Chez l’embryon précoce, une vague de reprogrammation majeure survient et permet de réinitialiser les profils de méthylation d’ADN de l’ensemble du génome. Lors de cette reprogrammation, les régions différentiellement méthylées (DMRs) (i.e., gènes empreintes) doivent toutefois être protégées de la déméthylation par une action continue de DNMT1 (Méthyltransférase d’ADN 1) pour assurer le développement adéquat de l’épigénome du fœtus. Sachant que l’induction d’une perte temporaire d’expression de Dnmt1 dans un modèle de cellules souches embryonnaires de souris entraîne la perte permanente des patrons de méthylation d’ADN aux régions DMRs et DMR-like, mon projet de recherche vise à comprendre pourquoi ces régions sont incapables de retrouver leurs patrons de méthylation d’ADN initiaux. Notre hypothèse est qu’une adaptation épigénétique (i.e. réarrangement erroné de certaines modifications d’histones) survient aux régions régulatrices de l’expression des gènes (promoteurs et enhancers) et empêche directement ou indirectement le retour au paysage épigénétique initial aux régions affectées. L’objectif du projet est donc de précisément définir comment la perte temporaire de Dnmt1 remodèle le paysage épigénétique aux régions promotrices (H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, H3K4me1, H3K9me3, méthylation d’ADN) et comment les adaptations épigénétiques sont associées avec des changements de l’expression des gènes (ex : gènes des régions DMRs et DMRs-like). / In early embryos, a major reprogramming wave occurs and permits to reset DNA methylation profiles genome-wide. During the reprogramming wave, differentially methylated regions (DMRs) (imprinted genes) must be protected from demethylation by the continuous action of DNMT1 (DNA Methyltransferase 1) to ensure the proper development of the foetal epigenome. As the induction of a temporary loss of Dnmt1 expression in a mouse embryonic stem cell model leads to permanent losses of DNA methylation at DMR and DMR-like regions, my project aims to understand why those regions are unable to re-establish their initial DNA methylation patterns. Our hypothesis is that an epigenetic adaptation (erroneous rearrangement of certain histone modifications) occurs at regulatory regions controlling gene expression (promoters and enhancers) and impede directly or indirectly the affected regions to return to their initial epigenetic landscape. The goal of this project is thus to define how the temporary loss of Dnmt1 remodels the epigenetic landscape at promoter regions (H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, H3K4me1, H3K9me3, DNA methylation) and how the epigenetic adaptations are associated with changes in gene expression (ex: genes in DMR and DMR-like regions).

La découverte de médicaments en oncologie repose encore majoritairement sur les criblages pharmacologiques à haut débit. Cependant, les modèles traditionnels de culture cellulaire en deux dimensions (2D) ne reflètent pas les conditions physiopathologiques des tumeurs solides in situ. Au laboratoire, notre hypothèse est que le manque de représentativité des cellules en culture 2D par rapport aux tumeurs in situ lors des essais de criblage pharmacologique in vitro est responsable du faible taux de succès des petites molécules lors d’essais cliniques. Pour pallier ce problème, nous avons développé une méthode de culture à long-terme en trois dimensions (3D) avec des cellules d’adénocarcinome du poumon qui permet le maintien des cellules en sphéroïdes jusqu’à 38 jours. Les cellules s’adaptent rapidement à la culture 3D en diminuant leur taille et en ralentissant significativement leur métabolisme. Au niveau épigénétique, l’expression du complexe KAT3A/KAT3B et de BRG1 est significativement diminuée, et ce de manière temps-dépendante. À l’inverse, l’expression de HDAC6 est augmentée lors du passage en 3D. Finalement, nous avons vérifié si les changements épigénétiques induits par la culture 3D influençaient significativement la réponse aux médicaments. Ainsi, nous avons traité les cellules en 2D et après 10 ou 24 jours en 3D avec une pharmacothèque de 154 médicaments épigénétiques. 60% des médicaments ont démontré une activité anticancéreuse significative sur les cellules en 2D, contrairement à 9% sur les sphéroïdes de 10 jours. Avec les sphéroïdes de 24 jours, uniquement 1 médicament, le MS023, un inhibiteur des arginines méthyltransférases (PRMT) de type I, a été efficace. L’augmentation de la sensibilité au MS023 concorde avec une augmentation de la méthylation des arginines dans les sphéroïdes. En conclusion, mon projet démontre que la culture 3D modifie l’épigénome des cellules cancéreuses du poumon de manière temps-dépendant et que ces changements sensibilisent les cellules à une inhibition des PRMT de type I. L’étude des sphéroïdes nous permet d’améliorer notre compréhension de la biologie tumorale et des processus de découverte de médicaments ce qui pourrait pallier le faible taux de succès associé aux modèles 2D classique. / Small molecule development in oncology mainly involves high-throughput drug screenings and preclinical validation studies using cancer cells grown in two-dimension (2D). However, classical cell culture methods poorly reflect tumor biology and cell epigenome. Here, our objective is to develop a 3D model that displays key epigenetic features of solid tumors in order to identify new actionable targets. First, we determined culture conditions for long-term expansion of adenocarcinoma spheroids to allow cell adaptation and the occurrence of specific epigenetic features triggered by 3D condition. Our results demonstrate that cells cultivated in 3D spheroids exhibit significant phenotypic and epigenetic changes as compared to 2D monolayers. Notably, we observed numerous expression changes of key epigenetic regulators, all taken place at a different time-point of the 3D cell culture. We observed a decrease in the expression of the KAT3A/KAT3B complex as well as BRG1. HDAC6 expression also increased in 3D. Then, we asked whether epigenetic changes triggered by 3D culture would modify drug sensitivity. We performed a screening of 154 epigenetic drugs on cancer cells cultivated in 2D and in 3D at two different time points. 60% of epigenetic drugs showed significant anticancer activity against 2D monolayers. Interestingly, A549 cells in 3D spheroids became gradually resistant over time. Against 3D spheroids cultivated for 10 days, only 9% of epigenetic drugs in the drug library showed anticancer activity. Against 3D spheroids cultivated for 24 days, only a single epigenetic compound called MS023, a selective agent against type I PRMTs, reduced cell viability significantly. This sensitivity is correlated with an increase of arginine methylation observed within spheroids. Taken together, we show that 3D spheroids trigger a time-dependent epigenetic context that increases lung cancer cells sensitivity to type I PRMT inhibition. 3D spheroids of well-characterized cancer cell lines will improve our understanding of tumor biology and drug discovery and can overcome the high false discovery rate associated with 2D classical models.

Les mutations somatiques sur le variant d’histone H3.3 et les régulateurs épigénétiques associés à H3.3 ont été identifiés dans 30 % des glioblastomes pédiatriques. Ces mutations sont caractérisées par des substitutions d'acides aminés à des positions spécifiques dans la région N-terminale de l'histone H3.3 telles que la glycine 34 en valine/arginine (G34V/R), l'alanine 29 en proline (A29P), ou une haplo-insuffisance de la protéine Zinc Finger MYND-Type Containing 11 (ZMYND11). ZMYND11 est un co-répresseur de la transcription qui se lie spécifiquement à H3.3K36me3 pour moduler l'activité de l'ARN polymérase II. De plus, il est intéressant de mentionner que l’interaction entre ZMYND11 et H3.3K36me3 est altérée lorsque le résidu G34 est muté en G34V. Récemment, les mutations germinales H3.3G34V, H3.3A29P et ZMYND11 ont été identifiées chez des patients présentant une déficience neurologique. Nous émettons l'hypothèse que les mutants H3.3G34V et H3.3A29P empêchent ZMYND11 de se lier à H3.3K36me3 et pourrait converger mécaniquement avec la perte de fonction de ZMYND11, ce qui perturberait la neurogenèse. À l'aide de la technologie CRISPR Cas9, nous avons généré des modèles mutants isogéniques à partir de cellules souches pluripotentes (iPSC) pour H3F3B-A29P, H3F3B-G34V et ZMYND11-knock-out (KO). Par la suite, nous avons stimulé la différenciation de ces modèles vers des lignées neuronales afin d’identifier si ces mutations affectent la neurogenèse. Enfin, en utilisant des méthodes de séquençage à haut-débit nous avons analysé le profil épigénomique et transcriptomique pour déterminer comment l’interaction entre ZMYND11 et H3K36me3 est perturbée et à quels degrés ces mutations impactent sur les modifications post-traductionnelles des histones. Ce projet permettra de mieux comprendre les fonctions de ZMYND11 sur le remodelage de la chromatine et sa fonction biologique au cours du développement cérébral. / Somatic mutations on the histone 3 variant H3.3 and H3.3-associated chromatin modifiers have been identified in 30% of pediatric high-grade gliomas (pHGG). The mutations are characterized by amino acid substitutions at specific positions within the histone H3.3 tail such as glycine 34 to valine/arginine (G34V/R), alanine 29 to proline (A29P), or haploinsufficiency of the chromatin reader Zinc Finger MYND-Type Containing 11 (ZMYND11). ZMYND11 is a transcriptional co-repressor that specifically reads H3.3K36me3 to modulate RNA polymerase II activity. Notably, binding of ZMYND11 to H3.3K36me3 is altered when G34 residue is mutated to G34V. Recently, germline mutations of H3.3G34V, H3.3A29P, and ZMYND11 have been identified in patients with Intellectual disability. We hypothesize that H3.3 G34V and H3.3A29P mutants impede the binding of ZMYND11 to H3.3K36me3 and may mechanistically converge with ZMYND11 loss-of-function mutation to perturb neurogenesis. Using CRISPR Cas9-mediated gene editing, we will generate isogenic human induced pluripotent stem cell (iPSC) models for H3F3B-A29P, H3F3B-G34V and ZMYND11-KO, and perform in vitro neural differentiation to identify whether specific neural lineages are affected. Next, using epigenomic and transcriptomic profiling we will study whether binding between ZMYND11 and H3K36me3 is disrupted, and the downstream impact on Post-Translational Modifications of histones (PTMs) and transcription. This project will lead to a better understanding of the crucial role of the chromatin reader ZMYND11 on chromatin remodeling and the biological function during neural development.

Le neuroblastome pédiatrique à haut risque est incurable malgré l’intensification des traitements. Chez le patient, les cellules de neuroblastome échappent à l’activité anticancéreuse des cellules immunitaires Natural Killer (NK). Or, lorsque cultivées in vitro en monocouche (2D), les cellules de neuroblastomes redeviennent sensibles à l’activité cytotoxique des cellules NK ce qui ne reflètent pas leur résistance dans les tumeurs in situ. Nous faisons l'hypothèse que lorsque cultivées en 3D sous forme de sphéroïdes, les cellules de neuroblastome pourraient retrouver certaines caractéristiques qui les rendraient plus représentatives des tumeurs in situ au niveau immunologique. Ainsi, un tel modèle préclinique pourrait mieux refléter la résistance aux cellules NK et servir de modèle de criblage pour la découverte de médicaments potentialisant la cytotoxicité des cellules NK. Pour répondre à cette question, nous avons développé un système de culture cellulaire 3D utilisant plusieurs lignées cellulaires de neuroblastome. À ce système, une co-culture en 3D avec une lignée de cellules Natural Killer (NK92) a été mise en place. Nous avons mis en évidence que les sphéroïdes de neuroblastome présentent des changements d’expression de certains gènes qui sont retrouvées chez les patients ainsi qu’une plus grande résistance à l’activité cytotoxique des cellules NK92 en comparaison avec les lignées en monocouche. Les co cultures de sphéroïdes ont été exposées à des inhibiteurs de protéines impliquées à différents niveaux de l’épigénome afin de découvrir des médicaments qui sensibiliseraient les cellules de neuroblastome à l’activité cytotoxique des NK92. Une différence dans la sensibilité aux médicaments entre les sphéroïdes et les cellules en 2D ainsi qu’en monoculture ou en co-culture a été observée et certains composés ont été identifiés en vue de potentialiser l’activité des cellules NK92. Ainsi, nos études ont permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la résistance des cellules du neuroblastome à l’activité cytotoxique des cellules NK dans un modèle plus représentatif de la tumeur in situ. / High-risk pediatric neuroblastoma remains incurable despite intensified treatments. In patients, neuroblastoma cells evade the anti-cancer activity of Natural Killer (NK) immune cells. However, when cultured in vitro in a monolayer (2D), neuroblastoma cells become sensitive to the cytotoxic activity of NK cells, which does not reflect their resistance in tumors in situ. We hypothesize that when cultured in 3D in the form of spheroids, neuroblastoma cells could regain certain characteristics that would make them representative of tumors in situ at the immunological level. Thus, such a preclinical model could better reflect NK cell resistance and serve as a screening model for drug discovery to discover a treatment that can potentiate NK cell cytotoxicity. To answer this question, we developed a 3D cell culture system using several neuroblastoma cell lines. To this system, a 3D coculture model with a Natural Killer (NK92) cell line was set up. We have shown that neuroblastoma spheroids develop changes in the expression of certain genes that are found in patients as well as greater resistance to NK92 cells compared to monolayer cell lines. Spheroid cocultures were exposed to inhibitors of proteins involved at different levels of the epigenome to discover drugs that would sensitize neuroblastoma cells to the cytotoxic activity of NK92. A difference in drug sensitivity between spheroids and cells in 2D as well as in monoculture or coculture was observed and some compounds were identified to potentiate the activity of NK92 cells. Thus, our studies have provided a better understanding of the mechanisms involved in the resistance of neuroblastoma cells to the cytotoxic activity of NK cells in a more representative model of the tumor in situ.

Au cours du développement précoce de l'embryon, une importante vague de reprogrammation épigénétique efface et rétablit les profils de méthylation d’ADN (metADN) à travers le génome. Cependant, des régions spécifiques telles que les gènes à empreinte doivent échapper à cette vague de reprogrammation et maintenir leurs profils de metADN précis par l’activité constante de l’enzyme DNMT1 (ADN méthyltransférase 1) pour assurer le bon développement embryonnaire. En utilisant un modèle de cellules souches embryonnaires (mES) de souris avec une répression inductible de Dnmt1 (Dnmt1tet/tet), nous avons précédemment montré que la perte temporaire de Dnmt1 déclenche la perte permanente des profils de metADN sur les régions à empreinte et régions similaires, ainsi que sur d'autres régions du génome. Nous ne comprenons toujours pas pourquoi certaines séquences génomiques sont incapables de rétablir leurs profils de metADN normaux après la ré-expression de Dnmt1, et comment d'autres marques épigénétiques (e.g. les modifications des histones) sont altérées. Notre hypothèse est qu’un réarrangement erroné des marques d’histones aux régions promotrices, suivant une perte temporaire du maintien de la méthylation d’ADN par DNMT1, empêchera l’expression normale dans les cellules souches embryonnaires de souris. Pour ce faire, nous avons collecté des cellules mES Dnmt1tet/tet avant l'inactivation de Dnmt1, après l'inactivation de Dnmt1, puis après la réactivation complète de l'expression de Dnmt1. Nous avons ensuite utilisé la technique ChIP-Seq pour les marques d'histones (H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, H3K9me3, H3K4me1), celle de RRBS pour la méthylation de l'ADN et la technique de RNA-Seq pour l'expression des gènes. En définissant une liste de 18 166 promoteurs uniques, nous les avons classés en quatre catégories (Actif, Bivalent, Déplété et Réprimé). Nous montrons que l'inactivation de Dnmt1 mène à une dérégulation drastique des marques d'histones à travers les types de promoteurs. Cependant, lors de la réactivation de Dnmt1, la plupart de ces défauts ont été corrigés. Pourtant, dans l’ensemble des catégories, nous observons des promoteurs avec des dysrégulations persistantes des marques d'histones ainsi qu'un nombre significatif de gènes avec une expression différentielle. Dans l'ensemble, nos résultats montrent qu'une absence temporaire de DNMT1 a un impact plus important sur la conservation des profils des marques d'histones et l'expression des gènes que sur le maintien des profils de metADN sur les régions promotrices, dans les cellules souches embryonnaires de souris. Cela suggère que l'absence temporaire de maintien de la méthylation d’ADN déclenche une série d'événements qui conduisent à des dérégulations permanentes de marques d'histones aux promoteurs, lesquelles ne sont pas directement associés aux altérations sous-jacentes de la méthylation d’ADN dans les régions promotrices. / During early embryo development, a major epigenetic reprogramming wave erases and re-establishes DNA methylation (DNAmet) profiles across the genome. However, specific regions such as imprinting loci must escape this reprogramming wave and maintain their precise DNAmet profiles by constant DNMT1 (DNA methyltransferase 1) activity to ensure the proper development. Using a mouse embryonic stem (mES) cell model with inducible Dnmt1 repression (Dnmt1tet/tet), we previously showed that the temporary loss of Dnmt1 triggers the permanent loss of DNAmet profiles on imprinted and imprinted-like regions, as well as on other regions across the genome. We still do not understand why particular genomic sequences are unable to re-establish their normal DNAmet profiles following Dnmt1 re-expression, and how other epigenetic marks (e.g., histone modifications) are altered. Our hypothesis is that an erroneous rearrangement of histone marks on promoter regions following a temporary lack of DNAmet maintenance by DNMT1 will prevent proper gene expression in mouse embryonic stem cells. To test this, we collected mESDnmt1tet/tet cells prior to Dnmt1 inactivation, after Dnmt1 inactivation, and following complete reactivation of Dnmt1 expression. We then performed ChIP-Seq for histone marks (H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, H3K9me3, H3K4me1), RRBS for DNA methylation and RNA-Seq for gene expression. By defining a list of 18 166 unique promoters we categorized them in four categories (Active, Bivalent, Depleted and Repressed). We show that inactivation of Dnmt1 lead to drastic dysregulation of histone marks across types of promoters. However, upon reactivation of Dnmt1, most of these defects were rescued. Still, across categories, we observe promoters with persistent histone mark dysregulations as well as a significant number of associated genes with differential expression. Overall, our results show that a temporary lack of DNMT1 has a greater impact on the conservation of histone mark profiles and gene expression than it has on the maintenance of DNAmet profiles on promoter regions in mouse embryonic stem cells. This suggests that the temporary lack of methylation maintenance triggers a series of events that leads to the permanent dysregulation of histone marks in promoter regions, which are not directly associated with underlying DNA methylation alterations in the promoter regions.

Les cancers du sein triple-négatifs (CSTN) présentent un taux élevé de récidive dû à la résistance aux chimiothérapies. Les adaptations du métabolisme cellulaire dans les CSTN contribuent à la résistance thérapeutique. Des changements du métabolisme de la glycolyse ou des acides aminés, peuvent permettre aux cellules de CSTN de s’adaptent rapidement en situation de stress. Toutefois, de nouvelles vulnérabilités peuvent être exposées chez les cellules du CSTN au cours de ces adaptations métaboliques. La méthyltransférase Enhancer of Zest Homologe 2 (EZH2) est connue pour son rôle dans l’identité cellulaire et la régulation de l’expression génique. Récemment, il a été montré qu’EZH2 joue un rôle dans la reprogrammation cellulaire des CSTN et contribue au développement de la résistance à la chimiothérapie. Mais les implications de cette reprogrammation sur le métabolisme des cellules CSTN, ne sont pas encore clairement identifiées. Ce projet a pour but d’étudier si les modifications épigénétiques résultant de l’activité d’EZH2 contribuent à la régulation du métabolisme cellulaire et permet les adaptations métaboliques dans les CSTN. Dans cette étude, nous utilisons les molécules UNC1999 et EPZ-4638, deux inhibiteurs sélectifs de l’activité enzymatique d’EZH2. Par des approches génomiques, transcriptomiques et métabolomiques, nous montrons que l’inhibition pharmacologique d’EZH2 induit des changements métaboliques caractérisés par une perturbation de la glycolyse et une résistance accrue à la privation de glucose. Nous observons aussi une augmentation de la dépendance à la glutamine et une utilisation accrue de la glutamine intracellulaire lors de l’inhibition d’EZH2. Ces vulnérabilités constituent des cibles potentielles pour un traitement concomitant avec le UNC1999. Finalement, nous proposons un mécanisme impliquant le facteur de transcription Estrogen Related Receptor-alpha (ERR) comme médiateur contribuant à l’effet métabolique résultant de l’inhibition d’EZH2 dans les CSTN. Les données préliminaires présentées dans ce mémoire proposent pour la première fois que les inhibiteurs d’EZH2 pourraient être utilisés pour induire des vulnérabilités métaboliques qui pourraient potentiellement être exploitées dans les CSTN. / Triple-negative breast cancers (TNBC) have a high rate of recurrence due to resistance to chemotherapy. Adaptations of cellular metabolism in TNBCs contribute to therapeutic resistance. Changes in glycolysis or amino acid metabolism may allow TNBC cells to adapt rapidly under stress. However, new and potentially targetable vulnerabilities may be exposed in TNBC cells during these metabolic adaptations. Methyltransferase Enhancer of Zest Homologue 2 (EZH2) is known for its role in cell identity and regulation of gene expression. Recently, EZH2 was shown to play a role in the cellular reprogramming of TNBCs and to contribute to the development of resistance to chemotherapy. But the implications of this reprogramming on the TNBC metabolism are not yet clearly identified. This project aims to investigate whether epigenetic modifications resulting from EZH2 activity contribute to the regulation of cellular metabolism and enable metabolic adaptations in TNBCs. In this study, we use the molecules UNC1999 and EPZ-4638, two selective inhibitors of the enzymatic activity of EZH2. Using genomic, transcriptomic and metabolomic approaches, we show that pharmacological inhibition of EZH2 induces metabolic changes characterized by disruption of glycolysis and increased resistance to glucose starvation. We also observe an increase in glutamine dependence and increased use of intracellular glutamine upon inhibition of EZH2. We show that these vulnerabilities are potential targets for concurrent treatment with UNC1999. Finally, we propose a mechanism proposing that the transcription factor Estrogen Related Receptor-alpha (ERR) contributes to the metabolic effect resulting from EZH2 inhibition in TNBCs. The preliminary data presented in this thesis propose for the first time that EZH2 inhibitors could be used to induce metabolic vulnerabilities that may potentially be exploited in TNBC.

Introduction: L'étude des biomarqueurs a le potentiel de documenter sur les mécanismes sous-jacents de l'étiologie du cancer du poumon. Dans cette étude, nous avons étudié l’association entre la méthylation de l’ADN dans les gènes F2RL3 et AHRR et le cancer du poumon. Méthodes: Une étude cas-témoin avec échantillonnage cumulatif a été nichée dans la cohorte CARTaGENE. Les cas (N=187) se composent de tous les participants diagnostiqués avec un cancer du poumon incident entre le début de la cohorte (2009) et 2015 et qui avaient fourni un échantillon de sang; les témoins (N=378) ont été échantillonnés à la fin du suivi parmi les non-malades selon un appariement fréquentiel (2:1) pour l'âge, le sexe et le moment du prélèvement sanguin. Sequenom EpiTYPER® a été utilisé pour quantifier les niveaux de méthylation dans sept et 33 sites CpG de F2RL3 et AHRR, respectivement. Les rapports de méthylation de l'ADN sur tous les sites CpG individuels et en tant que mesure moyenne ont été paramétrés à la fois comme variables continues et catégorielles. Une régression logistique multivariable non conditionnelle a été utilisée pour estimer les rapports de cotes (OR) et les intervalles de confiance (IC) à 95 % de l’association entre la méthylation de F2RL3 et AHRR et le cancer du poumon tout en contrôlant les facteurs de confusion identifiés à l'aide de graphiques acycliques dirigés. Résultats: Une forte association inverse entre les niveaux moyens de méthylation de l'ADN et le cancer du poumon a été observée pour F2RL3 (OR par écart type (SD) de changement de méthylation = 0,65, IC à 95 %: 0,53-0,80) et AHRR (OR par SD de changement de méthylation = 0,66, IC à 95 %: 0,53 à 0,80). De même, les sites CpG individuels ont montré des ORs (par SD de changement de méthylation) allant de 0,61 à 0,70 pour six des sept sites CpG de F2RL3 et de 0,57 à 0,79 pour 17 des 33 sites CpG de AHRR. Les sites CpG restants de F2RL3 et AHRR n'ont montré aucune association avec le risque de cancer du poumon, à l'exception d'un site CpG dans AHRR (chr5:369774) qui avait un OR de 1,25 (IC à 95 %: 1,02-1,54). Conclusion : Ces résultats confirment le rôle des mécanismes épigénétiques dans l'étiologie du cancer du poumon. / Background: The study of biomarkers has the potential to inform on underlying mechanisms in lung cancer etiology. In this study, we investigated DNA methylation in the F2RL3 and AHRR genes, and lung cancer risk. Methods: A case-control study with cumulative sampling was nested in the CARTaGENE cohort. Cases (N=187) consisted of all participants diagnosed with incident lung cancer from baseline to 2015 and who had provided a blood sample; controls (N=378) were sampled at a ratio of 2:1 with frequency-matching by age, sex, and timing of blood sampling. Sequenom EpiTYPER® was used to quantify methylation levels in seven and 33 CpG sites of F2RL3 and AHRR, respectively. DNA methylation ratios across all individual CpG sites and as an average measure were parametrized both as continuous and categorical variables. Unconditional multivariable logistic regression was used to estimate odds ratios (ORs) and 95% confidence intervals (CI) for lung cancer associated with F2RL3 and AHRR methylation while controlling for confounders identified using directed acyclic graphs. Results: A strong inverse relationship between average DNA methylation levels and lung cancer was observed for both F2RL3 (OR per standard deviation (s.d.) in methylation change = 0.65, 95% CI: 0.53-0.80) and AHRR (OR per s.d. in methylation change = 0.66, 95% CI: 0.53-0.80). Similarly, ORs for individual CpG sites (per s.d. in methylation change) ranged from 0.61-0.70 for six out of the seven CpG sites of F2RL3 and from 0.57-0.79 for 17 out of 33 CpG sites of AHRR. The methylation levels of the remaining CpG sites within F2RL3 and AHRR were not associated with lung cancer risk, except for one CpG site within AHRR (chr5:369774) which had an OR of 1.25 (95% CI: 1.02-1.54). Conclusion: These findings support the role of epigenetic mechanisms in lung cancer etiology.

L’objectif de cette thèse est de déterminer l’étendue de la variabilité épigénétique, plus particulièrement du polymorphisme de méthylation de l’ADN, non liée à la variabilité génétique dans les populations asexuées en milieu naturel. Cette évaluation nous a permis de mieux cerner l’importance que peuvent avoir les processus épigénétiques en écologie et en évolution. Le modèle biologique utilisé est l’hybride clonal du complexe gynogénétique Chrosomus eos-neogaeus. Malgré une homogénéité génétique, une importante variabilité phénotypique est observée entre les hybrides d’une même lignée clonale mais retrouvés dans des environnements différents. L’influence des processus épigénétiques apporte une explication sur ce paradoxe. L’épigénétique se définit comme une modification de l’expression des gènes sans changement de la séquence d’ADN. La diversité des phénotypes peut entre autre s’expliquer par des patrons de méthylation différentiels des gènes et/ou des allèles des gènes entre les hybrides génétiquement identiques. La diversité des lignées épiclonales peut quant à elle s’expliquer par la colonisation de plusieurs lignées épiclonales, s’établir en réponse à l’environnement ou de façon aléatoire. Plusieurs méthodes seront utilisées afin de survoler le génome des hybrides clonaux pour mettre en évidence le polymorphisme de méthylation de l’ADN à l’échelle de l’individu et entre les individus de différentes populations. / The aim of the thesis is to determine the extent of epigenetic variation, more specifically DNA methylation polymorphism, not linked to genetic variation in natural populations of an asexual vertebrate. This evaluation enables to better understand the importance that plays epigenetics processes in ecology and evolution. The biological model used is the clonal hybrid of the gynogenetic Chrosomus eos-neogaeus complex. Even in absence of genetic difference, an important phenotypic variability is observed among hybrids of the same clonal lineage living in different environments. Epigenetics, a modification of genes expression without a change at the DNA sequence, provides an explanation to this paradox. The diversity of phenotypes may be explained by differential methylation patterns of genes and/or alleles among genetically identical hybrids. The diversity of epiclonal lineages may be explained by the colonisation of many epiclonal lineages, established in response to the environment or stochastically. Many methods were used for screening the genome of clonal hybrids in order to highlight DNA methylation polymophism at the scale of an individual and among individuals of different populations.

L’hypothyroïdie congénitale par dysgénésie thyroïdienne (HCDT) est la condition endocrinienne néonatale la plus fréquemment rencontrée, avec une incidence d’un cas sur 4000 naissances vivantes. L’HCDT comprend toutes les anomalies du développement de la thyroïde. Parmi ces anomalies, le diagnostic le plus fréquent est l’ectopie thyroïdienne (~ 50% des cas). L’HCDT est fréquemment associée à un déficit sévère en hormones thyroïdiennes (hypothyroïdisme) pouvant conduire à un retard mental sévère si non traitée. Le programme de dépistage néonatal assure un diagnostic et un traitement précoce par hormones thyroïdiennes. Cependant, même avec un traitement précoce (en moyenne à 9 jours de vie), un retard de développement est toujours observé, surtout dans les cas les plus sévères (c.-à-d., perte de 10 points de QI). Bien que des cas familiaux soient rapportés (2% des cas), l’HCTD est essentiellement considérée comme une entité sporadique. De plus, plus de 92% des jumeaux monozygotiques sont discordants pour les dysgénésies thyroïdiennes et une prédominance féminine est rapportée (spécialement dans le cas d’ectopies thyroïdiennes), ces deux observations étant clairement incompatible avec un mode de transmission héréditaire mendélien. Il est donc cohérent de constater que des mutations germinales dans les facteurs de transcription thyroïdiens connus (NKX2.1, PAX8, FOXE1, and NKX2.5) ont été identifiées dans seulement 3% des cas sporadiques testés et furent, de plus, exclues lors d’analyse d’association dans certaines familles multiplex. Collectivement, ces données suggèrent que des mécanismes non mendéliens sont à l’origine de la majorité des cas de dysgénésie thyroïdienne. Parmi ces mécanismes, nous devons considérer des modifications épigénétiques, des mutations somatiques précoces (au stade du bourgeon thyroïdien lors des premiers stades de l’embryogenèse) ou des défauts développementaux stochastiques (c.-à-d., accumulation aléatoire de mutations germinales ou somatiques). Voilà pourquoi nous proposons un modèle «2 hits » combinant des mutations (épi)génétiques germinales et somatiques; ce modèle étant compatible avec le manque de transmission familial observé dans la majorité des cas d’HCDT. Dans cette thèse, nous avons déterminé si des variations somatiques (épi)génétiques sont associées à l’HCTD via une approche génomique et une approche gène candidat. Notre approche génomique a révélé que les thyroïdes ectopiques ont un profil d’expression différent des thyroïdes eutopiques (contrôles) et que ce profil d’expression est enrichi en gènes de la voie de signalisation Wnt. La voie des Wnt est cruciale pour la migration cellulaire et pour le développement de plusieurs organes dérivés de l’endoderme (p.ex. le pancréas). De plus, le rôle de la voie des Wnt dans la morphogénèse thyroïdienne est supporté par de récentes études sur le poisson-zèbre qui montrent des anomalies du développement thyroïdien lors de la perturbation de la voie des Wnt durant différentes étapes de l’organogénèse. Par conséquent, l’implication de la voie des Wnt dans l’étiologie de la dysgénésie thyroïdienne est biologiquement plausible. Une trouvaille inattendue de notre approche génomique fut de constater que la calcitonine était exprimée autant dans les thyroïdes ectopiques que dans les thyroïdes eutopiques (contrôles). Cette trouvaille remet en doute un dogme de l’embryologie de la thyroïde voulant que les cellules sécrétant la calcitonine (cellules C) proviennent exclusivement d’une structure extrathyroïdienne (les corps ultimobranchiaux) fusionnant seulement avec la thyroïde en fin de développement, lorsque la thyroïde a atteint son emplacement anatomique définitif. Notre approche gène candidat ne démontra aucune différence épigénétique (c.-à-d. de profil de méthylation) entre thyroïdes ectopiques et eutopiques, mais elle révéla la présence d’une région différentiellement méthylée (RDM) entre thyroïdes et leucocytes dans le promoteur de FOXE1. Le rôle crucial de FOXE1 dans la migration thyroïdienne lors du développement est connu et démontré dans le modèle murin. Nous avons démontré in vivo et in vitro que le statut de méthylation de cette RDM est corrélé avec l’expression de FOXE1 dans les tissus non tumoraux (c.-à-d., thyroïdes et leucocytes). Fort de ces résultats et sachant que les RDMs sont de potentiels points chauds de variations (épi)génétiques, nous avons lancé une étude cas-contrôles afin de déterminer si des variants génétiques rares localisés dans cette RDM sont associés à la dysgénésie thyroïdienne. Tous ces résultats générés lors de mes études doctorales ont dévoilé de nouveaux mécanismes pouvant expliquer la pathogenèse de la dysgénésie thyroïdienne, condition dont l’étiologie reste toujours une énigme. Ces résultats ouvrent aussi plusieurs champs de recherche prometteurs et vont aider à mieux comprendre tant les causes des dysgénésies thyroïdiennes que le développement embryonnaire normal de la thyroïde chez l’homme. / Congenital hypothyroidism from thyroid dysgenesis (CHTD) is the most common congenital endocrine disorder with an incidence of 1 in 4,000 live births. CHTD includes multiple abnormalities in thyroid gland development. Among them, the most common diagnostic category is thyroid ectopy (~ 50 % of cases). CHTD is frequently associated with a severe deficiency in thyroid hormones (hypothyroidism), which can lead to severe mental retardation if left untreated. The newborn biochemical screening program insures the rapid institution of thyroid hormone replacement therapy. Even with early treatment (on average at 9 d), subtle developmental delay is still be observed in severe cases (i.e., IQ loss of 10 points). Although there have been some reports of familial occurrence (in 2% of the cases), CHTD is mainly considered as a sporadic entity. Furthermore, monozygotic (MZ) twins show a high discordance rate (92%) for thyroid dysgenesis and female predominance is observed in thyroid dysgenesis (especially thyroid ectopy), these two observations being incompatible with simple Mendelian inheritance. In addition, germline mutations in the thyroid related transcription factors NKX2.1, PAX8, FOXE1, and NKX2.5 have been identified in only 3% of sporadic cases and linkage analysis has excluded these genes in some multiplex families with CHTD. Collectively, these data point to the involvement of non-Mendelian mechanisms in the etiology of the majority of cases of thyroid dysgenesis. Among the plausible mechanisms are epigenetic modifications, somatic mutations occurring in the thyroid bud early during embryogenesis, or stochastic developmental events. Hence, we proposed a two-hit model combining germline and somatic (epi)genetic variations that can explain the lack of clear familial transmission of CTHD. In this present thesis, we assessed the role of somatic (epi)genetic variations in the pathogenesis of thyroid dysgenesis via a genome-wide as well as a candidate gene approach. Our genome wide approach revealed that ectopic thyroids show a differential gene expression compared to that of normal thyroids, with enrichment for the Wnt signalling pathway. The Wnt signalling pathway is crucial for cell migration and for the development of several endoderm-derived organs (e.g., pancreas). Moreover, a role of Wnt signalling in thyroid organogenesis was further supported by recent zebrafish studies which showed thyroid abnormalities resulting from the disruption of the Wnt pathway during different steps of organogenesis. Thus, Wnt pathway involvement in the etiology of thyroid ectopy is biologically plausible. An unexpected finding of our genome-wide gene expression analysis of ectopic thyroids was that they express calcitonin similar to normally located (orthotopic) thyroids. Such a finding, although in contradiction with our current knowledge of the embryological development of the thyroid attributes C cell origins to extrathyroidal structures (ultimobrachial bodies) upon fusion with a fully-formed, normally situated gland. Using a candidate gene approach, we were unable to demonstrate any differences in the methylation profile between ectopic and eutopic thyroids, but nevertheless we documented the presence of a differentially methylated region (DMR) between thyroids and leukocytes in the promoter of FOXE1, a gene encoding the only thyroid related transcription factor known to play a crucial role in regulating the migration of the thyroid precursors during development as shown by animal studies. We demonstrated by in vivo and in vitro studies that the methylation status of this DMR is correlated with differential expression of FOXE1 in non-tumoral tissues (thyroids and leukocytes). Knowing that DMRs are hotspots for epi(genetic) variations, its screening among CTHD patients is justifiable in our search for a molecular basis of thyroid dysgenesis, currently underway in a case-control study. The results generated during my graduate studies represent unique and novel mechanisms underlying the pathogenesis of CHTD, the etiology of which is still an enigma. They also paved the way for many future studies that will aid in better understanding both the normal and pathogenic development of the thyroid gland.

L’objectif de cette thèse est de déterminer l’étendue de la variabilité épigénétique, plus particulièrement du polymorphisme de méthylation de l’ADN, non liée à la variabilité génétique dans les populations asexuées en milieu naturel. Cette évaluation nous a permis de mieux cerner l’importance que peuvent avoir les processus épigénétiques en écologie et en évolution. Le modèle biologique utilisé est l’hybride clonal du complexe gynogénétique Chrosomus eos-neogaeus. Malgré une homogénéité génétique, une importante variabilité phénotypique est observée entre les hybrides d’une même lignée clonale mais retrouvés dans des environnements différents. L’influence des processus épigénétiques apporte une explication sur ce paradoxe. L’épigénétique se définit comme une modification de l’expression des gènes sans changement de la séquence d’ADN. La diversité des phénotypes peut entre autre s’expliquer par des patrons de méthylation différentiels des gènes et/ou des allèles des gènes entre les hybrides génétiquement identiques. La diversité des lignées épiclonales peut quant à elle s’expliquer par la colonisation de plusieurs lignées épiclonales, s’établir en réponse à l’environnement ou de façon aléatoire. Plusieurs méthodes seront utilisées afin de survoler le génome des hybrides clonaux pour mettre en évidence le polymorphisme de méthylation de l’ADN à l’échelle de l’individu et entre les individus de différentes populations. / The aim of the thesis is to determine the extent of epigenetic variation, more specifically DNA methylation polymorphism, not linked to genetic variation in natural populations of an asexual vertebrate. This evaluation enables to better understand the importance that plays epigenetics processes in ecology and evolution. The biological model used is the clonal hybrid of the gynogenetic Chrosomus eos-neogaeus complex. Even in absence of genetic difference, an important phenotypic variability is observed among hybrids of the same clonal lineage living in different environments. Epigenetics, a modification of genes expression without a change at the DNA sequence, provides an explanation to this paradox. The diversity of phenotypes may be explained by differential methylation patterns of genes and/or alleles among genetically identical hybrids. The diversity of epiclonal lineages may be explained by the colonisation of many epiclonal lineages, established in response to the environment or stochastically. Many methods were used for screening the genome of clonal hybrids in order to highlight DNA methylation polymophism at the scale of an individual and among individuals of different populations.