L’activation des lymphocytes T (LT) CD8 naïfs mène à leur différenciation en deux sous-populations d'effecteurs, les SLEC (short-lived effector cells) et MPEC (memory precursor effector cells). Après contrôle de l’infection, les SLEC meurent par apoptose tandis que les MPEC deviennent des cellules mémoires qui protègent contre la réinfection. Peu de choses sont connues sur le rôle des mécanismes post-traductionnels, tel que la déubiquitination lors de la différenciation des LT CD8+. La déubiquitinase (DUB) BAP1 joue un rôle clé dans la différenciation thymique et dans le maintien des populations de LT matures. Elle interagit avec plusieurs partenaires comme YY1 et EZH2 dans des cellules autres que les LT. Certains de ces partenaires ont des rôles importants dans la biologie des LT CD8 notamment en contexte infectieux suggérant que BAP1 régule la réponse des LT CD8+ lors d’une infection. Afin de tester cela, des LT CD8 OT-I spécifiques pour le peptide ovalbumine dans lesquelles BAP1 a été surexprimé ont été transférés dans des souris infectées avec la bactérie Listeria monocytogenes codant pour l’ovalbumine (LM-OVA). Nos résultats au pic de la réponse démontrent un défaut de l’expansion clonale des LT CD8+, de la différenciation en SLEC et une augmentation de la différenciation en MPEC. Nous observons aussi une augmentation de la différenciation en LT centrale mémoire (TCM) au stade mémoire. Finalement, nous évaluerons aussi l’impact de la délétion de Bap1 dans la réponse des LT CD8+. Cela contribuera à une meilleure compréhension du rôle de l’ubiquitination dans la biologie des LT CD8+ dont l’importance est centrale dans la réponse face aux infections et au cancer. / Following antigen recognition, naive CD8+ T cells expand massively and differentiate into effector cells. After pathogen clearance, the short-lived effector cells (SLECs) die while memory precursor effector cells (MPECS) persist and differentiate into memory T cells to confer long-term protection against reinfection. The transcriptional network controlling the SLEC/MPEC differentiation is well characterized but little is known about the role of posttranslational modifications, such as deubiquitination, in this process. The deubiquitinase BAP1 interacts with multiple partners including YY1 and EZH2 that are important for CD8+ T cell response. BAP1 has been shown to participate in thymic differentiation and in the maintenance of mature peripheral T cells. However, the function of BAP1 during CD8+ T cell response to infection is unknow. To address this, we overexpressed BAP1 wild type (WT) in ovalbumin-specific (OT-I) CD8+ T cells by retroviral transduction and analysed their response after adoptive transfer into mice infected with Listeria monocytogenes encoding ovalbumin. The overexpression of BAP1 WT severely reduced CD8+ T cell expansion, SLEC differentiation and functionality. It also induces enhanced MPEC differentiation. In fact, we observed an increase in central memory CD8 T cell (TCM) differentiation 30 days following infection. Finally, we confirmed the presence of key partners of BAP1 complex in activated and naïve CD8+ T cells. As next steps, we will analyse the impact of BAP1-deficiency in CD8+ T cell response to infection. This will contribute to a better understanding of the role of deubiquitination in CD8+ T cell response

L'encéphalomyélite myalgique (EM), communément appelée syndrome de fatigue chronique (SFC), est une maladie chronique complexe, impliquant divers facteurs biochimiques, métaboliques, génétiques et épigénétiques dans sa pathogenèse. L'EM se caractérise par une fatigue persistante et débilitante, un malaise post-effort (PEM), des douleurs, des troubles du sommeil, des troubles cognitifs et d'autres symptômes. L'EM constitue un problème de santé important, compte tenu de sa prévalence dans la population générale. Cependant, notre compréhension des origines de l’EM reste limitée; son diagnostic est difficile et il n’existe aucun traitement curatif définitif ni de biomarqueur officiellement approuvé. Les approches de prise en charge actuelles visent principalement à soulager les symptômes, soulignant le besoin urgent de mieux comprendre ses causes sous-jacentes. Le développement de l’EM est reconnu comme une confluence de prédispositions génétiques et d’expositions environnementales, compte tenu de l’hétérogénéité clinique de cette pathologie. Ces dernières années, de nombreuses voies étiologiques ont été suggérées, notamment un développement post-infectieux de l’EM, qui reste l’une des principales hypothèses. L'implication de mécanismes épigénétiques, principalement la méthylation de l'ADN, un régulateur bien documenté de l'expression des gènes, est également apparu comme un acteur essentiel dans la pathogenèse de l'EM. Il est intéressant de noter, et avec une note d’inquiétude, que près de deux ans après la pandémie de SRAS-CoV-2 à l’origine du COVID-19, une cohorte croissante d’individus auparavant en bonne santé souffre du Long COVID (LC), une manifestation de symptômes persistants provenant de l’infection initiale. Il est remarquable de constater qu’il existe un chevauchement évident entre les présentations cliniques de l’EM et de la LC. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ce chevauchement restent encore à élucider. Dans le cadre de cette thèse, je me suis intéressée dans un premier temps à identifier les changements épigénétiques associés à l'EM à partir de la salive. Le choix d’utiliser la salive représente une approche non-invasive et découle également du fait que des études précédentes ont mis en évidence que les profils de méthylation de l’ADN obtenu des cellules buccales présentes dans la salive étaient assez similaires aux profiles observés au niveau du cerveau et des muscles (des tissus difficilement accessibles mais pourtant atteints dans l’EM) comparativement aux cellules mononuclées du sang périphériques (PBMCs). Cette approche pourrait aider à établir une signature épigénétique susceptible de combler le fossé conceptuel entre la génétique et l'influence environnementale dans la pathogenèse de l'EM. En effet, les sites CpG/gènes identifiés avec une méthylation différentielle pourraient être impliqués dans des mécanismes physiopathologiques associés au développement et/ou à la gravité de l'EM. Après correction de Bonferroni, mes travaux ont révélé un seul site CpG, "cg19803194", différentiellement méthylé chez les patients atteints d'EM par rapport aux sujets sains appariés pour l’âge. Ce site CpG est situé dans le corps du gène PTPRN2 codant pour la tyrosine phosphatase receptor type N2. De plus, le gène PTPRN2 contient un microARN intronique, le miR-153-3p (miR-153-2), qui est corégulé avec son gène hôte. En raison des défis éthiques et logistiques liés à l'accès aux tissus cérébraux ou musculaires, nous avons mesuré les niveaux circulants en miR-153-3p dans le plasma comme mesure de substitution pour évaluer les fluctuations de l'expression de PTPRN2. Nous avons donc analysé ce miARN comme un proxy prometteur pour mieux comprendre la dynamique d’expression de PTPRN2. Notre stratification des patients atteints d'EM basée sur les niveaux de méthylation de l'ADN cg19803194 (hypo vs hyper) a révélé qu'une réduction des niveaux circulants du miR-153-3p a été observée dans le groupe hypo-méthylé, ce qui concorde avec de précédentes études montrant que l'hypométhylation au niveau du corps des gènes, entraine habituellement une diminution de leur transcription. Cependant, l’intrigue a été amplifiée par un schéma contre-intuitif observé chez un sous-ensemble de patients. Cette découverte inattendue, nous a incité à découvrir un mécanisme alternatif régissant la régulation des niveaux de miR-153-3p en circulation, qui implique de manière complexe une interaction dynamique des niveaux nucléaires de PHB2 (Prohibitine 2) dans le contrôle de la maturation de certains miARN dont le miR-153-3p. La LC est un trouble complexe avec des symptômes prolongés et hétérogènes qui s’apparentent avec l’EM. Dans le cadre de ma seconde étude, nous avons utilisé une manoeuvre de provocation standardisée pour induire un malaise post-effort (PEM), ce qui nous a permis de stratifier les patients LC en deux groupes : LC1 (sévère) et LC2 (léger à modéré) en fonction de la gravité du PEM. Les patients LC1 présentaient des scores de gravité de la maladie significativement plus élevés et des scores neurocognitifs plus mauvais que les patients classés dans le groupe LC2. Ceci était étroitement lié aux scores PEM élevés chez les patients LC1 et aux scores PEM réduits chez les patients LC2. Nous avons également utilisé le profilage de la méthylation de l'ADN des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) pour étudier les changements dans la méthylation de l'ADN associés aux symptômes de la LC (n = 24) par rapport aux participants ayant eu la COVID-19, suivie d’une rémission complète (SC pour Short COVID en anglais) (n = 4). Il est intéressant de noter que nous avons identifié des altérations de plusieurs gènes impliqués dans le dysfonctionnement neurocognitif et le changement de la réponse immunitaire liés à la persistance des symptômes de la LC. En outre, dans le cadre de ma troisième étude, nous avons effectué une analyse complète de la méthylation de l'ADN à l'échelle du génome, à partir d'échantillons de salive provenant du même groupe de patients LC (n=24) LC, de 4 participants SC et de 13 témoins sains (HC) pré-pandémiques. Nous avons étudié les signatures épigénétiques associées à la LC. Nous avons constaté que les patients LC présentaient une hypométhylation significative de trois gènes communs, MEST, DDR1 et LRP1, par rapport aux participants SC et HC. Ces gènes sont impliqués dans la cascade de l’inflammation, l’altération de la réponse immunitaire et des maladies neurologiques. Nous avons également signalé des altérations de la méthylation de LGR6, ZFAND2A et TDG dans les PBMCs et la salive chez les mêmes individus associés à la sévérité de la LC. Plus précisément, nous avons constaté une hypométhylation au niveau des gènes LGR6 et ZFAND2A et une hyperméthylation au niveau du gène TDG dans les cas graves (groupe LC1) par rapport aux cas légers à modérés (groupe LC2). Cette convergence de profils entre la salive et les PBMCs souligne l'importance de LGR6, ZFAND2A et TDG dans la gravité des LC. L’ensemble des résultats obtenus dans le cadre de cette thèse apporte un éclairage nouveau et pertinent sur les mécanismes épigénétiques qui sous-tendent l’EM et la COVID longue. Les nouvelles connaissances présentées dans les trois manuscrits ci-joints devraient nous permettre de mieux comprendre l’EM et la COVID longue, de développer de futures stratégies diagnostiques, thérapeutiques et préventives, mais également de mieux gérer les effets à long terme de ces conditions. En effet, les altération épigénétiques identifiées dans ces deux contextes pathologiques, plus précisément au niveau de la méthylation de l’ADN, pourraient être impliquées dans la sévérité et la persistance des symptômes de ces pathologies complexes, distinctes et présentant tout de même des similitudes. / Myalgic encephalomyelitis (ME), also known as chronic fatigue syndrome (CFS), is a complex chronic disease involving various biochemical, metabolic, genetic, and epigenetic factors. Patients with ME experience persistent and debilitating fatigue, post-exertional malaise (PEM), pain, sleep disturbances, cognitive impairment, and other symptoms. ME is a significant health problem, with an estimated prevalence of 0.2% to 0.5% in the general population. However, our understanding of the origins of ME remains limited; its diagnosis is complex, and there is no definitive cure or officially approved biomarker. Current management approaches focus primarily on relieving symptoms, highlighting the urgent need to understand its underlying causes better. The development of ME is thought to be a confluence of genetic predispositions and environmental exposures. In recent years, many etiological pathways have been suggested, including a post-infectious development of ME, which remains one of the main hypotheses. The involvement of epigenetic mechanisms, primarily DNA methylation, a well-documented regulator of gene expression, has also emerged as a critical player in the pathogenesis of ME. Interestingly, and with a note of concern, nearly two years after the SARS-CoV-2 pandemic that caused COVID-19, a growing cohort of previously healthy individuals suffer from Long COVID (LC), a manifestation of persistent symptoms from the initial infection. Remarkably, there is a clear overlap between the clinical presentations of ME and LC. However, the mechanisms underlying this overlap remain to be elucidated. This thesis investigated the epigenetic mechanisms underlying ME and LC. As part of this thesis, I was initially interested in identifying the epigenetic changes associated with ME from saliva. Saliva is a non-invasive sample that can be easily collected, and previous studies have shown that the DNA methylation profiles obtained from buccal cells present in saliva are similar to those observed in the brain and muscles. This suggests that saliva could be used as a proxy for these tissues, which are difficult to access but are thought to be involved in the pathogenesis of ME. I used Bonferroni's correction to identify a single CpG site, "cg19803194", differentially methylated in ME patients compared to age-matched healthy subjects. This CpG site is located in the body of the PTPRN2 gene, which encodes the tyrosine phosphatase receptor type N2. The PTPRN2 gene also contains an intronic microRNA, miR-153-3p (miR-153-2), which is co-regulated with its host gene. Due to ethical and logistical challenges, I measured circulating levels of miR-153-3p in plasma as a surrogate measure to assess fluctuations in PTPRN2 expression. This miRNA is a promising proxy for understanding the expression dynamics of PTPRN2 because it is located in the same gene and is co-regulated with it. My stratification of ME patients based on cg19803194 DNA methylation levels (hypo vs hyper) revealed that a reduction in circulating levels of miR-153-3p was observed in the hypo-methylated group. These findings agree with previous studies showing that hypomethylation in the body of genes usually decreases their transcription. However, a counterintuitive pattern was observed in a subset of patients. This unexpected finding prompted me to discover an alternative mechanism governing the regulation of circulating miR-153-3p levels. This mechanism involves a dynamic interaction of nuclear PHB2 (Prohibitin 2) levels in controlling the maturation of certain miRNAs, including miR-153-3p. LC is a complex disorder with prolonged and heterogeneous symptoms that resemble myalgic encephalomyelitis (ME). In my second study, we used a standardized provocative maneuver to induce post-exertional sickness (PEM), which allowed us to stratify LC patients into two groups: LC1 (severe) and LC2 (mild to moderate), depending on the severity of the PEM. LC1 patients had significantly higher disease severity scores and worse neurocognitive scores than patients classified in the LC2 group. This was closely related to high PEM scores in LC1 patients and reduced PEM scores in LC2 patients. We also used peripheral blood mononuclear cell (PBMC) DNA methylation profiling to investigate changes in DNA methylation associated with LC symptoms (n=24) compared to participants who had COVID followed by complete remission Short COVID (SC) (n = 4). Interestingly, we identified alterations in several genes implicated in neurocognitive dysfunction and changes in immune response related to the persistence of LC symptoms. In my third study, we also performed a comprehensive genome-wide DNA methylation analysis of saliva samples from the same group of LC patients (n=24), 4 SC participants, and 13 pre-pandemic healthy controls (HC). We studied the epigenetic signatures associated with LC. We found that LC patients showed significant hypomethylation of three common genes, MEST, DDR1, and LRP1, compared to SC and HC participants. These genes are involved in the cascade of inflammation, impaired immune response, and neurological disease. We also reported LGR6, ZFAND2A, and TDG methylation alterations in PBMCs and saliva in the same individuals associated with CL severity. Specifically, we found hypomethylation at the LGR6 and ZFAND2A genes and hypermethylation at the TDG gene in severe cases (LC1 group) compared to mild to moderate cases (LC2 group). This convergence of profiles between saliva and PBMCs highlights the importance of LGR6, ZFAND2A, and TDG in the severity of CL. All the results obtained in this thesis shed new and relevant light on the epigenetic mechanisms underlying ME and LC. The new knowledge in the three attached manuscripts allowed us to understand ME and LC better, develop future diagnostic, therapeutic, and preventive strategies, and better manage these conditions' long-term effects. Epigenetic alterations, more precisely at the level of DNA methylation, have been identified in both ME and long-term COVID. These alterations could be involved in the severity and persistence of the symptoms of these complex pathologies, which are distinct but share some similarities. The findings of this thesis suggest that epigenetics could be a promising target for developing new treatments for ME and long-term COVID. Further research is needed to confirm these findings and to develop effective therapeutic interventions.

La déubiquitinase BRCA-associated protein 1 (BAP1) est un suppresseur de tumeurs chez l’homme, dont l’activité enzymatique est inactivée dans une variété de cancers. Les modèles actuels proposent que BAP1 forme un complexe de plusieurs méga daltons avec des protéines associées à la chromatine, et que ces protéines et les modifications post-traductionnelles (PTM) facilitent sa fonction de suppresseur de tumeurs en agissant sur la chromatine. Il a été démon-tré que les facteurs de transcription FOXK1 et FOXK2 recrutent BAP1 pour cibler des gènes et réguler la transcription. Cependant, comment FOXK1/2 sont régulés dans le complexe BAP1 reste inconnu. FOXK1/2 sont récemment apparus comme des régulateurs clés du métabolisme et de la prolifération cellulaire dans des conditions normales et de stress. Les observations dans les can-cers humains suggèrent que FOXK1, et non FOXK2, possède des propriétés oncogéniques. En effet, une expression élevée de FOXK1 est associée à une prolifération accrue, ainsi qu’à une invasion et des métastases plus importantes. Cependant, les mécanismes moléculaires exacts de la dérégulation de FOXK1 restent méconnus. Nos analyses sur la survie des patients montrent qu’une forte expression du transcrit de FOXK1 diminue significativement la survie par rapport aux patients présentant de faibles taux du transcrit de FOXK1, ce qui n’est pas observé avec FOXK2. Pour mieux comprendre les fonctions de FOXK1 et FOXK2, nous avons surexprimé ses protéines dans des fibroblastes humains normaux. Cela nous a conduits à découvrir que les pro-priétés oncogéniques de FOXK1 agissent en partie par l’induction de la voie des E2Fs. Contrai-rement à FOXK2, la surexpression de FOXK1 dans les fibroblastes humains normaux favorise la prolifération cellulaire et retarde l’induction de la sénescence. Nous avons également constaté que lorsque la surexpression de FOXK1 était combinée à d’autres oncogènes, sa capacité à transformer les fibroblastes était significativement augmentée. Ces résultats suggèrent que FOXK1 et FOXK2 jouent différents rôles dans les cellules et qu’un mécanisme peut réguler leur activité différemment. De manière intéressante, nous avons découvert que FOXK1, et non FOXK2, est modifié par O-GlcNAcylation, une modification post-traductionnelle unique connue pour être étroite-ment régulée par les fluctuations du métabolisme cellulaire. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que la O-GlcNAcylation est un mécanisme important de régulation de l’activité transcriptionnelle de FOXK1. L’identification des sites modifiés sur FOXK1 nous a permis de créer des mutants déficients en O-GlcNAcylation de ce facteur. Alors que la perte de la O-GlcNAcylation n’impacte pas sur le recrutement de FOXK1 à la chromatine, nous avons décou-vert que la O-GlcNAcylation régule les propriétés oncogéniques de FOXK1. En effet, l’absence de la O-GlcNAcylation de FOXK1 diminue la capacité proliférative des cellules ainsi que la crois-sance tumorale. De plus, nos analyses de génomiques nous ont permis de mettre en évidence que la O-GlcNAcylation régule le recrutement de BAP1 sur la chromatine. La diminution de la O-GlcNAcylation sur FOXK1 entraîne une réduction du recrutement de BAP1, ce qui est associé à une augmentation des niveaux de H2AK119Ub, une marque de répression génique ciblée par la déubiquitinase BAP1, ainsi qu’à une diminution de la marque d’activation H3K4me1. Nous proposons un modèle dans lequel la O-GlcNAcylation régule les fonctions biolo-giques de FOXK1 et promeut la croissance tumorale en pilotant les propriétés oncogéniques de ce facteur. Nos analyses suggèrent que la O-GlcNAcylation de FOXK1 est importante pour le bon fonctionnement des complexes sur la chromatine. Comprendre comment FOXK1 et FOXK2 régu-lent BAP1 pourrait nous aider à mieux définir les fonctions de suppression tumorale de BAP1 et comment la dérégulation des facteurs de transcription contribue au développement du cancer. / The deubiquitinase BAP1 (BRCA-associated protein 1) is a tumor suppressor in humans, whose enzymatic activity is inactivated in a variety of cancers. Current models suggest that BAP1 forms mega dalton complex with chromatin-associated proteins, and that these proteins and post-translational modifications (PTMs) facilitate its tumor suppressor function by acting on chromatin. It has been shown that the transcription factors FOXK1 and FOXK2 recruit BAP1 to target genes and regulate transcription. However, how FOXK1/2 are regulated within the BAP1 complex remains unknown. FOXK1/2 have recently emerged as key regulators of metabolism and cell proliferation under normal and stress conditions. Observations in human cancers suggest that FOXK1, and not FOXK2, has oncogenic properties. Indeed, high expression of FOXK1 is associated with increased proliferation, as well as greater invasion and metastasis. However, the exact molecular mechanisms of FOXK1 deregulation remain unknown. Our analyses of patient survival show that high expression of FOXK1 transcript significantly reduces survival compared to patients with low levels of FOXK1 transcript, which is not observed with FOXK2. To better understand the functions of FOXK1 and FOXK2, we overexpressed their proteins in normal human fibroblasts. This led us to discover that the oncogenic properties of FOXK1 act in part by inducing the E2F pathway. Unlike FOXK2, overexpression of FOXK1 in normal human fibroblasts promotes cell proliferation and delays the induction of senescence. We also found that when overexpression of FOXK1 was combined with other oncogenes, its ability to transform fibroblasts was significantly increased. These results suggest that FOXK1 and FOXK2 play different roles in cells and that a mechanism may regulate their activity differently. Interestingly, we discovered that FOXK1, and not FOXK2, is modified by O-GlcNAcylation, a unique post-translational modification known to be tightly regulated by fluctuations in cellular metabolism. Consequently, we hypothesized that O-GlcNAcylation is an important mechanism for regulating the transcriptional activity of FOXK1. Identifying the modified sites on FOXK1 allowed us to create mutants deficient in O-GlcNAcylation of this factor. While the loss of O-GlcNAcylation does not affect the recruitment of FOXK1 to chromatin, we discovered that O-GlcNAcylation regulates the oncogenic properties of FOXK1. Indeed, the absence of O-GlcNAcylation of FOXK1 reduces the proliferative capacity of cells as well as tumor growth. Moreover, our genomic analyses have allowed us to highlight that O-GlcNAcylation regulates the recruitment of BAP1 to chromatin. Loss of FOXK1 O-GlcNAcylation leads to a reduction of BAP1 recruitment to chromatin, which is associated with an increase in the levels of H2AK119Ub, a gene repression mark targeted by the deubiquitinase BAP1, as well as a decrease in the activation mark H3K4me1. We propose a model in which O-GlcNAcylation regulates the biological functions of FOXK1 and promotes tumor growth by driving the oncogenic properties of this factor. Our analyses suggest that O-GlcNAcylation of FOXK1 is important for the proper functioning of complexes on chromatin. Understanding how FOXK1 and FOXK2 regulate BAP1 could help us better define the tumor-suppressing functions of BAP1 and how the deregulation of transcription factors contributes to cancer development.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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L’importance des modificateurs de la chromatine dans la régulation de l’hématopoïèse et des hémopathies malignes est illustrée par l’histone méthyltransférase Mixed-Lineage Leukemia (MLL) qui est essentielle au maintien des cellules souches hématopoïétiques (CSH) et dont le gène correspondant, MLL, est réarrangé dans plus de 70% des leucémies du nourrisson. Les histones déméthylases (HDM), récemment découvertes, sont aussi impliquées dans le destin des CSH et des hémopathies malignes. Le but de ce projet est d’étudier l’expression des HDM dans les cellules hématopoïétiques normales et leucémiques afin d’identifier de potentiels régulateurs de leur destin. Nous avons réalisé un profil d'expression génique des HDM par qRT-PCR et par séquençage du transcriptome (RNA-seq) dans des cellules de sang de cordon (cellules CD34+ enrichies en CSH et cellules différenciées) et des cellules de leucémie aiguë myéloïde (LAM) avec réarrangement MLL. Les deux techniques montrent une expression différentielle des HDM entre les populations cellulaires. KDM5B et KDM1A sont surexprimés dans les cellules CD34+ par rapport aux cellules différenciées. De plus, KDM4A et PADI2 sont surexprimés dans les cellules leucémiques par rapport aux cellules normales. Des études fonctionnelles permettront de déterminer si la modulation de ces candidats peut être utilisée dans des stratégies d’expansion des CSH, ou comme cible thérapeutique anti-leucémique. Nous avons aussi développé et validé un nouveau test diagnostique pour détecter les mutations de GATA2 qui code pour un facteur de transcription clé de l’hématopoïèse impliqué dans les LAM. Ces travaux soulignent l’importance des facteurs nucléaires dans la régulation de l’hématopoïèse normale et leucémique. / The importance of chromatin modifiers in regulation of hematopoiesis and hematologic malignancies is illustrated by the Mixed-Lineage Leukemia (MLL) histone methyltransferase, which is essential to maintain hematopoietic stem cells (HSC) and whose corresponding gene, MLL, is rearranged in over 70% of infant leukemia. The recently discovered histone demethylases (HDM) are also involved in HSC fate and in hematologic malignancies. The purpose of this project is to study the expression of HDM in normal and leukemic hematopoietic cells to identify potential regulators of their fate. We performed a comprehensive gene expression profile of HDM by qRTPCR and transcriptome sequencing (RNA-seq) in cord blood cells (CD34+ cells enriched in HSC and differentiated cells) and in acute myeloid leukemia (AML) cells with MLL rearrangement. Both techniques revealed differential expression of HDM between these cell populations. KDM5B and KDM1A are overexpressed in CD34+ cells compared to differentiated cells. Moreover, KDM4A and PADI2 are overexpressed in leukemic cells compared to normal cells. Functional studies will determine whether modulation of these candidates can be used in HSC expansion strategies or as anti-leukemic drug target. We have also developed and validated a new diagnostic test to detect mutations of GATA2, a gene encoding a key transcription factor involved in hematopoiesis and in AML. This work highlights the importance of nuclear factors in the regulation of normal and leukemic hematopoiesis.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Le centromère est le site chromosomal où le kinetochore se forme, afin d’assurer une ségrégation fidèles des chromosomes et ainsi maintenir la ploïdie appropriée lors de la mitose. L’identité du centromere est héritée par un mécanisme épigénétique impliquant une variante de l’histone H3 nommée centromere protein-A (CENP-A), qui remplace l’histone H3 au niveau de la chromatine du centromère. Des erreurs de propagation de la chromatine du centromère peuvent mener à des problèmes de ségrégation des chromosomes, pouvant entraîner l’aneuploïdie, un phénomène fréquemment observé dans le cancer. De plus, une expression non-régulée de CENP-A a aussi été rapportée dans différentes tumeurs humaines. Ainsi, plusieurs études ont cherchées à élucider la structure et le rôle de la chromatine contenant CENP-A dans des cellules en prolifération. Toutefois, la nature moléculaire de CENP-A en tant que marqueur épigénétique ainsi que ces dynamiques à l'extérieur du cycle cellulaire demeurent des sujets débat. Dans cette thèse, une nouvelle méthode de comptage de molécules uniques à l'aide de la microscopie à réflexion totale interne de la fluorescence (TIRF) sera décrite, puis exploitée afin d'élucider la composition moléculaire des nucléosomes contenant CENP-A, extraits de cellules en prolifération. Nous démontrons que les nucléosomes contenant CENP-A marquent les centromères humains de façon épigénétique à travers le cycle cellulaire. De plus, nos données démontrent que la forme prénucléosomale de CENP-A, en association avec la protéine chaperon HJURP existe sous forme de monomère et de dimère, ce qui reflète une étape intermédiaire de l'assemblage de nucléosomes contenant CENP-A. Ensuite, des analyses quantitatives de centromères lors de différenciation myogénique, et dans différents tissus adultes révèlent des changements globaux qui maintiennent la marque épigénétique dans une forme inactive suite à la différentiation terminale. Ces changements incluent une réduction du nombre de points focaux de CENP-A, un réarrangement des points dans le noyau, ainsi qu'une réduction importante de la quantité de CENP-A. De plus, nous démontrons que lorsqu'une dédifférenciation cellulaire est induite puis le cycle cellulaire ré-entamé, le phénotype "différencié" décrit ci-haut est récupéré, et les centromères reprennent leur phénotype "prolifératif". En somme, cet oeuvre décrit la composition structurale sous-jacente à l'identité épigénétique des centromères de cellules humaines lors du cycle cellulaire, et met en lumière le rôle de CENP-A à l'extérieur du cycle cellulaire. / The centromere is a unique chromosomal locus where the kinetochore is formed to mediate faithful chromosome partitioning, thus maintaining ploidy during cell division. Centromere identity is inherited via an epigenetic mechanism involving a histone H3 variant, called centromere protein-A (CENP-A) which replaces histone H3 in centromeric chromatin. Defects in the centromeric chromatin can lead to missegregation of chromosomes resulting in aneuploidy, a ¬¬frequently observed phenomenon in cancer. Moreover, deregulated CENP-A expression has also been documented in a number of human malignancies. Therefore, much effort has been devoted to uncover the structure and role of CENP-A-containing chromatin in proliferating cells. However, the molecular nature of this epigenetic mark and its potential dynamics during and outside the cell cycle remains controversial. In this thesis, the development of a novel single-molecule imaging approach based on total internal reflection fluorescence and the use of this assay to gain quantitative information about the molecular composition of CENP-A-containing nucleosomes extracted from proliferating cells throughout the cell cycle as well as the dynamics and cellular fate of CENP-A chromatin in terminal differentiation are described. Here, we show that octameric CENP-A nucleosomes containing core Histones H2B and H4 epigenetically mark human centromeres throughout the cell cycle. Moreover, our data demonstrate that the prenucleosomal form of CENP-A bound by the chaperone HJURP transits between monomeric and dimeric forms likely reflecting intermediate steps in CENP-A nucleosomal assembly. Moreover, quantitative analyses of centromeres in myogenic differentiation and adult mouse tissue sections revealed that centromeres undergo global changes in order to retain a minimal CENP-A epigenetic code in an inactive state, upon induction of terminal differentiation. These include a robust decrease in the number of centromeric foci, subnuclear rearrangement as well as extensive loss of CENP-A protein. Interestingly, we show that forced dedifferentiation under cell cycle reentry permissive conditions, rescued the above-mentioned phenotype concomitantly with the restoration of cell division. Altogether, this work delineates the structural basis for the epigenetic specification of human centromeres during the cell cycle and sheds light on the cellular fate of the CENP-A epigenetic code outside the cell cycle.

Le sommeil est un besoin vital et le bon fonctionnement de l’organisme dépend de la quantité et de la qualité du sommeil. Le sommeil est régulé par deux processus : un processus circadien qui dépend de l’activité des noyaux suprachiasmatiques de l’hypothalamus et qui régule le moment durant lequel nous allons dormir, et un processus homéostatique qui dépend de l’activité neuronale et se reflète dans l’intensité du sommeil. En effet, le sommeil dépend de l’éveil qui le précède et plus l’éveil dure longtemps, plus le sommeil est profond tel que mesuré par des marqueurs électroencéphalographiques (EEG). Des études ont montré que le bon fonctionnement de ces deux processus régulateurs du sommeil dépend de la plasticité synaptique. Ainsi, les éléments synaptiques régulant la communication et la force synaptique sont d’importants candidats pour agir sur la physiologie de la régulation du sommeil. Les molécules d’adhésion cellulaire sont des acteurs clés dans les mécanismes de plasticité synaptique. Elles régulent l’activité et la maturation des synapses. Des études ont montré que leur absence engendre des conséquences similaires au manque de sommeil. Le but de ce projet de thèse est d’explorer l’effet de l’absence de deux familles de molécule d’adhésion cellulaire, les neuroligines et la famille des récepteur Eph et leur ligand les éphrines dans les processus régulateurs du sommeil. Notre hypothèse est que l’absence d’un des membres de ces deux familles de molécule affecte les mécanismes impliqués dans le processus homéostatique de régulation du sommeil. Afin de répondre à notre hypothèse, nous avons étudié d’une part l’activité EEG chez des souris mutantes n’exprimant pas Neuroligine‐1 (Nlgn1) ou le récepteur EphA4 en condition normale et après une privation de sommeil. D’autre part, nous avons mesuré les changements moléculaires ayant lieu dans ces deux modèles après privation de sommeil. Au niveau de l’activité EEG, nos résultats montrent que l’absence de Nlgn1 augmente la densité des ondes lentes en condition normale et augment l’amplitude et la pente des ondes lentes après privation de sommeil. Nlgn1 est nécessaire au fonctionnement normal de la synchronie corticale, notamment après une privation de sommeil, lui attribuant ainsi un rôle clé dans l’homéostasie du sommeil. Concernant le récepteur EphA4, son absence affecte la durée du sommeil paradoxal ainsi que l’activité sigma qui dépendent du processus circadien. Nos résultats suggèrent donc que ce récepteur est un élément important dans la régulation circadienne du sommeil. Les changements transcriptionnels en réponse à la privation de sommeil des souris n’exprimant pas Nlgn1 et EphA4 ne sont pas différents des souris sauvages. Toutefois, nous avons montré que la privation de sommeil affectait la distribution des marques épigénétiques sur le génome, tels que la méthylation et l’hydroxyméthylation, et que l’expression des molécules régulant ces changements est modifiée chez les souris mutantes pour le récepteur EphA4. Nos observations mettent en évidence que les molécules d’adhésion cellulaire, Nlgn1 et le récepteur EphA4, possèdent un rôle important dans les processus homéostatique et circadien du sommeil et contribuent de manière différente à la régulation du sommeil. / Sleep is a vital need and the proper functioning of the body depends on the amount and quality of sleep. Sleep is regulated by two processes: a circadian process that depends on the activity of suprachiasmatic nuclei of the hypothalamus and regulates the time of day during which we are going to sleep, and a homeostatic process that seems to depend on neuronal activity and that reflects sleep intensity. The homeostatic process controls a pressure for sleep as a function of the amount of time spent awake. Indeed, sleep quality depends on the duration of preceding wakefulness, the more one is awake, deeper the sleep afterwards as measured by electroencephalographic markers (EEG). Studies have shown that the proper functioning of these two sleep regulatory processes depends on synaptic plasticity. Thus, elements that regulate synaptic communication and synaptic strength are important candidates to act upon the physiology of sleep regulation. Cell adhesion molecules are key elements regulating synaptic plasticity. They control synapse activities and maturation. Studies have shown that their absence leads to consequences similar to sleep deprivation. The aim of this study is to explore the effect of the absence of two different cellular adhesion molecule, Neuroligin‐1 and EphA4 receptor in sleep regulatory processes. Our hypothesis is that the absence of either of these molecules will affect sleep regulation and more specifically sleep homeostasis. To address our hypothesis, we first studied EEG activity in mice which do not express Nlgn1 and EphA4 in normal condition or after sleep deprivation. Secondly, we measured the molecular changes that occur in these two models after sleep deprivation. At the level of EEG activity, our results show that the absence of Nlgn1 increases the density of slow waves under baseline condition, and that the amplitude and slope of slow waves are increased after sleep deprivation. We concluded that Nlgn1 is required for normal functioning of cortical synchrony especially after sleep deprivation, thereby giving it a key role in sleep homeostasis. Regarding the EphA4 receptor, its absence affects the duration of paradoxal sleep and sigma activity which are known to depend on the circadian process. These results suggest that the EphA4 receptor is an important element in the circadian regulation of sleep. The transcriptional response after sleep deprivation in mice not expressing Nlgn1 or EphA4 is not different from that in wild‐type mice. However, we found that sleep deprivation affects the distribution of specific epigenetic markers like methylation and hydroxymethylation and the expression of molecules regulating these changes is altered in EphA4 null mice. Our observations show that two cell adhesion molecules, Nlgn1 and EphA4 receptor, have an important role in the homeostatic and circadian sleep process and contribute differentially to sleep regulation.

Suite à l’exposition à des facteurs de risque incluant la malnutrition, la dyslipidémie, la sédentarité et les désordres métaboliques, les maladies cardiovasculaires (MCV) sont caractérisées par un état pro-oxydant et pro-inflammatoire, et une dérégulation de l’expression de divers facteurs responsables de l’homéostasie de l’environnement rédox et inflammatoire. L’implication d’enzymes antioxydantes telles que les superoxyde dismutases (SOD) et les glutathion peroxydases (Gpx), ainsi que la contribution de médiateurs pro-inflammatoires tels que l’angiopoietin-like 2 (Angptl2) ont été rapportées dans le cadre des MCV. Toutefois, les mécanismes moléculaires sensibles aux facteurs de risque et menant au développement des MCV sont peu connus. L’épigénétique est un mécanisme de régulation de l’expression génique sensible aux stimuli extracellulaires et pourrait donc contribuer au développement des MCV. La méthylation de l’ADN est un des mécanismes épigénétiques pouvant varier tant de manière gène-spécifique qu’à l’échelle génomique, et la conséquence de tels changements sur l’expression des gènes ciblés dépend du site de méthylation. Puisqu’il a été démontré que des variations au niveau de la méthylation de l’ADN peuvent être associées à divers contextes pathologiques incluant les MCV, le but de nos travaux était d’étudier le lien entre la méthylation de gènes antioxydants et pro-inflammatoires avec leurs répercussions fonctionnelles biologiques en présence de facteurs de risques associés aux MCV, tels que le vieillissement, la dyslipidémie et la sédentarité. Dans la première étude, nous avons observé que dans l’artère fémorale de souris vieillissantes, la méthylation au niveau du promoteur du gène Sod2, codant pour l’enzyme antioxydante superoxyde dismutase de type 2 (SOD2 ou MnSOD), diminue avec l’âge. Ceci serait associé à l’induction de l’expression de MnSOD, renforçant ainsi la défense antioxydante endogène. Le vieillissement étant associé à une accumulation de la production de radicaux libres, nous avons étudié la vasodilatation dépendante de l’endothélium qui est sensible au stress oxydant. Nous avons observé que la capacité vasodilatatrice globale a été maintenue chez les souris âgées, aux dépens d’une diminution des facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium (EDHF) et d’une contribution accentuée de la voie du monoxyde d’azote (NO). Nous avons ensuite utilisé deux approches visant à réduire les niveaux de stress oxydant in vivo, soit la supplémentation avec un antioxydant, la catéchine, et l’exposition chronique à de l’exercice physique volontaire. Ces interventions ont permis de prévenir à la fois les changements au niveau de la fonction endothéliale et de l’hypométhylation de Sod2. Cette première étude démontre donc la sensibilité de la méthylation de l’ADN à l’environnement rédox. Dans la deuxième étude, nous avons démontré une régulation de l’expression de l’enzyme antioxydante glutathion peroxydase 1 (Gpx1) en lien avec la méthylation de son gène codant, Gpx1, dans un contexte de dyslipidémie sévère. Nos résultats démontrent que dans le muscle squelettique de souris transgéniques sévèrement dyslipidémiques (LDLr-/-; hApoB+/+), Gpx1 est hyperméthylé, ce qui diminue l’expression de Gpx1 et affaiblit la défense antioxydante endogène. Chez ces souris, l’exercice physique chronique a permis d’augmenter l’expression de Gpx1 en lien avec une hypométhylation transitoire de son gène. Cette étude démontre que le stress oxydant associé à la dyslipidémie sévère altère les mécanismes de défense antioxydante, en partie via un mécanisme épigénétique. De plus, on observe également que l’exercice physique permet de renverser ces effets et peut induire des changements épigénétiques, mais de manière transitoire. La troisième étude avait pour but d’étudier la régulation de l’Angptl2, une protéine circulante pro-inflammatoire, dans le contexte des MCV. Nous avons observé que chez des patients coronariens, la concentration circulante d’Angptl2 est significativement plus élevée que chez des sujets sains et ce, en lien avec une hypométhylation de son gène, ANGPTL2, mesurée dans les leucocytes circulants. Nous sommes les premiers à démontrer qu’en réponse à l’environnement pro-inflammatoire associé à une MCV, l’expression de l’Angptl2 est stimulée par un mécanisme épigénétique. Nos études ont permis d’identifier des nouvelles régions régulatrices différentiellement méthylées situées dans les gènes impliqués dans la défense antioxydante, soit Sod2 en lien avec le vieillissement et Gpx1 en lien avec la dyslipidémie et l’exercice. Nous avons également démontré un mécanisme de régulation de l’Angptl2 dépendant de la méthylation d’ANGPTL2 et ce, pour la première fois dans un contexte de MCV. Ces observations illustrent la nature dynamique de la régulation épigénétique par la méthylation de l’ADN en réponse aux stimuli environnementaux. Nos études contribuent ainsi à la compréhension et l’identification de mécanismes moléculaires impliqués dans le développement du phénotype pathologique suite à l’exposition aux facteurs de risque, ce qui ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques. / Following exposure to risk factors including malnutrition, dyslipidemia, physical inactivity and metabolic disorders, cardiovascular diseases (CVD) are characterized by a pro-oxidative and pro-inflammatory state, and a dysregulation in the expression of various factors responsible for the redox and inflammatory environment homeostasis. The implication of antioxidant enzymes, such as superoxide dismutases (SOD) and glutathione peroxidases (Gpx), as well as the contribution of pro-inflammatory mediators such as angiopoietin-like 2 (Angptl2) are well characterized in the context of CVD. However, little is known about the molecular mechanisms sensitive to environmental cues leading to the development of CVD. Epigenetics are mechanisms regulating gene expression that are sensitive to extracellular stimuli and could therefore contribute to the pathogenesis of CVD. DNA methylation is an epigenetic mechanism that can vary both at gene and genomic levels; the consequence of these epigenetic changes on the expression of targeted genes is dependent on the methylation site. Since it has been reported that DNA methylation variations can be associated with diverse pathological conditions including CVD, the goal of our work was to study the link between the methylation of antioxidant and pro-inflammatory genes, and their consequences on biological functions in the context of risk factors associated with CVD, such as aging, dyslipidemia and physical inactivity. In the first study, we observed that in the femoral artery of aging mice, the methylation at the promoter of the Sod2 gene, which codes for the antioxidant enzyme superoxide dismutase, type 2 (SOD2 or MnSOD), decreases with age. This suggests an induction of MnSOD expression and thus a strengthening of the endogenous antioxidant defense. Since aging is associated with an accumulation of free radicals, we studied the endothelium-dependant vasodilation, known to be sensitive to oxidative stress. We observed that, overall, vasodilatory capacity was preserved in aging mice, due to a concomitant decrease in endothelium-derived hyperpolarizing factors (EDHF) and an increased contribution of the nitric oxide (NO) pathway. We then used two in vivo oxidative stress-reducing approaches, namely the supplementation with the antioxidant catechin and chronic exposure to voluntary physical exercise. These interventions prevented the changes in endothelial function and the Sod2 hypomethylation-dependent induction of MnSOD expression. Hence, this first study demonstrates the sensitivity of DNA methylation to the redox environment. In the second study, we demonstrated that the antioxidant enzyme glutathione peroxidase 1 (Gpx1) expression was regulated through the methylation of its coding gene, Gpx1, in the context of severe dyslipidemia. Our results show that in the skeletal muscle of severely dyslipidemic transgenic mice (LDLr-/-; hApoB+/+), Gpx1 is hypermethylated, which in turn decreased Gpx1 expression and weakened the endogenous antioxidant defense. In these mice, chronic physical exercise managed to increase Gpx1 expression, an effect linked with a transient gene hypomethylation. This study demonstrates that oxidative stress associated with severe dyslipidemia alters antioxidant defense mechanisms, partially through an epigenetic mechanism. Moreover, we also observed that physical exercise can revert these changes and can induce epigenetic changes, at least transiently. The goal of the third project was to study Angptl2 regulation, a circulating pro-inflammatory protein, in the context of CVD. We observed that, in coronary patients, circulating Angptl2 concentration is significantly increased in conjunction with hypomethylation of its gene, ANGPTL2, measured in circulating leukocytes. We are the first to show that in response to the pro-inflammatory environment associated with a CVD, Angptl2 expression is stimulated by an epigenetic mechanism. In conclusion, our studies allowed the identification of novel regulatory differentially methylated regions located in genes involved in antioxidant defense, namely Sod2, in the context of aging, and Gpx1 in the context of dyslipidemia and exercise. We also revealed, for the first time, an Angptl2 regulating mechanism dependent on ANGPTL2 methylation in a context of CVD. These observations illustrate the dynamic nature of epigenetic regulation through DNA methylation in response to environmental cues. Our studies therefore contribute to the understanding and identification of molecular mechanisms involved in the development of pathological phenotypes following exposure to risk factors, which opens the way to novel therapeutic strategies.