A pesquisa e o uso de produtos naturais como agentes terapêuticos tem crescido muito nos últimos anos. Os diterpenos são os principais constituintes de extratos de plantas que são usadas na medicina popular no tratamento da hipertensão arterial. Diterpenos da classe dos labdanos exercem atividade inibitória sobre a contração vascular e induzem relaxamento desses tecidos. Nesse sentido, o presente estudo foi delineado de forma a investigar os mecanismos envolvidos no efeito cardiovascular do labdano ácido ent-3-acetóxi-labda-8(17),13-dieno-15-óico (labda-15-óico) em ratos. Os resultados mostraram que o labdano exerce seu efeito inibitório máximo sobre a contração vascular induzida pelo KCl após 30 min de incubação. O efeito inibitório do labda-15-óico sobre a contração induzida por KCl foi totalmente revertido 60 e 120 minutos após a remoção do diterpeno das preparações em anéis sem endotélio (E-) e com endotélio (E+), respectivamente. Os valores de Emax para as curvas de fenilefrina e serotonina foram reduzidos na presença do labda-15-óico em anéis de aorta de rato E+ e E-. O labda-15-óico reduziu a contração induzida pelo CaCl2 em anéis E- nas concentrações de 10, 50 e 100 mol/L. O labda-15-óico não alterou a mobilização do Ca2+ intracelular induzida por fenilefrina ou cafeína. O labdano induziu relaxamento em artérias aorta E+ ou E- pré-contraídas com fenilefrina ou KCl. Em anéis de aorta E+ pré-contraídos com fenilefrina, os valores de Emax para o relaxamento foram reduzidos na presença de L-NAME, ODQ, hemoglobina, 7-nitroindazol, Rp-8-Br-Pet, tapsigargina e tetraetilamônio. Por outro lado, indometacina, wortmanin, LY294002, H-89, SQ22,536, atropina e propranolol não afetaram o relaxamento induzido pelo labdano. O labdano aumentou os níveis de nitrato e GMPc em anéis E+, mas não alterou os níveis de AMPc. O composto em estudo elevou ainda, a intensidade de fluorescência emitida por amostras de células endoteliais marcadas com DAF-2DA, indicando um aumento dos níveis de NO citosólico. Além disso, o labda-15-óico (3 mg/Kg) induziu hipotensão em ratos não anesteziados. O L-NAME reduziu a resposta hipotensora induzida pelo labdano. Concluímos que o labdano exerce um efeito vasorelaxante in vitro e hipotensor in vivo. O labda-15-óico age no músculo liso vascular, onde bloqueia canais para Ca2+ sensíveis a voltagem e operados por receptores, levando à redução do influxo de Ca2+ extracelular. A resposta de relaxamento é parcialmente dependente do endotélio onde o labda-15-óico ativa a via de sinalização do NO-GMPc e promove abertura de canais para K+ no músculo liso vascular. Os estudos in vivo confirmam a participação do NO na resposta cardiovascular induzida pelo labda-15-óico. / The research, development and use of natural compounds as therapeutic agents have been increasing in recent years. Diterpenoids are the main constituents of plant extracts that are used in folk medicine for the treatment of hypertension. Labdane-type diterpenes are described to exert antispasmodic and relaxant action in vascular tissues. The present investigation aimed to evaluate the mechanisms (in vitro and in vivo) underlying the cardiovascular effects displayed by the labdane ent-3-acetoxy-labda-8(17),13-dien-15-oic acid (labda-15-oic) in rats. Our findings show that labda-15-oic achieved its maximal inhibitory action on KCl-induced contraction at 30 min. The inhibitory effect on the the contraction induced KCl elicided by labda-15-oic was totally abolished 60 and 120 min after the removal of the labdane from the medium bath in endothelium-denuded (E-) rings and endothelium-intact (E+) rings. The Emax values for phenylephrine and serotonin in E+ and E- rings were reduced in the presence of labda-15-oic. The labda-15-oic inhibited the contraction induced CaCl2 in E- rings at 10, 50 and 100 mol/L. The labdane did not alter the intracellular Ca2+ mobilization induced by phenylephrine or caffeine. The labdane induced relaxation in E+ and E- rings pre-contracted with phenylephrine or KCl. In E+ rings pre-contracted with phenylephrine, labda-15-oic-induced relaxation was reduced in the presence of L-NAME, ODQ, haemoglobin and RP-8-Br-Pet. On the other hand, indomethacin, wortmannin, LY294002, H-89, SQ22,536, atropine, propranolol did not have a significant effect on the relaxation induced by the labdane. The labdane increased the levels of cGMP and nitrate but not cAMP in E+ rings. The compound studied also increased the intensity of fluorescence emitted by samples of endothelial cells labeled with DAF-2DA indicating an increase in the cytosolic levels of NO. Furthermore, labda-15-oic (3 mg/Kg) induced hypotension in unanesthezided rats and this effect was attenuated by L-NAME. Taken together, our results demonstrate that the labdane exerts a vasorelaxant effect in vitro and hypotensive effect in vivo. The labda-15-oic acts on vascular smooth muscle where it blocks Ca2+ influx through interference with both voltage and receptor-operated channels. The relaxant action of the labdane is also partly mediated by the activation of endothelial NO-cGMP pathway and the opening of K+ channels present in vascular smooth muscle. The studies in vivo confirm the role of NO in the cardiovascular response induced labda-15-oic acid.

Introdução: Os distúrbios ácido-básicos são comuns na prática médica e podem variar desde uma acidose ou alcalose simples até um distúrbio misto complexo e potencialmente fatal. A acidose metabólica ocorre por aumento na quantidade de ácidos não-voláteis sob condições como: insuficiência renal, sepse, diabetes grave, diarréia e outras. Há mais de um século tem-se conhecimento de que mudanças no pH promovem alterações no tônus vascular, o que afeta a circulação e controle da pressão sanguínea. Objetivos: 1) estabelecer um modelo eficiente de acidose metabólica crônica (AMC) em ratos; 2) avaliar os parâmetros ventilatórios durante a indução da AMC; 3) investigar os efeitos da AMC sobre a reatividade da aorta de ratos, bem como os mecanismos envolvidos nesta resposta. Metodologia: A AMC foi induzida com cloreto de amônio ad libitum 0,5 M + 0,02M por gavagem, durante 10 dias. Os parâmetros ventilatórios avaliados foram frequência respiratória (fR), volume corrente (Vc) e ventilação pulmonar (VE). No estudo de reatividade vascular foram realizadas curvas dose-resposta para acetilcolina (ACh), fenilefrina (Phe), endotelina 1 (ET-1) e angiotensina II (Ang II), em aorta com e sem endotélio, na ausência e presença do L-NAME. Resultados: A AMC induzida por cloreto de amônio (NH4Cl) reduziu o pH para 7.17 (controle 7.39), com níveis de bicarbonato (HCO3-) próximos a 9.8 mmol/L (controle 21.9 mmol/L). Quanto aos parâmetros ventilatórios, houve um aumento do Vc no segundo dia de tratamento, levando a um aumento na VE. Nos estudos de reatividade vascular, a AMC não alterou a resposta para a ACh e ET-1, entretanto reduziu a vasoconstrição induzida pela Ang II e Phe, sendo a resposta para Phe restaurada na presença de L-NAME. Conclusões: 1) a partir do protocolo empregado foi possível obter um modelo de AMC reprodutível; 2) houve alterações ventilatórias apenas no início do tratamento, associada à redução de pressão parcial de dióxido de carbono (pCO2), embora não significativa, mostrando uma resposta compensatória transitória; 3) o efeito da AMC sobre a reatividade vascular, parece ser agonista-seletiva e o óxido nítrico (NO) está envolvido nessa resposta. / Introduction: The acid-base disorders are common in the medical practice and can vary from an acidosis or simple alkalosis to a mixed, complex and potentially fatal disorder. The metabolic acidosis occurs because of the increase in the quantity of nonvolatile acids under conditions such as kidney disease, sepsis, serious diabetes, diarrhea, and so on. More than one century there is some knowledge that the extracellular pH has promoted changes in the vascular tonus, which affects the circulation and the blood pressure control. Objectives: 1) Develop an efficient model of chronic metabolic acidosis (CMA) in rats; 2) Evaluate the ventilatory parameters during the induction of the CMA; 3) to investigate the effects of the CMA on rat aorta reactivity as well as the mechanisms involved in this response. Methodology: The CMA was induced by NH4CI 0.5M ad libitum + 0.02M by gavage during 10 days. The assessed ventilatory parameters were respiratory frequency (fR), tidal volume (Vt) and pulmonary ventilation (VE). The studies of the vascular reactivity were carried out by dose-response curve to acetylcholine (ACh), phenylephrine (Phe), endotelina1 (ET-1) and angiotensin II (Ang II), in aorta with and without endothelium, in absence and presence of the L-NAME. Results: The acidosis induced by ammonium chloride (NH4Cl) reduced the pH to 7.17 (7.39 control), with levels of bicarbonate (HCO3-) about 9.8 mmol/L (21.9 control mmol/L). As for the ventilatory parameters, there was an increase of the Vt in the second day of the treatment, which lead to an increase in the VE. In the studies of the vascular reactivity, the CMA have not changed the response to the Ach and ET-1, however the vasoconstriction induced by Ang II and Phe were reduced after CMA, and this was restored by L-NAME. Conclusions: 1) From the used protocol, it was possible to obtain a model of reproducible CMA. 2) There were ventilatory alterations only in the beginning of the treatment, associated to the reduction of pCO2, although not significant, which showed a transitory compensatory response. 3) The effect of the CMA on the vascular reactivity seems to be agonist-selective and the nitric oxide (NO) is involved in this response.

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro biológico que tem vital importância em muitos processos fisiológicos, tais como o controle cardiovascular, a sinalização neural e a defesa contra microorganismos e tumores. Sua natureza radicalar lhe confere grande reatividade e versatilidade e torna um desafio o entendimento de sua bioquímica. A molécula de NO reage rapidamente com alguns metais de transição e forma compostos estáveis denominados complexos nitrosilos, os quais podem ser utilizados como fonte geradora de óxido nítrico. Neste caso, faz-se necessário o entendimento do comportamento físico-químico desses compostos. No presente trabalho foram sintetizados os complexos: [RuII(terpy)(L)NO]n+ onde o ligante terpy = 2,2:6,2- terpiridina e L = cloreto (Cl-), 2,2-bipiridina (bpy), benzoquinonadiímina (bdqi-COOH) e benzoquinonadiamina (bdcat-COOH). Os estudos fotoquímicos e farmacológicos desses novos compostos do tipo [RuII(terpy)(L)NO]n+ foram feitos em meio aquoso. Os compostos nitrosilos de rutênio sintetizados mostraram fotolabilização do óxido nítrico (NO) sob irradiação em 355 nm com rendimento quântico de 0,14 0,02, 0,47 0,03 e 0,46 0,02 mol eistein-1 para L = bpy, bdqi-COOH e bdcat-COOH, respectivamente, e 0,0065 0,001 mol eistein-1 para irradiação em 532 nm a partir do complexo [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+. O caminho fotoquímico para irradiação em 355 foi descrito envolvendo diferentes etapas de reação. No entanto, apenas um caminho reacional foi mais bem atribuído para a irradiação em 532 nm, envolvendo o mecanismo de transferência eletrônica fotoinduzida. O efeito de vasodilatador ocasionado pelo NO a partir da irradiação do complexo [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+ na região do visível foi comparado ao nitroprussiato de sódio (NSP). Os resultados foram bastante semelhantes entre ambas as espécies. Similares estudos farmacológicos foram feitos para o complexo [Ru(NO2)(bpy)(terpy)]+ em meio fisiológico e sob irradiação em 355 nm. O mecanismo fotoquímico descrito para tal composto se baseia na formação de dois fotoprodutos, onde (I) há fotoaquação do fragmento RuII-NO2 produzindo as espécies RuII-H2O e NO2- e uma segunda etapa (II) devido à dissociação homolítica do NO a partir do nitrito coordenado, formando as espécie RuII-OH2 e NO. Baseado no mecanismo fotoquímico, o nitro complexo de rutênio foi incorporado a uma microemulsão água óleo (W/O) e utilizada em estudos de vasodilatação muscular. O tempo observado para o máximo de relaxamento muscular promovido pelo complexo [Ru(NO2)((bpy)terpy)]+ foi de 50 minutos. Todos os complexos nitrosilos de rutênio descritos neste trabalho foram avaliados como doadores de NO encapsulados em matrizes sólidas. Os complexos [RuII(terpy)(L)NO]n+ foram encapsulados em matrizes do tipo sol-gel e silicone e submetidos a irradiação na região do ultravioleta (355 nm) e visível (532 nm). Todos as matrizes mostraram se tratar de material amorfo. A microscopia eletrônica de varredura mostrou partículas com formas irregulares, com tamanho de 1000 m para ambas as matrizes e distribuição homogênea. A fotólise das matrizes encapsuladas com complexos nitrosilos de rutênio foram imersas em solução tampão pH = 7,40 e a 37,0 0C. A cinética de liberação de NO a partir desses sistemas mostrou ser do tipo primeira ordem . / Nitric oxide (NO) is a biological messenger. It has been implicated in many physiological processes, including cardiovascular control, neuronal signaling, and defence against microorganism and tumors. Its radicalar nature gives it great reactivity and versatility, and makes the knowledge of its biochemistry a challeng. The NO molecule reacts fast with some transition metal resulting stable compounds named nitrosyl complexes that can be used as nitric oxide producers. For such use, it is necessary a good understanding of the physical-chemical behavior of these complexes. In the present work, the following complexes were synthesized: [RuII(terpy)(L)NO]n+ where terpy = 2,2:6,2 - terpyridine and L = chloride (Cl- ), 2,2 -bipiridine (bpy), benzoquinonediimine (bdqi-COOH) e benzoquinonediamine (bdcat-COOH). The compounds were isolated and characterized by elementary analysis, by spectroscopy (UV-visible, infrared, and fluorescence), HPLC, electrochemical techniques (cyclic and differential pulse voltammetry) and spectroeletrochemistry. Infrared spectroscopy has show band at 1850 cm-1 1960 cm-1 region attributed, to nNO stretching. The oxidation state for benzoquinone ligands were also characterized by this technique and shows band at 1700 cm-1 and 1280 cm-1, for L = bdqi-COOH and bdcat-COOH species, respectively. UV-visible spectra have displayed bands in the ultraviolet region originated by p®p* transition of the unsatured ligands and bands in 350 - 380 nm region characterized as MLTC due dp(RuII)®p*(NO+) transition. The [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+ spectrum has also shown the MLTC band in 510 nm due the dp(RuII)®p*(bdqi-COOH) transition. Electrochemical experiments have revealed two processes in the nitrosyl ligand: NO+/NO0 e NO0/NO-. The different nitrosyl redox potential depends on the inductive effects of ligand L. The complexes were irradiated in a Nd:YAG laser flash photolysis apparatus at ultraviolet (355 nm) and visible (532 nm) irradiation. During the irradiation the NO liberation was measured in situ by amperometry, and the solution spectral change was verified by UV-visible spectroscopy. The amperometric detection was done by a NO sensor electrode (NOmeter), which data were the base to calculate the quantum yields of NO liberation (fNO). For all complexes, fNO were determined in 355 nm light irradiation. The photochemical pathway at 355 nm light irradiation was described as a differents photochemical mechanism. The photochemical mechanism for NO releasing by [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+ complex under 532 nm light irradiation involves an intramolecular photoinduced electron transfer. Biological studies showed that [Ru(bdqi-COOH)(terpy)NO]3+ complex can be considered a promising drug. Their vasodilatation action is similar to sodium nitroprusside (SNP) and cytotoxic action diminishi 74 % for celular viability for metastatic cell.

Os complexos trans-[Ru(NO)(NH3)4(L)](X)3 (1), [Ru(NO)(Hedta)] (2) e seus precursores sintéticos trans-[Ru(H2O)(NH3)4(L)](X)2 (3), trans-[Ru(SO4)(NH3)4(L)](X) (4) , onde L = isn, nic, imN, 4-pic, py, P(OEt) e X = PF6 - e BF4 -, foram testados como captadores dos radicais livres DPPHo, OHo e O2 -o em meio aquoso. O potencial de oxidação do centro metálico nos complexos (1) foram estimados utilizando eletrodo de diamante dopado com boro como eletrodo de trabalho, estando situados em meio aquoso acima de 2,0 V vs. ECS (CH+ = 1,0 x 10-3, µ = 0,1 mol L-1). Os complexos (1) e (2) mostraram-se incapazes de reagir com o radical DPPHo, exceto o complexo trans-[Ru(NO)(NH3)4(P(OEt)3)]3+, que reagiu apenas em grande excesso (50 vezes) em relação ao radical DPPHo. Os complexos (3) reagiram quando em excesso ou em proporção estequiométrica. O mecanismo pelo qual esta reação ocorre é predominantemente o de transferência de elétrons. O radical OHo foi captado pelos complexos (1), sendo provavelmente o mecanismo predominante o de transferência de elétrons pela oxidação do centro metálico [Ru(NO)]3+ a [Ru(NO)]4+, compatível com o potencial de oxidação do radical OHo (acima de 2,8 V vs. ECS) reportado na literatura para este radical. As constantes de velocidade específica para estas reações foram estimadas como estando no intervalo de 108 a 1010 M-1 s-1. Não foi observada reação entre o radical OHo e os complexos (4). Os complexos (1) e (2) captam o radical O2 -o pela redução do ligante NO+ com constantes de velocidade específicas no intervalo de 2,0 ± 1,0 x 104 a 4,2 ± 1,0 x 105 M-1 s-1, em medidas efetuadas via cinética de competição com citocromo c. Após a redução, a liberação de NO foi acompanhada via eletrodo seletivo a NO e espectrofotometricamente pela reação do NO com o citocromo c. Nas condições experimentais utilizadas, não se observou a formação do íon peroxinitrito (ONOO-). Os complexos (3) e (4) não reagiram com o radical O2 -o. / The complexes trans-[Ru(NO)(NH3)4(L)](X)3 (1), [Ru(NO)(Hedta)] (2) and their synthetic precursors trans-[Ru(H2O)(NH3)4(L)](X)2 (3), trans-[Ru(SO4)(NH3)4(L)](X) (4) , where L = isn, nic, imN, 4-pic, py, P(OEt) e X = PF6 - and BF4 -, were tested as scavengers for the radicals DPPHo, OHo e O2 -o in aqueous media. The redox potential for the metal center in the complexes (1) were obtained a using boron doped diamond electrode as working electrode. The redox potentials values for ruthenium nitrosyl complexes were higher than 2,0 V vs. SCE. The complexes (1) and (2) were unable to reduce the radical DPPHo, excepted the complex ion trans-[Ru(NO)(NH3)4(P(OEt)3)]3+. The complexes (3) react with DPPHo in stoichometric proportion. Electron transfer from the oxidation of the ruthenium(II) center seems to be the reaction pathway. The OHo radical reacts with ruthenium nitrosyls, predominantly oxidizing the metal center, yielding the fragment [Ru(NO)]4+. This reaction is exothermic since the redox potential of the OHo is around 2.8 V vs. SCE. From competition kinetics the rate constant for this reaction were estimated in the range of 108 a 1010 M-1 s-1. Since the reaction between OHo radical and the complexes (4) was not observed, the hydrogen atom transfer mechanism for the scavenger of OHo by the nitrosyl complexes ca be ruled out. The complexes (1) and (2) scavenge the radical O2 -o by the reduction of the coordinated nitrosyl with specific rate constants ranging from 2,0 ± 1,0 x 104 to 4,2 ± 1,0 x 105 M-1 s-1 as probed by competitive kinetics using cytochrome c. After reduction, nitric oxide dissociation were probed ampherometricaly using a selective NO electrode or spectrophotometrically using cytochrome c as probe. Reduction of the complexes (3) by superoxide ion was not observed and may suggest the coordinated nitrosonium as the reaction site for reduction.

Sepse é definida como uma resposta inflamatória sistêmica frente a um estímulo infeccioso. Na fase inicial da doença ocorre aumento da secreção de vasopressina (AVP) e na fase tardia observamos uma redução, apesar dos elevados níveis de mediadores inflamatórios e agravamento da hipotensão que são estímulos para a secreção do hormônio. O óxido nítrico (NO), produzido pela enzima óxido nítrico sintase (NOS), parece modular a secreção de AVP dependendo do contexto fisiopatológico. Durante sepse experimental nosso grupo demonstrou que as concentrações plasmáticas de nitrato, que servem como índice da produção de NO, se elevam progressivamente durante a evolução da doença, mas não há evidências de que isto ocorra também a nível central. Nosso objetivo foi avaliar temporalmente a concentração de nitrato no líquido cefalorraquidiano (LCR) e a atividade enzimática das NOS no hipotálamo de ratos submetidos à sepse por ligadura e perfuração cecal (CLP). Os procedimentos, aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do Campus de Ribeirão Preto (CEUA-USP, protocolo nº 10.1.294.53.7), foram realizados com ratos Wistar pesando 250 ± 30 gramas, os quais foram divididos em dois grupos: CLP e operação fictícia (OF). Após 0, 2, 6 e 24 horas das cirurgias, foi feita a coleta do LCR para a determinação da concentração de nitrato pelo método de quimiluminescência NO/ozônio. Imediatamente após os animais foram decapitados para coleta de sangue utilizado para determinação de hematócrito, sódio sérico, proteína, interleucina (IL)-1?, nitrato e AVP plasmáticos. Também foram removidas as neurohipófises para análise do conteúdo de AVP e o hipotálamo para análise da atividade da NOS pelo método da Citrulina. Nos animais sépticos, as concentrações plasmáticas de AVP seguiram o padrão esperado, com aumento em 2h e 6h, retornando a níveis basais em 24h. Os estoques neurohipofisários de AVP reduziram em 2h e 6h retornando a níveis basais em 24h. O sódio sérico e as proteínas plasmáticas diminuíram 2h, 6h e 24h após CLP, e os hematócritos aumentaram nos mesmos períodos. As concentrações plasmáticas de IL-1? e nitrato aumentaram 6h e mantiveram-se elevadas 24h após CLP. Entretanto, no LCR o nitrato aumentou em 6h, mas retornou a níveis basais em 24h. A atividade hipotalâmica das NOS totais e constitutivas eram de 50 a 100 vezes maiores que as das NOS induzidas e aumentaram 6h e 24h após a CLP. Os resultados deste estudo mostram que as atividades das NOS observadas no hipotálamo ex vivo dos ratos sépticos indicam a presença de formas viáveis das enzimas, sendo a isoforma constitutiva a mais relevante para a produção de NO nesta região cerebral. Além disso, as alterações temporais das concentrações de nitrato no LCR diferem da de nitrato plasmático, revelando um perfil diferenciado da produção de NO central em relação à periférica, e que este pode estar relacionado à secreção bifásica de AVP na sepse / Sepsis is defined as a systemic inflammatory response to an infectious stimulus. In the initial phase of the disease the secretion of vasopressin (AVP) is increased and late is observed a reduction, although high levels of inflammatory mediators and worsening of the hypotension, which are stimuli for the hormone secretion. Nitric oxide (NO) produced by the enzyme nitric oxide synthase (NOS), appears to modulate the secretion of AVP depending on the pathophysiological context. During experimental sepsis our group demonstrated that the plasma nitrate concentrations, which serve as an index of NO production, increase gradually during the course of the disease. However, there is no evidence that this also occurs at the central level. Our aim was to evaluate the temporal nitrate concentration in the cerebrospinal fluid (CSF) and the enzymatic activity of NOS in the hypothalamus of rats submitted to sepsis by cecal ligation and puncture (CLP). The procedures, approved by the Ethics Committee on Animal Use of the Campus of Ribeirão Preto (CEUA - USP, Protocol nº10.1.294.53.7) were performed with Wistar rats weighing 250 ± 30 grams, which were divided into two groups: CLP and Sham operation. After 0, 2, 6 and 24 hours of surgery, CSF was collected for determining the nitrate concentration by the chemiluminescence NO/ozone method. Immediately after, the animals were decapitated, blood was collected and used for hematocrit, serum sodium, protein, interleukin (IL)-1?, nitrate and plasma AVP determination. The neurohypophysis was removed for AVP content determinations and hypothalamus for NOS activity analysis by the method of citrulline. In septic animals, plasma concentrations of AVP showed the expected pattern, an increase at 2h and 6h and returning to basal levels at 24h. The AVP neurohypophyseal stocks decreased at 2h and 6h returning to basal levels at 24h. The sodium serum and plasma proteins decreased 2h, 6h and 24h after CLP, and the hematocrit increased at the same periods. The plasma concentration of IL-1? and nitrate increased 6h and remained elevated 24h after CLP. However, in the cerebrospinal, nitrate increased at 6h but returned to basal level in 24h. The total and constitutive NOS activities were fifty to one hundred times higher than inducible NOS and were increased 6h and 24h after CLP. These results suggest that the activity of NOS observed in the hypothalamus ex vivo of rats septic indicates the presence of viable forms of enzymes, and that the constitutive isoform is the most relevant for the NO production in this brain region. Moreover the temporal alterations of the nitrate concentrations in the CSF differ from the plasma nitrate, showing a different profile of the central and peripheral NO production, which may be related to biphasic AVP secretion in the sepsis.

Desde os anos 50 o mercúrio tem chamado a atenção de muitos pesquisadores. No Brasil, a preocupação inicial se restringia à exposição humana pelo seu uso na mineração do ouro. Entretanto, nos últimos anos a atenção de muitos pesquisadores se voltou para outras fontes de exposição, incluindo fontes naturais. Na região Amazônica, os solos são naturalmente ricos em mercúrio. Devido a constante degradação da floresta, o solo se torna mais exposto à ação das chuvas que facilitam a passagem do mercúrio aos rios. Na água o mercúrio sofre um processo de metilação, se transformando em metilmercúrio (MeHg) que se acumula principalmente nos peixes da região. As populações ribeirinhas, que têm sua alimentação baseada no consumo de peixes, são as principais vítimas da exposição a este metal. Muito tem se estudado a respeito dos efeitos tóxicos do metilmercúrio, reconhecido como a forma do mercúrio mais perigosa à saúde humana, devido à alta solubilidade para atravessar barreiras biológicas, capacidade de bioacumulação e elevada meia-vida de eliminação dos tecidos. Dentre os efeitos tóxicos mais documentados do MeHg, encontram-se aqueles relacionados ao sistema nervoso. Entretanto, o sistema cardiovascular tem tomado destaque como um outro alvo a toxicidade do metal. Apesar do número considerável de estudos nesta área, ainda não há um consenso quanto aos mecanismos cardiotóxicos do mercúrio e muitos resultados em estudos clínicos são muito conflitantes. Alguns estudos em ratos sugerem uma relação entre a diminuição de disponibilidade do óxido nítrico (NO), com aumento na exposição ao metilmercúrio. O NO é um componente de extrema importância na fisiologia cardiovascular, porque mantêm o tônus vascular e inibe a agregação plaquetária. Por outro lado, uma dieta rica em peixes e castanhas, comum na região Amazônica, fornece ao organismo quantidades consideráveis de selênio (Se), um nutriente conhecido por propriedades antioxidantes bem como antagonista de efeitos tóxicos de alguns metais, principalmente o mercúrio. Isso sugere que os efeitos danosos do MeHg podem ser minimizados pela presença de selênio na dieta. Neste sentido, o presente estudo avaliou em uma população ribeirinha (n=265), do Rio Tapajós, no Estado do Pará a relação entre as concentrações de mercúrio e selênio em sangue, plasma e cabelo e os níveis de óxido nítrico no plasma. / Since the 1950s, the mercury has attracted attention of many researchers. In Brazil, the initial concern was restricted to human exposure of its use in gold mining. However in the latest years, many researchers have concerned to others exposure sources, including natural sources. In Amazon region, the soils are naturally rich in mercury. Soils become more exposed to rain actions, which provide the passage of mercury to the rivers due to forest degradation. In the water, mercury suffers a methylation process changing to methyl mercury (MeHg), which stores up mainly in the fish of that area. The riverside population, who has a diet based on fish, is the main victims of the exhibition to this metal. The toxic effects of methyl mercury have been studied and this metal is recognized as the most dangerous type of mercury to human health due to the high solubility to cross biological barriers, the capacity of bioaccumulation and the high half-life of elimination from tissues. Among the most studied toxic effects of MeHg, there are those related to the nervous system. However the cardiovascular system has been a highlight as another metal toxicity target. In spite of the large number of studies, there is not an agreement about the cardio toxic mechanisms of mercury and many results in clinical studies are very controversial. Some studies in mice suggest a relationship between the reduction of nitric oxide (NO) and the increase of methyl mercury exposure. Nitric oxide is a very important component in cardiovascular physiology because it maintains the vascular tone and inhibits the platelets aggregation. On the other hand, a diet based on fish and nuts, which are common in Amazon region, provides a large quantity of selenium (Se) to the organism. This nutrient is known by its antioxidant qualities and it is also known as an antagonist of some metal, especially mercury, toxic effects. These facts suggest that the harmful effects of MeHg may be reduced due to the presence of selenium in diet. Therefore, the present study has estimated the relationship among mercury and selenium concentrations in blood, plasma and hair and the nitric oxide levels in plasma, in a riverside population (n=265) of Tapajós River in Pará

A exposição ao estresse induz um aumento dos níveis de óxido nítrico (NO) e glutamato em estruturas do cérebro de ratos, as quais estão relacionadas com o transtorno de depressão maior (DM) em humanos. Ademais, o estresse está diretamente relacionado com o aumento da metilação do DNA, uma alteração epigenética repressiva, no hipocampo de animais. Estudos anteriores demonstraram o efeito tipo antidepressivo dos inibidores da enzima óxido nítrico sintase (NOS) em animais submetidos ao estresse. Porém não se sabe se há uma relação entre o aumento do NO e glutamato induzido pelo estresse e alteração na metilação do DNA em genes relacionado com a patofisiologia da DM. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos dos inibidores da NOS nas alterações comportamentais e nos mecanismos intracelulares relacionado com a metilação do DNA no cérebro de ratos submetidos ao teste do desamparo aprendido (learned helplessness - LH) e em cultura celular do hipocampo desafiadas com NMDA e dexametasona. Métodos: Estudo 1: Cultura primária de células do hipocampo ou cultura imortalizada HiB5 foram desafiadas/estressadas com NMDA (30µM,1h), L-arginina (500µM,1h) e/ou dexametasona (1µM, 1h ou 24h) e pré-tratadas com inibidor seletivo da nNOS (NPA, 100nM, 30min antes do desafio) ou com inibidor da DNMT (5-Aza, 10 µM, 30 min antes do desafio). A expressão dos genes para as enzimas DNMTs, BDNF, NT4, TrkB e nNOS foram avaliadas por RT-qPCR, a expressão proteica das enzimas DNMT3b e nNOS foram avaliadas por western blotting. Estudo 2: Ratos foram submetidos à choques inescapáveis (0,4 mA; 40 choques) na sessão de pré-teste do LH, após sete dias os animais foram submetidos a sessão de teste (choques escapáveis de 0,4 mA). Os animais foram tratados com inibidores da NOS 7-nitroindazole (7-NI;60mg/kg,i.p), aminoguanidina (AMG; 30mg/kg,i.p) ou veículo por 7 dias e submetidos a sessão de teste 1h, após a última injeção. A metilação global foi analisada por imunoensaio (ELISA) e a expressão dos genes DNMT3b, BDNF, nNOS e iNOS foram avaliadas por RT-qPCR, nas estruturas: cortex, hipocampo ventral e hipocampo dorsal. Resultados: Estudo 1: O pré- tratamento com NPA, atenuou o aumento da expressão do mRNA para a enzima DNMT3b, em cultura primária do hipocampo desafiada com NMDA, dexametasona e Larginina, e também em cultura HiB5 desafiada com dexametasona. Porém, o NPA não inibiu a diminuição da expressão do BDNF (exon 1, exon 4 e exon 9), em cultura primária de células do hipocampo desafiadas com NMDA. O pré tratamento com 5-Aza, não inibiu as alterações induzidas pelo NMDA em cultura primária de hipocampo. Estudo 2: Ratos submetidos ao estresse dos choques inescapáveis na sessão de pré-teste apresentaram aumento no número de falhas em escapar dos choques na sessão de teste (desamparo aprendido), um efeito que foi atenuado pelo tratamento com AMG ou 7-NI. Interessantemente, o efeito comportamental do estresse foi acompanhado por aumento nos níveis da metilação global do DNA e DNMT3b no hipocampo ventral (vHPC), que foi atenuado pelos pré-tratamentos com AMG e 7-NI, porém não houve diferença estatisticamente significante no córtex e no hipocampo dorsal dos ratos. Conclusão: Os dados apresentados demonstraram que tanto o estresse (in vivo) quanto o desafio com glicocorticóides, NMDA e L-arginina (in vitro) são capazes de modular a expressão daenzima DNMT3b e a metilação de DNA no hipocampo. O tratamento com inibidores da NOS reduzem os efeitos do estresse in vivo (comportamental e molecular) e in vitro. Em conjunto, os dados sugerem que a liberação de glutamato e NO durante o estresse pode modular a expressão da enzima DNMT3b, levando ao aumento da metilação do DNA em genes relacionados com a resposta de adaptação ao estresse. Essa é a primeira evidência de que o NO pode modular metilação do DNA induzida por estresse. / Stress exposure increases glutamate and nitric oxide (NO) levels, as well as DNA methylation in the hippocampus. However, it is not yet known if there is a causal relationship between these events. Moreover, both nitric oxide synthase (NOS) inhibitors and DNA methylation inhibitors counteract the behavioral effects of stress. Therefore, our aim was to investigate the effects of NOS inhibitors on stress-induced changes on behaviour, DNA methylation and genes expression in the hippocampus of rats submitted to learned helplessness - LH. Moreover, the effects of direct administration of dexamethasone (glucocorticoid), NMDA and L-arginine was investigated in hippocampal cell cultures. Methods: Study 1: Primary hippocampal cell culture was challenged with NMDA (30µM,1h), L-arginine (500µM,1h) or dexamethasone (1µM,24h) and pretreated with nNOS inhibitor (NPA, 100nM, 30min before the challenge) or with DNMT inhibitor (5-Aza, 10 µM, 30 min before the challenge). DNMTs, BDNF, NT4, TrkB and nNOS gene expression was assessed by RT-qPCR. DNMT3b and nNOS levels were assessed by western blotting. Study 2: Rats were submitted to inescapable footshocks and treated with the NOS inhibitors 7-nitroindazole (7-NI; 60 mg/kg, i.p) or aminoguanidine (AMG; 30 mg/kg, i.p], or vehicle for 7 days and tested 1h after the last injection with escapable footshocks. The number of escape failures during the test, global DNA methylation (ELISA) and DNMT3b, BDNF, nNOS and iNOS mRNA expression (RT-qPCR) was evaluated. Results: NPA pretreatment attenuated DNMT3b mRNA expression in hippocampus primary cell culture challenged with NMDA, dexamethasone or L-arginine. Similarly effects were observed in HiB5 cell challenged with dexamethasone. However, NPA pretreatment did not inhibit the decrease of BDNF (exon 1, exon 4 and exon 9) induced by NMDA. Moreover, pretreatment with 5-Aza did not inhibit the decreased of BDNF induced by NMDA in primary cell culture. Study 2: Stress exposure increased the number of escape failures in the test, which was attenuated by treatment with AMG or 7-NI, an antidepressant-like effect. Interestingly, the increased DNA methylation DNMT3b mRNA expression in the ventral hippocampus (vHPC) of stressed rats were also attenuated by treatment with both AMG and 7-NI. Conclusions: NOS inhibitors attenuated stress-induced depressive-like behavior, DNA methylation and DNMT3b mRNA expression in the vHPC. In vitro, selective nNOS inhibition also blocks corticosterone-, NMDA- and L-arginine-induced DNMT3b mRNA expression in hippocampal cell culture. Altogether, our results suggest that glutamate release, leading to NO production during stress may mediate intracellular mechanisms that regulate DNMT3b expression and DNA methylation. This is the first evidence indicating that NO modulates DNA methylation induced by stress.

A melatonina, um derivado da serotonina, é o principal produto da glândula pineal. Pode ser produzida também por diversas células e tecidos extrapineais, como retina, trato gastrointestinal, células do sistema imunológico, entre outros. Nos mamíferos exerce diferentes papéis, sendo que, classicamente, é conhecida por atuar como mediadora química da fase escura. A liberação rítmica desse hormônio para a corrente sanguínea e para o líquido cefalorraquidiano marca o ciclo claro-escuro e as estações do ano para os órgãos internos. Além disso, a melatonina atua como moduladora do sistema imunológico e da inflamação, agente citoprotetora e antioxidante. Os mecanismos de ação também são diversos e variam desde receptores de membrana às interações intracelulares. No presente trabalho mostramos que a melatonina inibe a produção de NO ativado por ACh ou BK em cultura de células granulares de cerebelo. Esses agonistas ativam as NOS constitutivas, que são dependentes do aumento de Ca2+ intracelular. A melatonina também bloqueia o aumento de Ca2+ intracelular induzido por ACh, sugerindo que, o efeito dessa indolamina sobre a produção de NO ativado por ACh é, provavelmente, um efeito sobre o aumento de Ca2+ intracelular. Lipopolissacarídeo da parede de bactéria gram-negativa ativa a transcrição da isoforma induzida NOS. A melatonina inibe a expressão dessa enzima e a produção de NO induzidas pela endotoxina bacteriana. Nossos resultados indicam que esses efeitos são dependentes da inibição da via do fator de transcrição NFKB. Em resumo, o presente trabalho mostra que a melatonina inibe a atividade da NOS constitutiva e a expressão da NOS induzida. Esses efeitos são dependentes de mecanismos específicos e devem estar relacionados às diferentes funções celulares. / Melatonin, a serotonin derivative, is the main product of the pineal gland. Can also be produced by various extra¬pineal sites as retina, gastrointestinal tract, immune cells, among others. In mammals it has different roles, and, classically, is known to act as a chemistry mediator of the darkness. The rhythmic release of this hormone into the blood and cerebrospinal fluid marks the light¬dark cycle and the seasons to the internal organs. Moreover, melatonin acts as a modulator of the immune system and inflammation, a cytoprotective agent and reduces free radicals formation. The mechanisms of action are also diverse and vary from membrane receptors to intracellular interactions. Here we show that melatonin inhibits the production of NO activated by ACh or BK in cultured cerebellar granule cells. These agonists activate constitutive NOS, which are dependent on increased intracellular Ca2+. Melatonin also blocks acetylcholine-induced Ca2+ intracellular increase, suggesting that, this indolamine effects on NO production activated by ACh is, probably, an effect on the increase of intracellular Ca2+. Lipopolysaccharide of gram¬negative bacteria wall activates the transcription of inducible NOS isoform. Melatonin inhibits the enzyme expression and NO production in granule cerebellar cells activated with the bacterial endotoxin. Our data shows that these effects are dependent on inhibition of nuclear factor kappa B pathway. In summary, the present work shows that melatonin inhibits constitutive NOS activity and inducible NOS expression. These effects are dependent on specific mechanisms and should be related to different cellular functions.

Evidências sugerem que os leucotrienos (LTs) e óxido nítrico (NO) podem apresentar um papel na liberação de vasopressina (AVP) que ocorre durante a fase inicial da sepse. Além disso, é conhecido que os LTs afetam a produção de NO. Nosso objetivo foi analisar o efeito do MK-886, um inibidor da síntese de LTs, na produção de NO e na liberação de AVP durante sepse experimental. Ratos Wistar receberam injeções i.p. de MK-886 (1.0, 2.0 ou 4.0mg/kg) ou veículo (DMSO 5%) 1h antes da ligadura e perfuração cecal (CLP) ou operação fictícia. Em um grupo a taxa de sobrevida foi monitorada durante 3 dias. Em outro grupo, os animais foram decapitados em 0, 4 e 24h após CLP ou operação fictícia, e o sangue foi coletado para a determinação da osmolalidade, sódio sérico, hematócrito, proteínas plasmáticas, nitrato sérico e cis-LTs e AVP plasmáticos. Além disso, foi avaliado o recrutamento de neutrófilos para a cavidade peritoneal dos ratos. O CLP aumentou os níveis de nitrato sérico, perda de proteínas, hematócrito e AVP plasmática 4h após a cirurgia, além disso, causou uma mortalidade de 80% após 3 dias de observação. Os níveis de sódio sérico e a osmolalidade apresentaram reduções pequenas, enquanto os níveis de cis-LTs e o recrutamento de neutrófilos permaneceram inalterados. O pré-tratamento com qualquer concentração de MK-886 não diminuiu a produção de nitrato sérico, a perda de proteínas plasmáticas e o hematócrito. Além disso, não alterou os níveis de sódio sérico, osmolalidade, cis-LTs plasmáticos, o recrutamento de neutrófilos e a taxa de sobrevida. Porém, a liberação de AVP foi afetada de uma maneira dose-dependente na fase inicial da sepse. Na fase tardia, a AVP plasmática se manteve em concentrações basais e a administração de MK-886 não alterou essas concentrações. Os resultados sugerem que o MK-886, um inibidor da síntese de leucotrienos, pode afetar a liberação de vasopressina na fase inicial da sepse e esse efeito parece ser independente da produção de óxido nítrico. / Evidence suggests that leukotrienes (LTs) and nitric oxide (NO) may have a role in vasopressin (AVP) release that occurs during the early phase of sepsis. Moreover, LTs are thought to affect NO production. Our objective was to analyze the effect of MK-886, a LTs synthesis inhibitor, on NO production and AVP release. Male Wistar rats received i.p. injections of MK-886 (1.0, 2.0 or 4.0mg/kg) or vehicle (DMSO 5%) 1h before cecal ligation and puncture (CLP) or sham operation. In one group the survival rate was monitored for 3 days. In another group, the animals were decapitated at 0, 4 and 24h after CLP or sham operation, and blood was collected for osmolality, serum sodium, hematocrit, plasma protein, serum nitrate and plasma cys-LTs and AVP levels measurement. Moreover, was evaluated neutrophil recruitment into the peritoneal cavities of rat. CLP increased serum nitrate levels, protein leakage, hematocrit, plasma AVP 4h after CLP, besides causing 80% mortality after 3 days of observation. The serum sodium levels and osmolality presented small reduction, while cys-LT levels and neutrophil recruitment remained unchanged. Pretreatment with any dose of MK-886 did not diminish nitrate production, protein leakage and hematocrit. Besides, not did it alter serum sodium levels, osmolality, plasma cys-LT levels and neutrophil recruitment. It also did not affect survival rate. AVP release was, however, affected in a dose-dependent manner in the early phase of sepsis. In the final phase of sepsis, plasma AVP levels remained basal and the administration of MK-886 did not alter these hormone levels. The results suggest that the MK-886, a LTs synthesis inhibitor, may affect the release of vasopressin in the early phase of sepsis and that this effect seems to be independent of nitric oxide production.

Os comportamentos agonísticos sociais dispostos por animais dominantes e subordinados podem ser notados no paradigma residente intruso. No hipotálamo há o núcleo pré-mamilar ventral (PMv) ligado a um sistema sexualmente dimórfico e relacionado a reprodução e comportamentos agonísticos. A cópula é fundamental para a modulação do comportamento de dominância e aumenta os níveis de CART (Cocaine and Amphetamine Regulated Transcript) no PMv. Animais knockout de Sintase do Óxido Nítrico (NOS) apresentam agressão acentuada. Através da hibridização in situ estudamos a expressão de CART e de NOS nos animais com experiência sexual prévia ao encontro agonístico e sem experiência sexual (naive). No grupo que copulou foi visto aumento na expressão de CART e comportamento diferente do grupo naive visto que buscam a dominância e não apresentam posturas de submissão. Este aumento não foi observado nos níveis de NOS. Sugere-se que a experiência sexual esteja relacionada ao aumento de CART no PMv e possivelmente perda do comportamento subordinado e aumento da busca da dominância. / Aggressive behavior occurs when the interests of one or more individuals conflict. Territory is one of these interests, and the resident intruder paradigm is widely used to observe the expression of social agonistic behaviors. The dominance behavior has been studied under several views and it was shown that it can be raised by the presence of the female, its olfactory clues and by the sexual behavior. In the hypothalamus there is the premammillary ventralis nucleus (PMv) connected to a sexual dimorphic system and related to reproduction and agonistic behaviors. This nucleus was suggested as being involved in the modulation of aggressive behavior, and PMvs neuropeptides can have a direct relation with the expression of those agonistic behaviors. Males exposed to females olfactory clues show an increase in the expression of CART (C Cocaine and Amphetamine Regulated Transcript) in the PMv. Nitric oxide synthase (NOS) knockout animals show increased aggression. In the present investigation, using in situ hybridization we studied the expression of the mRNA of CART and NOS on intruders exposed to the resident-intruder paradigm. Two experimental groups were examined: one with sexual experience before the agonistic encounter and other naïve. It was observed increased expression of CART in the PMv in the sexual-experienced intruder. More, these animals behaved differently from naive intruders, and did not display submissive postures and start searching for dominance. Sexual experienced intruders presented increased expression of CART, but not NOS, mRNA. Thus, suggesting that the sexual experience is related to an increase in CART expression in the PMv and possibly with the lost of submissive behavior and increased search for dominance status.