Submitted by TIAGO GAZOLA (tiago-gazola@hotmail.com) on 2017-09-12T15:48:47Z No. of bitstreams: 1 Tiago Gazola com ficha.pdf: 1538645 bytes, checksum: 1858094f7f52707ec423af3ef92da438 (MD5) / Approved for entry into archive by Monique Sasaki (sayumi_sasaki@hotmail.com) on 2017-09-12T17:59:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gazola_t_me_bot.pdf: 1538645 bytes, checksum: 1858094f7f52707ec423af3ef92da438 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-12T17:59:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gazola_t_me_bot.pdf: 1538645 bytes, checksum: 1858094f7f52707ec423af3ef92da438 (MD5) Previous issue date: 2017-07-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As infestações com Digitaria insularis em áreas de culturas anuais e os casos de resistência ao herbicida glyphosate aumentaram nos últimos anos, e estes fatos contribuíram para tornar a espécie uma das mais importantes plantas daninhas do Brasil. Diante disso, foram desenvolvidos experimentos que tiveram como objetivo confirmar a resistência de biótipos de D. insularis perenizados e propagados vegetativamente resistentes ao glyphosate, bem como, compreender o perfil metabólico do herbicida nestas plantas, verificar se existe alteração no controle relativo em função dos métodos de propagação empregados e determinar o fator de resistência nas progênies obtidas por sementes autofecundadas. Foram realizados três experimentos em casa de vegetação no delineamento inteiramente casualizado, sendo os dois primeiros com oito biótipos de capim-amargoso considerados como suscetíveis e três com suspeita de resistência ao herbicida glyphosate. No primeiro experimento foi avaliado o controle das plantas aos 7, 14, 21 e 28 dias após a aplicação (DAA) do glyphosate. No segundo experimento, avaliou-se o controle nas mesmas épocas do primeiro e 72 horas após a aplicação do herbicida foi quantificado o acúmulo de ácido chiquímico e ácido quínico, deposição, absorção e translocação de glyphosate, concentração de AMPA, dos aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina e triptofano) e ácido salicílico. No terceiro experimento foram conduzidas curvas de dose-resposta com glyphosate nas doses de 0; 90; 180; 360; 720; 1440; 2880 e 5760 g e.a. ha-1, na progênie de quatro biótipos, e foram avaliados o controle e a massa seca aos 21 DAA para obtenção do fator de resistência. O método de propagação vegetativa se mostrou consistente e não alterou a resposta dos biótipos nos testes de fitointoxicação por glyphosate. Confirmou-se a resistência dos três biótipos pelo controle visual e acúmulo de ácido chiquímico e quínico. A metabolização em AMPA não é considerada mecanismo de resistência da espécie ao glyphosate. Os biótipos resistentes apresentaram maior concentração de ácido salicílico. As progênies obtidas por autofecundação apresentaram fator de resistência para EC50 de 14,37 e 7,04 e para GR50 12,79 e 3,77. / Digitaria insularis ocurrence infestations in annual crop and cases of glyphosate herbicide resistance have increased in recent years, and the facts contributed to make the species one of the most important weeds in Brazil. Therefore, experiments were carried out to confirm the resistance of perennial and vegetatively propagated D. insularis biotypes resistant to glyphosate, as well as to understand the metabolic profile of the herbicide in these plants, to verify if there is alteration in the relative control according to the methods and determine the resistance factor in the progenies obtained by self-fertilized seeds. Three experiments were carried out under greenhouse conditions in a completely randomized design, the first two with eight sourgrass biotypes considered as susceptible and three with suspected resistance to glyphosate herbicide. In the first experiment, the control of the plants at 7, 14, 21 and 28 days after glyphosate application (DAA) was evaluated. In the second experiment, the control was evaluated in the same periods of the first and 72 hours after the application of the herbicide was quantified the accumulation of shiquimic acid and quinic acid, deposition, absorption and translocation of glyphosate, concentration of AMPA, aromatic amino acids (phenylalanine, tyrosine and tryptophan) and salicylic acid. In the third experiment, dose-response curves were conducted with glyphosate at doses of 0; 90; 180; 360; 720; 1440; 2880 and 5760 g e.a. ha-1 , in the progeny of four biotypes, and control and dry mass were evaluated at 21 DAA to obtain the resistance factor. The vegetative propagation method was consistent and did not alter the response of the biotypes in the glyphosate control tests. The resistance of the three biotypes was confirmed by the visual control and accumulation of shikimic and quinic acid. Metabolization in AMPA is not considered a resistance mechanism of the species to glyphosate. Resistant biotypes showed higher concentration of salicylic acid. The progenies obtained by self-fertilization presented a resistance factor for EC50 of 14,37 and 7,04 and for GR50 12,79 and 3,77.

Orientador: Prof. Dr. Danilo da Cruz Centeno / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2018. / A recalcitrância da parede celular, associada à presença da lignina nos tecidos vegetais, dificulta e torna mais oneroso o uso da biomassa para a produção de etanol de segunda geração. Para driblar este obstáculo, muitos estudos têm sido realizados para compreender o metabolismo da lignina e encontrar formas alternativas de tratamento da biomassa. Recentemente, o ozônio vem sendo aplicado como uma alternativa de pré-tratamento do material lignocelulósico, devido à ação específica sobre a lignina. O presente trabalho possui dois capítulos independentes, e teve como objetivo principal estudar as alterações no conteúdo de lignina em cana-de-açúcar dado as características inerentes aos colmos das variedades estudadas e ao efeito causado pela fumigação aguda com ozônio. No capítulo I, além da quantificação de lignina, determinamos a concentração de açúcares solúveis totais para quatro variedades ¿ RB72454, RB855156, RB867515 e RB9257. Estes dados foram submetidos a análises de correlação e conectância com dados de metabolismo primário previamente obtidos por nosso grupo de pesquisa. A influência da variação da concentração do ácido chiquímico sobre o conteúdo de lignina não pôde ser confirmada através da correlação encontrada entre os dois compostos. Porém, a análise de rede de conectância mostrou que a lignina e o ácido chiquímico estão mais fortemente conectados nas variedades de colheita tardia RB72454 e RB92579. Estas conexões revelam a influência das fases do desenvolvimento vegetal no metabolismo da lignina. No capítulo II, avaliamos as alterações no conteúdo de lignina de folhas de cana-de-açúcar após exposições sucessivas à fumigação com ozônio. Os resultados mostraram uma reação das plantas (despolimerização) aos danos causados pelo estresse oxidativo quando submetidas a um ciclo de fumigação, e um aumento no conteúdo de lignina como uma resposta de memória ao estresse, amplificando suas defesas contra este estresse. O metabolismo da lignina e sua relação com o metabolismo primário é complexo e, no presente estudo, os resultados mostraram que alterações nesta relação podem ser observadas tanto constitutivamente (i.e., inerentes ao desenvolvimento da planta), quanto induzidas por estresse. Ademais, reportamos que, entre as técnicas utilizadas neste trabalho, a rede de conectância e o FT-Raman mostraram-se importantes ferramentas no estudo da lignina. / The recalcitrance of the cell wall is associated with the presence of lignin in the vegetal tissues, making it difficult and more expensive to use biomass for the production of second-generation ethanol. To overcome this obstacle many studies have been carried out to understand the lignin metabolism and to find alternative forms of biomass treatment. Recently, ozone has been applied as an alternative pretreatment of the lignocellulosic material, due to its specific action on lignin. The present work has two independent chapters, in which the main objective was to study the changes in lignin content in sugarcane due to the inherent characteristics of the stems of the studied varieties and the effect caused by the acute fumigation with ozone. In chapter I, in addition to the quantification of lignin we determined the total soluble sugars of four varieties RB72454, RB855156, RB867515 and RB9257. These data were submitted to correlation analysis and the network connectance analysis with data of primary metabolism, previously obtained in our group. The influence of the variation of the shikimate concentration on the lignin content was not confirmed by the correlation found between the two compounds. However, the network connectance analysis showed that lignin and shikimate are more strongly connected in late harvest varieties RB72454 and RB92579. These connections revealed the influence of plant development phases over lignin metabolism. In chapter II, changes in the lignin content of leaf blades of sugarcane were evaluated after multiple exposures to ozone fumigation. The results showed a reaction of the plants (depolymerization) to the damage caused by oxidative stress when submitted to one fumigation exposure, and an increase in lignin content as a memory response to stress, amplifying their defenses against ozone. The metabolism of lignin and its relation to the primary metabolism is complex and our results showed that alterations in this relationship may be constitutive (i.e., inherent to the plant development), and induced by abiotic stress. In addition, we reported that among the techniques applied in this work, the network connectance and the FT-Raman showed to be useful tools in the study of lignin.

A investigação do potencial terapêutico de compostos naturais não tóxicos capazes de prevenir ou reduzir o impacto do estresse oxidativo em doenças inflamatórias diretamente relacionadas a dor tem exercido um papel fundamental no desenvolvimento de novas medicamentos. O ácido chiquímico (ACH) é um composto natural originalmente extraído da Illicium verum Hook. f., uma planta medicinal usada no tratamento de doenças inflamatórias. Apesar do ACH ter sido usado como um precursor químico na síntese do antiviral Tamiflu®, o seu potencial como um composto anti-inflamatório e antioxidante, já enraizado pelo uso popular, ainda permanece desconhecido. Baseado nisso, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade antioxidante, anti-inflamatória e antinociceptiva do ACH em modelos in vitro e in vivo. Inicialmente as propriedades físico-químicas do ACH foram avaliadas e a atividade antioxidante comprovada, bem como seu potencial de proteger a morte celular induzida por peróxido de hidrogênio em células de neuroblastoma SH-SY5Y. O ACH atenuou a inflamação induzida pelo LPS em macrófagos RAW 264.7, foi capaz de inibir a produção de citocinas (TNF-α e IL-β) e de NO, assim como a ativação das MAPKs (ERK1/2 e P38) induzida pelo LPS, sugerindo que o ACH pode exercer uma atividade anti-inflamatória. In vivo, o ACH bloqueou a hiperalgesia mediada pela carragenina (CG), TNF-α, prostaglandinas (PEG2) e dopamina (DA) em camundongos. Esses resultados sugerem que o efeito antinociceptivo do ACH pode ser atribuído, em parte, a sua ação antioxidante e anti-inflamatória, dois mecanismos que sustentam a transdução do sinal doloroso. / The investigation of the therapeutic potential of natural non-toxic compounds capable of counteracting oxidative stress associated with inflammatory disease and painful conditions, has been of key interest in drug development. Shiquimic acid (SA) is a nature-derived compound originally extracted from Illicium verum Hook. f., a chinese medicinal herb used to treat inflammatory diseases. Even though SA has currently been used as a chemical precursor for synthesis of the antiviral Tamiflu, its potential as an anti-inflammatory and antioxidant compound – already rooted by its popular use - remains unknown until now. Based on that, the aim of this study was to evaluate the antioxidant, anti-inflammatory and anti-nociceptive activity of SA in vitro and in vivo models. Initially the physic-chemical properties of SA were evaluated and proven antioxidant activity, as well as its potential to protect hydrogen peroxide-induced cell death in neuroblastoma SH-SY5Y cells. SA attenuates LPS-induced inflammation in RAW 264.7 macrophages, SA was capable of inhibiting TNF-α and IL-1β cytokines production, NO production as well as LPS-induced activation of MAPKs (p38 and ERK1/2), thus suggesting that SA may exert anti-inflammatory activity. In vivo, SA blocked carrageenan, TNF-alpha-, prostaglandin (PE2)-, and dopamine-induced hyperalgesia in mice. These results suggest that anti-nociceptive effect of SA could be attributed, at least in part, to their antioxidant and anti-inflammatory actions, two mechanisms underpinning painful signal transduction.

Apesar da incidência per capita da tuberculose (TB) ter se mantido estável em 2005, o número de novos casos que surgem a cada ano continua a aumentar no mundo todo. De acordo com a Organização Mundial de Saúde, foram estimados 9,4 milhões de novos casos de TB em 2008, dos quais 1,4 milhões eram HIV - positivos, e com 1,8 milhões de mortes - o equivalente a 4.500 mortes por dia. Fatores como migração, privação sócio-econômica, co-infecção TB-HIV e o aparecimento de cepas resistentes contribuíram para o aumento do número de casos de TB no mundo, principalmente nos países onde a TB já foi considerada erradicada, e criaram a necessidade do desenvolvimento de novas terapêuticas. Alvos moleculares específicos, que são essenciais para o patógeno, e ausentes no hospedeiro, como as enzimas da via do ácido chiquímico são alvos atraentes para o desenvolvimento de novas drogas antituberculose. Essa via leva à síntese de compostos aromáticos, como aminoácidos aromáticos, e é encontrada em plantas, fungos, bactérias e parasitas do phylum Apicomplexa, mas está ausente em humanos. No ano de 2000, foi comprovada a essencialidade dessa via para a viabilidade do bacilo, tornando todas essas enzimas alvos validados para estudo. A segunda enzima da via, deidroquinato sintase (DHQS), catalisa a conversão de 3-deoxi-D-arabino heptulosonato-7-fosfato em 3-deidroquinato, o primeiro composto cíclico. Neste trabalho, são descritos o requerimento de metais divalentes na reação e a determinação do mecanismo cinético da DHQS. Os parâmetros cinéticos verdadeiros foram determinados e, juntamente com os experimentos de ligação, o mecanismo rápido-equilíbrio aleatório foi proposto. O tratamento com EDTA aboliu completamente a atividade de DHQS, sendo que a adição de Co+2 e Zn+2 levam a recuperação total e parcial da atividade enzimática, respectivamente. O excesso de Zn+2 inibe a atividade DHQS, e os dados de ITC indicaram a presença de dois sítios seqüenciais de ligação, o que é consistente com a existência de um sítio secundário inibitório. O protocolo de cristalização foi estabelecido e experimentos em andamento proporcionarão a elucidação da estrutura tridimensional da DHQS, que irá beneficiar tanto o desenho de novos inibidores como uma análise detalhada dos rearranjos do domínio da proteína. Em conjunto, estes resultados representam um passo essencial para o desenho racional de inibidores específicos que podem fornecer uma alternativa promissora para um novo, eficaz, e mais curto de tratamento para TB. / Although the estimated per capita tuberculosis (TB) incidence was stable in 2005, the number of new cases arising each year is still increasing globally. According with World Health Organization, there were estimated 9.4 million new TB cases in 2008, from which 1.4 million were HIV-positive, with 1.8 million deaths total – equal to 4500 deaths a day. Migration, socio-economic deprivation, HIV co-infection and the emergence of extensively-resistance strains, have all contributed to the increasing number of TB cases worldwide, mainly in countries where it was once considered eradicated, and have created an urgent need for the development of new therapeutics against TB. Specific molecular targets, that are essential to the pathogen, and absent in the host, like the enzymes of the shikimate pathway, are attractive targets to development of new antitubercular drugs. This pathway leads to the biosynthesis of aromatic compounds, including aromatic amino acids and it is found in plant, fungi, bacteria and Apicomplexa parasites, but is absent in humans. In 2000, this pathway was proved to be essential to the viability of the pathogen, which validates all its enzymes as potential targets. The second enzyme of this pathway, dehydroquinate synthase (DHQS), catalyzes the conversion of 3-deoxy-D-arabinoheptulosonate 7-phosphate in 3-dehydroquinate, the first cyclic compound. In this work, we described the metal requirement and kinetic mechanism determination of the dehydroquinate synthase. The determination of the true kinetic parameters was performed, and, in addition to ligand binding experiments, the rapid-equilibrium random mechanism was determined. The treatment with EDTA abolished completely the activity of DHQS, and the addition of Co+2 and Zn+2 leads to full and partial recovery of enzyme activity, respectively. Excess of Zn+2 inhibits the DHQS activity, and the ITC data revealed two sequential binding sites, which is consistent with the existence of a secondary inhibitory site. The crystallization protocol was established and ongoing experiments will provide the three-dimensional structure of mtDHQS, which will benefit both the design of novel inhibitors as well as detailed analysis of domain rearrangements of protein. Taken together, these results represent an essential step for the rational design of specific inhibitors that can provide a promising alternative to a new, effective, and shorter treatment for TB.

A investigação do potencial terapêutico de compostos naturais não tóxicos capazes de prevenir ou reduzir o impacto do estresse oxidativo em doenças inflamatórias diretamente relacionadas a dor tem exercido um papel fundamental no desenvolvimento de novas medicamentos. O ácido chiquímico (ACH) é um composto natural originalmente extraído da Illicium verum Hook. f., uma planta medicinal usada no tratamento de doenças inflamatórias. Apesar do ACH ter sido usado como um precursor químico na síntese do antiviral Tamiflu®, o seu potencial como um composto anti-inflamatório e antioxidante, já enraizado pelo uso popular, ainda permanece desconhecido. Baseado nisso, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade antioxidante, anti-inflamatória e antinociceptiva do ACH em modelos in vitro e in vivo. Inicialmente as propriedades físico-químicas do ACH foram avaliadas e a atividade antioxidante comprovada, bem como seu potencial de proteger a morte celular induzida por peróxido de hidrogênio em células de neuroblastoma SH-SY5Y. O ACH atenuou a inflamação induzida pelo LPS em macrófagos RAW 264.7, foi capaz de inibir a produção de citocinas (TNF-α e IL-β) e de NO, assim como a ativação das MAPKs (ERK1/2 e P38) induzida pelo LPS, sugerindo que o ACH pode exercer uma atividade anti-inflamatória. In vivo, o ACH bloqueou a hiperalgesia mediada pela carragenina (CG), TNF-α, prostaglandinas (PEG2) e dopamina (DA) em camundongos. Esses resultados sugerem que o efeito antinociceptivo do ACH pode ser atribuído, em parte, a sua ação antioxidante e anti-inflamatória, dois mecanismos que sustentam a transdução do sinal doloroso. / The investigation of the therapeutic potential of natural non-toxic compounds capable of counteracting oxidative stress associated with inflammatory disease and painful conditions, has been of key interest in drug development. Shiquimic acid (SA) is a nature-derived compound originally extracted from Illicium verum Hook. f., a chinese medicinal herb used to treat inflammatory diseases. Even though SA has currently been used as a chemical precursor for synthesis of the antiviral Tamiflu, its potential as an anti-inflammatory and antioxidant compound – already rooted by its popular use - remains unknown until now. Based on that, the aim of this study was to evaluate the antioxidant, anti-inflammatory and anti-nociceptive activity of SA in vitro and in vivo models. Initially the physic-chemical properties of SA were evaluated and proven antioxidant activity, as well as its potential to protect hydrogen peroxide-induced cell death in neuroblastoma SH-SY5Y cells. SA attenuates LPS-induced inflammation in RAW 264.7 macrophages, SA was capable of inhibiting TNF-α and IL-1β cytokines production, NO production as well as LPS-induced activation of MAPKs (p38 and ERK1/2), thus suggesting that SA may exert anti-inflammatory activity. In vivo, SA blocked carrageenan, TNF-alpha-, prostaglandin (PE2)-, and dopamine-induced hyperalgesia in mice. These results suggest that anti-nociceptive effect of SA could be attributed, at least in part, to their antioxidant and anti-inflammatory actions, two mechanisms underpinning painful signal transduction.

A investigação do potencial terapêutico de compostos naturais não tóxicos capazes de prevenir ou reduzir o impacto do estresse oxidativo em doenças inflamatórias diretamente relacionadas a dor tem exercido um papel fundamental no desenvolvimento de novas medicamentos. O ácido chiquímico (ACH) é um composto natural originalmente extraído da Illicium verum Hook. f., uma planta medicinal usada no tratamento de doenças inflamatórias. Apesar do ACH ter sido usado como um precursor químico na síntese do antiviral Tamiflu®, o seu potencial como um composto anti-inflamatório e antioxidante, já enraizado pelo uso popular, ainda permanece desconhecido. Baseado nisso, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade antioxidante, anti-inflamatória e antinociceptiva do ACH em modelos in vitro e in vivo. Inicialmente as propriedades físico-químicas do ACH foram avaliadas e a atividade antioxidante comprovada, bem como seu potencial de proteger a morte celular induzida por peróxido de hidrogênio em células de neuroblastoma SH-SY5Y. O ACH atenuou a inflamação induzida pelo LPS em macrófagos RAW 264.7, foi capaz de inibir a produção de citocinas (TNF-α e IL-β) e de NO, assim como a ativação das MAPKs (ERK1/2 e P38) induzida pelo LPS, sugerindo que o ACH pode exercer uma atividade anti-inflamatória. In vivo, o ACH bloqueou a hiperalgesia mediada pela carragenina (CG), TNF-α, prostaglandinas (PEG2) e dopamina (DA) em camundongos. Esses resultados sugerem que o efeito antinociceptivo do ACH pode ser atribuído, em parte, a sua ação antioxidante e anti-inflamatória, dois mecanismos que sustentam a transdução do sinal doloroso. / The investigation of the therapeutic potential of natural non-toxic compounds capable of counteracting oxidative stress associated with inflammatory disease and painful conditions, has been of key interest in drug development. Shiquimic acid (SA) is a nature-derived compound originally extracted from Illicium verum Hook. f., a chinese medicinal herb used to treat inflammatory diseases. Even though SA has currently been used as a chemical precursor for synthesis of the antiviral Tamiflu, its potential as an anti-inflammatory and antioxidant compound – already rooted by its popular use - remains unknown until now. Based on that, the aim of this study was to evaluate the antioxidant, anti-inflammatory and anti-nociceptive activity of SA in vitro and in vivo models. Initially the physic-chemical properties of SA were evaluated and proven antioxidant activity, as well as its potential to protect hydrogen peroxide-induced cell death in neuroblastoma SH-SY5Y cells. SA attenuates LPS-induced inflammation in RAW 264.7 macrophages, SA was capable of inhibiting TNF-α and IL-1β cytokines production, NO production as well as LPS-induced activation of MAPKs (p38 and ERK1/2), thus suggesting that SA may exert anti-inflammatory activity. In vivo, SA blocked carrageenan, TNF-alpha-, prostaglandin (PE2)-, and dopamine-induced hyperalgesia in mice. These results suggest that anti-nociceptive effect of SA could be attributed, at least in part, to their antioxidant and anti-inflammatory actions, two mechanisms underpinning painful signal transduction.

Apesar da incidência per capita da tuberculose (TB) ter se mantido estável em 2005, o número de novos casos que surgem a cada ano continua a aumentar no mundo todo. De acordo com a Organização Mundial de Saúde, foram estimados 9,4 milhões de novos casos de TB em 2008, dos quais 1,4 milhões eram HIV - positivos, e com 1,8 milhões de mortes - o equivalente a 4.500 mortes por dia. Fatores como migração, privação sócio-econômica, co-infecção TB-HIV e o aparecimento de cepas resistentes contribuíram para o aumento do número de casos de TB no mundo, principalmente nos países onde a TB já foi considerada erradicada, e criaram a necessidade do desenvolvimento de novas terapêuticas. Alvos moleculares específicos, que são essenciais para o patógeno, e ausentes no hospedeiro, como as enzimas da via do ácido chiquímico são alvos atraentes para o desenvolvimento de novas drogas antituberculose. Essa via leva à síntese de compostos aromáticos, como aminoácidos aromáticos, e é encontrada em plantas, fungos, bactérias e parasitas do phylum Apicomplexa, mas está ausente em humanos. No ano de 2000, foi comprovada a essencialidade dessa via para a viabilidade do bacilo, tornando todas essas enzimas alvos validados para estudo. A segunda enzima da via, deidroquinato sintase (DHQS), catalisa a conversão de 3-deoxi-D-arabino heptulosonato-7-fosfato em 3-deidroquinato, o primeiro composto cíclico. Neste trabalho, são descritos o requerimento de metais divalentes na reação e a determinação do mecanismo cinético da DHQS. Os parâmetros cinéticos verdadeiros foram determinados e, juntamente com os experimentos de ligação, o mecanismo rápido-equilíbrio aleatório foi proposto. O tratamento com EDTA aboliu completamente a atividade de DHQS, sendo que a adição de Co+2 e Zn+2 levam a recuperação total e parcial da atividade enzimática, respectivamente. O excesso de Zn+2 inibe a atividade DHQS, e os dados de ITC indicaram a presença de dois sítios seqüenciais de ligação, o que é consistente com a existência de um sítio secundário inibitório. O protocolo de cristalização foi estabelecido e experimentos em andamento proporcionarão a elucidação da estrutura tridimensional da DHQS, que irá beneficiar tanto o desenho de novos inibidores como uma análise detalhada dos rearranjos do domínio da proteína. Em conjunto, estes resultados representam um passo essencial para o desenho racional de inibidores específicos que podem fornecer uma alternativa promissora para um novo, eficaz, e mais curto de tratamento para TB. / Although the estimated per capita tuberculosis (TB) incidence was stable in 2005, the number of new cases arising each year is still increasing globally. According with World Health Organization, there were estimated 9.4 million new TB cases in 2008, from which 1.4 million were HIV-positive, with 1.8 million deaths total – equal to 4500 deaths a day. Migration, socio-economic deprivation, HIV co-infection and the emergence of extensively-resistance strains, have all contributed to the increasing number of TB cases worldwide, mainly in countries where it was once considered eradicated, and have created an urgent need for the development of new therapeutics against TB. Specific molecular targets, that are essential to the pathogen, and absent in the host, like the enzymes of the shikimate pathway, are attractive targets to development of new antitubercular drugs. This pathway leads to the biosynthesis of aromatic compounds, including aromatic amino acids and it is found in plant, fungi, bacteria and Apicomplexa parasites, but is absent in humans. In 2000, this pathway was proved to be essential to the viability of the pathogen, which validates all its enzymes as potential targets. The second enzyme of this pathway, dehydroquinate synthase (DHQS), catalyzes the conversion of 3-deoxy-D-arabinoheptulosonate 7-phosphate in 3-dehydroquinate, the first cyclic compound. In this work, we described the metal requirement and kinetic mechanism determination of the dehydroquinate synthase. The determination of the true kinetic parameters was performed, and, in addition to ligand binding experiments, the rapid-equilibrium random mechanism was determined. The treatment with EDTA abolished completely the activity of DHQS, and the addition of Co+2 and Zn+2 leads to full and partial recovery of enzyme activity, respectively. Excess of Zn+2 inhibits the DHQS activity, and the ITC data revealed two sequential binding sites, which is consistent with the existence of a secondary inhibitory site. The crystallization protocol was established and ongoing experiments will provide the three-dimensional structure of mtDHQS, which will benefit both the design of novel inhibitors as well as detailed analysis of domain rearrangements of protein. Taken together, these results represent an essential step for the rational design of specific inhibitors that can provide a promising alternative to a new, effective, and shorter treatment for TB.

Apesar da incidência per capita da tuberculose (TB) ter se mantido estável em 2005, o número de novos casos que surgem a cada ano continua a aumentar no mundo todo. De acordo com a Organização Mundial de Saúde, foram estimados 9,4 milhões de novos casos de TB em 2008, dos quais 1,4 milhões eram HIV - positivos, e com 1,8 milhões de mortes - o equivalente a 4.500 mortes por dia. Fatores como migração, privação sócio-econômica, co-infecção TB-HIV e o aparecimento de cepas resistentes contribuíram para o aumento do número de casos de TB no mundo, principalmente nos países onde a TB já foi considerada erradicada, e criaram a necessidade do desenvolvimento de novas terapêuticas. Alvos moleculares específicos, que são essenciais para o patógeno, e ausentes no hospedeiro, como as enzimas da via do ácido chiquímico são alvos atraentes para o desenvolvimento de novas drogas antituberculose. Essa via leva à síntese de compostos aromáticos, como aminoácidos aromáticos, e é encontrada em plantas, fungos, bactérias e parasitas do phylum Apicomplexa, mas está ausente em humanos. No ano de 2000, foi comprovada a essencialidade dessa via para a viabilidade do bacilo, tornando todas essas enzimas alvos validados para estudo. A segunda enzima da via, deidroquinato sintase (DHQS), catalisa a conversão de 3-deoxi-D-arabino heptulosonato-7-fosfato em 3-deidroquinato, o primeiro composto cíclico. Neste trabalho, são descritos o requerimento de metais divalentes na reação e a determinação do mecanismo cinético da DHQS. Os parâmetros cinéticos verdadeiros foram determinados e, juntamente com os experimentos de ligação, o mecanismo rápido-equilíbrio aleatório foi proposto. O tratamento com EDTA aboliu completamente a atividade de DHQS, sendo que a adição de Co+2 e Zn+2 levam a recuperação total e parcial da atividade enzimática, respectivamente. O excesso de Zn+2 inibe a atividade DHQS, e os dados de ITC indicaram a presença de dois sítios seqüenciais de ligação, o que é consistente com a existência de um sítio secundário inibitório. O protocolo de cristalização foi estabelecido e experimentos em andamento proporcionarão a elucidação da estrutura tridimensional da DHQS, que irá beneficiar tanto o desenho de novos inibidores como uma análise detalhada dos rearranjos do domínio da proteína. Em conjunto, estes resultados representam um passo essencial para o desenho racional de inibidores específicos que podem fornecer uma alternativa promissora para um novo, eficaz, e mais curto de tratamento para TB. / Although the estimated per capita tuberculosis (TB) incidence was stable in 2005, the number of new cases arising each year is still increasing globally. According with World Health Organization, there were estimated 9.4 million new TB cases in 2008, from which 1.4 million were HIV-positive, with 1.8 million deaths total – equal to 4500 deaths a day. Migration, socio-economic deprivation, HIV co-infection and the emergence of extensively-resistance strains, have all contributed to the increasing number of TB cases worldwide, mainly in countries where it was once considered eradicated, and have created an urgent need for the development of new therapeutics against TB. Specific molecular targets, that are essential to the pathogen, and absent in the host, like the enzymes of the shikimate pathway, are attractive targets to development of new antitubercular drugs. This pathway leads to the biosynthesis of aromatic compounds, including aromatic amino acids and it is found in plant, fungi, bacteria and Apicomplexa parasites, but is absent in humans. In 2000, this pathway was proved to be essential to the viability of the pathogen, which validates all its enzymes as potential targets. The second enzyme of this pathway, dehydroquinate synthase (DHQS), catalyzes the conversion of 3-deoxy-D-arabinoheptulosonate 7-phosphate in 3-dehydroquinate, the first cyclic compound. In this work, we described the metal requirement and kinetic mechanism determination of the dehydroquinate synthase. The determination of the true kinetic parameters was performed, and, in addition to ligand binding experiments, the rapid-equilibrium random mechanism was determined. The treatment with EDTA abolished completely the activity of DHQS, and the addition of Co+2 and Zn+2 leads to full and partial recovery of enzyme activity, respectively. Excess of Zn+2 inhibits the DHQS activity, and the ITC data revealed two sequential binding sites, which is consistent with the existence of a secondary inhibitory site. The crystallization protocol was established and ongoing experiments will provide the three-dimensional structure of mtDHQS, which will benefit both the design of novel inhibitors as well as detailed analysis of domain rearrangements of protein. Taken together, these results represent an essential step for the rational design of specific inhibitors that can provide a promising alternative to a new, effective, and shorter treatment for TB.

Submitted by Michele Mologni (mologni@unoeste.br) on 2017-08-30T13:15:11Z No. of bitstreams: 1 Fláive Loyze Baldassarini Silva.pdf: 2001999 bytes, checksum: e6f3c3f0169423517f9b8ffac6f5f788 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-30T13:15:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fláive Loyze Baldassarini Silva.pdf: 2001999 bytes, checksum: e6f3c3f0169423517f9b8ffac6f5f788 (MD5) Previous issue date: 2017-06-27 / The association between proline metabolism in the plant and the pentose phosphate pathway has been proposed as a model to stimulate one of the biosynthetic routes of secondary metabolism related to the production of the different phenolic compounds in plants, known as the shikimic acid pathway. In transgenic plants in which overexpression of the P5CS gene Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase encoding the key enzyme of proline biosynthesis occurs, in addition to increased tolerance to abiotic stresses, there is the possibility of promoting the synthesis of phenolic compounds as a pleiotropic effect. The objective of this work was to evaluate the role of proline "per se" in relation to the production of phenolic compounds in transgenic tobacco plants accumulating this amino acid (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1) and to verify if water stress would modify this answer. The experiment was carried out under greenhouse conditions, at Campus II of Universidade do Oeste Paulista, Presidente Prudente - SP. A completely randomized design was used in the factorial scheme 3x2 consisting of 3 genotypes (two transgenic events with constitutive expression 35S::P5CSF129A and untransformed control plants) and two levels of water regime, with daily water replenishment of 100% and 30% of field capacity (water stress). The role of proline "per se" was evaluated by means of biometric growth analyzes (plant height, shoot and root dry mass and leaf number) in addition to proline analyzes, glucose-6-phosphate dehydrogenase activity (G6PDH), phenylalanine ammonia lyase (PAL), total phenolic compounds in leaves and lignin. In a natural response to water stress, a reduction in biometric parameters was observed for all genotypes. The accumulation of proline occurred in a greater proportion in the transgenic plants as expected by the constitutive expression of the P5CS gene, but the activity of the G6PDH enzyme was lower in the transgenic plants. The link between increased proline endogenous content and increased phenol synthesis occurred both under normal hydration conditions (for E2 event) and in the presence of water stress (for both transgenic events), as well as PAL activity. Lignin contents increased in all genotypes in response to stress. Thus, the results of this research lead us to affirm the existence of distinct responses between exogenous application of proline reported in the literature and endogenous cellular metabolism. It was not possible to confirm the hypothesis that the proline metabolism linked to the pentose phosphate pathway induces the synthesis of phenolic compounds, since the activity of the G6PDH enzyme was lower in the transgenic plants in the two water conditions. It is suggested that the precursors to the pathway of phenolic compounds linked to proline may be provided by other metabolic pathways such as glycolysis and the Calvin cycle. Further study will be needed to clarify this issue. / A associação entre o metabolismo de prolina na planta e a via pentose fosfato tem sido proposta como um modelo para se estimular uma das rotas do metabolismo secundário relacionada à produção dos diferentes compostos fenólicos em plantas, denominada via do ácido chiquímico. Em plantas transgênicas nas quais ocorrem a superexpressão do gene P5CS Δ1-pirrolina-5-carboxilato sintetase, que codifica a enzima-chave da biossíntese de prolina, além do aumento de tolerância a estresses abióticos, existe a possibilidade de promoção da síntese de compostos fenólicos como um efeito pleiotrópico. O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da prolina “per se” em relação à produção de compostos fenólicos em plantas transgênicas de tabaco acumuladoras deste aminoácido (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1) e verificar se o estresse hídrico modificaria essa resposta. O experimento foi realizado em condições de casa de vegetação, no Campus II da Universidade do Oeste Paulista, Presidente Prudente - SP. Utilizou-se o delineamento experimental em arranjo inteiramente casualizado, no esquema fatorial 3x2, formado por 3 genótipos (dois eventos transgênicos com expressão constitutiva 35S::P5CSF129A e plantas controle não transformadas) e dois níveis de regime hídrico, com reposições diárias de água de 100% e de 30% da capacidade de campo (estresse hídrico). O papel da prolina “per se” foi avaliado por meio de análises biométricas de crescimento (altura de plantas, massas seca de parte aérea e raiz e número de folhas) além das análises de prolina, atividade das enzimas glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PDH), fenilalanina amônia liase (FAL), compostos fenólicos totais nas folhas e lignina. Em resposta natural ao estresse hídrico, foi observado uma redução nos parâmetros biométricos para todos os genótipos. O acúmulo de prolina ocorreu em maior proporção nas plantas transgênicas como esperado pela expressão constitutiva do gene P5CS, porém a atividade da enzima G6PDH foi menor nas plantas transgênicas. A vinculação entre um maior conteúdo endógeno de prolina com a síntese aumentada de fenóis ocorreu tanto em condições normais de hidratação (para o evento E2) como na presença de estresse hídrico (para ambos os eventos transgênicos), assim como a atividade da FAL. Os teores de lignina aumentou em todos os genótipos em resposta ao estresse. Desta forma, os resultados dessa pesquisa levam-nos a afirmar a existência de respostas distintas entre aplicação exógena de prolina relatada na literatura e o metabolismo endógeno celular. Não foi possível confirmar a hipótese de que o metabolismo de prolina vinculado à via pentose fosfato induz a síntese de compostos fenólicos, pois a atividade da enzima G6PDH foi menor nas plantas transgênicas nas duas condições hídricas. Sugere-se que os precursores para a via dos compostos fenólicos ligados a prolina podem ser fornecidos por outras vias metabólicas tais como a glicólise e o ciclo de Calvin. Estudos mais aprofundados serão necessários para esclarecer esta questão.

Na literatura existe um consenso que os herbicidas glifosato (Gli) e 2,4-D interagem antagonicamente quando aplicados em combinação. No entanto, as bases bioquímicas e fisiológicas destes antagonismos são desconhecidas. Utilizou-se espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) para a caracterização de moléculas de Gli e 2,4-D em várias formulações analíticas, preparadas de maneira que os herbicidas fossem obtidos sem os ingredientes inertes das formulações comerciais. Não foram encontradas alterações significativas na conformação atômica do herbicida nos espectros de RMN entre as formulações analíticas de Gli isopropilamina, dimetilamina, potássio ou amônio; 2,4-D Dimetilamina ou colina, quando analisadas separadamente ou em mistura. Avaliando também formulações comerciais dos herbicidas, não foram encontradas diferenças significativas entre os espectros de RMN para a mistura entre Gli e 2,4-D. A formulação comercial de Gli amoníaco apresentou alterações na conformação molecular do Gli, principalmente na região P da molécula que mostrou maior deslocamento químico, mas isso foi atribuído aos maiores teores de Na encontrados nessa formulação. Aplicando-se as diferentes formulações comerciais na espécie modelo de tomate Micro-Tom (MT), foram estudados os padrões de absorção dos herbicidas. A absorção de Gli radiomarcado pelas plantas de MT foi reduzida somente para a formulação Gli sal de amônio, independentemente da presença de 2,4-D. Neste trabalho, não se observou efeito antagônico na absorção entre Gli e 2,4-D. Por meio de um ensaio fatorial para determinar o efeito antagônico dos herbicidas em plantas de MT, observou-se que a dose de maior antagonismo para 2,4-D foi: 35 g i.a. ha-1 - 0,65 mM e para Gli, 70 g g i.a. ha-1 - 1,7 mM. A translocação do Gli radiomarcado foi significativamente reduzida em MT, quando aplicado com 2,4-D. Experimentos utilizando o marcador molecular GUS no gene DR5 do MT, mostraram que o Gli reduz a resposta de expressão gênica pelas vias de sinalização do 2,4-D. Os ensaios de quantificação de espécies reativas de oxigênio (EROs) induzidas pela atuação do 2,4-D, apresentaram menor produção na presença do Gli. O acúmulo de ácido chiquímico causado pelo Gli no MT foi maior quando aplicado sem mistura com 2,4-D. A interferência do 2,4-D na atuação do Gli foi confirmada nos mutantes insensíveis à auxina diageotropica (dgt) e Never ripe (Nr), em que a produção de EROs foi menor e a translocação do Gli foi mantida independente da aplicação com o 2,4-D. O acúmulo de ácido chiquímico na aplicação de Gli e a mistura dos herbicidas, foram semelhantes. O mutante yellow-green2 (yg2), menos sensível ao Gli, apresentou menor translocação do herbicida. O acúmulo de ácido chiquímico para este mutante foi menor quando aplicado com Gli, mas na mistura de Gli + 2,4-D, a quantidade do ácido aumentou. A insensibilidade ao Gli proporcionou o reestabelecimento da produção de EROs pelo 2,4-D na aplicação da mistura dos herbicidas. Neste trabalho, em contraposição ao conhecimento atual, não se observou qualquer efeito antagônico entre Gli e 2,4-D a nível químico, mas o antagonismo ocorreu por fatores da inter-relação dos mecanismos que cada herbicida induz nos níveis fisiológicos, bioquímicos e genéticos na biologia do organismo vegetal. / A consensus exists in literature that the herbicides glyphosate and 2,4-D interact antagonistically when applied in combination. However, the biochemical and physiological basis of this antagonism are unknown. It was used Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectrometry to characterize the molecules of glyphosate and 2,4-D prepared with high purity analytical compounds without the commercial formulations inert ingredients. No changes in atomic herbicide conformation ware found in NMR spectra of glyphosate formulations isopropylamine, dimethylamine, potassium or ammonium and 2,4-D dimethylamine or choline, when evaluated separately or in mixture. Analysing also the commercial herbicides formulations, no differences in NMR spectra for the mixture between glyphosate and 2,4-D ware found in chemical shift. The ammonium salt glyphosate formulations, presented changes in molecular conformation in P region of glyphosate showing higher chemical shift, which was attributed to higher levels of Na found in its composition. It was applied different commercial formulations in tomato cultivar Micro-Tom (MT) to study the pattern of herbicide absorption. The absorption of radiolabeled glyphosate by MT was reduced in the ammonium salt formulation, regardless of the 2,4-D\'s presence. In this work, no antagonistic effect in plant absorption was observed between glyphosate and 2,4-D. Factor assay was conducted using different concentrations of 2,4-D and glyphosate to determine the antagonistic effect on tomato plants. It was observed that the dose of greater antagonism to 2,4-D form 35 g a.i. ha-1 - 0.65 mM and for glyphosate, 70 g a.i. ha-1 - 1.7 mM. Assays using molecular reporter GUS in MT`s DR5 gene, showed that the glyphosate reduces gene expression responses through signalling pathways of the 2,4-D. The absorption of radiolabeled glyphosate was significantly reduced in MT, when it was applied with 2,4-D. In trials that it was quantified production of reactive oxygen species (ROS) on MT induced by 2,4-D performance, lower production were found when 2,4-D ware applied with glyphosate. The shikimic acid accumulation affected by glyphosate action in MT was higher when applied without 2,4-D mixture. The interference of 2,4-D in glyphosate`s actions was confirmed in auxin insensitive mutants diageotropica (dgt) and Never ripe (Nr), which ROS production was lower. In those mutants, glyphosate translocation was maintained regardless 2,4-D application and shikimic acid accumulation between glyphosate treatment and herbicide mixture were similar. The yellow-green2 (yg2) mutant was less sensitive to glyphosate, presenting low translocation to the herbicide. The shikimic acid accumulation for yg2 mutant was lower when applied with glyphosate, but when it was treated with glyphosate + 2,4-D, the amount of acid was increased. The insensitivity of glyphosate provided reestablishment of ROS production by 2,4-D, when the mixture of herbicides were applied. In this paper it was show that, in contrast to current knowledge, there was no antagonistic effect between glyphosate and 2,4-D in chemical level, but the antagonism occurred by factors of the interrelationship of the mechanisms that each herbicide induces in the physiological, biochemical and genetic levels in the biology of the plant organism.