Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T03:11:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 295312.pdf: 1743921 bytes, checksum: 5721b330602424fbe65211dfbf890383 (MD5) / Vários estudos demonstraram que produção excessiva de NO, relacionada com o aumento da expressão da NOS-2, contribui para as alterações hemodinâmicas observadas durante a sepse. No entanto, alguns trabalhos mostram que a inibição desta enzima não reverte a hipotensão, a hiporeatividade a agentes vasoconstritores e não influencia na sobrevivência de animais sépticos. Portanto, resolvemos investigar o papel do NO proveniente da isoforma neuronal da óxido nítrico sintase (NOS-1) sobre a reatividade a agentes vasoconstritores, e sua influência na progressão da sepse bem como o efeito de agonistas opióides sobre parâmetros comumente avaliados nesta doença. Nossos resultados demonstram que animais sépticos são sensíveis a analgesia com drogas opióides em modelo de dor por estímulo térmico e, além disso, os analgésicos opióides reduziram a hipotensão e hiporeatividade vascular induzidas pela sepse. Estes compostos quando administrados em doses baixas não interferiram na sobrevivência de animais sépticos, enquanto que doses maiores aumentam a mortalidade. A inibição da NOS-1 melhorou a reatividade vascular a agonistas e -adrenérgicos, tanto na fase inicial quanto na fase tardia da sepse. Tanto a NOS-1 quanto a guanilato ciclase solúvel tem sua expressão aumentada nas camadas de músculo liso vascular da aorta e do leito vascular mesentérico, e nos momentos mais tardios, ambas as enzimas interagem fisicamente no leito vascular mesentérico. Parte do mecanismo de reversão da hiporeatividade a agonistas -adrenérgicos, após inibição da NOS-1, se deve a redução na formação de GMPc. No entanto, a reversão da hiporeatividade vascular a agentes -adrenérgicos durante a sepse pelo 7-NI parece ser independente do aumento nos níveis de cAMP. As alterações promovidas pelo NO proveniente da NOS-1 no início da sepse estão relacionadas com a instalação da hipotensão, disfunção vascular, alterações na glicemia e nos níveis de leucócitos sanguíneos. A redução do conteúdo enzimático da NOS-1, reduz ou abole as alterações patológicas induzidas pela sepse. Nosso trabalho demonstra que o NO proveniente da NOS-1 participa ativamente na disfunção vascular promovida pela sepse. / Several studies have shown that overproduction of NO, associated with the increased expression of NOS-2, contributes to the hemodynamic changes observed in sepsis. However, inhibition of NOS-2 does not reverse hypotension, hyporesponsiveness to vasoconstrictor and does not influence the survival of septic animals. Therefore, we decided to investigate the role of NO derived from the neuronal isoform of nitric oxide synthase (NOS-1) on the reactivity to vasopressor agents and the progression of sepsis as well as the effect of opioid agonists on parameters commonly evaluated in this pathology. Our results demonstrate that septic animals are sensitive to analgesia with opioids in the pain model of thermal stimulation. In addition, opioids reduced the hypotension and vascular hyporesponsiveness induced by sepsis. When administered in low doses these drugs did not affect the survival of septic animals, whereas higher doses increased the mortality. The inhibition of NOS-1 improved the vascular reactivity to and -adrenergic agonists, both in early and late phase of sepsis. The expression of NOS-1 and soluble guanylate cyclase was increased in vascular smooth muscle layers of aorta and mesenteric vascular bed and both enzymes interact physically in the mesenteric vascular bed in late phase of sepsis. At least part of the mechanism of the recovery in the responsiveness to adrenergic agonists, after inhibition of NOS-1, is due to the reduced formation of cGMP. The changes promoted by NOS-1-derived NO in early sepsis are associated with the onset of hypotension, vascular dysfunction and changes in blood glucose levels and blood leukocytes. The reduction in the NOS-1 enzyme content reduces or abolishes the pathological changes induced by sepsis. Our work demonstrates that NOS-1-derived NO plays a role in promoting vascular dysfunction in sepsis.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-03-06T17:21:16Z No. of bitstreams: 1 Cleiton Silva Santos O papel...2014.pdf: 3463624 bytes, checksum: e0ea46a25188ac23e355981d84456b5f (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-03-06T17:44:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Cleiton Silva Santos O papel...2014.pdf: 3463624 bytes, checksum: e0ea46a25188ac23e355981d84456b5f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-06T17:44:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cleiton Silva Santos O papel...2014.pdf: 3463624 bytes, checksum: e0ea46a25188ac23e355981d84456b5f (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A patogênese da leptospirose é pouco compreendida e os estudos com enfoque na resposta inflamatória sistêmica ou local são escassos, em especial no que se refere ao papel do óxido nítrico (NO) e da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS). Dados de ensaios em culturas de células renais sugerem um papel importante da liberação de mediadores inflamatórios, tais como NO, na resposta às leptospiras e consequente nefrite intersticial. A transposição destes achados para o modelo in vivo foi pouco explorada. Por outro lado, estudos em humanos sugerem que a liberação sistêmica de NO correlaciona-se com a gravidade da doença renal e, portanto, pode ser um potencial alvo para terapia adjuvante à antibioticoterapia. O presente trabalho estudou a correlação da iNOS com distúrbios hidroeletrolíticos na patogênese da leptospirose. No modelo experimental de hamsters, avaliamos a associação da inibição dos efeitos do NO, através da terapia combinada de antibioticoterapia padrão e azul de metileno, com distúrbios eletrolíticos, alterações histopatológicas em hamsters e sobrevida. Nenhum benefício da terapia adjuvante com azul de metileno foi demonstrado. No modelo de camundongos transgênicos, investigamos o efeito da ausência do gene da iNOS na nefrite intersticial e na quantidade de bactérias observadas nos tecidos. A ausência do gene iNOS esteve associado a menor frequência de nefrite intersticial grave. Maiores estudos são necessários para investigar a função da inibição da produção de NO na patogenia da doença e da nefrite associada a leptospirose. / The pathogenesis of leptospirosis is poorly understood, and there are few studies fusing on the systemic or local inflammatory responses, especially referring to the role of nitric oxide (NO) and the enzyme inducible nitric oxide synthase (iNOS). Data from in vitro studies suggest an important role of inflammatory mediators, such as NO, in the response to leptospires in the development of interstitial nephritis. The transposition of these findings to an in vivo model was little explored. However, studies in humans suggest that systemic liberation of NO is correlated with severity of renal disease and therefore can be potential target to adjuvant therapy along with antibiotic therapy. The present work evaluated the correlation of iNOS with the pathogenesis of leptospirosis. In the experimental hamster model, we evaluated the effect of inhibiting downstream effects of NO on electrolytic disorders, histopathological changes and survival. No benefit of methylene blue treatment could be observed when compared to antibiotic (ampicillin) therapy only. In the mouse transgenic model, we investigated the effect of the absence of the Inos gene in interstitial nephritis and in the bacterial burden in target tissues. The absence of a functional iNOS gene was associated with lower frequency of severe interstitial nephritis.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:04:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338128.pdf: 2873785 bytes, checksum: 55675b858483a8a04254782459b2cae6 (MD5) Previous issue date: 2015 / O mecanismo pelo qual a disfunção vascular séptica é iniciada, e como baixas concentrações de óxido nítrico (NO) podem estar relacionadas às vias de sinalização dos receptores de glicocorticoides (GR), são pouco entendidas. Os objetivos desse trabalho foram avaliar como a produção inicial de NO, induzida por lipopolissacarídeo (LPS), pode interferir na ativação de células musculares lisas obtidas de aorta de ratos (A7r5) e na distribuição celular dos GR. Células A7r5 estimuladas com LPS e Interferon-? (IFN) apresentaram um rápido (em minutos) aumento na produção de NO e ânion superóxido, formando peroxinitrito, e posterior ativação do NF-kB, expressão da NOS-2 e acúmulo de nitrito no sobrenadante celular. A inibição da NO sintase (NOS) e NADPH oxidase (NOX), ou o sequestro do NO e do ânion superóxido, diminuíram todos estes eventos. O silenciamento das enzimas envolvidas demonstrou que apenas a ativação das isoformas NOS-1 e NOX-1 são importantes para a expressão da NOS-2 nas células A7r5. O pré-tratamento de ratos adrenalectomizados (ADX) com 7-nitroindazol (7-NI), antes do desafio com LPS reduziu os níveis plasmáticos de IL-6 e de NOx, diminuiu a translocação nuclear de GR e reduziu a mortalidade induzida por LPS em 65%. Observou-se que a translocação nuclear de GR mediada pelo pulso de NO e peroxinitrito depende da integridade do domínio de dimerização do GR, pois não foi observada translocação de GR em fibroblastos de camundongos deficientes na dimerização de GR (GRdim/dim), bem como o pré-tratamento com 7-NI não preveniu a mortalidade destes camundongos quando desafiados com LPS. Dessa forma, concluímos que a rápida formação de NO, ânion superóxido e peroxinitrito, derivados da atividade da NOS-1 e da NOX-1, respectivamente, atuam como agentes sinalizadores para a expressão da NOS-2 através da ativação de NF-kB, sendo importantes para o início da disfunção vascular séptica. Além disso, demonstramos de forma inédita que este pulso de espécies reativas participa de uma nova via de translocação nuclear de GR induzida por LPS/IFN, na ausência de corticoides. Esta nova via pode ser importante para ajudar a entender as causas da falha dos glicocorticoides em conter a inflamação em fases avançadas da sepse. Palavras-chave: células musculares lisas vasculares, óxido nítrico, óxido nítrico sintases, peroxinitrito, receptores de glicocorticoides, translocação nuclear.<br> / Abstract : The mechanism whereby the vascular dysfunction is initiated, and how low concentrations of nitric oxide (NO) are related to glucocorticoid receptors (GR) signaling pathways are poorly understood. The objectives of this study were to understand how an initial NO release induced by lipopolysaccharide (LPS) could interfere with the activation of smooth muscle cells from rat aorta (A7r5) and cellular distribution of GR. A7r5 cells stimulated with LPS and interferon-? (IFN) showed a rapid (within minutes) increase in NO and superoxide production, forming peroxynitrite with subsequent NF-kB activation, NOS-2 expression and nitrite accumulation in cell supernatant. The inhibition of NO synthase (NOS) and NADPH oxidase (NOX) or the scavenging of NO and superoxide anion, decreased all these events. The silencing of involved enzymes showed that only the activation of NOS-1 and NOX-1 isoforms are important for the expression of NOS-2 in A7r5 cells. Pretreatment of adrenalectomized (ADX) rats with 7-nitroindazole (7-NI) before LPS challenge, reduced the plasma levels of IL-6 and NOx, decreased nuclear translocation of GR and reduced mortality induced by LPS in 65%. It was observed that the nuclear translocation of GR mediated by the NO and peroxynitrite pulse depends on the integrity of the dimerization domain of the receptor, once GR translocation in fibroblasts obtained from GR dimerization deficient mice (GRdim/dim) was not observed. Also, pre-treatment with 7-NI did not prevent the death of these mice when they were challenged with LPS. Thus, we conclude that rapid formation of NO, superoxide and peroxynitrite derived from the activity of NOS-1 and NOX-1, respectively, act as signaling agents for the expression of NOS-2 through the activation of NF-kB, being important for the initiation of septic vascular dysfunction. Furthermore, we demonstrated for the first time that this pulse of reactive species participate in a new route of GR nuclear translocation induced by LPS/IFN, in the absence of steroids. This new pathway may be important to help understand the causes of glucocorticoids failure to contain inflammation in advanced stages of sepsis.

Introdução: O Diabetes Mellitus é doença que apresenta elevada incidência e prevalência na população em diversas partes do mundo. Estudos experimentais sugerem que o estresse oxidativo esteja envolvido na patogênese e na progressão dela. Objetivo: Investigar os efeitos da utilização exógena do antioxidante orgoteína (SOD Cu/Zn) sobre o estresse oxidativo, ativação do fator de transcrição nuclear kappa B (NFκB) e expressão da óxido nítrico sintase induzível (iNOS) hepática no modelo experimental de diabetes mellitus (DM). Métodos e Resultados: Foram utilizados 28 ratos machos Wistar, divididos em quatro grupos: controle (CO), controle tratados com orgoteína (CO+ORG), diabéticos (DM) e diabéticos tratados com orgoteína (DM+ORG). A dose utilizada da ORG (orgoteína ®) foi de 13 mg/Kg de peso corporal durante os sete últimos dias de experimento através de injeção subcutânea. O DM foi induzido por injeção de estreptozotocina (i.p.,70 mg/kg) e, após sessenta dias, foi avaliada a lipoperoxidação hepática através das substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS- nmoles/mg de proteína), a atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT-pmoles/mg de proteína), superóxido dismutase (SOD-U/mg de proteína) e glutationa peroxidase (GPx- nmoles/mg de proteína). Também foi realizada a medida de nitritos e nitratos (mM de NO2 e NO3). As expressões da p65 do NFκB e da iNOS foram avaliadas pela técnica de Western blot e quantificadas por densitometria em relação à percentagem do controle. Resultados: Houve aumento na lipoperoxidação hepática no grupo DM e redução significativa no grupo DM+ORG (0,36±0,15 vs 0,18±0,04; p<0,01). A atividade da enzima CAT apresentou aumento no grupo DM e redução significativa no grupo DM+ORG (p<0,001), enquanto a atividade da SOD e da GPx apresentaram redução no DM e aumento no grupo DM+ORG, respectivamente (p<0,001 e p<0,05). A medida de nitritos e nitratos apresentou redução no DM e aumento no grupo DM+ORG (1,47±0,61 vs 2,29±0,20; p<0,05) enquanto a expressão da iNOS foi 32% maior no grupo DM em relação ao grupo CO e 53% maior no grupo DM+ORG, quando comparado com o grupo DM (p<0,01). A p65 foi 37% mais expressa no DM (p<0,05) e sem diferença estatística, quando comparado o grupo DM com o grupo DM+ORG. Conclusão: O tratamento com orgoteína reduziu o estresse oxidativo hepático em animais diabéticos, mesmo não alterando o fator de transcrição nuclear NFкB. A orgoteína também aumentou a bioatividade do NO, provavelmente, devido ao aumento da atividade, dismutando o radical superóxido, e devido ao aumento da expressão da iNOS. / Aim: To investigate the effects of exogenous antioxidant orgoteína on oxidative stress, activation of nuclear transcription factor kappa B (NFκB), and hepatic expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the experimental model of diabetes mellitus (DM). Methods: 28 male Wistar rats divided in four groups were used: control (CO), controls treated with orgoteína (CO+ORG), diabetics (DM), and diabetics treated with orgoteína (DM+ORG). Orgoteína (orgotein®, 13 mg/Kg body weight was administered subcutaneously for the last 7 days of the trial. DM was induced by a single streptozotocin injection (i.p.,70 mg/kg), and 60 days later, we evaluated liver lipoperoxidation through thiobarbituric acid reactive substances (TBARS- nmoles/mg of protein) and activity of antioxidant enzymes catalase (CAT-pmoles/mg of preotein), superoxide dismutase (SODU/ mg of protein) and glutathione peroxidase (GPx- nmoles/mg of protein). Nitrites e nitrates (mM NO2 and NO3) were also measured, and p65 of NFκB and iNOS expressions were evaluated by Western blot and quantified by densitometry as compared to control percentage. Results: Liver peroxidation was increased in the DM group and significantly decreased in the DM+ORG group (0.36±0.15 vs 0.18±0.04; p<0.01). CAT activity was increased in the DM group and significantly decreased in the DM+ORG group (p<0.001), whereas SOD and GPx activity were decreased in the DM group and increased in the DM+ORG group, respectively (p<0.001 and p<0.05). Nitrite and nitrate measures were reduced in the DM and increased in the DM+ORG group (1.47±0.61 vs 2.29±0.20; p<0.05), while iNOS expression in the DM group was 32% greater than in the CO and 53% greater in the DM+ORG group than in the DM group (p<0.01). P65 expression was 37% higher in the DM (p<0.05), and there was no significant difference between the DM and DM+ORG groups. Conclusion: Orgoteína treatment reduced liver oxidative stress in diabetic animals, even though it did not change NFкB. Orgoteína also increased NO bioactivity, probably by the increased dismutation of the superoxide radical and by increase in iNOS expression.

Introdução: Há crescentes evidências que sinalizam o papel do estresse crônico como desencadeante e mesmo perpetuador de crises asmáticas, bem como a importância do parênquima pulmonar na piora funcional da asma. Objetivos: Deste modo, consideramos relevante avaliar em cobaias com inflamação alérgica crônica pulmonar como o estresse físico repetido, induzido pela natação forçada, modula a responsividade do parênquima pulmonar, ainfiltração eosinofílica, ativação da via de estresse oxidativo e o remodelamento, bem como o papel da ativação de enzima óxido nítrico sintase induzida nestas respostas. Métodos: Os animais receberam inalações duas vezes por semana durante quatro semanas com doses crescentes de ovoalbumina ou solução fisiológica Após 24 horas da quarta inalação os animais foram separadas em dois grupos onde metade destes animais foi submetido ao protocolo de natação forçada por dez dias com intervalo de dois dias, para a indução do estresse, enquanto a outra metade dos animais permaneceu sem a indução de estresse. Para avaliar a participação da ativação de iNOS nesta resposta as cobaias foram novamente divididas em grupos, onde parte foi tratada com 1400-W (inibidor específico de iNOS, 2mg/kg ip/dia/4 dias) ou veículo no mesmo período, iniciando 30 minutos antes da sétima inalação. Para avaliação das repercussões comportamentais da indução de estresse os animais foram submetidos ao teste de campo aberto, sendo obtidos os seguintes parâmetros: distância percorrida, velocidade média total, tempo de movimentação total. Foi também coletada uma amostra de sangue no dia da realização da mecânica pulmonar para a dosagem do cortisol. Após 72h da sétima inalação, os animais foram anestesiados, exsanguinados e fatias de tecido pulmonar periférico foram retiradas e suspensas em banho orgânico de Krebs, e a resistência (Rt) e elastância (Et) do tecido pulmonar periférico foram avaliadas em condição basal e após desafio com ovoalbumina (1%). Foi também obtida a medida de histerisividade. Após a realização da mecânica oscilatória, as mesmas fatias de tecido pulmonar periférico foram submetidas à avaliação histopatológica. Resultados: Nos animais submetidos a natação forçada foi observado um aumento no peso da adrenal, no cortisol sérico, na distância percorrida e no tempo de movimentação em campo aberto o que demonstrou que a natação forçada foi eficaz como indutor de estresse. Os animais expostos às inalações com ovalbumina apresentaram valores maiores de porcentagem de aumento da resistência e da elastância tecidual após desafio com ovoalbumina (p<0.05). Os animais expostos às inalações com ovalbumina e submetidos a estresse induzido por natação forçada apresentaram um aumento da resistência e elastância teciduais (p<0,05), enquanto que o tratamento com 1400W reverteu esse aumento tanto nos animais sensibilizados quantos nos sensibilizados submetidos a estresse. Houve aumento do número de eosinófilos (P<0.05), de células iNOS positivas (P<0,05), da deposição de fibras colágenas (P<0,05), no conteúdo de actina (P<0,05) e de 8-epi-PGF2a (P<0,05) no septo alveolar. Nos animais sensibilizados e submetidos ao estresse houve aumento todos os parâmetros morfológicos descritos anteriormente (P<0,05) exceto pelo depósito de fibras colágenas. A administração de 1400W reduziu todos estes parâmetros funcionais e morfológicos (P<0,05) com exceção do conteúdo de actina no septo alveolar, da infiltração eosinofílica e dos níveis de cortisol sérico. Conclusões: Neste modelo experimental, o bloqueio específico da iNOS atenuou a constrição, a inflamação eosinofílica, a expressão de iNOS, o remodelamento no parênquima pulmonar tanto nos animais apenas sensibilizados quanto nos animais sensibilizados e submetidos ao estresse. Estas alterações podem estar relacionadas aos efeitos da ativação da óxido nítrico sintase induzida na modulação da via do estresse oxidativo, sinalizada pelos efeitos na produção de isoprostano 8. O presente estudo sugere que a inibição específica da iNOS pode amplificar as estratégias terapêuticas utilizadas na abordagem de doenças inflamatórias crônicas pulmonares / Introduction: There is growing evidence to indicate the role of chronic stress even perpetuating as triggering asthma attacks and the importance of functional lung parenchyma in worsening of asthmatic responses. Objective: We considered relevant to evaluate in guinea pigs with chronic allergic pulmonary inflammation if repeated physical stress, induced by forced swimming, modulates the responsiveness of the distal lung parenchyma, eosinophilic infiltration, oxidative stress pathway activation and extracellular matrix remodeling as well as the role of the activation of induced nitric oxide synthase in these responses. Methods: The animals received inhalations twice a week for four weeks with increasing doses of ovalbumin or normal saline. After 24 hours of the fourth inhalation, the animals were separated into two groups where half of these animals were subjected to the protocol of forced swimming for ten days with an interval two days, while the other half of the animals remained without stress induction. In order to evaluate the involvement of iNOS activation in this response, guinea pigs were again divided in two groups, one part of them were treated with 1400W (specific inhibitor of iNOS, 2mg/kg ip/day/4 days) or vehicle in the same period, starting 30 minutes before the seventh inhalation. To evaluate the behavioral impact of stress induction, the animals were subjected to open field test, and we obtained the following parameters: distance traveled, average speed, total time of handling. It was also collected a blood sample on the day of pulmonary mechanics to measure cortisol. After 72h of the seventh inhalation, animals were anesthetized, and exsanguinated and slices of peripheral lung tissue were removed, suspended in a Krebs bath, and resistance (Rt) and elastance (Et) of peripheral lung tissue were evaluated either at baseline condition and after oavalbumin challenge (1%). It was also measured the histerisivity. After the end of the mechanical oscillatory evaluation, the same slices of peripheral lung tissue were submited to histopathological analysis. Results: We observed that animals submitted to forced swimming had an increase in adrenal weight, in the serum cortisol, in the distance and time of movement in the open field, showing that forced swimming was effective as stressor. The animals exposed to inhalations with ovalbumin and submited to stress induced by forced swimming had an increase in pulmonary tissue resistance and elastance (p <0.05), had an increased in the number of eosinophils (P <0.05), iNOS positive cells (P <0.05), actin (P <0.05) and 8-epi-PGF2a content (P <0.05) in alveolar septum compared to ovalbumin exposed animals (OVA group). Treatment with 1400W reversed this response in sensitized animals submitted or not to stress induction (P <0.05) There was no difference in the collagen deposition. Administration of 1400W for sensitized and stressed animals reduced all these functional and morphological parameters (P <0.05) except for the actin content of the alveolar septum, eosinophilic infiltration and cortisol levels. Conclusions: In this experimental model, the specific iNOS inhibition attenuated the constriction, the eosinophilic inflammation, the iNOS expression, the lung parenchyma remodeling in animals sensitized and submitted or not to stress induction. These changes may be related to the effects of inducible nitric oxide activation in the modulation of oxidative stress pathway. This study suggests that specific inhibition may amplify the therapeutic strategies to chronic inflammatory lung diseases

Orientadores: Elenice Aparecida de Moraes Ferrari, Claudio Antonio Barbosa de Toledo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:38:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_MariaIsabel_M.pdf: 1381550 bytes, checksum: 9cb336aef794086ff363f071f8040818 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O hipocampo exerce papel fundamental no processamento de aprendizagem e memória espaciais. Comparações das características funcionais, anatômicas e neuroquímicas do hipocampo são favorecidas por evidência oriunda de estudo sobre aprendizagem especial em mamíferos e aves. O objetivo do presente estudo foi analisar a marcação imunohistoquímica de células nNOS- positivas no hipocampo de pombos (C. lívia) após diferentes duração do treino em aprendizagem especial. Foram analisados grupos de animais não treinados (MAN), treinados em 1 sessão (EXP1), treinados em 5 sessões (EXP5), exposto à arena em 1 sessão (CONT1) ou em 5 sessões (CONT5). As sessões foram realizadas numa arena onde havia quatro comedouros, um dos quais com alimento. Em cada sessão, com seis tentativas, registrou-se a latência (seg) e a assertividade da escolha de um comedouro. Após os testes comportamentais, usou-se imunoistoquímica para a análise da marcação de células nNOS-positiva no hipocampo dorsal e ventral. O grupo EXP5 teve diminuição da latência de escolha ('F IND. 4,28¿= 23,74; p < 0,001) e aumento das respostas corretas ('F IND. 4,35¿= 8,66; p < 0,001) em função do treino. A marcação das células nNOS-positivas no hipocampo foi significativamente maior no hipocampo dorsal dos animais EXP5 em comparação com o hipocampo ventral ('F IND. 4,22¿= 104,79; p<0,001) e com os demais grupos ('F IND. 4,22¿= 10,17; p < 0,001). O aumento da imunorratividade de células nNOS- positivas no hipocampo dorsal de pombos após a aprendizagem da localização do comedouro correto sugere o envolvimento desta região e de processos mediados pro transmissão glutamatérgica nesse processo de aprendizagem e memória em pombos / Abstract: The hippocampus has fundamental role in spatial learning and memory processes. Functional and neurochemical analysis of the hippocampus are favored by evidence on spatial learning in mammals and birds. The present study examined the immunohistochemical expression of nNOS-positive cells in the hippocampus of pigeons (C. livia) after training in food location task. Animals were trained in one (EXP1) or five (EXP5) sessions or had one (CONT1) or five sessions (CONT5) of exposure to the experimental arena. The six trials sessions were conducted daily in one arena with 4 food bowls, one of which had food. Latency and accuracy of choise recorded. After behavioral tests, nNOS immunoractivity in hippocampal cells was analyzed. EXP 5 showed reduction imunoreactivity in hippocampal cells was analysed. EXP5 showed reduction in latency of choise ('F IND. 4,28¿= 23,74; p < 0,001) and increassis in correct choise ('F IND. 4,35¿= 8,66; p < 0,001) as function of the training. The expression of nNOS- positive cells was significantily higher in the dorsal hippocampus of EXP5 group as compared with the ventral hippocampus ('F IND. 4,22¿= 104,79; p < 0,001) and the other groups ('F IND. 4,28¿= 10,17; p < 0,001). The increases of nNOS immunoreactive neurons after learning of the food location suggest that nNOS is involved in processes of spatial learning and memory that are mediated by the dorsal hippocampus of pigeons / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Heitor Moreno Junior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T22:07:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_ThiagoQuinagliaAraujoCosta_D.pdf: 1420649 bytes, checksum: e60823c9257fdc54d91d49f992550d11 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Objetivo: A falha no controle da pressão arterial (PA), apesar do uso de três ou mais antihipertensivos caracteriza hipertensão arterial resistente (HAR). A disfunção endotelial está intrinsecamente associada a esta condição e inibidores da fosfodiesterase 5 (iPDE5)-inibindo a degradação de GMP cíclico (GMPc)-reduzem a PA em pacientes com HAR. A administração aguda de iPDE5 poderia melhorar parâmetros hemodinâmicos, endoteliais e de função diastólica do ventrículo esquerdo (FDVE) em pacientes com HAR e o polimorfismo T-786C da sintase de óxido nítrico (NO) endotelial (eNOS) modularia essas respostas. Métodos: Os pacientes (n = 26) foram dispostos em três grupos de acordo com o genótipo da eNOS T-786C: CC (n = 8), a CT (n = 9) e TT (n = 9). Doses crescentes de sildenafil oral (37,5, 50 e 100 mg) e placebo (em datas separadas por pelo menos 2 semanas) foram administradas a intervalos de 30 minutos, enquanto parâmetros hemodinâmicos (não invasivos e contínuos) foram obtidos. Também foram determinados: FDVE; vasodilatação mediada por fluxo (VMF); e nitrito e GMPc plasmáticos ao início e término do protocolo. Resultados: PA média (PAM) e resistência periférica total (RPT) diminuíram no grupo total (n=26) após o sildenafil (84,17 ± 21,04-75 ± 17,21 mmHg, 1149 ± 459,7-1,037 dyn.s/cm-5 ± 340, respectivamente; p<0,05). Similarmente, o sildenafil melhorou a FDVE (volume atrial esquerdo: 25 ± 5,8-20 ± 4,4; Tempo de relaxamento isovolumétrico: 104 ± 19,33-88 ± 15,22; E/e'septal: 9,7 ± 3,8-7,9 ± 2,9; E/e' lateral: 7,7 ± 3,4-6,4 ± 3,2; p<0,05). Os grupos TT e TC obtiveram redução sustentada da RPT ao longo do protocolo. No CC, os valores da RPT retornaram aos basais após as doses. Não houve alterações significativas da VMF, nitrito e GMPc após a administração do sildenafil. Conclusão: A administração aguda de iPDE5 melhora o perfil hemodinâmico e função diastólica em HAR e o polimorfismo T-786C da eNOS modula a resposta hemodinâmica, mas não a FDVE / Abstract: Purpose: Failure to control blood pressure (BP) despite the use of three or more drugs characterizes resistant hypertension (RHTN). Impaired endothelial function is associated to this condition and phosphodiesterase-5 inhibitors (PDE5i)-inhibiting cGMP breakdown-reduce BP in RHTN patients. We hypothesized that acute administration of PDE5i could ameliorate hemodynamic, endothelial parameters and left ventricular diastolic function (LVDF) in RHTN patients and that the T-786C nitric oxide (NO) endothelial synthase (eNOS) polymorphism could modulate these responses. Methods: Subjects (n= 26) were arranged into three groups: CC (n= 8), TC (n= 9) and TT (n= 9) according to T-786C eNOS genotype. Increasing doses of oral sildenafil (37.5, 50 and 100 mg) and placebo (in protocols at least 2 weeks apart) were given at 30 minute intervals while continuous non-invasive hemodynamic measures were assessed. LVDF, Flow Mediated Dilation (FMD), plasma nitrite and cGMP were also determined. Results: Mean arterial pressure (MAP) and total peripheral resistance (RPT) decreased in all patients (84.17 ± 21.04 to 75 ± 17.21 mmHg; 1149 ± 459.7 to 1037 ± 340 dyn.s/cm-5, respectively; p<0.05). Likewise, sildenafil improved LVDF parameters (Left atrial volume: 25 ± 5.8 to 20 ± 4.4; Isovolumetric relaxation time: 104 ± 19.33 to 88 ± 15.22; E/e' septal: 9.7 ± 3.8 to 7.9 ± 2.9; E/e' lateral: 7.7 ± 3.4 to 6.4 ± 3.2; p<0.05). While TT and TC genotype groups sustained RPT reduction during the increasing sildenafil doses, CC group failed to sustain the RPT drop, by the end of the protocol. No statistical changes were found in FMD, nitrite and cGMP after PDE5i administration. Conclusion: Our data suggest PDE5i acutely improves hemodynamic profile and diastolic function in RHTN, also T-786C eNOS polymorphism modulates the hemodynamic response, but not diastolic function / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

Orientador: Maria Alice da Cruz-Hofling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:04:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ito_AngelaCristina_M.pdf: 452057 bytes, checksum: d8202544f8db18e2697b97b370cf85c2 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O óxido nítrico (NO) é uma molécula gasosa, de vida curta, que modula a neurotransmissão, a força de contração, o metabolismo de glicose, o tônus vascular e a função muscular em geral. O músculo esquelético é a maior fonte de NO em mamíferos e expressa todas as três isoformas de NO sintases (NOS). Os inibidores da NOS são ferramentas usadas para estudar a função do NO na fisiologia muscular. Neste trabalho, nós examinamos os efeitos do tratamento crônico de ratos com N?-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), que bloqueia a síntese de NO pelas NOSs, através de parâmetros bioquímicos e morfológicos dos músculos soleus e extensor digitorum longus. A tipagem das fibras musculares, a medida da área de secção transversal das fibras, a expressão das isoformas de miosina, a determinação do número dos núcleos da fibra muscular e, a expressão e imunolocalização da NOS endotelial e neuronal foram parâmetros usados para avaliar os efeitos da falta de NO nos músculos. Os ratos foram tratados com L-NAME (20 mg/rato/dia, na água de beber dos animais) por duas, quatro e oito semanas. Decorridos esses tempos, os animais foram sacrificados e os músculos removidos e processados para análises. O tratamento crônico dos ratos com L-NAME causou um pequeno (13.2%), porém significativo, decréscimo na porcentagem das fibras tipo I, após duas semanas de tratamento, e aumento na área de secção transversal das fibras IID, após oito semanas de tratamento, no músculo soleus. Não houve diferenças significativas na porcentagem dos tipos de fibras, ou em suas áreas de secção transversal no músculo extensor digitorum longus. O número de núcleos da fibra muscular, também usado como um indicador de hipertrofia da fibra, não apresentou diferenças significativas nos ratos tratados com L-NAME. Igualmente, não houve alterações significativas na expressão e distribuição das NOSs endotelial e neuronal, ou na expressão das isoformas de miosina de ambos os músculos.Estes resultados mostram que a inibição crônica da biossíntese de NO pelo LNAME, nos períodos pesquisados, em geral não altera os vários parâmetros estudados nos músculos soleus e extensor digitorum longus, exceto para as fibras tipo I e tipo IID no músculo soleus / Abstract: Nitric oxide (NO) is a short-lived gas molecule that modulates neurotransmission, contractile force, glucose metabolism, vascular tone, and muscle function in general. Skeletal muscle is a major source of NO in mammals and expresses all three isoforms of NO synthases (NOS). Inhibitors of the NOS are useful tools for studying the role of NO in muscle physiology. In this work, we examined the effects of chronic treatment of rats with N?-nitro- L-arginine methyl ester (L-NAME), which blocks the synthesis of NO by NOSs, through selected biochemical and morphological parameters of soleus and extensor digitorum longus muscles. Fiber typing, fiber cross-sectional area, expression of myosin isoforms, number of muscle fiber nuclei, and the expression and immunolocalization of endothelial and neuronal NOS were used to assess the effects of NO deprivation. Rats were treated with L-NAME (20 mg/rat/day, in the drinking water) for two, four and eight weeks, after which the animals were sacrificed and the muscles removed and processed for analysis. The chronic treatment of rats with L-NAME caused a slight (13.2%) but significant decrease in the percentage of type I fibers after two weeks of treatment and in the cross-sectional area of IID fibers after eight weeks of treatment in soleus muscle. There were no significant differences in the percentage of fiber types or in their cross-sectional areas in the EDL. The number of muscle fiber nuclei, also used as an indicator of hypertrophy, did not show significant differences in the treated rats. Likewise, there were no significant changes in the expression and distribution of endothelial and neuronal NOS, or in the expression of myosin isoforms. These results show that the chronic inhibition of NO biosynthesis by L-NAME in the time intervals examined, generally did not alter the various parameters studied in rat soleus and extensor digitorum longus muscles, except for type I and IID fibers in soleus muscle / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Jacqueline Mendonça Lópes de Faria, José Butori Lopes de Faria / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T10:41:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosales_MarianaAparecidaBrunini_D.pdf: 28953374 bytes, checksum: e9a2824bad639c7cbd3628c24c4308ad (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A patogênese da retinopatia diabética (RD) está associada ao estresse nitrosativo. Alterações na barreira hemato-retiniana (BHR) externa, formada pelas células do epitélio pigmentar da retina (EPR), estão associadas às fases precoces da RD e podem acarretar no desequilíbrio da manutenção dos fotorreceptores e consequentemente promoverem mudanças nas células neuronais da retina. O estresse nitrosativo como conseqüência do aumento da produção de óxido nítrico (NO¿) produzido pela super expressão da óxido nítrico sintetase induzida (iNOS) esteve presente em todas as camadas da retina, inclusive no EPR em condições de RD experimental in vivo precoce ou na linhagem celular humana do EPR (ARPE-19) expostas à alta concentração de glicose. O tratamento com agentes químicos como a S-nitrosoglutationa (GSNO), ou naturais (cacau enriquecido com polifenol) atuaram em diferentes vias de inibição da iNOS, prevenindo o estresse nitrosativo. Para o estudo in vivo com o colírio de GSNO (artigo I) foram utilizados animais espontaneamente hipertensos (SHR) com 4 semanas de idade. O diabetes (DM) foi induzido por STZ. Após a confirmação do DM (48 horas), os animais foram divididos em 6 grupos: controles (CTs) veículo; GSNO 900nm e GSNO 10?m ou DMs veículo; GSNO 900nm e GSNO 10?m. O efeito do tratamento com colírio de GSNO foi dependente da presença ou ausência da condição do DM. Nos animais CT, o GSNO atuou como um agente nitrosativo e nos animais DM preveniu o aumento da expressão da iNOS, preservando a retina funcional. Os estudos in vitro, demonstraram que o efeito do GSNO foi deletério ou protetor dependente da concentração de glicose. Nas células ARPE-19 expostas a condições normais de glicose, o tratamento promoveu um aumento na produção de NO¿ sem aumentar a expressão de iNOS e nas células sob alta glicose induziu uma modificação pós-translacional de proteína, a S-glutationilação da iNOS prevenindo o estresse nitrosativo. No estudo do cacau (artigo II), foi avaliado in vitro (ARPE-19 exposta a alta concentração de glicose) o seu efeito protetor dependente da concentração de polifenóis. Para isso foram testadas duas formulações de cacau que diferiram somente na concentração de polifenol: 0,5% para o cacau com baixo teor de polifenol e 60,5% para o cacau com alto teor de polifenol. A epicatequina (EC), encontrada na concentração de 12% no cacau com alto teor de polifenol foi tão eficaz quanto o próprio e esteve envolvida no controle da expressão da iNOS através da estimulação do receptor ?-opióide (DOR) diminuindo os níveis de TNF-?. A modulação da iNOS, preveniu a S-nitrosilação da caveolina-1 (CAV-1) e diminuição da expressão das junções intercelulares claudina-1 e ocludina através da prevenção da interação CAV-1?junções. Em ambos os estudos, o alvo terapêutico foi a iNOS em duas diferentes modalidades: modificação pós-translacional de proteína e modulação do TNF-? via DOR no EPR em modelos experimentais de RD. Os tratamentos apresentados neste trabalho demonstraram a iNOS como alvo terapêutico e mostraram-se eficaz em conter danos funcionais e morfológicos promovidas pela situação de mimetismo do DM no EPR demonstrando o importante papel da iNOS no desenvolvimento da RD / Abstract: The pathogenesis of diabetic retinopathy (DR) is associated with nitrosative stress. Changes in outer blood-retinal barrier (BRB), formed by retinal pigment epithelium cells (RPE) are associated in the early stages of DR and can cause imbalance in the maintenance of photoreceptors and thereby cause changes on retinal neuronal cells. The nitrosative stress as a result of increased production of nitric oxide (NO) produced by overexpression of nitric oxide synthase (iNOS) was present in all layers of the retina and mainly in RPE cells in early in vivo experimental DR or in human RPE cell line (ARPE-19) exposed to high glucose condition. Therapy with chemical agents such as S-Nitrosoglutathione (GSNO) or natural compounds (enriched cocoa polyphenol) acted in different pathways of iNOS inhibition, preventing nitrosative stress. For the in vivo study with GSNO eye drops (article I), it were used spontaneously hypertensive rats (SHR) rats with 4 week old. Diabetes (DM) was induced by streptozotocin (STZ). After DM confirmation (48 hours), the animals were divided into 6 groups: controls (CTs) vehicle; GSNO 900nm and GSNO 10?m or DMs vehicle; GSNO 900nm e GSNO 10?m. The effects of treatments were dependent on glucose concentration. In CT animals, GSNO acted as a nitrosative agent and in DM rats prevented iNOS overexpression, preserving the retina function. In vitro study showed that GSNO protective or deleterious effects were dependent on the glucose concentration. In ARPE-19 cells exposed to normal glucose, the treatment promoted an increase of NO¿ production without increase iNOS expression and in cells under high glucose (HG) condition induced post-translational protein modification, S-glutationylation of iNOS, preventing nitrosative stress. In the study with cocoa (article II), it was evaluated its protective effect dependent on concentration of polyphenols in ARPE-19 cells under HG condition. For this study, the composition of cocoa was the same in both preparations with the only difference in the amounts of polyphenol, 0.5% for low polyphenol cocoa (LPC) and 60.5% for high polyphenol cocoa (HPC). Epicatechin (EC), found in 12% of HPC was similarly protective compare to HPC and it was involved in controlling iNOS expression by stimulation of the delta opioid receptor decreasing TNF- ? levels. The modulation of iNOS prevented S-nitrosylation of caveolin-1 (CAV-1) and decreased expression of claudin-1 and occluding tight junctions by preventing CAV-1/junctions interactions. The treatments presented here showed iNOS as a therapeutic target containing functional and morphological changes promoted by DM milieu in RPE showing the important role of iNOS in the development of DR / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

Oxisteróis (por exemplo, 7hidroxicolesterol) são gerados por modificações oxidativas que ocorrem na molécula de colesterol. Podem ser encontrados em elevados níveis plasmáticos em pacientes com aterosclerose e como componentes da placa aterosclerótica. Considerando que o colesterol é o principal componente da cavéola (domínios específicos da membrana plasmática que ancoram diversas proteínas de sinalização) formulamos a hipótese que os oxisteróis podem ser incorporados a estes domínios, interferindo com as vias de sinalização aí localizadas. Células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) em cultura foram expostas a 7hidroxicolesterol (10g/mL) por diferentes tempos. Analisamos a incorporação desse oxisterol à cavéola utilizando espectrometria de massa e a atividade das proteínas de sinalização presentes neste domínio: óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), CD40/CD40L, receptor do fator de crescimento de fibroblastos (rFGF), utilizando PCR quantitativo e imunoblots. Inicialmente mostramos que o 7hidroxycholesterol, em concentrações fisiológicas, foi incorporado às cavéolas mais acentuadamente que em outros domínios de membrana. Esse fenômeno impediu o desligamento entre eNOS e caveolina, prejudicando a função dessa enzima. Também mostramos que o receptor CD40 apresentou uma maior incorporação à cavéola e o rFGF manteve uma ativação mais longa quando células foram expostas ao 7hidroxicolesterol. Esses efeitos gerados pelo oxisterol não estavam relacionados à sua ação sobre mediadores inflamatórios ou receptores nucleares, desde que nenhuma diferença foi observada no perfil de citocinas ou na expressão de genes dependentes da ativação de LXR. Assim, concluímos que a incorporação de 7hidroxycholesterol nos domínios de cavéola pode interferir com vias de sinalização sabidamente envolvidas na aterogênese ou na ruptura da placa / Oxysterols (for example, 7hidroxycholesterol) are generated by oxidative modifications to cholesterol molecules. They have been described in high levels in patients with atherosclerosis and as components of the atherosclerotic plaque. Since cholesterol is the main component of caveolae (plasma membrane domains that anchor several signaling proteins), we hypothesized that oxysterol could be incorporated to these domains, interfering with the signaling networks that use this pathway. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in culture were exposed to 7hidroxycholesterol (10g/mL) for different times. We analyzed incorporation of this oxysterol to caveolae using mass spectroscopy and the activity of signaling pathways present in these domains: endothelial nitric oxide synthase (eNOS), CD40/CD40L, fibroblast growth factor receptor (FGFr), using quantitative PCR and immunoblots. Initially we showed that 7hidroxycholesterol, in physiological concentrations, was incorporated to caveolae more prominently than to other plasma membrane domains. This phenomenon caused a difficulty in eNOS release from caveolin, impairing its function. We also showed that the receptor CD40 presented a stronger incorporation to caveolae and FGFr maintained a longer activation when cells were exposed to 7hidroxycholesterol. These oxysterol effects were not related to its action in inflammatory mediators or nuclear receptors, since no difference could be observed in cytokine profiles or in the expression of genes dependent on LXR activation. Therefore we conclude that 7hidroxycholesterol incorporation in caveolae domains may interfere with signaling pathways known to be involved in atherogenesis or in plaque rupture