the activation of ERK1/2 kinases was decreased indicating a major recruitment of ERK1/2 by ARRB2 to GLP-1R. In parallel, we showed that the expression levels of ARRB1 and ARRB2 in pancreatic islets were altered in diabetogenic and diabetic conditions. My results clearly demonstrate a critical role of ARRB2 in GLP-1R singaling which could impact the function, maintenance and plasticity of beta-cell mass in response to GLP-1. A lack of expression of ARRB2 could participate in the deficit of compensatory mechanisms of the functional beta-cell mass leading to T2D.

Résumé: La prostaglandine D? (PGD?) est un médiateur lipidique qui active directement deux récepteurs spécifiques, DP et CRTH2, régulant ainsi des processus inflammatoires, immunitaires et apoptotiques. Les ostéoclastes (OC) sont de larges cellules multinucléées participant au métabolisme et remodelage de l’os, ainsi qu’à la réparation de fracture osseuse. Nos travaux ont mis en évidence l’expression des récepteurs DP et CRTH2 chez des OCs humains. Cependant, les effets de la PGD? sur l’apoptose des OCs sont inconnus. L’objectif de la présente étude a été de déterminer si la PGD? induit l’apoptose et les mécanismes qui en découlent dans les OC humains. Les OCs humains différenciés ont été traités avec la PGD?, les agonistes et antagonistes de ses récepteurs. Le traitement des OCs avec la PGD?, en présence de naproxène, qui permet d’inhiber la production endogène de prostaglandines, augmente de façon dépendante de la dose et en fonction du temps le pourcentage d'OCs apoptotiques. Ceci a également été observé lors du traitement des OCs avec l’agoniste spécifique DK-PGD? du récepteur CRTH2, mais pas avec le traitement du composé BW 245C, antagoniste du récepteur DP. En absence de naproxène, l’antagoniste CAY10471 du récepteur CRTH2 réduit le taux d’apoptose des OCs tandis que le composé BW A868C, antagoniste du récepteur DP, n'a aucun effet. L'apoptose des OCs par la PGD? via CRTH2 est associée à l’activation de la caspase-9, et non pas la caspase-8, ce qui entraîne le clivage de la caspase-3. Afin de déterminer plus précisément les mécanismes menant à ces résultats, les OCs ont été traités avec les inhibiteurs de MEK-1/2, PI3K et IKK2/NF-?B. Le traitement des OCs avec la PGD? et l’agoniste de CRTH2 diminue la phosphorylation des protéines ERK1/2 et Akt, tandis que la phosphorylation de ?-arrestine-1 est augmentée. Par ailleurs, les niveaux de phosphorylation d'ERK1/2 et Akt ont été augmentés alors que le taux de protéines ?-arrestine-1 phosphorylees a été diminué par l’antagoniste de CRTH2. En outre, le traitement des OCs avec l’inhibiteur de MEK-1/2 augmente l’apoptose des OCs induite par PGD? et l’agoniste de CRTH2. Cependant, l’antagoniste de CRTH2 diminue l'activité de la caspase-3 induite par l’inhibiteur de MEK1/2. Le traitement des OCs avec l’inhibiteur de la PI3K diminue la phosphorylation d’ERK l/2, tandis que la phosphorylation d'ERK1/2 augmentée par l’antagoniste de CRTH2 a été atténuée par l’inhibiteur de PI3K. Les agonistes et antagonistes du récepteurs DP n'ont pas d’effet sur la phosphorylation d'ERK1/2, Akt, ?-arrestine-1 ni sur l’activité de la caspase-3 chez les OCs. Le traitement des OCs avec PGD? et les ligands de ses récepteurs ne modifie pas la phosphorylation de Re1A/p65. De plus, l’activité de la caspase-3 n'est pas altérée dans les OCs traités avec l’inhibiteur d’IKK2. En conclusion, PGD?, en se liant à CRTH2, induit l’apoptose des OCs via la voie apoptotique intrinsèque qui est associée à la régulation des voies de signalisation des protéines ?-arrestine-1, ERK1/2, et Akt, mais pas celle du IKK2/NF-?B. // Abstract: Prostaglandin D2 (PGD2) is a lipid mediator that directly activates two specific receptors, DP and CRTH2, thereby regulating inflammation, immune response and apoptosis. Osteoclasts (OCs) are large multinucleated cells that participate in bone metabolism, remodeling, and fracture repair. Our previous data show the expression of DP and CRTH2 in human OCs. However, it is unknown whether PGD2 affects OC apoptosis. The objective of the thesis was to determine whether PGD2 induces human OC apoptosis and the underlying mechanisms implicated in this effect. The differentiated human OCs were treated with PGD2, and its receptors agonists/antagonists. Treatment with PGD2 in the presence of naproxen to inhibit endogenous prostaglandins production increased OC apoptosis in a dose- and time-dependent manner, as did the specific CRTH2 agonist compound DK-PGD2 but not the DP agonist compound 13W 245C. In the absence of naproxen, the CRTH2 antagonist compound CAY 10471 reduced OC apoptosis whereas the DP antagonist BW A868C had no such effect. PGD2/CRTH2-induced OC apoptosis was associated with the activation of caspase-9 (an intrinsic apoptosis pathway-initiator caspase), but not caspase-8 (an extrinsic apoptosis pathway-initiator caspase), leading to caspase-3 cleavage. To further determine the mechanisms underlying these findings, human OCs were treated with the inhibitors of MEK-1/2, P13K and IKK2/NF-KB. Treatments with PGD2 and a CRTH2 agonist decreased ERKI/2 and Akt phosphorylation, whereas both treatments increased 13-arrestin- I phosphorylation. Both ERK1/2 and Akt phosphorylation were augmented, whereas the phosphorylated 13-arrestin-1 was reduced by a CRTH2 antagonist. Furthermore, treatment of OCs with a MEK-1/2 inhibitor increased OC apoptosis induced by PGD2 and by a CRTH2 agonist. However, a CRTH2 antagonist diminished the MEK- I /2 inhibitor-induced increase in caspase-3 activity. In addition, treatment of OCs with a PI3K inhibitor decreased ERK I /2 phosphorylation, whereas increased ERK1/2 phosphorylation by CRTH2 antagonist was attenuated by a P13K inhibitor. Both DP receptor agonist and antagonist did not affect either Akt, ERK1/2, 13-arrestin-1 phosphorylation or a specific MEK-1/2 inhibitor-induced increase in caspase-3 activity in OCs. Treatment of OCs with PGD2 and its receptor ligands did not alter ReIA/p65 phosphorylation (ser536). Moreover, the caspase-3 activity was not altered in OCs treated with an IKK2/NF-KB inhibitor. In summary, PGD2 induces human OC apoptosis through a CRTH2-dependent intrinsic apoptosis pathway, which is associated with regulation of the 13-affestin-1, ERK1/2, and Akt, but not with 1KK2/NF-KB, signaling pathways. [symboles non conformes]

No description available.

Les troubles cognitifs constituent des symptômes quasi constants parmi les patients souffrant de dépression caractérisée. De récentes études indiquent que ces troubles mentaux pourraient bénéficier de la modulation de la signalisation du récepteur sérotoninergique 5-HT4. Dans ce travail de thèse, nous avons dans un premier temps caractérisé les troubles cognitifs dans un modèle d’anxiété/dépression chez la Souris, le modèle CORT. Nous avons ensuite évalué l’efficacité d’un traitement chronique par un agoniste du récepteur 5-HT4, le RS 67333, en comparaison à la fluoxetine, un antidépresseur monoaminergique de référence sur les altérations émotionnelles et cognitives. D’autre part, des données de la littérature indiquent que la cascade de signalisation de la protéine β-arrestine 1 (impliquée dans la désensibilisation et l’internalisation du récepteur 5-HT4) serait un biomarqueur potentiel préclinique/clinique des états dépressifs et de la réponse au traitement antidépresseur. Nous avons donc cherché à définir le phénotype anxio/dépressif et cognitif chez des souris tissus-spécifiques conditionnelles, dont l’expression de la protéine β-arrestine 1 dans les cellules souches du gyrus dentelé a été supprimée. L’ensemble de ces travaux de thèse met en avant le rôle prépondérant de l’activation du récepteur 5-HT4 non seulement dans sa capacité à corriger les symptômes d’anxiété/dépression mais aussi les troubles cognitifs associés à la dépression dans un modèle d’anxiété/dépression chez la Souris. D’un point de vue mécanistique, ces données confirment l’implication de la protéine β-arrestine 1 dans la réponse à la fluoxetine au niveau comportemental et directement au sein du processus de neurogenèse hippocampique chez la souris adulte. Enfin, l’expression de la protéine β-arrestine 1 dans les jeunes neurones de l’hippocampe se révèle aussi être un acteur déterminant dans les processus cognitifs et la réponse à la fluoxetine et au RS 67333. / Cognitive disturbances are often reported as serious incapacitating symptoms by patients suffering from major depressive disorders. Recent studies showed that these mood disorders could benefit from the modulation of 5-HT4 receptor pathway. Here, we performed a complete characterization of cognitive functions in a neuroendocrine mouse model of depression, the CORT model. We then evaluated emotional and cognitive effects of either a chronic 5-HT4 receptor agonist treatment, RS 67333 or fluoxetine, a classical monoaminergic antidepressant. Recent data indicate that β-arrestins proteins could be an important molecular determinant in depressive states and in the effects of antidepressants. We determined emotional and cognitive phenotypes in conditional tissue-specific mice in which expression of β-arrestin 1 in adult hippocampal stem cells was deleted. This work suggests that the 5-HT4 receptor plays a major role to correct not only anxiety/depression-related symptoms but also cognitive alterations in a mouse model of anxiety/depression model. Moreover, these data confirm the involvement of β-arrestin 1 protein in behavioral and neurogenic responses to fluoxetine treatment in adult mice. Finally, β-arrestin 1 protein expression in adult born neuron is critical for cognition and also to fluoxetine and RS 67333 response.

Le récepteur de chimiokine CXCR7 a été récemment identifié comme liant la chimiokine SDF-1, anciennement considérée comme ligand exclusif du récepteur CXCR4. Ces deux récepteurs sont exprimés majoritairement dans les mêmes types cellulaires et, ainsi, la découverte de CXCR7 incite à réévaluer les effets respectifs de SDF-1 sur CXCR4. Étant donné son rôle dans le cancer, CXCR4 est une cible de choix pour le développement de molécules thérapeutiques. Également, CXCR7 semble être impliqué dans la croissance tumorale. AMD3100, un antagoniste «sélectif» pour CXCR4, est maintenant commercialisé. Cet antagoniste a été identifié comme liant lui aussi CXCR7. De plus, sur CXCR7, l’AMD3100 agit comme agoniste puisqu’il induit le recrutement de la β-arrestine, à l’opposé de son effet sur. En revanche, AMD3100 n’induit pas le recrutement de la β-arrestine à CXCR4. Basé sur ces résultats, il est nécessaire de revoir la sélectivité d’autres antagonistes synthétiques de CXCR4. À l’aide de la technique de BRET (Résonance d’un transfert d’énergie par bioluminescence), nos résultats montrent que le Tc14012, un autre antagoniste synthétique de CXCR4, et structurellement distinct de l’AMD3100, interagit avec CXCR7. Contrairement à CXCR4, les deux antagonistes de CXCR4 agissent comme agonistes sur CXCR7 en induisant le recrutement de la β-arrestine. Nos résultats suggèrent que l’organisation spatiale du corps du récepteur serait responsable de cet effet opposé. En conclusion, AMD3100 et Tc14012 ne sont pas sélectifs pour CXCR4, puisqu’ils interagissent avec CXCR7. Lors du développement de nouvelles molécules synthétiques ciblant CXCR4, il serait alors nécessaire d’en évaluer leur sélectivité, et leurs effets en les testant aussi sur CXCR7. / ASBTRACT SDF-1 was at first thought to exclusively bind CXCR4, but it was subsequently found to also bind to the chemokine receptor CXCR7. CXCR4 is a promising target for drug development due to its role in cancer. AMD3100 is newly commercialised synthetic antagonist of CXCR4. This drug leads to massive release of hematopoietic stem cell into the peripheral blood. It was found that AMD3100 also binds to CXCR7 and acts as an agonist of β-arrestin recruitment to CXCR7. An antagonist of CXCR4 acts as an agonist on CXCR7. Prompted by this observation, we tested whether this might hold true for other CXCR4 antagonist. Tc14012, a peptidomimetic of T140, has been extensively described as a potent CXCR4 antagonist. We find that TC14012 also interacts on CXCR7. Like AMD3100, TC14012 alone induces β-arrestin recruitment to CXCR7. Thus, two structurally unrelated CXCR4 antagonists, AMD3100 and TC14012, are agonists of the CXCR7-arrestin pathway. This suggests distinct activation mechanisms of the arrestin pathway by CXCR4 and CXCR7. The results we obtained using a BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)-based arrestin recruitment assay, suggest that the CXCR7 receptor core is responsible for the recruitment of beta-arrestin in response to AMD3100 and TC14012. The finding that both AMD3100 and TC14012 do not only bind CXCR4, but also CXCR7, with opposite effects on arrestin recruitment, is important for the use of the compounds as tools to dissect SDF-1-mediated effects. This may be a general feature of synthetic ligands of the two receptors, with potential consequences for drug development. Key words: Chemokine receptor, CXCR4 and CXCR7, BRET, β-arrestin recruitement, TC14012, AMD3100 and SDF-1.

RÉSUMÉ Le récepteur de chimiokine CXCR7 a été récemment identifié comme liant la chimiokine SDF-1, anciennement considérée comme ligand exclusif du récepteur CXCR4. Ces deux récepteurs sont exprimés majoritairement dans les mêmes types cellulaires et, ainsi, la découverte de CXCR7 incite à réévaluer les effets respectifs de SDF-1 sur CXCR4. Étant donné son rôle dans le cancer, CXCR4 est une cible de choix pour le développement de molécules thérapeutiques. Également, CXCR7 semble être impliqué dans la croissance tumorale. AMD3100, un antagoniste «sélectif» pour CXCR4, est maintenant commercialisé. Cet antagoniste a été identifié comme liant lui aussi CXCR7. De plus, sur CXCR7, l’AMD3100 agit comme agoniste puisqu’il induit le recrutement de la β-arrestine, à l’opposé de son effet sur. En revanche, AMD3100 n’induit pas le recrutement de la β-arrestine à CXCR4. Basé sur ces résultats, il est nécessaire de revoir la sélectivité d’autres antagonistes synthétiques de CXCR4. À l’aide de la technique de BRET (Résonance d’un transfert d’énergie par bioluminescence), nos résultats montrent que le Tc14012, un autre antagoniste synthétique de CXCR4, et structurellement distinct de l’AMD3100, interagit avec CXCR7. Contrairement à CXCR4, les deux antagonistes de CXCR4 agissent comme agonistes sur CXCR7 en induisant le recrutement de la β-arrestine. Nos résultats suggèrent que l’organisation spatiale du corps du récepteur serait responsable de cet effet opposé. En conclusion, AMD3100 et Tc14012 ne sont pas sélectifs pour CXCR4, puisqu’ils interagissent avec CXCR7. Lors du développement de nouvelles molécules synthétiques ciblant CXCR4, il serait alors nécessaire d’en évaluer leur sélectivité, et leurs effets en les testant aussi sur CXCR7. Mot-clés : Récepteur de chimiokine CXCR4 et CXCR7, BRET, recrutement de la β-arrestine, AMD3100, Tc14012 et SDF-1. / ASBTRACT SDF-1 was at first thought to exclusively bind CXCR4, but it was subsequently found to also bind to the chemokine receptor CXCR7. CXCR4 is a promising target for drug development due to its role in cancer. AMD3100 is newly commercialised synthetic antagonist of CXCR4. This drug leads to massive release of hematopoietic stem cell into the peripheral blood. It was found that AMD3100 also binds to CXCR7 and acts as an agonist of β-arrestin recruitment to CXCR7. An antagonist of CXCR4 acts as an agonist on CXCR7. Prompted by this observation, we tested whether this might hold true for other CXCR4 antagonist. Tc14012, a peptidomimetic of T140, has been extensively described as a potent CXCR4 antagonist. We find that TC14012 also interacts on CXCR7. Like AMD3100, TC14012 alone induces β-arrestin recruitment to CXCR7. Thus, two structurally unrelated CXCR4 antagonists, AMD3100 and TC14012, are agonists of the CXCR7-arrestin pathway. This suggests distinct activation mechanisms of the arrestin pathway by CXCR4 and CXCR7. The results we obtained using a BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)-based arrestin recruitment assay, suggest that the CXCR7 receptor core is responsible for the recruitment of beta-arrestin in response to AMD3100 and TC14012. The finding that both AMD3100 and TC14012 do not only bind CXCR4, but also CXCR7, with opposite effects on arrestin recruitment, is important for the use of the compounds as tools to dissect SDF-1-mediated effects. This may be a general feature of synthetic ligands of the two receptors, with potential consequences for drug development. Key words: Chemokine receptor, CXCR4 and CXCR7, BRET, β-arrestin recruitement, TC14012, AMD3100 and SDF-1.

L’adhérence, l’activation et l’agrégation des plaquettes sanguines sont essentielles à l’hémostase mais peuvent également conduire à la thrombose artérielle sur plaque d’athérosclérose, aujourd’hui première cause de mortalité dans le monde. Les anti-thrombotiques actuels, dirigés contre l’activation et l’agrégation plaquettaires, ont une efficacité reconnue mais ont pour inconvénient d’augmenter le risque de saignement. L’objectif de cette thèse a été d’explorer de nouvelles stratégies réduisant la thrombose tout en préservant l’hémostase. L’utilisation de souris modifiées génétiquement a mis en évidence que l’intégrine alpha6 beta1, impliquée dans l’adhérence des plaquettes aux laminines, joue un rôle critique en thrombose expérimentale mais pas en hémostase. De plus, nous avons montré dans un système de perfusion de sang qu’une protéine préférentiellement exprimée dans les plaques d’athérosclérose, la ténascine-C, permet l’adhérence et l’activation des plaquettes. En revanche, la beta-arrestine-1, une protéine de signalisation, ne contribue que modestement aux fonctions plaquettaires et à la thrombose. En conclusion, ce travail a permis de dégager deux nouvelles pistes anti-thrombotiques potentiellement capables de préserver l’hémostase, basées sur le ciblage de l’intégrine alpha6 beta1 ou de l’interaction plaquette/ténascine-C. / Following vascular injury, blood platelet adhesion, activation and aggregation are essential for hemostasis but can also lead to arterial thrombosis, which is a leading cause of death worldwide. Current antithrombotic drugs impede platelet activation and aggregation, thereby considerably reducing cardiovascular mortality, but their use is linked to an increased bleeding risk. This thesis aimed to explore more selective strategies causing minimal perturbation of hemostasis. The use of genetically-modified mice has revealed an unsuspected important contribution of integrin alpha6 beta1, which mediates platelet adhesion to laminins, to experimental arterial thrombosis but not hemostasis. In addition, we showed that tenascin-C, an extracellular matrix protein overexpressed in atherosclerotic plaques, can support platelet adhesion and activation under flow. In contrast, the signaling protein beta-arrestin-1 does not play a major role in platelet function, hemostasis and thrombosis. In conclusion, this work provides two interesting candidates, namely integrin alpha6 beta1 and tenascin-C, to put into practice the concept of targeting thrombosis while minimally impairing hemostasis.

Environ 30% des patients ne répondent pas de manière adéquate à un traitement antidépresseur. Cette absence de rémission, voire aggravation de l’état dépressif après la mise en place du traitement est qualifiée de non-réponse au traitement. La résistance au traitement est caractérisée lorsque cet échec thérapeutique est récurrent pour différentes stratégies thérapeutiques de mécanisme d’action différents. Afin d’améliorer les stratégies thérapeutiques visant à traiter les patients résistants, une meilleure compréhension des mécanismes biologiques associés à la non-réponse/résistance est nécessaire. De nombreux travaux ont associé le phénomène de neurogenèse hippocampique adulte à la réponse antidépressive, et ont montré qu’un blocage de la neurogenèse altère la réponse antidépressive chez la Souris. Cependant, aucune étude n’a montré si la non-réponse/résistance au traitement était associée à des altérations de la neurogenèse. De plus, il n’existe à ce jour aucun modèle de résistance qui ne présente une validité translationelle à ce qui est observé chez l’Homme. Enfin, alors que 2/3 des patients dépressifs sont des femmes, la majorité des études précliniques sont réalisées chez des mâles. Le but de mon travail de thèse a donc été de modéliser la résistance au traitement antidépresseur chez la souris C57BL6 mâle et femelle.Le premier objectif de ce travail a été la modélisation chez la femelle d’un phénotype anxio-dépressif, en adaptant un modèle neuroendocrinien de la dépression élaboré chez le mâle, basée sur l’administration chronique de corticostérone. Le deuxième objectif a été l’étude de la comparaison de la neurogenèse entre les souris répondeuses et non-répondeuses à un traitement chronique de fluoxétine ou résistantes à 2 stratégies successives de traitement présentant un mécanisme d’action différent (fluoxétine puis imipramine).D’autre part, les données de la littérature clinique suggèrent qu’un marqueur périphérique, la protéine β-arrestine 1, serait un marqueur de l’état dépressif et de la réponse au traitement. Nous avons donc mesuré dans notre modèle les variations de ce potentiel biomarqueur clinique.L’ensemble de ces travaux de thèse a permis de montrer la complexité d’induire un phénotype anxio/dépressif chez la souris femelle de façon stable et robuste via l’administration chronique de corticostérone. Chez le mâle, nous avons pu modéliser la résistance au traitement antidépresseur dans le modèle CORT. Nous avons pu observer que les processus neurogéniques semblent jouer un rôle essentiel dans la réponse au traitement, puisqu’une absence de réponse est associée avec une altération de la neurogenèse hippocampique adulte. Si dans notre modèle, l’expression périphérique de la β-arrestine 1 n’est pas diminuée chez les souris présentant un phénotype anxio-dépressif, elle permet cependant de discriminer les souris répondeuses des souris résistantes au traitement, ce qui valide son intérêt en tant que biomarqueur de la réponse antidépressive. / Around 30% of patients do not respond adequately to chronic antidepressant treatments. This lack of response, or worsening of the depressive state after the onset of the treatment can lead to treatment resistant depression (TRD). TRD is characterized by a recurrent lack of therapeutic response to various antidepressant which display different mechanism of action. A better understanding of the mechanisms that underlies TRD is necessary to discover some new effective therapeutic strategies. Numerous studies in rodents have shown that chronic antidepressant treatment improves adult hippocampal neurogenesis, and that disrupting this phenomenon partially alters antidepressant response. However whether lack of response or resistance to antidepressant treatment is associated with altered neurogenesis has yet not been observed. Additionally, there is yet no model of TRD with a translational validity. As major depressive disorders affects women twice more than men, yet the preclinical studies are performed mostly in males. Thus, the aim of this thesis was to model non-response an resistance to antidepressant response in male and female C57BL6 mice.The first aim of this thesis work was to induce a anxio-depressive phenotype in female mice, by adapting a neurodencocrine model of depression developed in males and based on chronic administration of corticosterone (CORT). The second aim was to study adult hippocampal neurogenesis in animals that respond or not to chronic fluoxetine administration, and in animals that were resistant to two successive antidepressant treatment with a different mechanism of action (fluoxetine and then imipramine).Additionally, data from the literature suggests that peripheral β-arrestin 1 expression could be a potential biomarker of depressive state and antidepressant response in humans. Thus, we explore its validity in our model of TRD in mice.Overall, our results highlight the difficulty of inducing an anxio-depressive phenotype in female mice, using different dosage or treatment duration of corticosterone, which hampers the use of corticosterone to induce emotionality in female mice.However, in male mice, we showed that we were able model resistance to treatment in the using the CORT model. Lack of response to chronic fluoxetine and treatment resistance to fluoxetine/imipramine were associated with altered neurogenesis in the dentate gyrus of the hippocampus. This confirms that hippocampal neurogenesis is critical for a full antidepressant response. While peripheral β-arrestin 1 expression was not decreased after chronic CORT exposure, its differential expression between responder vs treatment-resistant mice confirms its validity as a biomarker for antidepressant response.

L’interaction d’un ligand avec un récepteur à sept domaines transmembranaires (7TMR) couplé aux protéines G, mène à l’adoption de différentes conformations par le récepteur. Ces diverses conformations pourraient expliquer l’activation différentielle des voies de signalisation. Or, le lien entre la conformation et l’activité du récepteur n’est pas tout à fait claire. Selon les modèles classiques pharmacologiques, comme le modèle du complexe ternaire, il n’existe qu’un nombre limité de conformations qu’un récepteur peut adopter. Afin d’établir un lien entre la structure et la fonction des récepteurs, nous avons choisi dans un premier temps, le récepteur de chimiokine CXCR4 comme récepteur modèle. Ce dernier, est une cible thérapeutique prometteuse, impliqué dans l’entrée du VIH-1 dans les cellules cibles et dans la dissémination de métastases cancéreuses. Grâce au transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) nous pouvons détecter les changements conformationnels des homodimères constitutifs de CXCR4 dans les cellules vivantes. En conséquence, nous avons mesuré les conformations de mutants de CXCR4 dont les mutations affecteraient sa fonction. Nous montrons que la capacité des mutants à activer la protéine Galphai est altérée suite au traitement avec l’agoniste SDF-1. Notamment, ces mutations altèrent la conformation du récepteur à l’état basal ainsi que la réponse conformationnelle induite suite au traitement avec l’agoniste SDF-1, l’agoniste partiel AMD3100 ou l’agoniste inverse TC14012. Ainsi, différentes conformations de CXCR4 peuvent donner lieu à une activation similaire de la protéine G, ce qui implique une flexibilité des récepteurs actifs qui ne peut pas être expliquée par le modèle du complexe ternaire (Berchiche et al. 2007). Également, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CCR2, exprimé à la surface des cellules immunitaires. Il joue un rôle important dans l’inflammation et dans des pathologies inflammatoires telles que l’asthme. CCR2 forme des homodimères constitutifs et possède différents ligands naturels dont la redondance fonctionnelle a été suggérée. Nous avons étudié le lien entre les conformations et les activations d’effecteurs (fonctions) de CCR2. Notre hypothèse est que les différents ligands naturels induisent différentes conformations du récepteur menant à différentes fonctions. Nous montrons que les réponses de CCR2 aux différents ligands ne sont pas redondantes au niveau pharmacologique et que les chimiokines CCL8, CCL7 et CCL13 (MCP-2 à MCP-4) sont des agonistes partiels de CCR2, du moins dans les systèmes que nous avons étudiés. Ainsi, l’absence de redondance fonctionnelle parmi les chimiokines liant le même récepteur, ne résulterait pas de mécanismes complexes de régulation in vivo, mais ferait partie de leurs propriétés pharmacologiques intrinsèques (Berchiche et al. 2011). Enfin, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CXCR7. Récemment identifié, CXCR7 est le deuxième récepteur cible de la chimiokine SDF-1. Cette chimiokine a été considérée comme étant capable d’interagir uniquement avec le récepteur CXCR4. Notamment, CXCR4 et CXCR7 possèdent un patron d’expression semblable dans les tissus. Nous avons évalué l’effet de l’AMD3100, ligand synthétique de CXCR4, sur la conformation et la signalisation de CXCR7. Nos résultats montrent qu’AMD3100, tout comme SDF-1, lie CXCR7 et augmente la liaison de SDF-1 à CXCR7. Grâce au BRET, nous montrons aussi qu’AMD3100 seul est un agoniste de CXCR7 et qu’il est un modulateur allostérique positif de la liaison de SDF-1 à CXCR7. Aussi, nous montrons pour la première fois le recrutement de la beta-arrestine 2 à CXCR7 en réponse à un agoniste. L’AMD3100 est un ligand de CXCR4 et de CXCR7 avec des effets opposés, ce qui appelle à la prudence lors de l’utilisation de cette molécule pour l’étude des voies de signalisation impliquant SDF-1 (Kalatskaya et al. 2009). En conclusion, nos travaux amènent des évidences qu’il existe plusieurs conformations actives des récepteurs et appuient les modèles de structure-activité des récepteurs qui prennent en considération leur flexibilité conformationnelle. / Ligand binding to 7TMRs is thought to induce conformational changes within the receptor that translate into activation of downstream effectors. The link between receptor conformation and activity is still poorly understood, as current models of receptor activation fail to take an increasing amount of experimental data into account. Classical pharmacological models such as the ternary complex model are based on the concept that receptors can only adopt a limited number of conformations. To clarify structure-function relationships in 7TMRs, first we studied chemokine receptor CXCR4. This receptor is an important drug target, involved in HIV-1 entry and cancer metastasis. Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) allows us to directly probe conformational changes within pre-formed CXCR4 homodimers in live cells. Using BRET, we measured the conformation of CXCR4 mutants and we also monitored their function by measuring their ability to induce Galphai activation. The analyzed mutants had substitutions in locations which are pivotal molecular switches for receptor conformation and activation. We show that agonist induced Gi activation is altered for most mutants. These mutations also alter CXCR4’s conformation at basal conditions (in absence of ligand) and in the presence of the agonist, SDF-1, the partial agonist, AMD3100 and the inverse agonist, TC14012. Moreover, different conformations of active receptors were detected in the presence of SDF-1, suggesting that different receptor conformations are able to trigger Galphai activity. These data provide biophysical evidence for different active receptor conformations, that cannot be explained by classical models of receptor function (Berchiche et al. 2007). Furthermore, the second part of our work focused on chemokine receptor CCR2. Mainly expressed on immune cells, CCR2 is involved in many inflammatory and vascular diseases. This receptor binds seven natural ligands that have been referred to as redundant. We set out to explore whether the different chemokine ligands of CCR2 receptor induce different conformational changes leading to different functional consequences. Our results show that the different natural ligands of CCR2 are not pharmacologically redundant. Moreover, chemokines CCL8, CCL7 and CCL13 (MCP-2 to MCP-4) are partial agonists of CCR2, at least in the systems we used. Our results support the validity of models for receptor-ligand interactions in which different ligands stabilize different receptor conformations also for endogenous receptor ligands, demonstrating that these natural ligands are not pharmacologically and functionally redundant (Berchiche et al. 2011). As the third part of this work, we studied chemokine receptor CXCR7, the alternative receptor for SDF-1. Until recently, CXCR4 was the only receptor known to bind SDF-1. Moreover, the expression patterns are similar for receptors CXCR4 and CXCR7. Therefore, we investigated the conformational and functional consequences of the synthetic inhibitor of CXCR4, AMD3100, on CXCR7. We show that AMD3100 also binds the alternative SDF-1 receptor, CXCR7. SDF-1 or AMD3100 alone trigger beta-arrestin recruitment to CXCR7, which we identify as a previously unreported signalling pathway of CXCR7. In addition, AMD3100 has positive allosteric effects on SDF-1 binding to CXCR7, on SDF-1-induced conformational rearrangements in the receptor dimer as measured by BRET, and on SDF-1-induced beta-arrestin recruitment to CXCR7. The finding that AMD3100 not only binds CXCR4, but also to CXCR7, with opposite effects on the two receptors, call for caution in the use of this compound as a tool to dissect SDF-1 effects on the respective receptors in vitro and in vivo. Finally, these data provide biophysical evidence for different active receptor conformations, and support models of 7TMR structure-activity relationships that take conformational heterogeneity into account.

Les jonctions adhérentes (JA) sont nécessaires à l’élaboration d’une barrière vasculaire sélective dans laquelle la VE-cadhérine joue un rôle crucial. En effet, la VE-cadhérine est une molécule d’adhérence entrant dans la constitution des JA et présente spécifiquement au sein de l’endothélium. Lorsque la VE-cadhérine est exprimée à la surface des cellules endothéliales, l’intégrité de la barrière est préservée. En revanche, des modifications de la VE-cadhérine, comme par exemple sa phosphorylation, provoquent son internalisation, la dissociation des complexes adhésifs ou la désorganisation générale des jonctions endothéliales, défavorisant ainsi la sélectivité de la barrière. De manière générale, une perméabilité vasculaire élevée peut être observée au cours de l’activation de l’endothélium, telle que l’angiogenèse ou la réponse inflammatoire, en conditions physiologiques comme pathologiques. Par exemple, la phosphorylation de la VE-cadhérine provoquée par le facteur VEGF (vascular growth endothelial facteur) entraîne l’augmentation de la perméabilité vasculaire. En outre, une molécule pro-inflammatoire telle que l’interleukine-8 (IL-8) peut également provoquer la phosphorylation de la VE-cadhérine, aboutissant ainsi à l’augmentation de la perméabilité vasculaire. Tandis que les voies de signalisation régissant les effets pro-angiogéniques ou pro-inflammatoires du VEGF et de l’IL-8, respectivement, sont bien caractérisées, les mécanismes moléculaires sous-tendant spécifiquement l’augmentation de perméabilité endothéliale sont moins bien connus. Au cours de mon doctorat, je me suis donc attachée à examiner les interactions moléculaires entre la VE-cadhérine phosphorylée et la molécule d’échafaudage β-arrestine1, dans les cellules endothéliales humaines exposées au VEGF. J’ai également exploré la distribution de la VE-cadhérine dans les cellules endothéliales cérébrales dans un contexte tumoral, récapitulé par le sécrétome de cellules gliomateuses (GB). Mon travail a permis d’identifier la partie C-terminale (C-tail) de la β-arrestine1 qui comporte 43 acides aminés, comme une région interagissant directement avec la VE-cadhérine lorsqu’elle est phosphorylée sur le résidu S665. Cette liaison pourrait conduire alors à l’internalisation de la VE-cadhérine, lors de la stimulation par le VEGF. En outre, nous avons démontré le rôle inattendu du domaine C-tail de la β-arrestine1 dans la régulation négative de l’activité du promoteur de la VE-cadhérine. Ceci se traduit par une réduction des niveaux d’expression de la VE-cadhérine, contribuant ainsi à l’affaiblissement de la barrière endothéliale en réponse au VEGF. En outre, nous avons voulu évaluer l’effet des différents facteurs secrétés par le GB sur la perméabilité vasculaire. L’étude du sécrétome du GB a révélé une production abondante et majoritaire d’IL-8, qui provoque l’internalisation de la VE-cadhérine et la désorganisation des jonctions endothéliales. En plus de son action sur la perméabilité, l’IL-8 favorise la tubulogenèse des cellules endothéliales cérébrales. En conclusion, nous avons mis en évidence un rôle nouveau de la β-arrestine1 dans la régulation de la VE-cadhérine dans les cellules endothéliales humaines. Nous avons également démontré que la sécrétion d’IL-8 par le GB entraîne le remodelage des jonctions de la VE-cadhérine et conduit à une perte de la fonction de barrière des cellules endothéliales cérébrales. L’ensemble de nos résultats a donc permis d’améliorer nos connaissances des mécanismes moléculaires modulant la perméabilité endothéliale. / VE-cadherin is a major adhesion molecule composing endothelial adherens junctions (AJ), which ensure selectivity of the endothelial barrier. Stabilization of the VE-cadherin complex at the surface of endothelial cells plays a pivotal role in the maintenance of vascular homeostasis. Conversely, the disorganization or internalisation of VE-cadherin is a frequent consequence of VE-cadherin modifications (e.g phosphorylation), which promotes in turn vascular permeability. In general, vascular leakage can be observed in both physiological and pathological conditions. Indeed, VE-cadherin phosphorylation caused by pro-angiogenic and pro-permeability factors, among which vascular endothelial growth factor (VEGF) is the prototype, occurs during physiological angiogenesis, as well as tumour-associated angiogenesis. Besides, pro-inflammatory molecules, such as interleukin-8 (IL-8) can also participate in the phosphorylation of VE-cadherin and thereby promote vascular permeability. To best characterise VE-cadherin-mediated increase in vascular permeability under physiological VEGF challenge, we notably investigated the molecular interactions between serine (S665) phosphorylated VE-cadherin and the scaffolding molecule β-arrestin. We also studied the distribution of VE-cadherin in brain endothelial cells under pathological conditions, as provided by the secretome of glioblastoma (GB) brain tumour cells. My work allows the identification of a 43 amino-acid sequence within the C-terminus tail of β-arrestin1 (C-tail) that can directly bind to (S665) phosphorylated VE-cadherin and further triggers its internalisation upon VEGF stimulation. Moreover, we demonstrated the unexpected role of β-arrestin1 C-tail in the down-regulation of the VE-cadherin promoter activity, which results in reduction of VE-cadherin RNA and protein levels, thus contributing to the endothelial barrier properties. Furthermore, in order to evaluate the effects of tumour-secreted factors on the hyper-permeability associated with the tumour microenvironment, we explored the composition and function of the GB secretome on brain endothelial cells. We found that abundant secretion of IL-8 by GB cells causes VE-cadherin-mediated endothelial junction disorganization. Moreover, IL-8 promotes both brain endothelial cell permeability and tubulogenesis. In conclusion, we established a new role for β-arrestin1 in the control of VE-cadherin-based junctions in human endothelial cells. Likewise, we demonstrated that tumour cell-released IL-8 chemokine provokes VE-cadherin-dependent junction remodelling and thereby increases the permeability of human brain endothelial cells. Our results reinforce the central role of VE-cadherin in the modulation of the vascular barrier function in physiological and pathological conditions.