Orientador: Ione Salgado / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:25:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peixoto_FernandoJoseGondim_D.pdf: 3265287 bytes, checksum: 78fc9ca3914db87dd6ffdb25529eec81 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Em várias espécies de mamíferos o músculo esquelético expressa ¿splicings¿ variantes do mRNA da isoforma neuronal da enzima Óxido Nítrico Sintase (nNOS). O músculo esquelético é composto por uma população de fibras musculares metabolicamente heterogêneas. A distribuição destas fibras no músculo esquelético de eqüinos está correlacionada com aptidão atlética destes animais. Investigamos a expressão da nNOS em músculo esquelético eqüino, e analisamos se esta expressão está relacionada à tipologia muscular e ao estado atlético de cavalos treinados para competições de enduro. Biópsias musculares foram removidas, a uma profundidade de 5 cm, do músculo glúteo médio esquerdo de nove cavalos árabes sedentários e nove treinados para enduro. O homogenato das amostras foi analisado quanto ao conteúdo de cadeias pesadas de miosia (MyHC), segundo sua mobilidade em gel de eletroforese (SDS-PAGE), e quanto à atividade enzimática de síntese de óxido nítrico. Ainda, através de cortes transversais seriados, as amostras foram submetidas a ensaios histoquímicos para as atividades enzimáticas de adenosina trifosfatase da miosina (mATPase) e da nicotinamida adenina dinucleotídeo tetrazólio redutase (NADH-TR). As amostras foram submetidas também a ensaios imunohistoquímicos para a nNOS. Os dados referentes ao conteúdo relativo dos diferentes tipos de fibras musculares e à expressão da nNOS, foram obtidos através de análise em microscopia óptica, enquanto que, os dados referentes ao conteúdo de MyHCs e ao tamanho das fibras musculares foram obtidos através de densitometria e morfometria, respectivamente. Três isoformas de MyHC foram identificadas no músculo glúteo médio esquerdo eqüino, a saber, MyHC I, MyHC IIa e MyHC IIx. Os cavalos pertencentes ao grupo treinado (GT), quando comparados aos do grupo sedentário (GS), apresentaram maior capacidade oxidativa e maior porcentagem das fibras lentas oxidativas (tipo I) e das fibras rápidas oxidativas e glicolíticas (tipo IIA) e menor porcentagem de fibras rápidas glicolíticas (tipo IIX). Os cavalos treinados apresentaram maiores níveis de expressão e atividade da nNOS, quando comparado com os cavalos sedentários. A localização da nNOS em cavalos sedentários se apresentou restrita a áreas subsarcolemais enquanto que em cavalos treinados a nNOS também foi identificada em áreas citoplasmáticas. A nNOS se apresentou heterogeneamente distribuída entre os diferentes tipos de fibras. Sua expressão foi mais alta nas fibras rápidas oxidativas e glicolíticas do tipo IIA do que nas fibras rápidas glicolíticas do tipo IIX e ausentes nas fibras lentas do tipo I. A prática de enduro induziu uma adaptação aeróbia oxidativa, no sentido de rápida para lenta, no músculo esquelético glúteo médio esquerdo de eqüinos e um aumento na expressão da nNOS. Além disto, foi possível demonstrar que a nNOS possui expressão e localização diferenciada no músculo glúteo médio de eqüinos que estão relacionadas com os tipos de fibras musculares e com o estado atlético dos cavalos / Abstract: Skeletal muscle of many mammalian species is known to express variant splicings of the neuronal nitric oxide synthase (nNOS) isoform. Skeletal muscles are composed of a metabolically heterogeneous population of myofibers, and fiber composition in equine skeletal muscle is correlated to their athletic ability in endurance events. In this study we investigated if nNOS is expressed in equine skeletal muscle according to fiber typing and the athletic performance of enduranceraced horses. Biopsy samples from 5 cm depth of the gluteus medius muscle of nine sedentary (SH) and nine endurance trained (TH) horses were examined, for myosin heavy chain (MyHC) electrophoretic mobility and NOS activity and, using serial cross sections, for myosin adenosine triphosphatase and nicotinamide adenine dinucleotide reductase histochemical activities, and also for immunostaining against nNOS. Data about relative content of the various myofiber types and nNOS expression, were obtained by optical microscopy, while data about relative content of MHC and myofiber sizes were collected by densitometry and morphometry, respectively. Three MyHC isoforms, MyHC I, MyHC IIa and MyHC IIx, were identified in the left gluteus medius equine skeletal muscle. Endurance-trained horses presented a higher oxidative capacity and a higher percentage and a larger size of slow-aerobic oxidative (type I) and fast-aerobic oxidative (type IIA) and a lower percentage and size of fast-glycolytic, type IIX fibers when compared with those of the sedentary animals. Trained horses presented higher levels of nNOS expression and activity when compared with that of sedentary ones. nNOS in sedentary horses is restricted to the subsarcolemal area while in endurance-trained animals it is also present in cytoplasmic sites. nNOS is heterogeneously distributed among the different myofibers, its expression is higher in fast-oxidative type IIA, then in the fast-glycolytic type IIX myofiber and is absent in slow-twitch type I fibers. The differences encountered between the two groups of horses constitute an expected alteration in muscular typology resulting from an endurance-training program in equines, what validates our analyses about the effects of endurance training on the nNOS expression in equine skeletal muscle using an experimental model with two independent groups of horses. Endurance training induced a fast to slow (aerobic oxidative) adaptation on gluteus medius equine skeletal muscle and an increase in nNOS expression. In addition, muscular nNOS isoform was differently expressed and localized in myofibers according to the fiber typing and the athletic conditioning of the horses / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T09:06:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_EllenHeidi_M.pdf: 2900050 bytes, checksum: 9d8e25a1489d19ae52348b31bef00046 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: A produção de óxido nítrico (NO) e das interleucinas pró-inflamatórias, IL-Ia, IL-IO e TNF-a, por células aderentes, residentes e/ou elicitadas, proveníentes de camundongos eutímicos da linhagem BALB/c, no decorrer do seu desenvolvimento pós-natal, foi investigada no presente trabalho As células residentes das cavidades peritoneais de camundongos récem-natos (1-15 dias) foram capazes de liberar quantidades elevadas de NO (59,08 + 3,31 µMol/l x 106 céls), quando estimuladas in vitro com LPS+IFN-y. Ao contrário, células peritoneais residentes obtidas de camundongos com idade superior a 30 dias não liberaram quantidades mensuráveis de NO «5IlMol/1 x 106 céls). As células provenientes de camundongos naive com 72 semanas de idade também foram capazes de liberar quantidades mensuráveis de NO após o estímulo com LPS + IFN-y, entretanto em níveis bem inferiores àqueles observados nos camundongos neonatos (7-14 µMol/1 x 106 céls). As células dos animais das demais faixas etárias só foram responsivas ao estímulo in vitro, liberando em média 29,35 + 2,72 IlMol de NO/1 x 106 céls (adulto jovem de 4 a 24 semanas) e 61,04 + 9,01 IlMol de NO/1 x 106 céls (adulto velho de 32 semanas), quando proveníentes de anímais elicitados in vivo com tioglicolato. A produção de NO também foi elevada em camundongos de 15 dias (63,88 + 5,34 JlMol de NO/1 x 106 céls) elicitados in vivo com tioglicolato. Experimentos realizados para verificar se a ausência de produção de NO pelas células não primadas pelo tioglicolato, obtidas de animais com idade superior a 30 dias, se devia às doses de LPS + IFN-y até então empregadas ou ao tempo de coleta após o estímulo não resultaram em uma mudança significativa do perfil anteriormente obtido. Os animais de todas dose de IFNy doses crescentes do lipopolissacáride produziram um aumento nos níveis do gás as idades empregadas responderam de forma dose-dependente aos estímulos utilizados, sendo que o estímulo que parece ter uma influência maior na produção de NO nas idades estudadas é o LPS, tanto nos camundongos previamente elicitados como nos naive, pois para uma mesma liberado. A sintase de óxido nítrico induzível (iNOS) pode ser detectada por Westem blot em lisados obtidos de células residentes e elicitadas de camundongos com até 8 semanas de idade. Nos animais mais velhos testados (32 e 72 semanas de idade) só foi possível a detecção da iNOS em lisados obtidos de células elicitadas pelo tioglicolato. No que se refere a produção de IL-la, foi possível verificar que as células aderentes obtidas de animais jovens e velhos, previamente estimulados com tioglicolato, foram igualmente responsivas ao estímulo empregado in vitro (LPS). Em células residentes, no entanto, observou-se que os níveis dessa citocina foram mais baixos em animais jovens, elevando-se nos animais velhos (72 semanas de idade). Por outro lado, a liberação de TNF -a não pode ser observada em sobrenadantes de quando as células aderentes foram obtidas de cavidades peritoneais previamente estimuladas cultura de células aderentes obtidas de cavidades peritoneais de animais naive de qualquer idade testada. A liberação de TNF -a só pode ser detectada em sobrenadantes de cultura com tioglicolato. Neste caso, os níveis de TNF-a foram baixos (433,8 e 143,10 pglml) em animais neonatos (1 e 2 semanas de idade, repectivamente) e se mostrou de 10 a 15 vezes mais elevada em animais com idade igualou superior a 8 semanas. Células residentes ou elicitadas com tioglicolato, obtidas de animais com idade superior a 8 semanas foram capazes de produzir IL-I0 em níveis detectáveis. Entretanto, as quantidades de IL-IO liberadas por células provenientes de animais previamente elicitados pelo tioglicolato foi 2,5 a 4 vezes menores do que as detectadas em células provenientes de cavidades não elicitadas. De acordo com observações já relatadas na literatura, os resultados ora obtidos sugerem que durante o envelhecimento as células inflamatórias, particularmente os macrófagos, produzem de forma aumentada certos mediadores, tais como o TNF-a, bem como o óxido nítrico / Mestrado / Imunologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Edson Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-24T22:01:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gordo_WladimirMignone_M.pdf: 2864685 bytes, checksum: 6a8bba25e26d953480b7a1efd8200e22 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: Catuama é um fitoterápico amplamente usado pela população brasileira. É constituído por quatro plantas medicinais: Tríchílía catígua (catuaba), Paullínía cupana (guaraná), Ptychopetalum olacoides (muirapuama) e Zinziber offícinalis (gengibre). A Catuama é empregada como medicação tônica em casos de astenias neuromusculares, convalescenças, fraquezas em geral e impotência sexual masculina. O objetivo deste trabalho foi o de investigar o efeito e o mecanismo de ação da Catuama e separadamente os extratos de T. catígua, P. cupana, P. olacoídes e Z. offícínalís em corpo cavernoso isolado de coelho e humano. Os experimentos foram realizados com segmentos de corpo cavernoso de coelhos (1,5 a 2,5 Kg). Após anestesiados (Sagatal, 30-40 mg/Kg, i.v.), o pênis do animal foi retirado, dissecado e perfundido em sistema de cascata com uma solução aquecida e oxigenada de Krebs. Após o período de 60-90 min de estabilização, os tecidos foram pré-contraídos com KCI (40 mM). Os experimentos com corpo cavernoso de humanos foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital das Clínicas da UNICAMP. Os tecidos retirados de cadáveres foram dissecados e montados em um sistema de cascata, conforme descrito acima. A Catuama (1, 3 e 10 mg) causou relaxamentos dose-dependentes dos segmentos de corpo cavernoso de coelho (11 .:t 7%, 26 .:t 5% e 82.:t 9%, respectivamente; n=6), com perfil de relaxamento semelhante àquele induzido pela acetilcolina e gliceriltrinitrato. A infusão de L-NAME (10 µM), inibidor inespecífico da síntese de NO, induziu aumento do tônus dos tecidos e reduziu os relaxamentos de corpo cavernoso de coelho induzidos por acetilcolina (ACh; 0.6 nmol; 72 + 23% antes e 7 + 4% durante a infusão de L-NAME; n=6 p< 0.01), sem afetar aqueles induzidos pela Catuama. De modo similar, a infusão do ODa (1 O µM, n=6), um inibidor potente da atividade de guanilato ciclase solúvel, induziu aumento do tônus dos tecidos e aboliu os relaxamentos de corpo cavernoso de coelho induzidos por acetilcolina e gliceriltrinitrato. Entretanto, o OOQ não modificou o relaxamento induzido pela Catuama (10 mg; 85± 17% antes e 91 ± 17% durante a infusão de 000). A cromacalína (CMK), agonista de canais de potássio ATP-dependentes, causou relaxamento dose-dependente e de longa duração dos segmentos de corpo cavernoso. A infusão do antagonista desta classe de canais de K+, glibenclamida (10µM, n=6), reduziu significativamente os relaxamento induzidos pela CMK (30 nmol; 102 ± 11 % antes e 47 ±8% durante a infusão de glibenclamida, p<0.05) sem afetar aqueles induzidos por ACh. Na concentração utilizada, a glibenclamida não modificou o relaxamento de corpo cavernoso induzido pela Catuama (10 mg; 64± 10% antes e 63 ± 4% durante a infusão de glíbenclamida). O bloqueador de canais de sódio, tetrodotoxina (TTX, 1 µM, n=4) e o antagonista de receptores muscarínicos atropina (1 µM, n=4), não modificaram os relaxamentos induzidos pela Catuama (10 mg; 62 :t 10% antes e 67 :t 14% durante a infusão de TTX) e GTN. Os extratos de P cupana (0.5 - 5 mg), Z. officinalis (1 -10 mg), T. catigua (1 - 10 mg) e P. olacoides (2 - 20 mg) produziram relaxamentos dependentes da dose em corpo cavernoso de coelho que não foram modificados pelo L-NAME (10 µM, n=4). A infusão da nifedipina (10 nM, n=4), um bloqueador de canais de Ca2+ do tipo L, reduziu parcialmente o tônus dos tecidos e inibiu seletivamente os relaxamentos de corpo cavernoso de coelho induzidos pela T. catigua, P. olacoides e Catuama. Os relaxamentos induzidos pela acetilcolina, P. cupana e Z. officinalis não foram significantemente afetados pela nifedipina. Resultados semelhantes, com exceção do P. olacoides, foram observados com outro bloqueador de canais de Ca2+ do tipo L, o verapamil (10 nM). A infusão contínua do extrato de Trichilia catigua (10 mg/ml, n=4) aboliu a contração de corpo cavernoso induzi da pelo Bay-K 8644 (10 nmol; 61 ± 14.4% antes e 8 ±3.1 % durante a infusão da catuaba, p< 0.01). As contrações causadas pela noradrenalina e pelo próprio KCI (0.1 mmol) não foram significantemente afetadas pela infusão de Trichilia catigua. Em corpo cavernoso humano, a Catuama (1, 3 e 10 mg) causou relaxamentos dose-dependentes (15 ± 10%, 37 ± 18% e58 ± 29%, respectivamente; n=14) com perfil de relaxamento semelhante aquele induzido pela ACh (0.6 nmol) e GTN (1.3 nmol). A infusão de L-NAME (3 µM, n=4) induziu aumento do tônus dos tecidos e reduziu marcantemente o relaxamento de corpo cavernoso induzido pela ACh. Com relação ao Catuama, notamos que o L-NAME causou pequena, porém significativa, redução no relaxamento. O ensaio dos componentes de P. cupana (1.5 mg), Z. offícínalís (3 mg), T. catígua (10 mg) e P. olacoídes (10 mg) revelou que todos foram capazes de produzir relaxamentos significantes dos segmentos de corpo cavernoso humano. A infusão de L-NAME (3 IJM; n=4) reduziu parcialmente os relaxamentos induzidos pelos extratos de P. cupana, Z. offícínalís, T. catígua e P. olacoídes. A incubação do homogenato de corpo cavernoso isolado de coelho com o inibidor da fosfodiesterase (+IBMX; n=8), causou um aumento da ordem de 600 % dos níveis de AMPc. Com relação ao extrato de P. cupana, notamos um aumento dos níveis de AMPc não relacionado à concentração empregada, e menor do que aquele produzido pelo IBMX. Os outros extratos não modificaram os níveis de AMPc em relação ao controle, mesmo em concentrações elevadas (100 mg/ml). Isto indica que o mecanismo de relaxamento de corpo cavernoso isolado de coelho causado pela Catuama e seus componentes não indica ser através da inibição da fosfodieserase. Podemos concluir que, em tecido de. coelho, as respostas relaxantes causadas pela Catuama e seus componentes, não estão diretamente envolvidas com a liberação de NO. Em tecido isolado de' humano, o NO demonstra estar associado ao mecanismo de relaxamento desses compostos. Investigações futuras serão necessárias para o esclarecimento completo do mecanismo de relaxamento induzido pela Catuama e componentes, em coelhos e humanos / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências

Orientador: Sara T. O. Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-24T22:00:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brandao_MarceloMendes_M.pdf: 4459742 bytes, checksum: 267017db4dd878d082fc176c9f549218 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Oncogenes são genes que afetam o crescimento e desenvolvimento celular normal. A maioria dos oncogenes se constitui de formas modificadas de genes normais, denominados de protoncogenes. o protoncogene RAS, encontrado em diversos organismos, codifica uma proteína com atividade de ligação à Guanina trifosfato (GTP) normal, sem atividade de GTPase. O gene RAS mutante é encontrado em muitos seres humanos com cânceres do pulmão, cólon e pâncreas; o produto deste gene mutante é responsável pela divisão incontrolada de células cancerosas. O óxido nítrico é uma importante molécula sinalizadora sintetizada em diversos tecidos humanos, por proteínas codificadas em uma família de genes da NO sintase . A produção de NOS pode ser induzida por diversas substâncias tais como, endotoxinas, citocinas, lipopolissacarídeos bacterianos (LPS) e por 1a-interleucina. O NO ativa a p21ras em células T humanas, como pode ser observado pelo aumento da ligação GTP-p21ras.Recentemente, um grupo de pesquisadores identificou o sítio de interação entre NO e p21ras que é responsável pela iniciação da transmissão do sinal. O presente trabalho teve como objetivo analisar a interação do NO com a proteína p21RAS em células de linhagens leucêmicas mielóide (U937, HL60 e K562) e estudar a expressão do RAS e da iNOS em pacientes com Leucemia Mielóide Aguda.Linhagens leucêmicas foram incubadas com o lipopolissacarídeo (LPS) e interferon y (IFNy) indutores da NO sintase. A expressão da iNOS e do RAS foi analisada através de imunocitoquímica, western blotting e citometria de fluxo. Para se confirmar o aumento da atividade do RAS foi analisada a fosforilação das MAPK p42/44. A dosagem de NO dissolvido no meio foi feita utilizando-se o reagente de Griess. Analisando os resultados obtidos foi possível chegar às seguintes conclusões: 1. Células de leucemia mielóide aguda apresentam superexpressão de iNOS. 2. O aumento da expressão da iNOS, em pacientes com LMA, é independente da p21 RAS. 3. Em linhagens leucêmicas com mutação no N-RAS houve maior - expressão da iNOS em condições basais e redução do NO após estímulo com LPS. 4. As linhagens leucêmicas K562, U937 e HL60 apresentam uma iNOS insensível à estimulação por LPS e IFNy, nos tempos e concentrações apresentadas. 5. A linhagem K562 possui RAS susceptível a aumento da sua expressão por estímulos de LPS e LPS + IFNy nos tempos e concentrações apresentadas / Abstract: Oncogenes are genes which affect the normal cellular growth and development. Most oncogenes are derived from normal genes, called protoncogenes. The protoncogene RAS, found in various organisms, codify a guanine triphophate linkage protein, without GTPase activity. The RAS mutant is found in some cancers as lung, breast and colon cancer. Nitric Oxide is an important signaling molecule synthesized, in many different human tissues, by a family of three Nitric Oxide Synthases. The NOS can be induced by addition of Human recombinant Interferon (lFN y), endotoxins, cytocins and bacterial Lipopolissacharide (LPS). Nitric Oxide can activate the RAS in Human T cells, by increasing GTP-p21ras ratio. Recently,the interactionsite was found on CYS 118 on the p21 molecule. The aim of the present study was to analyze the interaction between p21 and nitric oxide in myeloid leukemia cell lines (K562, HL60, and U937 and the expression of RAS and iNOS in human acute myeloid leukemia (AML). The main conclusions reached by this study were that AML cells overexpress iNOS, and this is independent of p21ras.Cultured cells with NRAS mutation express higher iNOS amo~nts, and decrease the NO amount when stimulated with LPS plus IFN. At ali incubation times and ali LPS and IFN concentrations, iNOS was insensible in culture cells. The K562 RAS are 68 liable to increase it's expression by stimulation with LPS and LPS+IFNy treatment at ali times and concentrations shown / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Ione Salgado Martins / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T00:42:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RibeiroJunior_EuripedesdeAlmeida_M.pdf: 4498986 bytes, checksum: 206d68ecc6ad1f49c3fac46ee5088b4d (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo:A enzima óxido nítrico sintase (NOS) é responsável pela síntese de óxido nítrico (NO) através da oxidação da L-arginina a L-citrulina. Esta enzima é encontrada amplamente distribuída na natureza. No reino animal, as isoformas de NOS constitutivamente expressas são freqüentemente Ca2+ -dependentes e envolvidas em processos fisiológicos enquanto que isoformas de NOS Ca2+-independentes são normalmente induzidas a produzir grandes quantidades de NO em situações patológicas. Evidências da existência de uma via endógena para a síntese de NO no reino vegetal tem surgido nos anos recentes. No presente trabalho investigou-se a presença da NOS em algumas espécies vegetais, avaliando-se a reação cruzada de anticorpos produzidos contra NOS de macrófagos de camundongos e de cérebro de rato com extratos de diferentes tecidos vegetais, e também medindo-se a atividade NOS pela produção de L-[U-14C]-citrulina a partir de L-[U-14C]-arginina. Anticorpos contra NOS de macrófagos e NOS de cérebro detectaram uma proteína de aproximadamente166 kDa em ensaios de Western blot com extratos citossólicos de ápices radiculares e folhas jovens de plântulas de milho. A imunolocalização, usando anticorpos contra NOS de macrófagos conjugados com isotiocianato de fIuoresceína, revelou esta proteína no citosol das células na zona de divisão bem como no núcleo das células da zona de elongação de ápices radiculares de milho. Os extratos citossólicos de ápices radiculares e folhas jovens de milho apresentaram atividade NOS Ca2+ -dependente, medida pela sensibilidade aos inibidores da NOS, como L-NAME, L-NMMA, L-NNA e aminoguanidina. Estes resultados sugerem a existência de uma enzima NOS constitutiva nestes tecidos de milho e que a localização subcelular desta proteína depende da fase de crescimento celular. Extratos citossólicos derivados de cultura de células de laranja também apresentaram reação cruzada com anticorpos produzidos contra NOS de macrófagos e cérebro. Os extratos citossólicos derivados da região dos pêlos absorventes de raízes de milho apresentaram atividade NOS muito maior, comparada com os ápices radiculares e as folhas jovens. Esta atividade se mostrou Ca2+ -independente, sugerindo a existência de uma isoforma induzida nesta zona da raiz. Uma atividade NOS Ca2+ -independente também foi detectada em células mãe de grãos-de-pólen de café em diferentes estágios de divisão meiótica sugerindo um papel para esta enzima no processo de microsporogênese de café. O conjunto de resultados indica a existência, em vegetais, de diferentes isoformas de uma enzima do tipo NOS que pode ter um importante papel no controle do crescimento e na diferenciação celular / Abstract: The enzyme nitric oxide synthase (NOS) is responsible for the synthesis of nitric oxide (NO), from the oxidation of L-arginine to L-citrulline. This enzyme has been found largely distributed in nature. In the animal kingdom, the NOS isoforms constitutively expressed are frequently Ca2+ -dependent and involved in physiological processes while Ca2+ -independent NOS isoforms are normally induced to produce large amounts of NO under pathological situations. Evidences for the existence of an endogenous pathway for NO synthesis in the plant kingdom has emerged in recent years. In the present work we investigate the presence of NOS in some plant species, by checking the ability of antibodies raised against mouse macrophage NOS and rabbit brain NOS cross-react with Iysates prepared from different plant tissues and also measured NOS activity, by L- [U_14C]-citrulline production from L-[U-14C]-arginine. Antibodies against macrophage NOS and brain NOS detected a protein of about 166 kDa in Western blot assays of cytosolic fractions of root tips and young leaves of maize seedlings. Immunochemical localization, using antibodies against macrophage NOS, conjugated with fluorescein isothiocyanate, revealed this protein in the cytosol of the cells at division zone as well as in the nucleus of the cells at the elongation zone of maize root tips. Cytosolic fractions of maize root tips and young leaves presented a2+-dependent NOS activity, as measured by the sensitivity to NOS inhibitors, such as, L NAME, L-NMMA, L-NNA and aminoguanidine. These results suggest the existence of a constitutive NOS enzyme in these maize tissues with the subcellular localization of this protein depending on the phase of 0011 growth. Cytosolic fraction derived from orange cells in culture also presented cross-immunoreactivity with antibodies raised against macrophage and brain NOS. Cytosolic fraction derived from the maize root hair zone presented a much higher NOS activity compared to root tips and young leaves and this activity was shown to be Ca2+ -independent, suggesting the existence of an inducible isoform in this root zone. A Ca2+ -independent NOS activity was also detected in coffee pollen mother cells in different stages of meiotic division suggesting a role for this enzyme in the process of microsporogenesis of coffee. The overall results indicate the existence, in plants, of different NOS-like enzyme isoforms, that may have important role in the control of cell growth and differentiation / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Stephen Hyslo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T18:20:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Linardi_Alessandra_D.pdf: 15128970 bytes, checksum: 4be731ddc0db6384f8f9441ec592a817 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: As peptidases desempenham um papel importante na modulação da atividade de peptídeos endógenos em situações normais e patológicas. Neste trabalho, investigamos a atividade e expressão de quatro peptidases (aminopeptidase M- APM, dipeptidil peptidase IV - DPP IV, endopeptidase neutra - NEP 24.11 e metaloendopeptidase 24.15 - MEP 24.15) em tecidos (aorta, cérebro, coração, fígado, pulmão e rim) de ratos em dois modelos de hipertensão: a hipertensão induzida pelo tratamento crônico de ratos com NliJ-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), um inibidor da biossíntese de óxido nítrico (NO), e em ratos espontaneamente hipertensos (SHR). A atividade enzimática foi avaliada por ensaios enzimáticos fluorométricos ou colorimétricos enquanto a expressão foi avaliadapor westernblotting.Em ratos tratadoscom L-NAME(80 mg kg-1day-1, p.o., durante 4 semanas), não houve alteração na atividade das quatro peptidases estudas em cérebro, coração, fígado, pulmão e rim (a NEP 24.11 foi detectada apenas no pulmão e rim). Entretanto, na aorta torácica, a atividade da APM mostrou um pequeno decréscimo enquanto as atividades da DPP IV e MEP 24.15 foram significativamente aumentadas. A expressão de DPP IV e MEP 24.15 também foi aumentada pelo tratamento com L-NAME.As atividades da MEP 24.15 recombinante ou DPP IV renal não foram afetadas pela incubação com L-NAME (1-100 fJM)ou nitroprussiato de sódio e 3-morfolinosidnonimina (1-100 fJM cada), ambos doadores de NO. A administração de N-[1-(R,S)-carboxi-3-fenilpropil]-Ala- Aib-Tyr-p-aminobenzoato (JA2), um inibidor de MEP 24.15/MEP 24.16, em ratos anestesiados com pentobarbital sódico aumentou a resposta hipotensora da bradicinina. No modelo SHR, a atividade da DPP IV foi aumentada no cérebro, enquanto que as atividades da MEP 24.15 e NEP 24.11 foram aumentadas no pulmão (MEP 24.15 e NEP 24.11) e rim (NEP 24.11). Por outro lado, as atividades da DPP IV e MEP 24.15 foram reduzidas na aorta torácica; a APM foi inalterada e a NEP 24.11 não foi detectada neste tecido. Western blotting para DPP IV e MEP 24.15 mostrou redução correspondente na expressão de ambas as enzimas na aorta e um aumento para DPP IV no cérebro; não houve alteração na expressão da MEP 24.15 no pulmão e nem da NEP 24.11 no pulmão ou rim. A administração do JA2 em SHR não alterou as respostas à bradicinina. Estes resultados indicam que há alterações na atividade e expressão das peptidases estudadas (exceto APM) nos dois modelos de hipertensão. Entretanto, a variabilidade nestas alterações entre os dois modelos sugere que a hipertensão per se não é a causa principal destas diferenças, mas que provavelmente resultam de alterações bioquímicas associadas a cada modelo e seletivas para cada peptidase / Abstract: Peptidases play an important role in modulating the activity of endogenous peptides in normal and pathological situations. In this work, we investigated the activity and expression of four peptidases (aminopeptidase M - APM, dipeptidyl peptidase IV - DPP IV, metalloendopeptidase 24.15 - MEP 24.15 and neutral endopeptidase 24.11 - NEP 24.11) in rat tissues (aorta, brain, heart, kidney, liver and lung) in two models of hypertension, namely, chronic treatment with NlV-nitro-Larginine methyl ester (L-NAME), a nitric oxide (NO) synthase inhibitor (80 mg kg-1 dai1, p.o. for 4 weeks), and spontaneously hypertensive rats (SHR). Enzymatic activity was assayed fluorometrically or colorimetrically and protein expression was assessed by westem blotting. Treatment with L-NAME did not significantly alter the activities of the four peptidases in brain, heart, kidney, liver and lung (NEP was detected only in kidney and lung). In contrast, in thoracic aorta, the activity of APM was slightly but significantly reduced whereas those of DPP IV and MEP 24.15 were markedly enhanced. Immunoblotting for DPP IV and MEP 24.15 showed increased expression in aortic tissue. Neither L-NAME (1-100 J.lM)nor the NO donors sodium nitroprusside and 3-morpholinosydnonimine (1-100 J.lMeach) had any consistent effect on the activity of recombinant MEP 24.15 or renal DPP IV. Administration of the MEP 24.15/MEP 24.16 inhibitor N-[1-(R,S)-carboXy-3- phenylpropyl]-Ala-Aib-Tyr-p-aminobenzoate (JA2) in pentobartibal-anesthetized rats significantly potentiated the hypotensive response to bradykinin. In SHR, the activity of DPP IV was significantly increased in brain, whereas MEP 24.15 and NEP 24.11 activities were markedly enhanced in lung (MEP 24.15 and NEP 24.11) and kidney (NEP 24.11). In contrast, the activities of DPP IV and MEP 24.15 were markedly decreased in aortic tissue; APM was unaltered and NEP 24.11 was not detected in this tissue. Immunoblotting for DPP IV and MEP 24.15 showed decreased expression in aortic tissue and increased expression of DPP IV in the brain; there was no alteration in the expression of MEP 24.15 in the lung or of NEP 24.11 in kidney and lung. The administration of JA2 to SHR did not alter the responses to bradykinin. These results indicate that there were alterations in the activity and expression of the peptidases studied (except for APM) in both models of hypertension. However, the different patterns of afterations seen between the two models suggests that the changes were not caused by the hypertension per se, but rather were probably the result of biochemical alterations associated with each model and selective for each peptidase / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Orientador: Marcelo Ganzarolli de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:23:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Shishido_SilviaMika_D.pdf: 6680220 bytes, checksum: 367ab124d58a6b15940de6af9bab920e (MD5) Previous issue date: 2003 / Doutorado

Orientador: Roberto Zatz / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-19T10:15:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mattar_AnaLucia_M.pdf: 2393120 bytes, checksum: b64cd0e105b28dec04542d0e6574cdd9 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: Nós examinamos a hipótese de que o óxido nítrico (NO) possa mediar a hiperfiltração do diabetes mellitus experimental. Foram utilizados no estudo 75 ratos Munich-wistar machos tomados diabéticos por estreptozotocina e 39 ratos controles não diabéticos que foram distribuídos em 4 grupos: C, controles normais; C+NAME, controles que receberam o inibidor do NO, N-nitro-metil-éster-L-argjnina (L-NAME). 40 mg/dl dissolvido em água; DM, ratos diabéticos; DM+NAME, ratos diabéticos que receberam L-NAME, 15 mg/dl dissolvidos em água. Depois de 1 mês de tratamento, o L-NAME aumentou a pressão arterial nos grupos C+NAME e DM+NAME e preveniu a hiperfiltração e a hiperperfusão renal no grupo DM+NAME. A administração aguda de L-NAME, 2,5 mg/kg, aumentou a pressão arterial, normalizou o RFG e promoveu vasoconstrição muito mais acentuada no grupo DM que no grupo C. A administração de endotelina I (600ng/kg em bôlus) ou de angiotensina II (25 g/kg/min em infusão contínua) resultou em efeitos similares na hemodinâmica renal tanto no grupo C quanto no grupo DM, sugerindo que a resposta aumetada pela infusão aguda de L-NAME no grupo DM reflete uma sensibilidade específica dos animais diabéticos a inibição do NO. A excreção urinária de nitratos e nitritos foi 4 vezes maior em DM comparado com C. Estes resultados são consistentes com a hipótese de que a produção aumentada de NO pode estar mediando a hiperperfusão e a hiperfiltração glomerulares no diabestes / Abstract: We examined the hypothesis that nitric oxide (NO) could mediate hyperfiltration in experimental diabetes. Thirty-five adult male Munich-Wistar rats with streptozoc it 1 - induced diabetes and 39 nondiahetic controls were distributed among 4 groups: C. normal controls: C + LNAME. controls receiving the NO inhibitor Nw-mtro-L-arginine methyl ester (L-NAME), 40 mg/di in drinking water; DM- diabetic rats; DM + LNAME. diabetic rats receiving L-NAME. 15 mg/dl in drinking water. After I month of treatment. L-NAME raised blood pressure in Groups C + LNAME and DM + LNAME and prevented renal hyperfiltration and hyperperfusion in Group DM-f LNAME. Acute administration of L-NAME, 2.5 rag/kg, raised blood pressure, depressed GFR and promoted renal vasoconstrition to a much greater extent in Group DM than in Group C. Acute administration of endothelin 1 (600 ng/kg in bolus) or angiotensin II (25 /.tg/kg/mm continuous infusion) exerted similar renal hemodynamic effects in Groups C and. DM, suggesting that the enhanced effect of acute L-NAME in DM reflected a specific sensitivity of DM to NO inhibition. Urinary excretion of nitrates and nitrites was fourfold higher in DM compared to C. These results support the notion that augmented NO production may mediate renal hyperfiltration and hyperperfusion in diabetes / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Doctor en Farmacología / Dexmedetomidina (Dex) es un agonista alfa2 adrenérgico altamente selectivo utilizado como coadyuvante en anestesia. Se ha descrito que además de su efecto sedante, Dex pre-condiciona el corazón frente a isquemia-reperfusión (IR). Sin embargo, no se ha establecido con claridad el mecanismo farmacológico implicado en la protección miocárdica con Dex y si este mecanismo se lleva a cabo de forma directa o indirecta en el cardiomiocito. El endotelio y la vía óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS)/óxido nítrico (NO)/ proteína kinasa dependiente de GMP cíclico (PKG) han sido descritos como factores clave para disminuir el daño por reperfusión. Los objetivos de este trabajo se enfocaron en estudiar si la vía eNOS/NO/PKG es responsable del efecto cardioprotector inducido por Dex y si este pre-condicionamiento en el cardiomiocito requiere la presencia del endotelio. Para evaluar esto, se utilizaron corazones aislados de rata en sistema Langendorff y fueron tratados con Dex (10 nM) durante 25 min y se determinó la formación de dímeros de eNOS y la producción de NO. Posteriormente, los corazones fueron sometidos a 30 min de isquemia global y 120 min de reperfusión. Además, la participación de la vía eNOS/NO/PKG fue evaluada. Dex indujo la activación de eNOS y generación de NO. Asimismo, Dex disminuyó el tamaño de infarto (16 ±10%) en comparación a los corazones no tratados y sometidos a IR (42 ± 12%) y mejoró los parámetros funcionales del ventrículo izquierdo al final de la reperfusión, pero este efecto se revirtió cuando Dex fue co-administrada con los inhibidores de la vía eNOS/NO/PKG. Además, Dex no redujo la muerte celular en cardiomiocitos de rata adulta sometidas a IR simulada (sIR) (65 ± 8%) en comparación a las células control (63 ± 8%). Sin embargo, Dex disminuyó la muerte celular co-cultivando cardiomiocitos con células endoteliales pre-tratadas con Dex (39 ± 6 %). Por lo tanto, los resultados sugieren que Dex induce su efecto precondicionante cardíaco activando la vía eNOS/NO/PKG y este efecto farmacológico requiere la interacción del cardiomiocito con el endotelio / Dexmedetomidine (Dex) is a highly selective alpha2 adrenergic receptor agonist used as a coadjutant in anesthesia. It has been described that Dex acts not only as a sedative, but it can also pre-condition the heart against ischemia-reperfusion (IR). However, the pharmacological mechanisms that mediate the myocardial protection with Dex and whether this action happens directly or indirectly on the cardiomyocyte, remains to be fully elucidated. The endothelium and the nitric oxide synthase (eNOS)/nitric oxide (NO)/cyclic GMP dependent kinase (PKG) pathway have been described as key factors to reduce reperfusion injury. The aims of this work are focused on studying if the eNOS/NO/PKG pathway is responsible for the cardioprotection induced by Dex and whether this pre-conditioning happens directly on the cardiomyocyte or requires the presence of the endothelium. To evaluate this, isolated rat hearts using the Langendorff system were treated for 25 min with Dex 10 nM and the formation of eNOS dimers and production of NO was assessed. Then, the hearts were subjected to 30 min of global ischemia, followed by 120 min of reperfusion. Also, the role of the eNOS/NO/PKG was studied. Dex triggered the activation of eNOS and generation of NO. Moreover, Dex reduced the infarct size (16 ±10%) compared to untreated hearts (42 ± 12%) and improved the functional parameters of the left ventricle at the end of reperfusion, but this effect was reversed when Dex was co-administered with the eNOS/NO/PKG inhibitors. Also, Dex did not reduced cell death on adult rat cardiomyocytes subjected to simulated IR (sIR) (65 ± 8%) compared to control cells (63 ± 8%). However, Dex reduced cell death when cardiomyocytes were co-cultured with endothelial cells pre-treated with Dex (39 ± 6 %). Therefore, our results suggest that Dex induces its cardiac pre-conditioning effect activating the eNOS/NO/PKG pathway and this pharmacological effect requires the interaction between the cardiomyocyte and the endothelium / Conicyt; Fondecyt; Fondap

GIRÃO, Virgínia Claúdia Carneiro. Participação do óxido nítrico (NO) na modulação central da hiperalgesia na artrite induzida por zymosan (AZy) em ratos. 2006. 112 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2006. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-10-18T12:46:38Z No. of bitstreams: 1 2006_tese_vccgirão.pdf: 737933 bytes, checksum: 3ae0404d5f4a11e61714d21689e40a34 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2012-10-22T12:11:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_tese_vccgirão.pdf: 737933 bytes, checksum: 3ae0404d5f4a11e61714d21689e40a34 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-22T12:11:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_tese_vccgirão.pdf: 737933 bytes, checksum: 3ae0404d5f4a11e61714d21689e40a34 (MD5) Previous issue date: 2006 / We investigate in this work the role of the central nervous system in the modulation of the inflammatory peripheral pain in the zymosan induced arthritis (AZy) in rats. Cerebrospinal fluid (CSF) and sinovial fluid were collected from animals at different AZy times (1, 3, 6, 12 and 14 hours) in order to determine the nitrite level. Different groups of male, Wistar rats (n=6), 250 to 300g weight, were then submitted to surgery in order to place a cannula in the subarachnoid space, to allow for intrathecal (i.t) insertion of substances. The animals were also submitted to AZy followed by the paw suspension test (PST) that measures articular incapacitation (AI), aiming to analyze hyperalgesia in this experimental model. The pharmacological modulation was achieved by the prophylactic or therapeutic i.t administration of a NO donor (SIN-1), NOS inhibitors (L-NAME, 1400W), a soluble Guanylate cyclase inhibitor (ODQ), a GMPc analogue (8-Bromo-GMPc) and an NMDA receptor antagonist (MK-801). The ODQ was also administered intraarticulary to one group of animals. The results are expressed as mean ± s.e.m, followed by ANOVA and the Tukey test, comparing to the groups that received the vehicle. The levels of nitrite in the CSF were smaller at 1 and 3 hours after zymosan injection, as compared with basal levels (P<0.05). The surgical procedure did not alter hyperalgesia. SIN-1 i.t (10 mcg) reduced the AI, while 40mcg increased the AI (P<0.05). L-NAME or 1400W, prophylactic or therapeutic, reduced the AI (P<0.05). ODQ i.t, prophylactic, but not therapeutic, reduced the AI, and also reverted the AI promoted by the 40mcg of SIN-1. Besides, ODQ, intraarticulary, reverted the AI promoted by the 40mcg of SIN-1, administered i.t. MK-801 i.t inhibited the AI, both caused by AZy and by the 40mcg of SIN-1. The results suggest a central endogenous anti-nociceptive role of NO in the acute articular hyperalgesia of the AZy. The NO, depending on the dose and local where it acts, may present an anti-nociceptive or pro-nociceptive effect in the AZy, both due to the activation of GMPc and the excitation of NMDA receptors. We have shown, for the first time, the existence of a peripheral-central activation way modulating the articular hyperalgesia in the AZy acute phase. / Nesse trabalho, investigamos a participação do sistema nervoso central (SNC) na modulação da dor inflamatória periférica na artrite induzida por zymosan (AZy) em ratos. Coletou-se o líquor (LCR) e lavado articular dos animais em diferentes tempos de artrite (1, 3, 6, 12 e 24 horas) para a determinação dos níveis de nitrito. Em seguida, diferentes grupos de ratos (n=6) machos, Wistar, pesando entre 250 300g, foram submetidos ao procedimento cirúrgico para colocação de uma cânula no espaço subaracnóideo, para permitir a administração intratecal (i.t) de substâncias. Os animais foram também submetidos à artrite induzida por zymosan (AZy) seguida da realização do teste de suspensão da pata (TSP) para permitir a avaliação da incapacitação articular (IA), refletindo a hiperalgesia no modelo. A modulação farmacológica foi realizada através da administração i.t, de forma profilática ou terapêutica, de um doador de NO (SIN-1), de inibidores de NOS (L-NAME, 1400W), de um inibidor da guanilato ciclase solúvel (ODQ), de um análogo do GMPc (8-Bromo-GMPc) e de um antagonista dos receptores NMDA (MK-801). Em um grupo, o ODQ foi também administrado por via i.a. Os resultados foram expressos em média ± e.p.m., seguida de ANOVA e Teste de Tukey, comparando-se aos grupos que receberam o veículo. Os níveis de nitrito no LCR foram menores à 1 e 3 h após a injeção do zymosan, em relação aos valores basais (P<0,05). O procedimento cirúrgico não alterou a hiperalgesia. SIN-1 i.t (10mcg) reduziu a IA, mas 40 mcg de SIN-1 aumentaram a IA (P<0,05). L-NAME ou 1400W, de forma profilática ou terapêutica, reduziram a IA (P<0,05). ODQ i.t, profilático, mas não terapêutico, reduziu a IA da AZy e também reverteu a IA promovida por 40mcg de SIN-1. Ainda, ODQ, intra-articular, reverteu a IA promovida por 40mcg de SIN-1, i.t., MK-801 i.t inibiu a IA tanto da AZy quanto de 40mcg de SIN-1. Os resultados sugerem um papel antinociceptivo endógeno central do NO na hiperalgesia articular aguda da AZy. O NO, a depender da dose e do local de ação, pode ter efeito pró ou anti-nociceptivo, por ativação de GMPc e excitação de receptores NMDA. De forma inédita, demonstramos a existência de uma via de ativação periférico-central modulando a hiperalgesia articular na fase aguda da AZy.