Orientador: Prof. Dr. Luiz Antônio Munhoz da Cunha / Co-orientador: Prof. Dr. Mauro Batsista Albano / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Clínica Cirúrgica. Defesa: Curitiba, 13/06/2017 / Inclui referências : f.52-60 / Resumo: Título: Viscossuplementação Intra-articular de Ácidos Hialurônicos em Modelo Experimental de Osteoartrite. Introdução: O tratamento medicamentoso da osteoartrite tem obtido um avanço significativo nas últimas décadas. Medicações denominadas ""condroprotetoras?? como o ácido hialurônico são utilizadas em aplicações intra-articulares de modo crescente na prática médica. Entretanto, existem controvérsias relacionadas à utilização deste método de tratamento, tanto em sua eficácia quanto em sua verdadeira função fisiológica. Objetivo: Analisar do ponto de vista imuno-histoquímico os efeitos do ácido hialurônico de diferentes pesos moleculares em modelo experimental de osteoartrite em coelhos. Material e Métodos: 44 coelhos, jovens, da raça California, machos, foram alocados de modo aleatório em três grupos (PR, S e P), sendo submetidos à ressecção do ligamento cruzado anterior do joelho direito. Decorridos três semanas do procedimento cirúrgico iniciaram-se as três injeções intra-articulares semanais de ácido hialurônico nativo de baixo peso molecular (Polireumin®) grupo PR, ácido hialurônico de cadeia ramificada de alto peso molecular (Synvisc®) grupo S e soro fisiológico 0,9% grupo P. Todos os animais foram sacrificados após 12 semanas do ato cirúrgico e os platôs tibiais dos joelhos infiltrados foram dissecados. Cortes histológicos da cartilagem das áreas de apoio dos platôs tibiais foram coradas com marcadores imuno-histoquímicos para pesquisa da quantidade de metaloproteases (MMPs-3,13) e seus inibidores (TIMPs-1,3). A intensidade de coloração foi quantificada em um aparelho de microscopia Zeiss Imager.Z2 Metasystems e analisadas pelo software Metafer4 Msearch. Esse estudo é a continuação da avaliação macroscópica e histológica dos platôs. Resultado: O efeito condroprotetor dos ácidos hialurônicos utilizados no estudo foi demonstrado quando comparados ao grupo controle, porém feita a comparação entre si, não houve diferença estatística significante quanto à condroproteção. Conclusão: Os ácidos hialurônicos testados obtiveram efeito condroprotetor, porém quanto à medição dos marcadores imuno-histoquímicos não houve diferença estatística entre os dois diferentes ácidos hialurônicos utilizados nesta pesquisa. Palavras-chaves: Osteoartrite; Ácido Hialurônico; Modelo Experimental de Osteoartrite; Imuno-histoquímica. / Abstract: Title: Intra-articular Viscosupplementation of Hyaluronic Acids in an Experimental Model of Osteoarthritis. Introduction: The medical treatment of osteoarthritis has made significant progress in recent decades. Medicines called '' chondroprotective '' such as hyaluronic acid are increasingly used in intra-articular applications in medical practice. However, there are controversies related to the use of this treatment method, both in its efficacy and in its true physiological function. Objective: Analyze the effects of immunohistochemical of hyaluronic acid of different molecular weights of osteoarthritis rabbits experimental model. Material and Methods: 44 male, young, rabbits of breed California were randomly assigned to three groups (PR, S and P) and submitted to anterior cruciate ligament resection of the right knee. After three weeks of the surgical procedure, three intra-articular injections were done weekly with low molecular weight native hyaluronic acid (Polyireumin®) to PR group, high molecular weight branched chain hyaluronic acid (Synvisc®) to group S and saline solution 0,9% to group P. All animals were sacrificed after 12 weeks of the surgical procedure and their tibial plateaus of the infiltrated knees were dissected. Histological sections of cartilage from the tibial plateau support areas were stained with immunohistochemical markers to investigate the amount of metalloproteases (MMPs 3 and 13) and their inhibitors (TIMPs 1 and 3). The staining intensity was quantified on a Zeiss Imager.Z2 Metasystems microscope and analyzed by Metafer4 Msearch software. This study is the continuation of the macroscopic and histological evaluation of the plateaus. Results: The condoprotective effect of the hyaluronic acids used in the study was demonstrated when compared to the control group, but compared each other, there was no significant statistical difference regarding to chondroprotection. Conclusion: Both hyaluronic acids tested showed chondroprotective effect, however, in the measurement of the immunohistochemical markers there was no statistical difference between two different hyaluronic acids used in this study. Key-words: Osteoarthritis; Hyaluronic Acid; Experimental Model of Osteoarthritis; Immunohistochemistry.

Made available in DSpace on 2011-12-27T14:14:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 000431505-0.pdf: 2652734 bytes, checksum: 34930e0dc8e71cd2f8bedee48c925054 (MD5) license.txt: 581 bytes, checksum: 44ea52f0b7567232681c6e3d72285adc (MD5) / Hyaluronic Acid (HA) is currently the most applied resorbable filling material. Its indiscriminate use has showed the adverse reactions. Scientific literature does not conclusively clarify the aetiology of the adverse effects, which can occur after material injection. The current research has aimed at evaluating, through clinical and histological analysis, local and systemic tissue response to the injection of 2 different hyaluronic acid concentrations in rat’s tongue. Fifty-four female Wistar rats (Rattus norvegicus) were randomically allocated into 3 groups according to the treatment (5. 5mg/mL HA, 25mg/mL HA and 0. 9 % NaCl - control) and 3 experimental times (7 days, 60 days and 90 days). Immediately before euthanasia, clinical analysis was performed guided by the parameters of presence and absence of inflammatory signs or any other alteration of the normal pattern. After euthanasia, the tongue and the right kidney of each animal were removed for microscopic analysis. Presence or absence of inflammatory reaction was measured in the tongue sections stained by hematoxylin and eosin (HE) and reactions were classified as mild, moderate or severe. The proportion of collagen fibers present was established in the sections stained with picrosirius. Presence or absence of inflammatory response in the total extension of each slide was observed in the kidney samples (HE). The clinical changes present were not statistically significant among groups (Kruskal-Wallis; p>0. 05). The groups that received HA injection presented a higher degree of inflammation if compared to the control groups in all monitoring periods (Kruskal-Wallis, p<0. 01). Regarding fibroplasias, the 25mg/mL HA group tended to form more collagen if compared to the control group (ANOVA Mixed Models; p=0. 016). In 100% of the analyzed kidney samples, there was no inflammatory reaction. According to the methodology used in this study, the obtained results allows the conclusion that (1) HA at 5. 5 and 25mg/mL presented variable and occasional clinic changes in all evaluation periods; (2) HA in the chosen concentrations, within 7 days, promoted a moderate degree of tissue inflammation; (3) After 60 and 90 days, inflammatory reaction surrounding HA particles became milder, reducing risks of adverse reactions to the material; (4) HA at 25mg/mL provoked larger concentrations of collagen if compared to the control group; (5) There was no inflammatory response and/or renal systemic migration due to the injection of HA at 5. 5mg/mL and 25mg/mL in up to 90 days of monitoring. / O ácido hialurônico (AH) é o material de preenchimento estético reabsorvível mais empregado na atualidade. Seu uso indiscriminado tem frequentemente evidenciado reações indesejáveis nos usuários destes produtos. A literatura científica disponível não esclarece, de forma conclusiva, a etiologia dos efeitos adversos que podem ocorrer a partir da sua injeção. A presente pesquisa teve por objetivo avaliar, por meio da análise clínica e histológica, a resposta tissular local e sistêmica de duas concentrações de AH em língua de ratos. Cinquenta e quatro ratos fêmeos (Rattus norvegicus, Wistar) foram distribuídos em 3 grupos de tratamento (AH 5,5mg/mL, AH 25mg/mL e NaCl 0,9 % - controle) e 3 tempos experimentais (7 dias, 60 dias e 90 dias). Antes da eutanásia, procedeu-se a avaliação clínica, através de parâmetros de presença e ausência de sinais. Posteriormente, removeu-se língua e rim direito para análise microscópica. Nos cortes de língua corados por hematoxilina e eosina (HE), mensurou-se parâmetros de ausência ou presença de reação inflamatória, sendo esta classificada como leve, moderada ou severa. Nos cortes corados com picrosírius, estabeleceuse o percentual de fibras colágenas presentes. Nas amostras obtidas do rim (HE), foram observadas a presença ou ausência de resposta inflamatória em toda a extensão da lâmina. As alterações clínicas presentes não foram estatisticamente significativas entre os grupos (Kruskal-Wallis; p>0,05). Histologicamente, os grupos AH apresentaram maior grau de inflamação que os controles em todos os tempos do experimento (Kruskal-Wallis, p< 0,01). Quanto à fibroplasia, o grupo AH 25mg/mL tendeu a formar mais colágeno se comparado ao grupo controle (ANOVA Mixed Models; p=0. 016). Em 100% das amostras de rim analisadas, não se observou resposta inflamatória. A partir da metodologia utilizada neste estudo, os resultados obtidos permitem concluir que (1) O AH nas concentrações de 5,5 e 25mg/mL provocou alterações clínicas variáveis e ocasionais em todos os períodos; (2) O AH nas Atr 14 concentrações utilizadas, em até 7 dias, promoveu um grau moderado de inflamação tecidual; (3) A reação inflamatória circunjacente às partículas do AH diminuiu de intensidade entre 60 e 90 dias, reduzindo a possibilidade de reações adversas pelo uso do material; (4) O AH 25mg/mL suscitou maior formação de colágeno se comparado ao grupo controle; (5) Não houve resposta inflamatória e/ou migração sistêmica renal a partir da injeção do AH a 5,5mg/mL e 25mg/mL em até 90 dias de observação.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Os hormônios exercem importante influência sobre a laringe. Variações da voz são comuns na prática clínica, e podem refletir alterações nas pregas vocais ao nível macroscópico e ultraestrutural. A prega vocal contém, entre outras substâncias, 0 ácido hialurônico, sendo este responsável, em grande parte, pelas suas propriedades viscoelásticas. A concentração do ácido hialurônico nos tecidos pode variar com a ação dos hormônios. OBJETIVO: 0 objetivo deste trabalho e analisar comparativamente a concentração do ácido hialurônico nas pregas vocais de ratas durante 0 ciclo estral e ciclo gravídico-puerperal. MÉTODO: Foram utilizadas 40 ratas adultas, divididas em dois grupos, ciclo estral e gravídico-puerperal. No primeiro grupo utilizamos 20 ratas para determinação da concentração do ácido hialurônico no ciclo estral; no segundo grupo, também de 20 animais, foi realizado 0 mesmo experimento no ciclo gravídico-¬puerperal. Os dois grupos foram divididos em subgrupos de acordo com a fase do ciclo em que se encontravam, e com 0 tempo de prenhez do animal. Nos subgrupos de cinco animais, quatro foram utilizados para 0 estudo da concentração do AH e um para os procedimentos histológicos. 0 método utilizado foi desenvolvido no Departamento de Biologia Molecular da Universidade de São Paulo-Escola Paulista de Medicina e trata-¬se de um método fluorimétrico para a determinação do AH em fluidos biológicos, utilizando sondas de ligação do AH. Os cortes histológicos foram submetidos a coloração de Hematoxilina-Eosina, e azul de alcian com e sem tratamento com hialuronidase. RESULTADOS: No grupo do ciclo estral não se observou variação da concentração do ácido hialurônico. No grupo do ciclo gravídico-puerperal houve aumento da concentração do ácido hialurônico no subgrupo do puerpério. Na comparação entre os dois grupos do ciclo estral e gravídico-puerperal não houve diferença. Quando comparamos todos os subgrupos há diferença no grupo do puerpério. CONCLUSÕES: Comparando-se todos os subgrupos do ciclo estral e ciclo gravídico-puerperal, só no puerpério houve aumento da concentração do ácido hialurônico.. / Hormones play an important role in the larynx. Voice variations are common in the clinical practice and may reflect alterations in the vocal folds at the macroscopic and ultrastructural levels. The vocal fold is composed of a number of substances that provideits viscoelastic properties nestly the hialuronic acid. The concentration of hyaluronic acid in the tissues may vary according to hormone action. OBJECTIVE: the objective of this study is to analyze the concentration of hyaluronic acid in the vocal folds during estral and gravidic-puerperal cycles. METHOD: 40 adult female rats were divided into two groups: Group I- 20 adult female rats were to determine concentration of hyaluronic acid during the estral cycle, and group II , 20 animals were submitted to the same procedure but during the gravidic-puerperal cycle. The two groups were divided into sub-groups according to the rats phase of the cycle and according to gestacional phase. In the sub-groups of five animals, four were used to analyze the HA concentration and one was used for histological procedures. The method used was developed in the Department of Molecular Biology of the Federal University of São Paulo University – Escola Paulista de Medicina. It is a fluorometric method that determines HA in biologic fluids, using a probe to bind HA. Histological sections were submitted to alcian blue/ hematoxylin-eosin staining method with and without hyaluronidase treatment. RESULTS: Variation in the concentration of hyaluronic acid was not observed during the estral cycle. In the gravidic puerperal cycle group, an increase in the hyaluronic acid concentration was observed only in the puerperal subgroup. No difference could be observed in the comparison between the two groups of estral and gravidic-puerperal cycles, CONCLUSIONS: When comparing all subgroups of the estral and gravidic-puerperal cycles, an increase in the hyaluronic acid concentration could be seen only in the puerperal phase. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Andrea Hayashi (deachan@gmail.com) on 2016-06-17T19:38:30Z No. of bitstreams: 1 2011-12-doutorado-paulo-roberto-dias-dos-santos.pdf: 6370997 bytes, checksum: 9a2878a903c3f2d2f6dfbf3ca1712c66 (MD5) / Approved for entry into archive by Andrea Hayashi (deachan@gmail.com) on 2016-06-17T19:38:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011-12-doutorado-paulo-roberto-dias-dos-santos.pdf: 6370997 bytes, checksum: 9a2878a903c3f2d2f6dfbf3ca1712c66 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-17T19:38:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011-12-doutorado-paulo-roberto-dias-dos-santos.pdf: 6370997 bytes, checksum: 9a2878a903c3f2d2f6dfbf3ca1712c66 (MD5) Previous issue date: 2011-12-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Introdução: As ondas de choque têm sido utilizadas para estimular a regeneração óssea em pacientes com retardo de consolidação nas fraturas. Dentre as estruturas envolvidas na osteogênese, a matriz extracelular, composta de glicosaminoglicanos (GAGs), tem um papel fundamental. Objetivo: Distinguir e quantificar os glicosaminoglicanos sulfatados e ácido hialurônico (AH) de fêmures de ratos, após perfuração óssea e aplicação de ondas de choque. Métodos: A amostra foi constituída de 50 ratos machos da linhagem Wistar, com três meses de idade e cerca de 300 gramas de peso. Os animais foram divididos em dois grupos e submetidos à cirurgia com perfuração óssea de dois milímetros, associado ou não a aplicação de ondas de choque, sendo feito eutanásia no terceiro, sétimo, 14o, 21o e 28o dias. A análise dos glicosaminoglicanos foi realizada pela eletroforese em gel de agarose, densitometria das bandas de migração e pelo teste ELISA-like. Resultados: Houve aumento significativo dos valores dos glicosaminoglicanos sulfatados no período de três a 28 dias com predominância do condroitim sulfato. O ácido hialurônico, no terceiro dia de sacrifício, mostrou aumento significativo no grupo submetido às ondas de choque em relação ao grupo controle. Conclusão: A aplicação de ondas de choque em fêmures perfurados de ratos estimularam a expressão de glicosaminoglicanos sulfatados durante a reparação óssea e a expressão do ácido hialurônico, no grupo três dias, em relação ao grupo controle. / Introduction: Several cases of delayed bone consolidation in fractures treated with shock waves for bone healing are related in cientific literature. Some of these studies point to a key role of Glycosaminoglycans extracellular matrix in the osteogenesis process. Objective: Sulfated Glycosaminoglycans (GAGs) and Hyaluronic Acid (HA) distinguish and quantification in rat femurs, after bone drilling and shock waves. Methods: The study included 50 male Wistar rats, aged three months and 300g weighted. These animals were divided in two groups, both submitted to bone drilling, but only one of them treated with shock wave. All rats were sacrified by euthanasia in different days after bone drilling: third, seventh, 14th, 21th and 28th days. The glycosaminoglycans were analysed by agarose gel electrophoresis, migration bands densitometry and by ELISA like test. Results: Sulfated glycosaminoglycans statistically significant increased since the third day group to the 28th day group, with chondroitin sulfate predominance. The hyaluronic acid statistically significant increased in the third day group treated with shock waves compared with control group. Conclusion: The application of shock waves in perforated femurs of rats stimulated the expression of sulfated glycosaminoglycans during bone repair and expression of hyaluronic acid in the group three days in the control group.

SOUSA, A. S. Cromatografia de permeação em gel em escala semi-preservativa aplicada à caracterização, purificação e fracionamento do ácido hialurônico produzido por cultivo de microorganismos. 94 f. 2007. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2007. / Submitted by Marlene Sousa (mmarlene@ufc.br) on 2016-03-22T12:38:11Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_assousa.pdf: 1171864 bytes, checksum: 6a1b99afa67f29d1d865de66d7e597e6 (MD5) / Approved for entry into archive by Marlene Sousa(mmarlene@ufc.br) on 2016-03-28T19:12:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_assousa.pdf: 1171864 bytes, checksum: 6a1b99afa67f29d1d865de66d7e597e6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-28T19:12:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_assousa.pdf: 1171864 bytes, checksum: 6a1b99afa67f29d1d865de66d7e597e6 (MD5) Previous issue date: 2007-03-20 / Hyaluronic acid (HA) is a linear, unbranched polymer, composed by simple disaccharide units, whose molar mass may range in a wide interval of distribution (104-107 Da). It is used in pharmaceutical and cosmetic applications depending on its average molecular mass. The fractionation of macromolecules of the order of magnitude of the HA may be performed by gel permeation or size-exclusion chromatography (GPC). The objective of this work is to study the characterization, purification and fractionation of microbial HA by using GPC. HA was supplied by the Department of Biotechnological Processes (DPB/FEQ/UNICAMP), having been produced by microorganisms – Streptococcus zooepidemicus – in synthetic culture media. After being centrifuged from the fermentation broth, HA was precipitated with ethanol and then dissolved in saline solution, this pre-purification procedure being performed up to four times. The presence of proteic contaminants was identified by electrophoresis in polyacrylamide gel under denaturant conditions (SDS-PAGE) and quantified by the Bradford method. For the HA sample which had been precipitated in ethanol and dissolved in 0.1 M NaNO3 four times, protein concentration was found to be nearly 100 μg/mL. The sodium salt of commercial (Sigma Aldrich - EUA) microbial HA was used as standard in order to measure a calibration curve to assess HA concentration in the samples. For the sample precipitated in ethanol and dissolved in 0.1 M NaNO3 four times, AH concentration was found to be approximately 780 μg/mL. Molar mass distribution of HA samples was assessed by GPC, both in analytical and semi-preparative scale, using refractive index (RI) and UV/Vis (280 nm) detectors, 0.1 M NaNO3 as mobile phase, flow rate 0.8 mL/min and tracers dextran and pullulan (polymers of similar hydrodynamic volume as compared to HA) as molar mass standards. The samples showed molar mass distributions in the range of 103 to 107 Da, after being precipitated and dissolved four times. For these samples, the average molar mass was found to be in the order of magnitude of 105 Da. In the semi-preparative column Superose, it was possible to separate HA fractions, with molar mass above 105 Da, and free of proteic contaminants, in an elution interval of 10 minutes / O Ácido Hialurônico (AH) é um polímero linear, não ramificado, composto por unidades dissacarídicas simples, cuja massa molar pode se distribuir num largo intervalo (104-107 Da). É usado em aplicações farmacêuticas e cosméticas dependendo de sua massa molar média. A separação de macromoléculas da ordem de grandeza do AH é possível através da Cromatografia de permeação em gel (GPC). Este trabalho tem como objetivo estudar a caracterização, purificação e fracionamento do AH produzido por microorganismos, utilizando GPC. O AH, cedido pelo Departamento de Processos Biotecnológicos (DPB/FEQ/UNICAMP), foi obtido por cultivo de microorganismos - Streptococcus zooepidemicus - em meio de cultura sintético. Após centrifugação do caldo de fermentação, o AH foi precipitado com etanol e ressuspenso em solução salina, sendo esta etapa de pré-purificação executada até quatro vezes. A presença de contaminantes protéicos foi identificada por eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes (SDS-PAGE) e quantificada pelo método de Bradford, obtendo-se 97,20 μg/mL, para a amostra de AH após quatro precipitações em etanol e ressuspensões em NaNO3 0,1 M. Para as determinações de concentração de AH nas amostras estudadas, utilizou-se o sal sódico de AH microbial comercial (Sigma Aldrich - EUA) como padrão. Quantificando-se a amostra de AH após quatro precipitações em etanol e ressuspensões em NaNO3 0,1 M, obteve-se 783,70 μg/mL. A distribuição da massa molar do AH foi avaliada por GPC, em escala analítica, utilizando coluna Shodex OHPak-SB806M-HQ e, em escala semi-preparativa, a coluna Superose 6, detectores de índice de refração e UV/Vis (280 nm), NaNO3 0,1 M como fase móvel, vazão de 0,8 mL/min e padrões de Dextrana e Pullulan (polímeros de volume hidrodinâmico semelhante ao AH) como marcadores de massa molar (5,2x103 - 7,9x106 Da e 5,8x103 – 8,53x105 Da, respectivamente). A amostra apresentou uma distribuição polimérica na faixa de 103 a 107 Da, após quatro precipitações em etanol e ressuspensões em NaNO3 0,1 M, sendo sua massa molar média da ordem de 105 Da. Foi possível separar frações de AH, acima de 105 Da, livre de contaminantes protéicos, num intervalo de aproximadamente 10 minutos, na coluna Superose 6

Made available in DSpace on 2015-05-08T02:02:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000468069-Texto+Completo-0.pdf: 1430495 bytes, checksum: 0bb6fedf792362692d6371829315b2e1 (MD5) Previous issue date: 2015 / Hyaluronic acid (HA) and polymethylmethacrylate (PMMA) are the most used dermal fillers nowadays. The indiscriminate use of such substances has brought to light unwanted adverse effects. Thus biocompatibility studies are a necessity, since the scientific literature does not clarify the etiology of these effects. The current research has evaluated cytotoxic, genotoxic and mutagenic responses from distinct in vitro tests performed in an independent manner. The cytotoxicity potential of the materials was evaluated by the induction of an inhibition halo in a solid yeast cultures. To conduce a preliminary view, the dilutions ranging from 10-2 to 10-5 were verified. For quantitative test, the colonies were counted to estimate the CFU/mL (colony-forming units per milliliter) values. Halo inhibition test showed that only silicone, used as a positive control, was capable of inducing cytotoxicity in this yeast. The preliminary experiment also indicated silicone and HA 16 mg/mL as a cellular toxicity inductor material. Quantitative test indicated that HA 20 mg/mL and 0. 1mL volume inhibited cell proliferation (ANOVA, Tukey test, p≤ 0. 05). PMMA was dosedependent to 2 and 10% concentrations (Tukey test, p≤ 0. 05). 30% PMMA showed cell proliferation inhibition similar to the negative control. Silicone proved to inhibit S. cerevisiae cell proliferation (Tukey test, p≤ 0. 05). In a second investigation, in Chinese hamster lung fibroblasts (V79 cells), the cytotoxic, genotoxic and mutagenic potentials of 20 mg/mL HA and 30% PMMA were determined. For testing these effects, clonogenic survival, comet and micronucleus assay were performed. HA and PMMA were able to decrease the colony formation when cultures were exposed to compounds by 24 h followed by 6 days in drug-free media. In addition, no genotoxic effects were detected in the 3 or 24 h of exposure to HA or PMMA. In the same manner, both dermal fillers did not induce increase in the micronucleus frequency in binucleated cells. Taken together, these results suggest that (1) 20 mg/mL HA and 10% PMMA are cytotoxicity inductors for the eukaryotic model S. cerevisiae; (2) 20 mg/mL HA and 30% PMMA have a weak cytotoxic activity in V79 cells; (3) the tested substances do not cause detectable DNA damage and chromosome alterations in V79 cells. / O ácido hialurônico (AH) e o polimetilmetacrilato (PMMA) são os materiais de preenchimento estético mais empregados na atualidade. Seu uso indiscriminado tem evidenciado efeitos indesejáveis nos usuários destes produtos, tornando necessário o estudo da biocompatibilidade dos mesmos, uma vez que a literatura científica disponível não esclarece, de forma conclusiva, a etiologia das reações adversas que podem se desenvolver a partir da sua injeção. A presente pesquisa avaliou a resposta citotóxica, genotóxica e mutagênica, a partir de testes in vitro distintos e efetuados de maneira independente. Utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae averiguou-se a citotoxicidade do AH (16 mg/mL e 20 mg/mL) e do PMMA (2%, 10% e 30%), por meio de experimentos qualitativos e quantitativos. O primeiro procedeu-se pela indução de halo de inibição. Para conduzir uma análise preliminar, as diluições 10-2 a 10-5 foram verificadas. No teste quantitativo, as colônias formadas foram contadas em UFC/mL (unidades formadoras de colônias por mililitro).Os dados observados em levedura demonstraram que no teste do halo de inibição, o silicone, utilizado como controle positivo, foi o único material capaz de induzir citotoxicidade. O exame preliminar também indicou o silicone e o AH 16 mg/mL como indutores de toxicidade celular. Na análise quantitativa, o AH 20 mg/mL no volume de 0,1 mL inibiu a proliferação celular (ANOVA, teste de Tukey, p≤ 0,05). O PMMA apresentou resposta dose-dependente nas concentrações de 2% e 10% (teste de Tukey, p≤ 0,05). Por outro lado, o PMMA 30% exibiu níveis de crescimento celular semelhantes ao controle negativo. O silicone confirmou o impedimento de proliferação celular em S. cerevisiae (teste de Tukey, p≤ 0,05). Numa segunda investigação, em cultura de fibroblastos pulmonares de hamster Chinês (linhagem V79), foram determinados os potenciais de citotoxicidade, genotoxicidade e mutagenicidade do AH 20 mg/mL e do PMMA 30%. Para esses parâmetros, a abordagem envolveu os ensaios clonogênico, cometa e micronúcleos. O AH e o PMMA foram capazes de diminuir o crescimento de colônias quando as culturas foram expostas aos produtos por 24 h, seguidos por 6 dias em meio com ausência das drogas. Não foram detectados efeitos genotóxicos em 3 h ou 24 h de exposição ao AH ou PMMA. Da mesma maneira, ambas as substâncias não induziram aumento na frequência de micronúcleos em células binucleadas. Os resultados obtidos permitem sugerir que (1) o AH 20 mg/mL e o PMMA 10% são indutores de citotoxicidade em modelo eucarioto S. cerevisiae; (2) o AH e o PMMA possuem fraca citotoxicidade sobre a linhagem V79; (3) os materiais testados não provocam danos no DNA e alterações cromossômicas detectáveis.

Made available in DSpace on 2014-03-15T02:01:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000454708-Texto+Completo-0.pdf: 503289 bytes, checksum: ad5f0c77d8fc1163a56cb76e1be4884d (MD5) Previous issue date: 2014 / In recent decades, tissue engineering techniques have been reported in the literature as an alternative to conventional autogenous grafts for bone defects and subsequent installation of dental implants, combining a material with the same biological properties of autogenous bone without its limiting factors. This technology requires a carrier for the cells, where hyaluronic acid, a natural glycosaminoglycan, appears to have suitable characteristics to carry out this role. It exerts various biological functions depending on its molecular weight, which can be classified as high (> 1000 kDa), low (from 50 to 1000 kDa) or very low (<50 kDa). Furthermore, there is the hyaluronidase, an enzyme that degrades hyaluronic acid into smaller fragments, influencing the cellular response. Thus, this study aimed to evaluate in vitro the influence of the enzyme hyaluronidase (HYAL) on the high hyaluronic acid (HA-HMW) and low molecular weight (HA-LMW) and their potential cytotoxicity on NIH - 3T3 cells. The MTT assay was performed analyzing cell viability of the following groups: (G1) Cells + HA-HMW; (G2) Cells + HA- LMW; (G3) Cells + HA-HMW + HYAL; (G4) Cells + HA-LMW + HYAL; (G5) Cells + HA-HMW + hydroxyapatite; (G6) Cells + HA-LMW + hydroxyapatite; (G7) Cells + HA-HMW + HYAL + hydroxyapatite; (G8) Cells + HA-LMW + HYAL + hydroxyapatite; (G9) Cells (positive control); (G10) Cells + hypochlorite (negative control). The cell viability for each group were as follows: (G1) 76,0%, (G2) 63,3%, (G3) 67,4%, (G4) 76,5%, (G5) 57,6%, (G6) 60,8%, (G7) 64,4%, (G8) 74,3%, (G9) 100% e (G10) 12,4%.It was found that all groups had significantly higher cell viability compared to the negative control. And although there was no significant difference between experimental groups, only the G1, G4 and G8 groups did not differ significantly from the positive control. Therefore, HA-HMW had better viability in the absence of enzyme hyaluronidase, although HA-LMW provided greater cell viability in the presence of the enzyme. Results indicated that the low-weight hyaluronic acid might be applicable for tissue engineering grafting techniques. / Nas últimas décadas, técnicas envolvendo engenharia tecidual têm sido reportadas na literatura como opção alternativa aos enxertos autógenos convencionais para correção de defeitos ósseos e posterior instalação de implantes dentários. Estas buscam basicamente um material que apresente as mesmas propriedades biológicas do osso autógeno sem seus fatores limitantes. Tal tecnologia necessita, entre outros componentes, de um scaffold para as células, onde o ácido hialurônico, um glicosaminoglicano natural, parece ter características adequadas para exercer este papel. Ele exerce funções biológicas diferentes dependendo do seu peso molecular, que pode ser classificado em alto (> 1000 kDa), baixo (de 50 a 1000 kDa) ou baixíssimo (< 50 kDa). Além disso, no organismo humano há a presença da hialuronidase, enzima que degrada o ácido hialurônico em fragmentos menores, elementos estes que possivelmente podem influenciar a resposta celular. Desta forma, este estudo buscou avaliar, in vitro, a influência da enzima hialuronidase (HIAL) sobre o ácido hialurônico de alto (AH-APM) e baixo peso molecular (AH-BPM), bem como seu possível potencial citotóxico sobre células da linhagem NIH-3T3.Para tal, foi realizado o teste de MTT analisando a viabilidade celular dos seguintes grupos: (G1) Células + AH-APM; (G2) Células + AH-BPM; (G3) Células + AH-APM + HIAL; (G4) Células + AH-BPM + HIAL; (G5) Células + AH-APM + Hidroxiapatita; (G6) Células + AH-BPM + Hidroxiapatita; (G7) Células + AH-APM + HIAL + Hidroxiapatita; (G8) Células + AH-BPM + HIAL + Hidroxiapatita; (G9) Células (controle positivo); (G10) Células + hipoclorito (controle negativo). A viabilidade celular média de cada grupo foi: (G1) 76,0%, (G2) 63,3%, (G3) 67,4%, (G4) 76,5%, (G5) 57,6%, (G6) 60,8%, (G7) 64,4%, (G8) 74,3%, (G9) 100% e (G10) 12,4%. Os resultados indicaram que todos os grupos apresentaram viabilidade celular significativamente superior ao controle negativo. E apesar de não haver diferença significativa entre os grupos experimentais, somente os grupos G1, G4 e G8 não diferiram do controle positivo. O AH-APM apresentou melhor viabilidade na ausência da enzima hialuronidase, enquanto que o AH-BPM proporciona uma melhor viabilidade celular na presença desta enzima.

Made available in DSpace on 2014-07-12T02:02:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000459191-Texto+Completo-0.pdf: 819229 bytes, checksum: 3f5f2f0e1d369ad5b2e6c1504cd4c144 (MD5) Previous issue date: 2014 / The reposition of a lost osseous structure is challenging in oral rehabilitations involving osseointegrated implants. Tissue engineering techniques aiming reposition of lost calcified tissues has evolved in the last years as an alternative to the autologous bone graft, without the need of a donor site. Among the required techniques and biomaterials, the hyaluronic acid (HA) presents itself as promising alternative for tissue engineering. HA is present in the extracellular matrix of all living tissues, and also allows modifications in its structure, serving as a carrier for several compounds utilized in bone repair. Depending on its molecular weight, studies show that different cytotoxic effects might be observed. Thus, the present study evaluated, in vitro, the cytotoxicity of high and low molecular weight HA on NIH-3T3 cells, following the ISO 10993-12 test standards for cytotoxicity analysis. A MTT test was conducted with the following groups: (G1) cells + high molecular weight hyaluronic acid; (G2) cells + low molecular weight hyaluronic acid; (G3) cells + high molecular weight hyaluronic acid + hydroxyapatite; (G4) cells + low molecular weight hyaluronic acid + hydroxyapatite; (G5) cells (positive control); (G6) cells+ hypochlorite (negative control). The results show that most groups presented higher cellular viability when compared to the negative control and lower than the positive control group (p<0. 05). Group G1 presented no statistical difference when compared to the positive control (G5) (p<0. 05), indicating that high molecular weight HA might be applicable as a cell carrier for tissue engineering. / A reposição de base óssea perdida é um fator de grande complexidade nas reabilitações orais envolvendo implantes osseointegrados. A engenharia tecidual tem evoluído nos últimos anos por apresentar-se como uma alternativa ao enxerto ósseo autógeno, não exigindo um sitio doador de tecido para tal. Dentre as principais técnicas e biomateriais utilizados em engenharia tecidual, o acido hialurônico (AH) apresenta-se como um composto promissor como veículo celular. Presente na matriz extracelular de todos os tecidos vivos, ele permite sua modificação estrutural, maximizando seu potencial como veículo celular em reparos ósseos. Dependendo do seu peso molecular, estudos mostram diferentes efeitos citotóxicos podem ser verificados. Desta forma, este estudo procurou avaliar, in vitro, a citotoxicidade do AH de alto e de baixo peso molecular, sobre células da linhagem NIH-3T3, segundo o teste padrão da norma ISO 10993-12 para analise de citotoxicidade. Para isso, um teste de MTT foi realizado com o seguinte arranjo de grupos: (G1) Células + AH de alto peso molecular; (G2) Células + AH de baixo peso molecular; (G3) Células + AH de alto peso molecular + Hidroxiapatita; (G4) Células + AH de baixo peso molecular + Hidroxiapatita; (G5) Células (controle positivo); (G6) Células + hipoclorito (controle negativo). Os resultados mostram que todos os grupos apresentam viabilidade superior ao controle negativo e inferior ao controle positivo exceto o grupo G1, onde verificou-se ausência de diferença estatística entre este e o controle positivo. Resultados preliminares apontam para o emprego do AH de alto peso molecular como compatível para veículo celular em engenharia tecidual.

Orientador: Maria Helena Andrade Santana / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T22:51:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_RhelvisdeCampos_M.pdf: 1444700 bytes, checksum: 22be4f55322956156176e0226207310e (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O ácido hialurônico (AH) é um polissacarídeo linear com diversas aplicações nas áreas médica e farmacêutica. A produção de ácido hialurônico por via fermentativa vem sendo muito estudada atualmente e modificações no meio de cultura tornaram - se uma das principais alternativas para se atingir um produto com altos níveis de rendimento e massa molar (MM). A primeira etapa deste trabalho teve como objetivo estudar os efeitos de duas peptonas de soja, cuja principal diferença se encontra nas concentrações dos aminoácidos aspartato glutamina e glutamato (AGG), além das proporções de aminoácidos livres e totais. O microrganismo Streptococcus zooepidemicus ATCC 39920 foi cultivado por 24h em frascos agitados contendo uma concentração inicial de 25g L-1 de glicose e razões Carbono:Nitrogênio (C:N) de 3,4:1, 4,1:1 e 5,5:1 para a peptona rica em AGG e 4,1:1, 4,9:1 e 6,3:1 para a peptona pobre em AGG. Os resultados mostraram que a maior produção de AH foi de 1,37g L-1 à razão C:N de 4,1:1 para a peptona pobre em AGG, com MM média de 8,9x10 3 Da e cerca de 50 % das frações de MM na casa de 104 Da, enquanto que para a peptona rica em AGG esses valores foram de 0,70g L-1 e 4,1:1 em termos de produção de AH e razão C:N respectivamente, com MM média de 1,19x106 Da e cerca de 67 % das frações de MM na casa de 105 Da. Na segunda parte deste trabalho foi feita uma comparação do comportamento cinético de fermentações realizadas com as duas peptonas de soja em ensaios com aeração forçada. Os modelos logísticos de Verhulst para o crescimento celular, um análogo ao modelo de Luedeking-Piret incorporando o modelo logístico de Verhulst para o consumo de glicose, Verhulst modificado e Luedeking¿Piret para a produção de AH foram utilizados para estimar os parâmetros cinéticos. Os ajustes dos modelos apresentaram coeficientes de correlação maiores que 0,93. Os resultados mostraram que crescimento celular, consumo de glicose e produção de AH ocorreram durante as 24h de cultivo em meio de cultura contendo a peptona rica em AGG, enquanto que para a peptona pobre em AGG esse tempo reduziu para 10h. A quantidade produzida de AH foi semelhante para ambas as peptonas, entretanto, utilizando a peptona pobre em AGG, 60% da concentração final de AH veio da fase anterior à etapa de fermentação propriamente dita. Os parâmetros cinéticos apresentaram um coeficiente de manutenção maior para o cultivo com a peptona pobre em AGG e maior consumo de glicose foi verificado no cultivo com a peptona rica em AGG, refletindo-se no no rendimento YX/S, enquanto que o rendimento YP/X foi semelhante nos cultivos com ambas as peptonas. Esses resultados mostram que as peptonas não são somente fontes de nitrogênio, mas desempenham papéis específicos no cultivo celular / Abstract: Hyaluronic acid (HA) is a linear polysaccharide with many applications in the medical and pharmaceutical fields. The production of hyaluronic acid by fermentation pathway has been widely studied nowadays, and modifications made in the culture medium is one of the main alternatives to achieve a product with high levels of yield and molecular weight (MW). The first step of this work was to study the effects of two soy peptones, whose main difference is the amino acids concentrations of aspartate, glutamine and glutamate (AGG), and the proportions of free and total amino acids. The microorganism Streptococcus zooepidemicus ATCC 39920 was grown over 24 hours in shake flasks containing initial glucose concentration of 25 g L-1 and the same carbon: nitrogen (C: N) ratios 3.1:1, 1.7:1 and 1.0:1 for both peptones. The results showed that the higher production of HA was 1.37g L-1 with C:N ratio of 1.0:1 for poor AGG peptone with average MW of 8.9 x 103 Da and about 50 % of the MW fraction in the range of 104 Da, while rich AGG peptone showed values of 0.70 g L-1 and 1.7:1 in terms of HA production and C:N ratio respectively, with average MW of 1.19 x 106 Da and about 67% of the fractions of MW in the range of 105 Da. In the second part of this work was made one comparison of the kinetic behavior of cultivations using both peptones in assays with forced aeration. The logistic models of Verhulst for cell growth, analogous to Luedeking-Piret model incorporating the logistic model of Verhulst for glucose consumption, Verhulst modified and Luedeking-Piret for the production of HA were used to estimate the kinetic parameters. The adjustments of the models had correlation coefficients greater than 0.93. The results showed that cell growth, glucose consumption and HA production occurred over the 24 hours of cultivation in culture medium with rich AGG peptone, while with poor AGG peptone this time reduced for 10h. The amount of HA produced was similar for both peptones, however, using poor AGG peptone 60% of the final HA concentration came from the previous stage of the fermentation. The kinetic parameters showed higher coefficient of maintenance for cultivation with poor AGG peptone and increased glucose consumption was observed in cultivation with rich AGG peptone, reflected in terms of YX/S yield, while the yield YP/X was similar in cultivations with both peptones. These results show that peptones are not only sources of nitrogen but play specific roles in cell culture / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

A ausência ou perda da papila interdental cria deficiência estética, problemas fonéticos, impactação alimentar e gera muita expectativa ao paciente. Até o momento, o tratamento da ausência ou perda da papila interdental tem sido mal sucedido e não há estudos que indiquem que a regeneração da papila é um resultado previsível. O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade da injeção de gel de ácido hialurônico de origem não animal na redução ou eliminação da deficiência de papila entre dentes naturais comparativamente ao tratamento por meio de enxerto de tecido conjuntivo subepitelial. Foram avaliados neste estudo 20 sítios de 6 pacientes de ambos os sexos, com idade variável de 29 a 62 anos, apresentando deficiência de papila entre dentes naturais, na região anterior superior, em pelo menos dois dentes. Os 20 sítios tratados foram aleatoriamente divididos em dois grupos, de acordo com o tratamento para correção da deficiência de papila por meio de enxerto de tecido conjuntivo subepitelial (grupo controle) ou por meio de injeção de gel de ácido hialurônico (grupo teste). Um examinador único, calibrado, avaliou a distância da ponta da papila ao ponto de contato com auxílio de sonda periodontal milimetrada antes e aos 1, 3 e 6 meses após o tratamento. Além disso, foram investigados, nos sítios tratados, as medidas de profundidade de sondagem, nível de inserção, índice de sangramento do sulco, índice de placa, distância do ponto de contato à crista óssea alveolar, distância da ponta da papila à crista óssea alveolar e largura da papila. Os resultados demonstraram que aos 6 meses de pósoperatório o percentual de mudança na altura da papila foi maior no grupo teste (14,94% ± 21,35%) do que no grupo controle (-1,39% ± 31,46%), entretanto sem diferenças significantes entre os grupos (p> 0.05). Não houve variação estatisticamente significante na largura da papila antes e aos 4 meses após o tratamento nos grupos teste (p= 0.09) e controle (p= 0.16), assim como não houve variação significativa na distância entre a ponta da papila e a crista óssea alveolar. Houve melhora significativa do Índice de Estética Rosa (IER) observado aos 6 meses de acompanhamento em comparação com a condição inicial no grupo teste (p= 0.0078; Wilcoxon), enquanto que não houve mudança significativa no IER observado no grupo controle aos 6 meses de acompanhamento (p= 0.35). Os resultados obtidos permitiram concluir que o tratamento da deficiência de papila por meio de injeção de gel de ácido hialurônico promove melhora da deficiência de papila, similar aos resultados obtidos com o tratamento por meio de enxerto de tecido conjuntivo subepitelial, porém com melhora estética significativa relacionada especialmente às características de cor e textura do tecido relativamente aos tecidos moles adjacentes. / The absence or loss of interdental papilla creates an esthetic deficiency, phonetic problems and food impaction and generates a lot of expectation for the patient. Until now, the treatment for absence or loss of interdental papilla is unsuccessful e and there are no researches that show that the papilla regeneration is a predictable outcome. The aim of this study was to evaluate the effectivity of a non-animal originated hyaluronic acid injection in the reduction or elimination of papilla deficiency between natural teeth in comparison to a sub epithelial connective tissue graft treatment. The analysis was made on 20 sites in 6 patients, both genders, 29 - 62 years, showing deficiency in the papilla between natural teeth in the upper anterior region in at least two teeth. The 20 sites treated were randomly divided into two groups, according to the treatment by subepithelial connective tissue graft (control group) or by hyaluronic acid injection (test group). A single calibrated examiner evaluated the distance between the tip of the papilla to the contact point using a graduated periodontal probe before the treatment and 1, 3 and 6 months after it. Besides, it were investigated probing pocket depth, clinical attachment level, gingival bleeding index, plaque index, distance from papilla to alveolar crest, distance from contact point to alveolar crest and width of the papilla. The results showed that 6 months after the procedure, the percentage of change in the papilla level was higher in the test group (14,94% ± 21,35%) than in the control group (-1,39% ± 31,46%), though not statistically significant (p>0.05). There was no significant difference variation in the width of the papilla before and 4 months after the treatment in test group (p=0.09) and control group (p=0.16), and there was no significant difference variation in the distance between the tip of the papilla and the alveolar bone crest. There was significant improvement of the Pink Esthetic Score (PES) after 6 months in comparison to the initial condition in test group (p=0.0078; Wilcoxon), while there was no significant difference in the PES in control group 6 months after treatment (p=0.35). The results allow to conclude that the treatment for of the papilla deficiency using hyaluronic acid injection promotes improvement, similar to the results of the sub epithelial connective tissue graft treatment, but with significant esthetic improvement related specially to the color and texture characteristics of the adjacent soft tissues.