Made available in DSpace on 2014-08-20T13:25:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_taciane_finatto.pdf: 5834731 bytes, checksum: e10f781234d54582cc17a9b8dff16c53 (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / Iron toxicity in plants is associated with the presence of large concentrations of reduced iron (Fe2+) in the soil solution, which occurs in flooded soils and affects rice plants grown under this condition. Symptoms of iron toxicity involve oxidative stress in leaves, as a response to excessive Fe2+ absorption by the roots. The responses of plants to stress conditions include stimulus perception, signal transduction and gene transcription activation. Besides gene expression, LTR (Long Terminal Repeat) retrotransposons represent ca. 22% of the rice genome, they can be transcriptionally activated under stress, and they can alter the expression of adjacent genes (e.g. due to alterations in chromatin structure). This study aimed to identify differentially expressed genes and LTR retrotransposons in leaves of 18-day-old rice seedlings (Oryza sativa ssp. japonica cv. Nipponbare) after four days of iron excess exposure. They were identified a differential expression of genes and LTR retrotransposons in rice exposed to iron excess using a microarray approach. Total RNA was extracted from leaves of 18-day-old rice seedlings (Oryza sativa L. ssp japonica cv. Nipponbare) after four days of cultivation in nutrient solution with iron excess (7 mM of FeSO47H2O) and in a control solution. The hybridization was performed with cDNA and rice transposome array v. 2.0 microarray (Roche/NimbleGen technology, an improvement of v.1.0, Picault et al., 2009). Data from gene expression was analyzed by the Bayesian t-test with BH adjustment method. Gene annotation, gene ontology, and LTR retrotransposon identification were performed at RAP-DB (Rice Annotation Project Database, build 5), and microarray results were validated by RT-qPCR. Considering log2 FC (log2-fold-change) ≤ -1 as underexpression and ≥ 1 as overexpression (p-values ≤ 0.05), 44 down-regulated and 1,572 up-regulated genes with described function were identified. Down-regulated genes were related to a wide range of functions and no gene family could be highlighted. Among the up-regulated genes, 166 were transcription factors, the most representative belonging to the Zinc finger RING/FYVE/PHD-type family (22) and WRKY family (19); other genes were from the kinase family, participating in biological processes of protein amino acid phosphorylation (86); had molecular function of iron ion binding (56); were involved in response to oxidative stress (scavenging of reactive oxygen species) (26); had molecular function of transport activity (84), including four genes related to heavy metal transport/detoxification and four genes of the multi antimicrobial extrusion protein MATE family; and were involved in the biological process of apoptosis (14), including 10 genes of NB-ARC. Among the up-regulated genes, 435 present at least one cis-regulatory element responsive to abscisic acid (ABA) with significant occurrence (P≤0.05) in its promoter region (1 kbp upstream of the transcription start site). These data indicate that about 28% of the up-regulated genes can be regulated by changing in the ABA content in leaves in response to iron excess. Regarding expression of LTR retrotransposons, 302 were down-regulated (53 Ty1/Copia, 172 Ty3/Gypsy and 77 unclassified), and 4342 up-regulated (466 Ty1/Copia, 2276 Ty3/Gypsy and 1600 unclassified). They were observed a large activity of LTR retrotransposons in response to iron toxicity, and furthermore, they were verified that LTR retrotransposons transcription can extend to 5' and 3' flanking regions. In addition, 16 situations that should up-regulated LTR retrotransposons are located at a very short distance (smaller than 1000 base pairs) in the same chromosome of up-regulated genes suggesting co-transcription, these occurrences are represented by eight where the LTR retrotransposon and the gene have the same sense of transcription (plus); five occurrences with the both with the same sense of transcription (minus) and one occurrence where they have opposite senses. Additionally, two occurrences that in which both, DNA sequences of up-regulated retrotransposon and gene, are overlapped and have the same sense of transcription. / A toxidez por ferro em plantas está associada com a presença de grandes concentrações de ferro (Fe) reduzido (Fe2+) na solução do solo, esta condição pode ocorrer em solos irrigados por inundação. Os sintomas de toxidez por ferro incluem estresse oxidativo nas folhas como resultado do excesso de Fe2+ absorvido pelas raízes, resultando em perdas na produtividade. As respostas das plantas às condições de estresse envolvem a percepção dos estímulos, transdução de sinais e ativação da transcrição gênica. Além da expressão gênica, os LTR retrotransposons (Long Terminal Repeat Retrotransposons) que respresentam cerca de 20% do genoma do arroz, podem ser transcricionalmente ativados em condições de estresse e desta forma, influenciar a expressão de genes adjacentes (por exemplo devido a alterações na estrutura da cromatina). Este estudo teve por objetivo identificar genes e LTR retrotransposons diferencialmente expressos em plântulas de arroz (Oryza sativa ssp. japonica cv. Nipponbare), após quatro dias de exposição ao excesso de ferro em solução nutritiva. A expressão diferencial de genes e LTR retrotransposons foi analisada utilizando a técnica de microarranjo e sua validação foi realizada por meio de RT-qPCR. O RNA total foi extraído de folhas de plântulas de arroz cv. Nipponbare, após quatro dias de cultivo em solução nutritiva adicionada de ferro na concentração de 7 mM (FeSO47H2O) (presença de toxidez) e a condição controle com presença de ferro na concentração de 10 μM. O cDNA fita dupla foi sintetitizado a partir do RNA mensageiro. A hibridização foi realizada entre o cDNA das duas condições em triplicatas biológicas e o microarranjo Rice Transposome Array v. 2.0 (Roche/NimbleGen technology, an improvement of v.1.0, Picault et al., 2009). Os valores de intensidade de cada spot foram normalizados, transformados e comparados pelo teste T Bayesiano. A identificação dos genes e LTR retrotransposons foi realizada de acordo com o banco de dados RAP-DB (Rice Annotation Project Database, build 5). Considerando log2 FC (log2-fold-change) ≤ -1 como subexpressão e ≥ 1 como superexpressão e P≤ 0.05 para ambas condições. Foram identificados 44 genes subexpressos e 1.572 superexpressos com funções descritas. Os genes subexpressos desempenham a uma vasta gama de funções. Entre elas destacam-se: 166 genes que são fatores de transcrição, sendo que os mais representativos pertencem à família Zinc finger RING/FYVE/PHD-type family (22 genes) e WRKY (19 genes); outros genes da família das cinases que participam também da sinalização celular em processos biológicos de fosforilação de aminoácidos nas proteínas (86 genes); outros genes com função molecular de ligação ao íon ferro (56 genes); 26 genes envolvidos na resposta ao estresse oxidativo (scavengers de espécies reativas de oxigênio); 84 genes com função molecular de transporte, incluindo quatro genes relacionados ao transporte e detoxificação de metais pesados e quatro genes da família MATE; 14 genes envolvidos em apoptose, incluindo 10 genes NB-ARC. Entre os genes superexpressos, 435 apresentam pelo menos um elemento regulatório de ação cis responsivo ao ácido abscisico (ABA) com ocorrência significativa (P≤0,05) em sua região promotora (1 kbp a montante do sítio de início da transcrição). Estes dados indicam que cerca de 28% dos genes superexpressos podem ser regulados pelas alterações no conteúdo de ABA nas folhas, em resposta ao estresse por excesso de ferro. Considerando a expressão do LTR retrotransposons, 302 apresentaram subexpressão (53 Ty1/Copia, 172 Ty3/Gypsy e 77 não classificados), e 4.342 apresentaram superexpressão (466 Ty1/Copia, 2276 Ty3/Gypsy e 1600 não classificados). Foi constatada grande atividade transcricional dos LTR retrotransposons em resposta à toxidez por ferro, sendo que a transcrição dos LTR retrotransposons pode se estender às suas regiões flanqueadoras 5 e 3 , além disso foram encontradas 16 ocorrencias em que o LTR retrotransposon e o gene superexpresso estão localizados a uma distância menor do que 1000 pares de bases no mesmo cromossomo, sugerindo co-transcrição entre ambos. Entre as 16 ocorrências, oito em que o LTR retrotransposon e o gene apresentam o mesmo sentido de transcrição (plus); cinco ocorrências com mesmo sentido de transcrição (minus) e uma ocorrência onde LTR retrotrotransposon e gene apresentam sentidos de transcrição opostos. Foram observadas ainda, duas ocorrências em que as sequencias de DNA do LTR retrotransposon e do gene superexpressos estão sobrepostas, e apresentam o mesmo sentido de transcrição.estresse oxidativo (scavengers de espécies reativas de oxigênio); 84 genes com função molecular de transporte, incluindo quatro genes relacionados ao transporte e detoxificação de metais pesados e quatro genes da família MATE; 14 genes envolvidos em apoptose, incluindo 10 genes NB-ARC. Entre os genes superexpressos, 435 apresentam pelo menos um elemento regulatório de ação cis responsivo ao ácido abscisico (ABA) com ocorrência significativa (P≤0,05) em sua região promotora (1 kbp a montante do sítio de início da transcrição). Estes dados indicam que cerca de 28% dos genes superexpressos podem ser regulados pelas alterações no conteúdo de ABA nas folhas, em resposta ao estresse por excesso de ferro. Considerando a expressão do LTR retrotransposons, 302 apresentaram subexpressão (53 Ty1/Copia, 172 Ty3/Gypsy e 77 não classificados), e 4.342 apresentaram superexpressão (466 Ty1/Copia, 2276 Ty3/Gypsy e 1600 não classificados). Foi constatada grande atividade transcricional dos LTR retrotransposons em resposta à toxidez por ferro, sendo que a transcrição dos LTR retrotransposons pode se estender às suas regiões flanqueadoras 5 e 3 , além disso foram encontradas 16 ocorrencias em que o LTR retrotransposon e o gene superexpresso estão localizados a uma distância menor do que 1000 pares de bases no mesmo cromossomo, sugerindo co-transcrição entre ambos. Entre as 16 ocorrências, oito em que o LTR retrotransposon e o gene apresentam o mesmo sentido de transcrição (plus); cinco ocorrências com mesmo sentido de transcrição (minus) e uma ocorrência onde LTR retrotrotransposon e gene apresentam sentidos de transcrição opostos. Foram observadas ainda, duas ocorrências em que as sequencias de DNA do LTR retrotransposon e do gene superexpressos estão sobrepostas, e apresentam o mesmo sentido de transcrição.

Salinity is a challenge for crop productivity. Hence, plants exposed to saline environments reduce their vegetative and reproductive growth due to adverse effects of specific ions on metabolism and water relations. In order to cope with salinity, plants display physiological mechanisms based on three main aspects: i) source-sink relationships, ii) resource allocation and iii) alterations in endogenous hormone levels. The roles of developmental and hormonal mechanisms in salt response were investigated here. We employed mutants and transgenic tomato plants affecting different aspects of plant development and hormone response in the same genetic background (cultivar Micro-Tom). The following genotypes were used: Galapagos dwarf (Gdw), Lanata (Ln), lutescent (l), single flower truss (sft), sft heterozygous (sft/+), diageotropica (dgt), entire (e), Never ripe (Nr), epinastic (epi), procera (pro), notabilis (not), anti sense Chloroplastic carotenoid cleavage dioxygenase 7 (35S::asCCD7) and Salicylate hydroxylase (35S::nahG). Among the developmental genotypes studied, sft and l, involved in flower induction and senescence, respectively, were less affected when exposed to salt stress. Although l is considered deleterious due to its precocious senescence, it presented greater shoot biomass and leaf area during salinity. The heterozygous sft/+, whose high productivity was recently linked to an improved vegetative-to-reproductive balance, changed this balance and lowered its yield more than the control MT upon salt treatment. In the analysis of genotypes affecting hormonal status/signaling four kinds of salt responses among the genotypes were observed: i) High shoot growth in spite of high Na:K ratio presented by the strigolactone deficient and high branching CCD7 transgene; ii) High shoot growth and reduced accumulation of Na in tissues (probably due to dilution) presented by the auxin constitutive response e mutant; iii) The opposite response observed in \"ii\" presented by the low auxin sensitivity dgt mutant and iv) growth inhibition combined with reduced levels of Na and higher accumulation of K presented by the not mutant, which produces less ABA. Taken together, the results presented here points to novel developmental mechanisms, such as the promotion of moderate senescence and vegetative growth, and hormonal imbalances to be explored in the pursuing of crops resistant to salt stress. / A salinidade é um desafio para a produtividade agrícola, uma vez que plantas expostas à salinidade tem o crescimento vegetativo e reprodutivo reduzido devido aos efeitos adversos de íons específicos no metabolismo e nas relações hídricas. A fim de lidar com a salinidade, as plantas desempenham mecanismos fisiológicos baseados em três principais características: i) relações fonte-dreno; ii) alocação de reservas e iii) alterações nos níveis endógenos de hormônios. Nesse trabalho, investigamos a relação entre os processos de desenvolvimento e de regulação hormonal com a resposta à salinidade. Para tanto foram usados genótipos de tomateiro com alteração em diferentes vias de desenvolvimento e de produção ou sinalização de hormônios vegetais. Os seguintes genótipos foram usados: Galapagos dwarf (Gdw), Lanata (Ln), lutescent (l), single flower truss (sft), sft heterozygous (sft/+), diageotropica (dgt), entire (e), Never ripe (Nr), epinastic (epi), procera (pro), notabilis (not), anti sense Dioxigenase cloroplastídica de carotenoide 7 (35S::asCCD7) e Salicilato hidroxilase (35S::nahG). Entre os genótipos de desenvolvimento estudados, sft e l, relacionados à menor indução floral e senescência respectivamente, foram os menos afetados quando expostos à salinidade. O genótipo l acumulou maior biomassa e área foliar, apesar de ser considerado deletério devido à senescência precoce. As plantas heterozigotas, sft/+, cuja maior produtividade foi recentemente relacionada a um melhor balanço vegetativo/reprodutivo, alteraram esse balanço sob salinidade e reduziram sua produtividade mais que o controle MT sob estresse salino. Na análise dos genótipos com alteração hormonais foram observados quatro tipos de respostas à salinidade: i) elevado crescimento da parte aérea, apesar da razão Na:K ser alta no genótipo CCD7 cujo transgene induz deficiência de estrigolactona e excessiva ramificação; ii) elevado crescimento e acúmulo reduzido de Na nos tecidos (devido provavelmente a diluição) apresentada pelo mutante de resposta constitutiva a auxina e; iii) o oposto da resposta anterior foi apresentado pelo mutante pouco sensível à auxina , dgt; iv) inibição do crescimento combinado com nível reduzido de Na e alto acúmulo de K apresentada pelo mutante not que produz menos ácido abscísico. Considerados em conjunto, os resultados apresentaram temas para novos mecanismos de desenvolvimento, como a promoção moderada de senescência e do crescimento vegetativo além dos desbalanços hormonais, para serem explorados na busca de culturas resistentes ao estresse salino.

[ES] El tiempo de floración es uno de los caracteres más importantes que influyen en la productividad y el rendimiento de los cultivos. La identificación de compuestos sintéticos que sean bioactivos en el control de la inducción floral es de gran interés. Su identificación podría permitirnos ajustar el tiempo de floración en los cultivos, adaptándolos a las condiciones ambientales más favorables. Para identificar estos compuestos, hemos tomado dos enfoques diferentes: un cribado genético químico y la caracterización del metaboloma de transición floral. En primer lugar, realizamos un rastreo de genética química para identificar moléculas pequeñas que tengan el potencial de controlar la expresión del florígeno, FLOWERING LOCUS T (FT) o la actividad o señalización de FT en Arabidopsis. Para ello, hemos utilizado plantas transgénicas que expresan el gen ß-GLUCURONIDASE (GUS) bajo el control del promotor FT para probar una librería de 360 moléculas preseleccionadas. Los resultados positivos obtenidos se volvieron a analizar mediante un cribado secundario basado en la expresión del gen reportero LUCIFERASE (LUC) bajo el control del promotor FT. Utilizando este enfoque, hemos identificado una molécula que induce con éxito la floración en condiciones de cultivo in vitro. En segundo lugar, hemos caracterizado la función del ácido pipecólico (Pip), una molécula previamente identificada como candidata a regular la floración. Hemos confirmado que las mutaciones en las enzimas responsables de la biosíntesis de Pip muestran una alteración en la respuesta del tiempo de floración. Además, hemos identificado un nuevo papel del Pip relacionado con el crecimiento y el tamaño de la roseta de Arabidopsis. Finalmente, utilizamos un sistema inducible basado en el promotor de CONSTANS (CO) que controla la expresión del gen endógeno de CO fusionado con el receptor de glucocorticoides de rata (CO::GR). De manera que con un solo tratamiento con dexametasona podemos inducir la floración. Con este sistema, realizamos un estudio del metaboloma de muestras de ápices y hojas mediante técnicas de metabolómica dirigida, lipidómica, cuantificación hormonal y transcriptómica. La integración de estos conjuntos de datos ómicos nos ha permitido identificar rutas metabólicas que se encuentran alteradas durante la transición floral. A su vez, la caracterización de mutantes de pérdida de función que codifican enzimas clave de esas vías metabólicas, reveló que algunos de estos mutantes mostraban un fenotipo afectado para el tiempo de floración. Entre ellos, nos enfocamos en la caracterización de los genes relacionados con el metabolismo de la rafinosa, un oligosacárido de reserva. Mutantes afectados en el gen RAFFINOSE SYNTHASE 5 (RS5) presentan un fenotipo de floración temprana y fertilidad reducida. En base a los resultados obtenidos, proponemos un modelo en el que, durante la transición floral, se produce una reestructuración de las ratios entre carbohidratos sencillos (monosacáridos y disacáridos) y de reserva, como la rafinosa. Estos cambios podrían ser modulados por el ácido abscísico (ABA) y por genes relacionados con la floración, desencadenando cambios en el metabolismo de la trehalosa y promoviendo una expresión temprana de FT. / [CA] El temps de floració és un dels caràcters amb més influència en la productivitat i el rendiment dels cultius. La identificació de compostos sintètics bioactius per al control de la inducció floral és de gran interés, ja que la seua identificació podria permetre ajustar el temps de floració dels cultius, aspecte que podria contribuir a l'adaptació a condicions ambientals més favorables. Per a identificar aquests compostos, hem portat a terme dues aproximacions diferents: un garbellat genètic químic i la caracterització del metaboloma de la transició floral. En primer lloc, hem realitzat un cribratge genètic-químicper a identificar xicotetes molècules amb potencial per a controlar l'expressió del florígen, FLOWERING LOCUS T (FT) o l'activitat o la senyalització de FT a Arabidopsis. Per a portar a terme aquest cribratge, hem utilitzat plantes transgèniques que expressen el gen ß-GLUCURONIDASE (GUS) sota el control del promotor de FT amb les quals hem assajat una llibreria de 360 molècules preseleccionades de manera prèvia. Els resultats positius obtinguts en aquest cribratge t s'han sotmés a un cribratge secundari basat en l'expressió del gen reporter LUCIFERASE (LUC) sota el control del promotor FT. La utilització d'aquesta primera aproximació ha permés la idenfiticació d'una molècula que indueix amb èxit la floració en condicions de cultiu in vitro. En En segon lloc, hem caracteritzat la funció de l'àcid pipecòlic (Pip), una molècula prèviament identificada com a candidata a regular la floració. Aquesta aproximació ens ha permet confirmar que mutacions als enzims responsables de la biosíntesi de Pip comporten una alteració al temps de floració. A més, en aquest treball hem identificat un nou paper del Pip relacionat amb el creixement i la grandària de la roseta d'Arabidopsis. Finalment, hem utilitzat un sistema induïble basat en el promotor de CONSTANS (CO) que controla l'expressió del gen endogen de CO fusionat al receptor de glucocorticoides de rata (CO::GR). Aquesta construcció ens proporciona una ferramenta amb la qual induir la floració amb un sol tractament amb dexametasona. A continuació, hem realitzat un estudi del metaboloma de mostres d'àpexs i fulles mitjançant tècniques de metabolòmica dirigida, lipidómica, quantificació hormonal i transcriptòmica. La integració d'aquest conjunt de dades ómiques ens ha permés identificar les rutes metabòliques que es troben alterades durant la transició floral. Al mateix temps, la caracterització de mutants de pèrdua de funció que codifiquen enzims clau per a aquestes rutes metabòliques, ha revelat que alguns d'aquests mutants mostren un fenotip afectat pel que fa al temps de floració. Dintre dels mutants analitzats, ens hem centrat en la caracterització dels gens relacionats amb el metabolisme de la rafinosa, un oligosacàrid de reserva. Els mutants del gen RAFFINOSE SYNTHASE 5 (RS5) presenten un fenotip de floració primerenca i fertilitat reduïda. Sobre la base dels resultats obtinguts, proposem un model en el qual, durant la transició floral, es produeix una reestructuració de les ràtios entre carbohidrats senzills (monosacàrids i disacàrids) i de reserva, com la rafinosa. Aquests canvis podrien ser modulats per l'àcid abscísic (ABA) i per gens relacionats amb la floració, i desencadenariencanvis al metabolisme de la trehalosa, així com la generació de l'expressió primerenca de FT. / [EN] Flowering time is one of the most important traits affecting crop productivity and yield. The identification of natural or synthetic bioactive compounds for the control of flowering induction is of great interest. The identification of compounds with the potential to regulate flowering could allow us to fine-tune flowering responses in crops and adapt them to the changing environmental conditions. To identify these compounds, we have taken two different approaches: a chemical genetic screening and the characterization of the metabolome of floral transition. First, we performed a chemical genetic screening to identify small molecules that have the potential to control the expression of the florigen FLOWERING LOCUS T (FT) or FT activity or signaling in Arabidopsis. We used transgenic plants expressing the ß-GLUCURONIDASE gene (GUS) under the control of the FT promoter to test a preselected library of 360 molecules. Positive hits were retested by a secondary screening based on the expression of the LUCIFERASE (LUC) reporter gene under the control of the FT promoter. Using this approach, we have identified one molecule that successfully induces flowering under in vitro culture conditions. Secondly, we have characterized the function of pipecolic acid (Pip), a molecule previously identified as a candidate to regulate flowering time. We have confirmed that mutations in enzymes responsible for Pip biosynthesis display an altered flowering response. A new role for Pip in rosette growth is also revealed in this work. Finally, we used an inducible system based on the promoter of CONSTANS (CO) driving the expression of CO fused to the rat glucocorticoid receptor (CO::GR). Such a construction provides a tool to induce flowering with a single dexamethasone treatment. We then performed a comprehensive metabolomic study of the shoot apex and leaf samples that included targeted metabolomics, lipidomics, hormone quantification, and transcriptomics. Integration of these omic datasets has allowed us to point out metabolic pathways that are altered during floral induction. Characterization of loss-of-function mutants coding key enzymes of those metabolic pathways revealed that some of these mutants showed a flowering time phenotype. Among them, we focused on the characterization of the contribution of the raffinose metabolism, a storage oligosaccharide, to the determination of flowering time. Mutants affecting RAFFINOSE SYNTHASE 5 (RS5) exhibit an early flowering phenotype and reduced fertility. We propose a model in which the balance between simple and storage carbohydrates in the apex changes during floral induction. This change could be modulated by ABA and flowering-related genes, and it triggers changes in trehalose metabolism, promoting flowering by an early FT upregulation. / Praena Tamayo, J. (2022). Identification of Bioactive Molecules in the Control of Flowering Time [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/185177