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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Erika Crispim Resende - 2013.pdf: 9225841 bytes, checksum: 704ac58eda3cb376fd2c234dcc302a24 (MD5) Previous issue date: 2013-06-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / O ácido ursólico (AU) é um composto triterpenoide pentacíclico que ocorre em grande variedade de plantas do Cerrado. Apresenta atividades anti-inflamatória, antioxidante, antitumoral e ação inibidora de enzimas responsáveis pelo envelhecimento cutâneo. Devido à sua reduzida hidrossolubilidade, a incorporação do AU em produtos de uso tópico representa um desafio farmacotécnico. Neste sentido, a produção de nanossistemas pode ser considerada uma alternativa promissora. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar sistemas nanoestruturados contendo AU, investigar a atividade citotóxica, antioxidante, antidegradação da matriz celular, toxicidade, avaliar o efeito de permeação cutânea ex vivo e in vivo do AU e verificar a eficácia no tratamento de manchas cutâneas e prevenção de rugas. Inicialmente o AU foi submetido aos ensaios de citotoxicidade em células B16-F10 e Balb/c 3T3 por MTT e em Balb/c 3T3 pela captação do corante vermelho neutro. A morfologia das células B16-F10 tratadas com AU foi avaliada através de coloração de Giemsa. A atividade antioxidante celular (AAC) do AU foi realizada em células NIH-3T3 pelo método de diclorofluoresceína. A capacidade do AU em inibir enzimas (elastase, colagenase e tirosinase) foi avaliada por métodos espectrofotométricos. Os Lipossomas (LPs, obtidos pelo método de hidratação do filme lipídico), nanopartículas poliméricas (NPs, preparadas através da técnica de precipitação do polímero pré-formado) e as microemulsões (MEs, obtidas por emulsificação espontânea) foram caracterizados quanto à distribuição do tamanho, índice de polidispersão (PdI), pH, potencial zeta e teor do AU incorporado. Com a finalidade de veicular as MEs, uma emulsão (EM) foi formulada. O índice de refração (IR) foi determinado para os componentes das MEs e das EMs. A estabilidade física foi por observação visual e testes de centrifugação. Métodos cromatográficos com detector ultravioleta e de massas (CLAE-UV e CLAE-EM/EM) foram desenvolvidos e validados para quantificar o AU nas formulações e nos ensaios de permeação. Os testes pré-clínicos da EM com ME (AU 0,02%) e da ME (AU 0,2%) envolveram ensaios de contagem de micro-organismos totais, toxicidade oral aguda em ratos, irritação ocular e cutânea primária em coelhos, sensibilização cutânea em cobaias, toxicidade dermal aguda em ratos, mutagenicidade in vitro e micronúcleo em camundongos. Foram realizadas permeações cutâneas ex-vivo (utilizando células de Franz e pele de orelha de porco) e in vivo (pela técnica de tape stripping em antebraços de voluntários sadios). Nos estudos ex-vivo uma solução receptora de lauril sulfato de sódio a 2,5% (pH 7,4, 37°C a 300rpm) foi utilizada atendendo as condições sink. Após 24 horas, a solução receptora, o estrato córneo e a epiderme viável foram analisados quanto à presença do AU. A permeação in vivo teve a finalidade de obter informações sobre o tempo de exposição na pele de voluntários sadios à dose de AU presente nas formulações. O estudo clínico foi mono-cêntrico, aberto, prospectivo com dois tratamentos em um período utilizando-se quatro voluntários masculinos sadios (18–28 anos). Os parâmetros dermofarmacocinéticos da área sob a curva do perfil de penetração de AU ao longo das fitas (ASC0-t) e do tempo necessário para que o AU atingisse a metade do efeito máximo predito ET50 foram avaliados. A integridade cutânea dos voluntários foi monitorada pela perda de água transepidermal. As formulações (60mg) foram aplicadas em 5 sítios (2,0 cm2) em cada antebraço ficando em contato com a pele por 30 minutos, 1 h, 2 h, 4 h e 6 h (sítios 1 ao 5, respectivamente). Decorrido o tempo de cada sítio, a técnica de tape stripping foi realizada e o AU quantificado. 32 mulheres (35-63 anos) foram instruídas a utilizar a ME contendo AU por 30 dias em um estudo de eficácia clínica dermatológica de aceitabilidade cutânea e de apreciabilidade cosmética. Após o tratamento, as voluntárias fizeram avaliação clínica final para comparação do aspecto do rosto (D30) com o início do tratamento (D0). A eficácia clínica foi analisada quanto à uniformidade do tom da pele, manchas, linhas de expressão e rugas. Já a apreciabilidade cosmética foi feita por meio de um questionário. Os resultados dos ensaios da concentração inibitória CI50 de AU para B16-F10 foi de 15,70μM e de 22,09 μM para 3T3. A CI50 de AU em células de melanoma confirmou a capacidade antitumoral do AU. Ocorreram alterações na morfologia das células B16-F10 quando tratadas com AU próximo ao valor da CI50 sugerindo apoptose. O AU exibiu atividade antioxidante celular inibindo cerca de 65% a oxidação da quercetina, mas não foi possível observar esta atividade quando o AU foi submetido a ensaios in vitro com reações radicalares (DPPH•). Nos ensaios enzimáticos, o AU inibiu ±25% da colagenase, ±22% da tirosinase e ±11% da elastase. O método CLAE-EM/EM foi validado sendo linear com R>0,99. Apresentou precisão e exatidão com desvio padrão relativo (DPR%) abaixo de 10% e recuperação variando de 93,3 a 103,4%. Os LPs e as NPs apresentaram instabilidade com vazamento de AU e baixa encapsulação. As MEs apresentaram pH dentro da faixa aceitável para aplicação tópica e maior incorporação de AU do que os sistemas de LPs e NPs. A ME incorporada à emulsão apresentou estabilidade a temperatura ambiente. A ME e a emulsão contendo AU demonstraram perfis reológicos semelhantes evidenciando ausência de propriedade tixotrópica. Os IRs variaram de 1,3388 para emulsão sem ME a 1,4700 para os tensoativos. As MEs apresentaram valores intermediários de IR concluindo eram do tipo água em óleo (A/O). Não foi observada degradação do AU analisado por CLAE-EM/EM mesmo após um ano de preparação da ME e na emulsão contendo ME. Ensaios pré-clínicos de toxicidade demonstraram que a EM contendo 10% de ME (0,02% de AU) e a microemulsão (0,2% de AU) não apresentaram toxicidade oral, não foram irritantes para os olhos nem para a pele e não foram mutagênicas. Nos estudos de permeação ex-vivo, cerca de 1,5 vezes mais AU permeou a pele quando incorporado na ME, já na emulsão contendo AU disperso (não microencapsulado), o AU ficou mais retido no estrato córneo, cerca de 5,3 vezes mais que ao valor encontrado na epiderme. Na ME, a concentração do AU na epiderme viável foi aproximadamente 7 vezes maior quando comparado ao AU livre (emulsão). Na ME veiculada na emulsão cerca de 7% de AU foi quantificado no estrato córneo e cerca de 32% foi encontrado na epiderme viável. Nos estudos de permeação in vivo, não foi verificada nenhuma ocorrência de reação adversa. A metade do efeito máximo predito (ET50) para a formulação de emulsão contendo AU disperso foi alcançada em aproximadamente 49 minutos após a aplicação do produto na pele, já a formulação de emulsão contendo microemulsão demonstrou um perfil de duração da dose do AU independentemente do tempo de exposição sendo que o efeito máximo predito para a absorção permaneceu constante ao longo do tempo. A avaliação clínica após tratamento com a ME mostrou eficácia de 3% em relação à uniformidade do tom da pele, 16% de eficácia em relação às manchas, 66% em relação às linhas de expressão e 59% de eficácia contra as rugas. Já a avaliação da opinião das voluntárias, 44% perceberam melhora na sensação de pele mais jovem, 41% perceberam melhora na sensação de pele mais bela e 61% referiram gostar do produto. Diante dos resultados obtidos pode-se concluir que a microemulsão contendo AU é uma forte candidata a agente terapêutico tópico podendo veicular o AU para camadas mais profundas da pele. Além disto, foi verificado que o AU é capaz de prevenir o aparecimento de rugas, inibir a ação de enzimas que degradam as proteínas estruturais da pele, agir contra células de melanoma e como antioxidante. / O ácido ursólico (AU) é um composto triterpenoide pentacíclico que ocorre em grande variedade de plantas do Cerrado. Apresenta atividades anti-inflamatória, antioxidante, antitumoral e ação inibidora de enzimas responsáveis pelo envelhecimento cutâneo. Devido à sua reduzida hidrossolubilidade, a incorporação do AU em produtos de uso tópico representa um desafio farmacotécnico. Neste sentido, a produção de nanossistemas pode ser considerada uma alternativa promissora. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar sistemas nanoestruturados contendo AU, investigar a atividade citotóxica, antioxidante, antidegradação da matriz celular, toxicidade, avaliar o efeito de permeação cutânea ex vivo e in vivo do AU e verificar a eficácia no tratamento de manchas cutâneas e prevenção de rugas. Inicialmente o AU foi submetido aos ensaios de citotoxicidade em células B16-F10 e Balb/c 3T3 por MTT e em Balb/c 3T3 pela captação do corante vermelho neutro. A morfologia das células B16-F10 tratadas com AU foi avaliada através de coloração de Giemsa. A atividade antioxidante celular (AAC) do AU foi realizada em células NIH-3T3 pelo método de diclorofluoresceína. A capacidade do AU em inibir enzimas (elastase, colagenase e tirosinase) foi avaliada por métodos espectrofotométricos. Os Lipossomas (LPs, obtidos pelo método de hidratação do filme lipídico), nanopartículas poliméricas (NPs, preparadas através da técnica de precipitação do polímero pré-formado) e as microemulsões (MEs, obtidas por emulsificação espontânea) foram caracterizados quanto à distribuição do tamanho, índice de polidispersão (PdI), pH, potencial zeta e teor do AU incorporado. Com a finalidade de veicular as MEs, uma emulsão (EM) foi formulada. O índice de refração (IR) foi determinado para os componentes das MEs e das EMs. A estabilidade física foi por observação visual e testes de centrifugação. Métodos cromatográficos com detector ultravioleta e de massas (CLAE-UV e CLAE-EM/EM) foram desenvolvidos e validados para quantificar o AU nas formulações e nos ensaios de permeação. Os testes pré-clínicos da EM com ME (AU 0,02%) e da ME (AU 0,2%) envolveram ensaios de contagem de micro-organismos totais, toxicidade oral aguda em ratos, irritação ocular e cutânea primária em coelhos, sensibilização cutânea em cobaias, toxicidade dermal aguda em ratos, mutagenicidade in vitro e micronúcleo em camundongos. Foram realizadas permeações cutâneas ex-vivo (utilizando células de Franz e pele de orelha de porco) e in vivo (pela técnica de tape stripping em antebraços de voluntários sadios). Nos estudos ex-vivo uma solução receptora de lauril sulfato de sódio a 2,5% (pH 7,4, 37°C a 300rpm) foi utilizada atendendo as condições sink. Após 24 horas, a solução receptora, o estrato córneo e a epiderme viável foram analisados quanto à presença do AU. A permeação in vivo teve a finalidade de obter informações sobre o tempo de exposição na pele de voluntários sadios à dose de AU presente nas formulações. O estudo clínico foi mono-cêntrico, aberto, prospectivo com dois tratamentos em um período utilizando-se quatro voluntários masculinos sadios (18–28 anos). Os parâmetros dermofarmacocinéticos da área sob a curva do perfil de penetração de AU ao longo das fitas (ASC0-t) e do tempo necessário para que o AU atingisse a metade do efeito máximo predito ET50 foram avaliados. A integridade cutânea dos voluntários foi monitorada pela perda de água transepidermal. As formulações (60mg) foram aplicadas em 5 sítios (2,0 cm2) em cada antebraço ficando em contato com a pele por 30 minutos, 1 h, 2 h, 4 h e 6 h (sítios 1 ao 5, respectivamente). Decorrido o tempo de cada sítio, a técnica de tape stripping foi realizada e o AU quantificado. 32 mulheres (35-63 anos) foram instruídas a utilizar a ME contendo AU por 30 dias em um estudo de eficácia clínica dermatológica de aceitabilidade cutânea e de apreciabilidade cosmética. Após o tratamento, as voluntárias fizeram avaliação clínica final para comparação do aspecto do rosto (D30) com o início do tratamento (D0). A eficácia clínica foi analisada quanto à uniformidade do tom da pele, manchas, linhas de expressão e rugas. Já a apreciabilidade cosmética foi feita por meio de um questionário. Os resultados dos ensaios da concentração inibitória CI50 de AU para B16-F10 foi de 15,70μM e de 22,09 μM para 3T3. A CI50 de AU em células de melanoma confirmou a capacidade antitumoral do AU. Ocorreram alterações na morfologia das células B16-F10 quando tratadas com AU próximo ao valor da CI50 sugerindo apoptose. O AU exibiu atividade antioxidante celular inibindo cerca de 65% a oxidação da quercetina, mas não foi possível observar esta atividade quando o AU foi submetido a ensaios in vitro com reações radicalares (DPPH•). Nos ensaios enzimáticos, o AU inibiu ±25% da colagenase, ±22% da tirosinase e ±11% da elastase. O método CLAE-EM/EM foi validado sendo linear com R>0,99. Apresentou precisão e exatidão com desvio padrão relativo (DPR%) abaixo de 10% e recuperação variando de 93,3 a 103,4%. Os LPs e as NPs apresentaram instabilidade com vazamento de AU e baixa encapsulação. As MEs apresentaram pH dentro da faixa aceitável para aplicação tópica e maior incorporação de AU do que os sistemas de LPs e NPs. A ME incorporada à emulsão apresentou estabilidade a temperatura ambiente. A ME e a emulsão contendo AU demonstraram perfis reológicos semelhantes evidenciando ausência de propriedade tixotrópica. Os IRs variaram de 1,3388 para emulsão sem ME a 1,4700 para os tensoativos. As MEs apresentaram valores intermediários de IR concluindo eram do tipo água em óleo (A/O). Não foi observada degradação do AU analisado por CLAE-EM/EM mesmo após um ano de preparação da ME e na emulsão contendo ME. Ensaios pré-clínicos de toxicidade demonstraram que a EM contendo 10% de ME (0,02% de AU) e a microemulsão (0,2% de AU) não apresentaram toxicidade oral, não foram irritantes para os olhos nem para a pele e não foram mutagênicas. Nos estudos de permeação ex-vivo, cerca de 1,5 vezes mais AU permeou a pele quando incorporado na ME, já na emulsão contendo AU disperso (não microencapsulado), o AU ficou mais retido no estrato córneo, cerca de 5,3 vezes mais que ao valor encontrado na epiderme. Na ME, a concentração do AU na epiderme viável foi aproximadamente 7 vezes maior quando comparado ao AU livre (emulsão). Na ME veiculada na emulsão cerca de 7% de AU foi quantificado no estrato córneo e cerca de 32% foi encontrado na epiderme viável. Nos estudos de permeação in vivo, não foi verificada nenhuma ocorrência de reação adversa. A metade do efeito máximo predito (ET50) para a formulação de emulsão contendo AU disperso foi alcançada em aproximadamente 49 minutos após a aplicação do produto na pele, já a formulação de emulsão contendo microemulsão demonstrou um perfil de duração da dose do AU independentemente do tempo de exposição sendo que o efeito máximo predito para a absorção permaneceu constante ao longo do tempo. A avaliação clínica após tratamento com a ME mostrou eficácia de 3% em relação à uniformidade do tom da pele, 16% de eficácia em relação às manchas, 66% em relação às linhas de expressão e 59% de eficácia contra as rugas. Já a avaliação da opinião das voluntárias, 44% perceberam melhora na sensação de pele mais jovem, 41% perceberam melhora na sensação de pele mais bela e 61% referiram gostar do produto. Diante dos resultados obtidos pode-se concluir que a microemulsão contendo AU é uma forte candidata a agente terapêutico tópico podendo veicular o AU para camadas mais profundas da pele. Além disto, foi verificado que o AU é capaz de prevenir o aparecimento de rugas, inibir a ação de enzimas que degradam as proteínas estruturais da pele, agir contra células de melanoma e como antioxidante.

A doença de Chagas representa um grave problema de saúde pública, afetando principalmente a população de baixa renda, o que a torna negligenciada pela indústria farmacêutica. Atualmente, existe apenas um fármaco disponível para o tratamento, o benzonidazol, porém este apresenta eficácia limitada e está associado a diversos efeitos colaterais. O ácido ursólico, um triterpeno de origem natural, possui atividade tripanocida, porém, sua solubilidade aquosa baixa limita sua biodisponibilidade. Para o aumento da biodisponibilidade tem destaque o uso das dispersões sólidas, onde fármacos lipofílicos são dispersos molecularmente ou no estado amorfo em carreadores hidrofílicos, acarretando um aumento do perfil de dissolução. Neste trabalho, dispersões sólidas e misturas físicas contendo ácido ursólico foram preparadas com os carreadores polietilenoglicol 6000, Gelucire 50/13 e dióxido de silício coloidal, Poloxamer 407 e caprato de sódio, empregando as técnicas de fusão e evaporação do solvente. Os sistemas foram caracterizados através das técnicas de microscopia eletrônica de varredura, espectroscopia do infravermelho com transformada de Fourier, calorimetria exploratória diferencial, microscopia em hot stage e difratometria de raios-X. Em outra etapa, os produtos foram avaliados quanto à solubilidade aquosa, perfil de dissolução in vitro, citotoxicidade em linhagem celular LLC-MK2, e atividade tripanocida em modelo animal. Em conjunto, os resultados mostraram que o fármaco não teve suas propriedades afetadas pela manipulação em misturas físicas, mantendo sua estrutura cristalina. Por outro lado, os experimentos de difratometria de raios-X e as observações microscópicas em hot stage revelaram a alteração do ácido ursólico para o estado amorfo, principalmente para os sistemas preparados pelo método do solvente, enquanto que algumas formulações manipuladas pelo método da fusão exibiram alterações polimórficas. Além disso, evidenciaram-se interações intermoleculares do tipo ligações de hidrogênio para as dispersões sólidas preparadas pelo método do solvente. As alterações do fármaco observadas para as dispersões sólidas preparadas pelo método do solvente aumentaram sua solubilidade e melhoraram seu perfil de dissolução comparado às dispersões sólidas pelo método da fusão e misturas físicas, sendo este aumento maior para os sistemas compostos por Poloxamer 407 + caprato de sódio, seguido por Poloxamer 407, Gelucire 50/13 + dióxido de silício coloidal e PEG 6000, o que pode ser atribuído ao poder tensoativo dos três primeiros carreadores. As formulações mostram-se seguras até a concentração de 128 ?M do fármaco, através da avaliação da citotoxicidade. Por último, o ursólico teve um aumento significativo da atividade tripanocida para a formulação composta pelo tensoativo Poloxamer 407 junto com o promotor de absorção oral caprato de sódio, manipulada pelo método do solvente, sugerindo o aumento da biodisponibilidade do fármaco. / Chagas disease represents a severe problem in public health, affecting mainly the low-income population, making it neglected by the pharmaceutical industry. Currently, there is only one drug available for treatment, benznidazol, however, it presents limited efficacy and is associated with several side effects. Ursolic acid, a naturally occurring triterpene, presents trypanocidal activity, but its low water solubility limits the bioavailability. To increase the biovailability, solid dispersions, where lipophilic drugs are molecularly or in the amorphous state dispersed in hydrophilic carriers, can play an important role, resulting in enhanced dissolution profile of the drug. In this work, solid dispersions and physical mixtures containing ursolic acid were prepared with Polyethyleneglycol 6000, Gelucire 50/13 and silicon dioxide, Poloxamer 407 and sodium caprate as carriers, employing the fusion and solvent evaporation techniques. The products were characterized through scanning electron microscopy, Fourier transform infrared spectroscopy, differential scanning calorimetry, hot stage microscopy and X-ray diffractometry. In another step, the formulations were evaluated regarding the aqueous solubility, in vitro dissolution profile, citotoxicity using LLC-MK2 cell line, and trypanocidal activity in animal model. Together, results showed that the drug did not suffer any change in its properties when in physical mixture. On the other hand, X-ray diffractometry and hot stage microscopy revealed a transition from the crystalline to the amorphous state for ursolic acid, especially for the products prepared by the solvent method. In the fusion method, some formulations exhibited a polymorphic change. Moreover, we identified intermolecular interactions between drug and carrier by hydrogen bonding in the products prepared by the solvent method. These changes observed for solid dispersions prepared by the solvent method resulted in increased water solubility and dissolution profile and these effects were higher for the products prepared with Poloxamer 407 + sodium caprate, followed by Polomer 407 alone, Gelucire 50/13 + silicon dioxide and PEG 6000, which can be attributed to the surfactant property of the three first carriers. The formulations were safe up to 128 ?M of the drug, showed by the citotoxicity evaluation. Very importantly, we highlight that ursolic acid had a significant increase in the trypanocidal activity for the product prepared with the surfactant Poloxamer 407 and the penetration enhancer sodium caprate, prepared by the solvent method, suggesting that in this composition ursolic acid was more bioavailable.

A doença de Chagas causada pelo Trypanosoma cruzi representa um grave problema de saúde pública na América Latina e cada vez mais em todo o mundo, afetando principalmente regiões de baixo poder aquisitivo, e por isso negligenciada pela indústria farmacêutica. Atualmente apenas um fármaco está disponível, o benzonidazol, o qual apresenta eficácia limitada e está associado a diversos efeitos colaterais. Estudos recentes demonstraram atividade tripanocida do ácido ursólico, entretanto sua utilização é limitada pela alta hidrofobicidade, sendo o uso dos nanocarreadores lipossomais reconhecido como uma estratégia promissora para solucionar tal limitação, além de serem sistemas altamente versáteis e biocompatíveis. Neste trabalho, foram desenvolvidos lipossomas de fosfatidilcolina e colesterol contendo ácido ursólico pela técnica da evaporação do solvente e hidratação do filme lipídico seguida de sonicação, permitindo a obtenção de vesículas unilamelares e com baixa polidispersividade. A partir da avaliação preliminar da estabilidade das dispersões, a adição do colesterol na razão molar 10:1 fosfatidilcolina:colesterol foi essencial para a manutenção do conteúdo encapsulado quando a formulação foi estocada em temperatura ambiente e melhor retenção do conteúdo a 4°C (90%). Após a liofilização o emprego de sucrose na razão molar 1:10 lipídeo:açúcar, a formulação manteve o tamanho e distribuição de tamanho e impediu a agregação das vesículas. A formulação obtida foi caracterizada por microscopia eletrônica de transmissão, apresentando diâmetro entre 100 e 120 nm, também observado pelo espalhamento dinâmico da luz. As análises por espectroscopia no infravermelho e calorimetria exploratória diferencial demonstraram uma forte interação do fármaco com a membrana fosfolipídica por interações de hidrogênio, assim como uma menor mobilidade das cadeias lipídicas e formação de uma matriz vítrea a qual foi responsável pela efetiva crioproteção das vesículas. Estudo in vitro do perfil de liberação do fármaco a partir dos lipossomas pela técnica da diálise resultou em alta retenção do conteúdo encapsulado e uma liberação sustentada deste. A partir de ensaio biológico in vitro empregando azul de trypan, a formulação liofilizada contendo ácido ursólico se mostrou segura até a concentração em que seria necessária para carrear 32 ?M do fármaco, considerando a linhagem de mamíferos LLC-MK2. Em relação à atividade tripanocida em linhagem da cepa CL da forma epimastigota empregando MTT, o lipossoma contendo o fármaco foi capaz de causar morte celular do parasita em 100%, considerando-se um possível efeito sinérgico do ácido ursólico e o colesterol, cuja seletividade à membrana do parasita tem sido recentemente demonstrada. Contudo apenas a formulação contendo o ácido ursólico apresentou índice de seletividade aceitável, o que está relacionado com o efeito citoprotetor do ácido ursólico. / Chagas disease caused by Trypanosoma cruzi is a serious public health problem in Latin America and is an increasing disease around the world, mainly affecting regions with low purchasing power, and therefore Chagas disease is considered neglected by the pharmaceutical industry. Today, only one product is available, benznidazole, which has limited efficacy and is associated with several side effects. Recent studies have shown trypanocidal activity of ursolic acid, however its use is limited by the high hydrophobicity. The use of liposomal nanocarriers is recognized as a promising strategy to address this limitation and they are highly versatile and biocompatible systems. In this study, ursolic acid loaded phosphatidylcholine and cholesterol liposomes were developed using the solvent evaporation and lipid film hydration technique followed by sonication, allowing unilamellar vesicles formation with low polydispersity. From the preliminary assessment of the dispersion stability, the addition of cholesterol allowed the encapsulation efficiency maintenance when the formulation was stored at room temperature and better drug retention at 4°C (90%). After lyophilization employing sucrose 1:10 lipid:sugar molar ratio, the formulation manteined the size and size distribution and vesicle aggregation was prevented. The formulation obtained was characterized by transmission electron microscopy, with diameter between 100 and 120 nm, also observed by dynamic light scattering. The analysis by infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry showed a strong hydrogen interaction between ursolic acid and the phospholipid membrane, as well as a lower mobility of the lipid chains and glassy matrix formation which was responsible for the effective cryoprotection. In vitro drug release profile from liposomes by dialysis technique resulted in high retention of the encapsulated content and a sustained release. From in vitro biological assay using trypan blue, the ursolic acid loaded lyophilized liposomes proved to be safe up to a concentration that would be required to carry 32 ?M of the drug, considering the LLC-MK2 mammalians cell line. Regarding the trypanocidal activity of epimastigotes CL strain by MTT technique, the ursolic acid loaded liposomes showed greater efficacy than blank liposome able to causing 100% of parasite cell death, considering a possible synergism effect of ursolic acid and cholesterol, whose selectivity to the parasite membrane has been recently demonstrated. However, only the formulation containing ursolic acid showed acceptable selectivity index, which is related to the ursolic acid cytoprotective effect.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The present work describes the synthesis of twenty-two new derivatives (4-25) from stigmasterol (1) and seven new derivatives (26-32) from ursolic acid (2) via esterification and coupling reactions with different amino acids. All the structures of the compounds were confirmed by 1H and 13C NMR. The derivatives were tested for their antimicrobial activity, antitumor activity against cancer cells HT -29 (colorectal) and inhibition of POP, AChE and BChE enzymes. In antimicrobial activity among the compounds tested, ursolic acid (1) showed the greatest potential for inhibition. The results obtained from enzyme inhibition tests were satisfactory, generally the activities of the starting compounds 1 and 2 were increased after the introduction of the amino acids. Among the derivatives evaluated, ursolic-proline-proline-OH acid (32) showed the highest inhibitory capacity of AChE and BChE enzymes and may be considered a dual cholinesterase inhibitor, which can provide greater efficacy in the treatment of Alzheimer's disease. In the evaluation of the antitumor effect, after the first 24 h, most of ursolic acid derivatives showed inhibition effect in cell viability between 33.7 and 70%. After 72 h, the derivative 32 showed the best performance because it did not increase the number of viable cells at any concentration tested, indicating that this compound may be a candidate for antitumor drug. / O presente trabalho descreve a síntese de vinte e dois novos derivados (4 - 25) do estigmasterol (1) e sete novos derivados (26 - 32) do ácido ursólico (2) através de reações de esterificação e de acoplamento com diferentes aminoácidos. Todas as estruturas dos compostos foram confirmadas por RMN 1H e RMN 13C. Os derivados foram testados quanto à sua atividade antimicrobiana, atividade antitumoral frente à célula cancerígena HT-29 (colorretal) e de inibição das enzimas POP, AChE e BChE. Na atividade antimicrobiana, dentre os compostos testados, o ácido ursólico (1) demonstrou o maior potencial de inibição. Os resultados obtidos nos ensaios de inibição enzimática foram satisfatórios, geralmente ocorrendo um aumento da atividade dos compostos de partida 1 e 2 após a introdução dos aminoácidos. Dentre os derivados avaliados, o ácido ursólico-prolina-prolina-OH (32) apresentou a maior capacidade inibitória das enzimas AChE e BChE, podendo ser considerado um inibidor colinesterásico dual, o que pode proporcionar maior eficácia no tratamento da doença de Alzheimer. Na avaliação do efeito antitumoral, após as primeiras 24 h, a maioria dos derivados do ácido ursólico demonstrou efeito de inibição da viabilidade celular entre 33,7 e 70 %. Após 72 h, o derivado 32 foi o que apresentou melhor desempenho, pois não aumentou o número de células viáveis em nenhuma concentração testada, o que indica que este composto pode ser um candidato a fármaco antitumoral.

A doença de Chagas é um problema de saúde pública, com dados preocupantes referentes ao número de pessoas contaminadas e daquelas que ainda permanecem expostas ao risco de infecção. As doenças tropicais desafiam as pesquisas científicas, pois os medicamentos existentes apresentam sérios efeitos colaterais. As tripanossomíases são doenças de grande importância no Brasil, como é o caso da doença de Chagas. Estudos realizados em diversos países têm relatado que muitas espécies vegetais possuem atividade contra o agente etiológico da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi. Ácido ursólico e seu isômero, ácido oleanólico, pertencem à classe de compostos triterpenóides e são amplamente distribuídos no reino vegetal e têm sido frequentemente isolados como mistura isomérica. Nesse sentido, a proposta para o presente estudo foi avaliar a atividade tripanocida, sobre a cepa Y e Bolívia de T. cruzi, dos triterpenos ácido ursólico e ácido oleanólico, sintetizar e avaliar a atividade tripanocida do sal derivado de ácido ursólico. As substâncias foram administradas nas concentrações de 20 e 50 mg/kg por via intraperitoneal e oral, após a avaliação da dose letal média (DL50). As três substâncias empregadas nas concentrações de 20 e 50 mg/kg, administradas por via intraperitoneal não foram capazes de reduzir a parasitemia dos animais experimentalmente infectados com as cepas Y e Bolívia de T. cruzi. Entretanto, as três substâncias exibiram atividade tripanocida significativa, na concentração de 50 mg/kg, administradas por via oral, em animais infectados com a cepa Y de T. cruzi. Para a cepa Bolívia de T. cruzi, as substâncias administradas por via oral exibiram atividade biológica na concentração de 20 mg/kg, sendo significativa apenas para o triterpeno ácido ursólico. A análise histológica realizada não demonstrou uma correlação significativa entre os níveis parasitêmicos e o parasitismo tecidual, para todos os grupos avaliados. A avaliação do perfil hepatobiliar e renal das substâncias foi realizada a fim de se verificar possíveis efeitos tóxicos das mesmas. Entretanto, não foi observada nenhuma diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratados e o grupo controle, indicando que o aumento dos níveis parasitêmicos não está associado ao efeito das substâncias no tecido. Através da avaliação do efeito dos triterpenos sobre a resposta imune, verificamos uma diminuição dos níveis plasmáticos de IFN- e um aumento das concentrações de IL-10. Dessa maneira, nós sugerimos que o tratamento com essas substâncias pode direcionar a resposta imune para o padrão Th2 e, em conseqüência desse efeito imunossupressor, uma maior quantidade de formas tripomastigotas poderia ser observada na circulação do hospedeiro. / Chagas disease is a public health problem with worrisome data on the number of infected people, not to mention the population that still remains at risk of infection. Tropical diseases defy scientific research since the existing drugs have serious side effects. Trypanosomiases, such as Chagas disease, are of great importance in Brazil. Studies in several countries have reported that many plant species display activity against Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. Ursolic acid and its isomer, oleanolic acid, belong to a class of triterpenoid compounds that is widely distributed in the plant kingdom and has frequently been isolated as an isomeric mixture. In the present study, the trypanocidal activity of the triterpenoids ursolic acid and oleanolic acid was evaluated against the Y and Bolivia strains of T. cruzi. In addition, the potassium salt derivative of ursolic acid was synthesized and also tested. The triterpenoids were administered intraperitoneally and orally at concentrations of 20 and 50 mg / kg, after evaluation of the median lethal dose (LD50). At the concentrations of 20 and 50 mg / kg, the intraperitoneal administration of each of the substances was not able to reduce parasitemia of the animals infected with the Y and Bolivia strains of T. cruzi. However, ursolic and oleanolic acid, as well as the potassium salt derivative of ursolic acid exhibited significant trypanocidal activity at a concentration of 50 mg / kg when they were orally administered to animals infected with the Y strain of T. cruzi. On the other hand, oral administration of the tested compounds at a concentration of 20 mg / kg evidenced biological activity, which was significant for ursolic acid only. For the most of studied groups, histological analysis did not demonstrate a significant correlation between the levels of parasitemia and tissue parasitism. Determination and evaluation of biochemical parameters in the serum of experimental animals was performed, to assess the hepatic, biliary, and renal toxic effects of the substances. There were no statistically significant differences between the treated groups and the control group, indicating that the increase in parasitemia is not associated with the effects of the substances in the tissue. We suggest the hypothesis of an immunosuppressive effect, since there was a decreased plasma levels of IFN- after treatment with the triterpenes. Moreover, the treated groups also exhibited increased levels of IL-10. Therefore, we suggest that treatment with the substances could be directing the immune response toward the Th2 type and, as a consequence of this immunosuppressive effect, a greater amount of trypomastigotes could be observed in the circulation of the host.

A doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi e acomete milhões de pessoas, principalmente as de baixa renda em países subdesenvolvidos. É considerada uma doença negligenciada, não existindo uma terapia eficaz contra os parasitas na fase crônica da doença. Estudos preliminares demonstraram que o ácido ursólico apresenta atividade tripanocida, entretanto, este fármaco possui baixa solubilidade em água, o que prejudica a sua biodisponibilidade. Com o intuito de viabilizar a terapia com ácido ursólico, as nanopartículas poliméricas são sistemas de liberação promissores, devido a sua capacidade de liberação modificada. Além disso, os sistemas nanoencapsulados destacam-se pela alta eficiência de encapsulação do fármaco, proteção contra degradação, e menor possibilidade de causar toxicidade. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento e a caracterização de nanopartículas de policaprolactona para a veiculação de ácido ursólico, visando à otimização da terapia da Doença de Chagas. O estudo teve início com o desenvolvimento das nanopartículas poliméricas contendo ácido ursólico. A formulação obtida neste estudo pela técnica da nanoprecipitação apresentou menor valor de tamanho de partícula (173,17±4,20) e índice de polidispersividade (0,09±24,77), com perfil monomodal, potencial zeta de -36 mV e eficiência de encapsulação de 94,1±1,31%. O tamanho das partículas observado na microscopia eletrônica de varredura demonstrou ser compatível com os valores observados nas análises de espalhamento dinâmico de luz, embora tenha apresentado uma característica agregada e ligeiramente esférica. Através da determinação do coeficiente de partição do ácido ursólico foi possível avaliar a alta lipofilicidade do ácido ursólico. Na determinação do coeficiente de solubilidade do ácido ursólico, o lauril sulfato de sódio foi o tensoativo de escolha para o estudo in vitro do perfil de liberação, solubilizando aproximadamente 300 ?g.mL-1 de fármaco, mas não foi possível a realização do estudo in vitro do perfil de liberação, devido a sua característica altamente lipofílica. O estudo da citotoxicidade por ensaio de resazurina mostrou que a formulação escolhida não alterou a viabilidade celular de células LLCMK2, portanto sem toxicidade para o meio biológico, bem como evidenciou a capacidade das nanopartículas poliméricas contendo ácido ursólico de reduzir a viabilidade dos parasitas em aproximadamente 50%. A avaliação da atividade biológica do ácido ursólico em camundongo C57BL/6 infectados com a cepa Y do Trypanosoma cruzi apresentou uma redução acentuada (p<0,001) dos tripomastigotas quando comparados ao grupo I, sugerindo uma liberação sustentada do ácido ursólico nesse modelo de nanopartículas poliméricas. Como conclusão, as nanopartículas poliméricas contendo ácido ursólico podem ser propostas como uma abordagem quimioprofilática da doença de Chagas, considerando a necessidade dessa medida de segurança para pacientes que recebem transfusão sanguínea no Sistema Único de Saúde no Brasil. / Chagas disease is caused by parasite Trypanosoma cruzi and affects millions of lowincome in developing countries and because of that it is neglected by the pharmaceutical industry and there is no effective therapy against parasites in the chronic phase of the disease. Preliminary studies showed that ursolic acid presents tripanocidal activity, however, it has low water solubility, which reduces its bioavailability. Among the existing drug delivery systems, polymeric nanoparticles play a central role, due to their ability to sustain or control the release of drugs. Moreover, nanocoated systems are distinguished by high drug encapsulation efficiency, protection from degradation, and less likely to cause irritation. The aim of this work is development and characterization of the polymeric nanoparticles containing ursolic acid, aiming to optimize the treatment of Chagas disease. The study began with the development of polymeric nanoparticles containing ursolic acid. The formulation obtained in this study by the nanoprecipitation technique showed the lowest particle size (173.17 ± 4.20) and polydispersity index (0.09 ± 24.77), with monomodal profile, zeta potential of -36 mV and encapsulation efficiency was 94.1% ± 1.31. The size of the particles observed by scanning electron microscopy showed to be compatible with the values observed in the analysis of dynamic light scattering, although it had an aggregate and slightly spherical characteristic. By determining the coefficient of ursolic acid partition was possible to evaluate the high lipophilicity of ursolic acid. In determining the solubility coefficient of ursolic acid, sodium lauryl sulfate was the surfactant of choice for studying in vitro release profile, solubilizing approximately 300 ?g.mL-1 of the drug, but it has not been possible to conduct the study in vitro release profile, due to its highly lipophilic character. The study of resazurin cytotoxicity assay showed that the formulation did not alter the cell viability of LLCMK2 cells, and therefore, without toxicity to the biological environment and demonstrated the ability of the polymeric nanoparticles containing ursolic acid to reduce the viability of parasites in approximately 50 %. The evaluation of biological activity of ursolic acid in mice C57BL/6 mice infected with the Y strain of Trypanosoma cruzi showed a marked reduction (p<0.001) of trypomastigotes when compared to group I, suggesting a sustained release of ursolic acid in polymeric nanoparticles model. In conclusion, polymeric nanoparticles containing ursolic acid may be proposed as a chemoprophylactic approach of Chagas disease, considering the need for this safety measure for patients receiving blood transfusion Health System in Brazil.

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A doença de Chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi e acomete milhões de pessoas, principalmente as de baixa renda em países subdesenvolvidos. É considerada uma doença negligenciada, não existindo uma terapia eficaz contra os parasitas na fase crônica da doença. Estudos preliminares demonstraram que o ácido ursólico apresenta atividade tripanocida, entretanto, este fármaco possui baixa solubilidade em água, o que prejudica a sua biodisponibilidade. Com o intuito de viabilizar a terapia com ácido ursólico, as nanopartículas poliméricas são sistemas de liberação promissores, devido a sua capacidade de liberação modificada. Além disso, os sistemas nanoencapsulados destacam-se pela alta eficiência de encapsulação do fármaco, proteção contra degradação, e menor possibilidade de causar toxicidade. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento e a caracterização de nanopartículas de policaprolactona para a veiculação de ácido ursólico, visando à otimização da terapia da Doença de Chagas. O estudo teve início com o desenvolvimento das nanopartículas poliméricas contendo ácido ursólico. A formulação obtida neste estudo pela técnica da nanoprecipitação apresentou menor valor de tamanho de partícula (173,17±4,20) e índice de polidispersividade (0,09±24,77), com perfil monomodal, potencial zeta de -36 mV e eficiência de encapsulação de 94,1±1,31%. O tamanho das partículas observado na microscopia eletrônica de varredura demonstrou ser compatível com os valores observados nas análises de espalhamento dinâmico de luz, embora tenha apresentado uma característica agregada e ligeiramente esférica. Através da determinação do coeficiente de partição do ácido ursólico foi possível avaliar a alta lipofilicidade do ácido ursólico. Na determinação do coeficiente de solubilidade do ácido ursólico, o lauril sulfato de sódio foi o tensoativo de escolha para o estudo in vitro do perfil de liberação, solubilizando aproximadamente 300 ?g.mL-1 de fármaco, mas não foi possível a realização do estudo in vitro do perfil de liberação, devido a sua característica altamente lipofílica. O estudo da citotoxicidade por ensaio de resazurina mostrou que a formulação escolhida não alterou a viabilidade celular de células LLCMK2, portanto sem toxicidade para o meio biológico, bem como evidenciou a capacidade das nanopartículas poliméricas contendo ácido ursólico de reduzir a viabilidade dos parasitas em aproximadamente 50%. A avaliação da atividade biológica do ácido ursólico em camundongo C57BL/6 infectados com a cepa Y do Trypanosoma cruzi apresentou uma redução acentuada (p<0,001) dos tripomastigotas quando comparados ao grupo I, sugerindo uma liberação sustentada do ácido ursólico nesse modelo de nanopartículas poliméricas. Como conclusão, as nanopartículas poliméricas contendo ácido ursólico podem ser propostas como uma abordagem quimioprofilática da doença de Chagas, considerando a necessidade dessa medida de segurança para pacientes que recebem transfusão sanguínea no Sistema Único de Saúde no Brasil. / Chagas disease is caused by parasite Trypanosoma cruzi and affects millions of lowincome in developing countries and because of that it is neglected by the pharmaceutical industry and there is no effective therapy against parasites in the chronic phase of the disease. Preliminary studies showed that ursolic acid presents tripanocidal activity, however, it has low water solubility, which reduces its bioavailability. Among the existing drug delivery systems, polymeric nanoparticles play a central role, due to their ability to sustain or control the release of drugs. Moreover, nanocoated systems are distinguished by high drug encapsulation efficiency, protection from degradation, and less likely to cause irritation. The aim of this work is development and characterization of the polymeric nanoparticles containing ursolic acid, aiming to optimize the treatment of Chagas disease. The study began with the development of polymeric nanoparticles containing ursolic acid. The formulation obtained in this study by the nanoprecipitation technique showed the lowest particle size (173.17 ± 4.20) and polydispersity index (0.09 ± 24.77), with monomodal profile, zeta potential of -36 mV and encapsulation efficiency was 94.1% ± 1.31. The size of the particles observed by scanning electron microscopy showed to be compatible with the values observed in the analysis of dynamic light scattering, although it had an aggregate and slightly spherical characteristic. By determining the coefficient of ursolic acid partition was possible to evaluate the high lipophilicity of ursolic acid. In determining the solubility coefficient of ursolic acid, sodium lauryl sulfate was the surfactant of choice for studying in vitro release profile, solubilizing approximately 300 ?g.mL-1 of the drug, but it has not been possible to conduct the study in vitro release profile, due to its highly lipophilic character. The study of resazurin cytotoxicity assay showed that the formulation did not alter the cell viability of LLCMK2 cells, and therefore, without toxicity to the biological environment and demonstrated the ability of the polymeric nanoparticles containing ursolic acid to reduce the viability of parasites in approximately 50 %. The evaluation of biological activity of ursolic acid in mice C57BL/6 mice infected with the Y strain of Trypanosoma cruzi showed a marked reduction (p<0.001) of trypomastigotes when compared to group I, suggesting a sustained release of ursolic acid in polymeric nanoparticles model. In conclusion, polymeric nanoparticles containing ursolic acid may be proposed as a chemoprophylactic approach of Chagas disease, considering the need for this safety measure for patients receiving blood transfusion Health System in Brazil.

Toxoplasma gondii é um protozoário pertencente ao filo Apicomplexa, de distribuição mundial, e que infecta diversas espécies hospedeiros, como mamíferos e aves, possuindo como hospedeiros definitivos o gato e outros felídeos, enquanto o homem e outros animais são os seus hospedeiros intermediários. O tratamento é feito, na maioria das vezes, com uma combinação de sulfadiazina e pirimetamina, agindo na via metabólica do ácido fólico, o qual é necessário para a biossíntese de purinas, pirimidinas e certos aminoácidos. Propusemos estabelecer um protocolo de avaliação sobre esse protozoário, assim como padronizarmos uma metodologia por espectroscopia para uma rápida avaliação ou triagem de substâncias potencialmente ativas contra o parasito. Verificamos a atividade das substâncias ácido ursólico e ácido oleanóico, as quais já demonstraram atividade biológica sobre outras espécies de protozoários, como Plasmodium, Trypanosoma cruzi e Leishmania sp. em sistemas in vitro e in vivo. A metodologia colorimétrica pelo MTT, pelo Alamar Blue®, do kit CyQUANT® NF e a contagem manual em meio líquido das formas taquizoítas do parasito em ensaios biológicos in vitro mostram-se inviáveis, pois há grande dificuldade em manter a integridade do parasita em meio de cultura líquido, o qual se mostra sensível à adição de qualquer outro componente que não aqueles necessários para manter sua viabilidade em ambiente extracelular. O ácido ursólico mostrou-se potencialmente ativo in vitro sobre formas intracelulares de T. gondii. Entretanto, o contato de células infectadas com as substâncias avaliadas por um período de 48 horas não resultou em diminuição mais acentuada na porcentagem de células infectadas do que a ocorrida no tratamento de 24 horas. A comparação dos resultados do tratamento pós infecção celular por 24 horas e do pré-tratamento das formas taquizoítas houve diferenças significativas, indicando principalmente maior ação do pré-tratamento sobre T. gondii. Quando administrado na dose de 7 mg/kg/ dia a camundongos infectados, o ácido ursólico não apresentou atividade sobre o parasita. / Toxoplasma gondii is an Apicomplexa protozoan, of worldwide distribution, that infects several species, from mammalians to birds; its definitive hosts are the cats and other felines, while man and other animals are considered as intermediate hosts. Treatment is, generally, a combination of sulfadiazine and pyrimethamine, triggering the metabolic pathway of folic acid, which is necessary for certain purines, pirimidines and aminoacids biosynthesis. We have proposed an evaluation protocol on this protozoan, and also to establish a methodology by spectroscopy for rapid evaluation of pottentialy bioactive substances against the parasite. The ursolic acid and oleanoic acid bioactivity were tested. These substances have already demonstrated to be effective on another protozoan species, like Plasmodium, Trypanosoma cruzi e Leishmania sp., either in vitro or in vivo. The colorimetric methodology by MTT, Alamar Blue®, CyQUANT® NF kit and manual counting of tachyzoite forms in liquid culture medium showed to be unviable, because there is a great difficult to maintain the parasite viability in liquid culture medium, wich one is sensible to addition of any other component different of that necessary for its survival in extracelular ambient. Ursolic acid was pottentialy active on T. gondii intracellular forms. However, the infected cells in contact with the tested substances for a period of 48 hours did not show a statistical greater reduction as compared to infected cells which underwent treatment for 24 hours. Significant results were observed when comparing pre-treatment of tachyzoite forms and treatment for 24 hours post-cellular infection. Our data pointed in the direction that pre-treatment exerted a higher effectiveness. Any parasiticidal activity was observed when ursolic acid on a concentration of 7 mg/kg/day was administered to infected mice.

A doença de Chagas é um problema de saúde pública, com dados preocupantes referentes ao número de pessoas contaminadas e daquelas que ainda permanecem expostas ao risco de infecção. A dificuldade do combate a Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença, está intimamente relacionada às interações existentes entre o parasito e o hospedeiro, sendo que até o momento, nenhum medicamento ou substância tem demonstrado real eficácia ao combate ao parasito. Em estudos recentes realizados por nosso grupo de pesquisa, os ácidos ursólico e oleanólico demonstraram um bom potencial tripanocida, além de um efeito imunomodulatório, promovendo a inibição da produção de IFN-? quando de suas utilizações por via intraperitoneal em elevadas concentrações. Considerando essas evidências encontradas em relação a essas substâncias e os efeitos promovidos no processo de avaliação biológica, propusemos como objetivo avaliar o potencial terapêutico dos triterpenos ácido ursólico e ácido oleanólico na fase crônica da infecção chagásica e suas associações ao benzonidazol, fármaco referência indicado ao tratamento da parasitose, verificando a possibilidade de geração de benefícios sobre a patogênese da infecção crônica experimental. A quantificação de linfócitos T CD4+ e T CD8+, e das citocinas IL-2, IL-10, IL-12, IFN-? e TNF-??pela técnica de citometria de fluxo, utilizando o kit BD Cytometric Bead Array®, indicaram que essas substâncias não apresentam efeitos imunomodulatórios significativos sobre a resposta Th1 e Th2 nessa fase da doença, na comparação entre grupos infectados e tratados e aquele que recebeu apenas solvente. O parasitismo tecidual determinado por Real Time PCR e as observações realizadas em cortes histológicos, mostraram, respectivamente, baixo número de cópias de DNA de T. cruzi, e ausência de ninhos amastigotas, porém, com marcante presença de infiltrado inflamatório em todos os grupos. Assim, os dados obtidos levam à conclusão de que apesar da atividade apresentada pelos triterpenos ácidos em estudo na fase aguda da doença de Chagas, o mesmo não ocorre na fase crônica, como seria desejável para favorecer uma melhora do quadro patológico, mesmo não havendo a cura da doença, considerando as conseqüências da infecção de longo prazo. / Chagas disease is a public health problem, with disturbing data about the number of infected people and those who remain at risk of infection. The difficulty of eliminating Trypanosoma cruzi, etiologic agent of the disease is closely related to the interactions between the parasite and the host, and until now, no medicine or substance has demonstrated real effectiveness against the parasite. In recent studies by our research group, the ursolic and oleanolic acids revealed considerable trypanocidal activity, and an immunomodulatory effect, promoting the inhibition of IFN-? with intraperitoneal administration in high concentrations. Considering these evidences and the effects observed during the biological evaluation, our objective was to evaluate the biological potential of the triterpenoids ursolic acid and oleanolic acid in the chronic phase of chagasic infection and their associations to benznidazole, the reference drug indicated for the treatment of this disease, verifying the possibility of benefits on the pathogenesis of experimental chronic infection. Quantification of T CD4+ and T CD8+ cells and of the cytokines IL-2, IL-10, IL-12, IFN-? and TNF-? by flow cytometry using the kit BD cytometric Bead Array®, indicated that these substances do not exhibit significant immunomodulatory effects on Th1 and Th2 responses in this stage of the disease, comparing infected and treated groups and that who received only solvent. The tissue parasitism determined by Real Time PCR and in histological observations showed, respectively, low copy number of T. cruzi DNA, and absence of amastigote nests, however, with marked inflammatory infiltration in all groups. Thus, our data lead to the conclusion that despite the activity presented by the triterpene acids studied in the acute phase of Chagas disease, the same does not occur in the chronic phase, as would be desirable to the reduction of the pathological conditions, even if there is no cure of the disease, considering the consequences of long term infection.