Methylmalonic acidemia, one of the most frequent organic acidemias, is caused by deficiency of the methylmalonyl CoA mutase, leading to tissue accumulation of Lmethylmalolonic acid (MMA). Affects individuals present lethargy, coma, vomiting, muscular hypotonia, recurrent episodes of metabolic acidosis and progressive encephalopathy. In this context, it has been proposed that MMA inhibits succinate dehydrogenase (SDH) and leads to ATP depletion, lactate accumulation and excitotoxic damage. In the present study we confirmed that MMA competitively inhibits of SDH, and later were investigated the enzymatic medium reduction alters the activity of SDH or its inhibition by MMA. SDH activity was determined in cerebral cortex homogenates, using 2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride (INT), as the electorn acceptor. The reduction enzymatic medium was promoted by preincubation with β-NADH (160 μM). The preincubation of β-NADH prevented the inhibition of the activity of SDH induzed by 5mM of the MMA [F(1,5)=9.31; p=0.028]. In addition, was determined of the kinetic parameters (Km and Vmax) and inhition constant (Ki ) of SDH preincubated in the presence and absence of β-NADH. The Km of SDH preincubated with β-NADH (Km=0.216 nmol INT) was different of the Km of SDH preincubated in the absence of the β-NADH (Km=0.272nmol INT) [T(2)=10.375; p=0.009]. The presence of β-NADH in the incubation medium did not alter Vmax= 4.72 ± 0.28.10-8 mol INT/mg protein/min) [T(2)=-1.0; p=0.423]. The Ki of the MMA by SDH activity in presence of the β- NADH (Ki =20.05 mM) is increased that of Ki of the MMA by SDH activity in absence of the β-NADH (Ki =11.60 mM), [T(2)=18.806; p=0.003]. In conclusion, we showed that, in the presence of β-NADH, SDH is less sensitive to the inhibition by MMA. / A acidemia metilmalônica, uma das mais frequentes acidemias orgânicas, é causada pela deficiência da enzima metilmalonil-CoA mutase, ocasionando acumulação tecidual de ácido L-metilmalônico (MMA). Os indivíduos afetados apresentam letargia, coma, vômito, hipotonia muscular, episódios recorrentes de acidose metabólica e encefalopatia progressiva. Em decorrência do acúmulo de MMA ocorre inibição da sucinato desidrogenase (SDH), E.C.5.5.99.2, diminuição da produção de ATP, aumento dos níveis de lactato e dano excitotóxico. No presente estudo confirmamos que o MMA inibe a SDH competitivamente e investigamos se a presença de uma agente redutor no meio enzimático alteraria a atividade da SDH, ou sua inibição por MMA. A atividade da SDH em córtex cerebral de ratos foi determinada usando o 2-(p-iodofenil)-3-(p-nitrofenil)-5-feniltetrazólio (INT), como aceptor de elétrons. A pré-incubação com β-NADH (160 μM) preveniu a inibição da SDH causada por 5 mM de MMA [F(1,5)=9,31; p=0,028]. Posteriormente, foi determinado os parâmetros cinéticos (Km e Vmax) da SDH pré-incubada na presença e ausência de β- NADH. O Km da SDH pré-incubada com β-NADH (Km=0,216 nmol INT) é menor que o Km da SDH pré-incubada na ausência de β-NADH (Km=0,272nmol INT), [T(2)=10,375; p=0,009]. Por outro lado a pré-incubação da enzima com β-NADH não alterou a Vmax (4,72 ± 0,28.10-8 mol INT/mg proteína/min) [T(2)=-1,0; p=0,423]. A constante de inibição (Ki) do MMA para a SDH pré-incubada com β-NADH (Ki=20,05 mM) foi maior que o Ki do MMA para a SDH préincubada sem β-NADH (Ki=11,60 mM) [T(2)=18,806; p=0,003]. Os dados mostram que a presença de β-NADH diminui a sensibilidade da sucinato desidrogenase a inibição por ácido metilmalônico.

O ácido metilmalônico (MMA) é um agente convulsivante endógeno que se acumula na acidemia metilmalônica, um erro inato no metabolismo caracterizado por disfunções neurológicas severas, predispondo ao aparecimento de convulsão. O mecanismo responsável pelas convulsões induzidas pelo MMA envolve a ativação do receptor NMDA. O envolvimento GABAérgico nas convulsões induzidas pelo MMA ainda não foi demonstrado. Desta forma, no presente estudo objetivou investigar o envolvimento de macanismos GABAérgicos nas convulsões induzidas pelo MMA. Ratos adultos foram injetados (i.c.v.) com muscimol (46 pmol/1 ml), baclofen (0.03, 0.1 and 0.3 mmol/1 ml), MK- 801 (6 nmol/1 ml), piridoxine (2 mmol/ 4 ml) ou salina (0.15 mmol/1 ml). Após trinta minutos, MMA (0.3, 0.1 and 3 mmol/1 ml) ou NaCl (6 mmol/1 ml, i.c.v.) eram injetados. Após estas injeções, os animais eram transferidos imediatamente para um campo aberto, sendo observado o aparecimento de convulsões. Após a avaliação comportamental, foi dosada a atividade glutamato descarboxilase (GAD) em homogeneizado de córtex cerebral, mensurando a quantidade de 14CO2 liberado do L-[14C]-glutamato. As convulsões foram confirmadas pelo estudo eletrencefalográfico. O MMA induziu convulsões do tipo crônicas de forma dose-dependente e reduziu a atividade da GAD no córtex cerebral ex vivo. A atividade da GAD correlacionou-se negativamente com a duração das convulsões (r=- 0.873, P<0.01), mas somente o MK-801 e a piridoxina reverteram à inibição da GAD pelo MMA. Estes resultados sugerem o envolvimento de mecanismos GABAérgicos nas convulsões induzidas pelo MMA, e que a inibição da GAD depende da ativação de receptores NMDA ou da proteção da enzima pela piridoxina. Por fim, o presente estudo propôs, de forma inovadora, o envolvimento do sistema GABAérgico nas convulsões induzidas pelo MMA e o envolvimento dos receptores NMDA na falha da transmissão GABAérgica. / Methylmalonic acid (MMA) is an endogenous convulsing compound that accumulates in methylmalonic acidemia, an inborn error of the metabolism characterized by severe neurological dysfunction, including seizures. The mechanisms by which MMA causes seizures involves the activation of the NMDA receptors, but whether GABAergic mechanisms are involved in the convulsions induced by MMA is not known. Therefore, in the current study we investigated the involvement of GABAergic mechanisms in the convulsions induced by MMA. Adult rats were injected (i.c.v.) with muscimol (46 pmol/1 ml), baclofen (0.03, 0.1 and 0.3 mmol/1 ml), MK-801 (6 nmol/1 ml), pyridoxine (2 mmol/ 4 ml) or physiological saline (0.15 mmol/1 ml). After thirty minutes, MMA (0.3, 0.1 and 3 mmol/1 ml) or NaCl (6 mmol/1 ml, i.c.v.) was injected. The animals were immediately transferred to an open field and observed for the appearance of convulsions. After behavioral evaluation, glutamate decarboxylase (GAD) activity was determined in cerebral cortex homogenates by measuring the 14CO2 released from L-[14C]-glutamic acid. Convulsions were confirmed by electroencephalographic recording in a subset of animals. MMA caused the appearance of clonic convulsions in a dose-dependent manner and decreased GAD activity in the cerebral cortex ex vivo. GAD activity negatively correlated with duration of MMA-induced convulsions (r=-0.873, P<0.01), in an individual basis. Muscimol, baclofen, MK-801 and pyridoxine prevented MMA-induced convulsions, but only MK-801 and pyridoxine prevented MMA-induced GAD inhibition. These data suggest GABAergic mechanisms are involved in the convulsive action of MMA, and that GAD inhibition by MMA depends on the activation of NMDA receptors or enzyme protection by pyridoxine. While in this study we present novel data about the role of the GABAergic system in MMAinduced convulsions, the central role of NMDA receptors in the neurochemical actions of MMA is further reinforced since they seem to trigger GABAergic failure.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do Título de Doutor em Ciências da Saúde. / A acidemia metilmalônica é um erro inato do metabolismo de herança autossômica recessiva causado pela deficiência da enzima metilmalonilCoA mutase. Os principais sinais e sintomas incluem danos neurológicos, renais e hepáticos. Essa doença é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo de ácidos orgânicos no plasma, na urina e em tecidos dos pacientes afetados, particularmente o ácido metilmalônico (MMA). Adicionalmente, os pacientes apresentam quadros de hiperamonemia, especialmente durante crises metabólicas. Entretanto, até o momento, não se sabe a influência da hiperamonemia na fisiopatologia da doença, bem como a toxicidade do MMA associado à hiperamonemia. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar parâmetros bioenergéticos e inflamatórios em rim e fígado em um modelo animal de acidemia metilmalônica associada à hiperamonemia. Para este estudo, foram utilizados ratos Wistar machos com 7, 15, 30 e 60 dias de vida, divididos em 4 grupos experimentais: controle, MMA, acetato de amônio (AA) e MMA+AA. Os animais do grupo controle receberam solução de NaCl 0,9 % e os animais dos grupos tratados receberam MMA (1,76 µmol/g; s.c) associado ou não ao AA (2,65 µmol/g; i.p) por cinco dias.. Os resultados mostram aumento significativo da taxa de creatinina sérica no grupo de animais com 7 e 30 dias de vida nos grupos AA e MMA+AA, bem como aumento das concentrações de ureia, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase e creatina cinase em animais com 60 dias. Adicionalmente, foi observada uma redução da taxa de filtração glomerular nos grupos de animais com 7, 30 e 60 dias. A análise histológica apresentou resultados heterogêneos, como dilatação dos túbulos, vacuolização nos túbulos proximais e dilatação dos túbulos distais, assim como desestruturação celular com desintegração da sua estrutura, alteração do epitélio e retração glomerular no grupo MMA+AA. Também foram encontradas alterações significativas na atividade da enzima citrato sintase no tecido hepático de animais com 15, 30 e 60 dias e no tecido renal de animais com 15 dias de vida. A atividade da enzima succinato desidrogenase se mostrou diminuída no grupo de animais com 15, 30 e 60 dias sobre o tecido hepático e renal. Além disso, as atividades dos complexos da cadeia respiratória foram alteradas estatisticamente. A atividade do complexo IV foi aumentada em rins de animais com 15 dias de vida. Por outro lado, a atividade do complexo II-III da cadeia respiratória foi aumentada em tecido hepático de animais do grupo MMA+AA. No grupo de animais com 30 dias de vida, houve alteração das atividades dos complexos I e II no tecido hepático, bem como complexos e II, II-III e IV no tecido renal de animais com 60 dias de vida. Aliados a esses resultados, foram observadas alterações estatisticamente significativas nos níveis de interleucina 6 e fator de necrose tumoral alfa (TNFα) em tecido hepático dos animais do grupos MMA, AA e MMA+AA e de TNFα no tecido renal de animais com 30 dias de vida dos grupos MMA e MMA+AA. Tomados em conjunto, esses achados sugerem que alterações bioenergéticas e inflamatórios ocasionadas pela toxicidade da hiperamonemia associada ao MMA podem colaborar para os danos hepáticos e renais apresentados por pacientes acometidos pela acidemia metilmalônica.

O ácido metilmalônico (MMA) é um agente convulsivante endógeno que se acumula na acidemia metilmalônica, um erro inato no metabolismo caracterizado por disfunções neurológicas severas, predispondo ao aparecimento de convulsão. O mecanismo responsável pelas convulsões induzidas pelo MMA envolve a ativação do receptor NMDA. O envolvimento GABAérgico nas convulsões induzidas pelo MMA ainda não foi demonstrado. Desta forma, no presente estudo objetivou investigar o envolvimento de macanismos GABAérgicos nas convulsões induzidas pelo MMA. Ratos adultos foram injetados (i.c.v.) com muscimol (46 pmol/1 ml), baclofen (0.03, 0.1 and 0.3 mmol/1 ml), MK- 801 (6 nmol/1 ml), piridoxine (2 mmol/ 4 ml) ou salina (0.15 mmol/1 ml). Após trinta minutos, MMA (0.3, 0.1 and 3 mmol/1 ml) ou NaCl (6 mmol/1 ml, i.c.v.) eram injetados. Após estas injeções, os animais eram transferidos imediatamente para um campo aberto, sendo observado o aparecimento de convulsões. Após a avaliação comportamental, foi dosada a atividade glutamato descarboxilase (GAD) em homogeneizado de córtex cerebral, mensurando a quantidade de 14CO2 liberado do L-[14C]-glutamato. As convulsões foram confirmadas pelo estudo eletrencefalográfico. O MMA induziu convulsões do tipo crônicas de forma dose-dependente e reduziu a atividade da GAD no córtex cerebral ex vivo. A atividade da GAD correlacionou-se negativamente com a duração das convulsões (r=- 0.873, P<0.01), mas somente o MK-801 e a piridoxina reverteram à inibição da GAD pelo MMA. Estes resultados sugerem o envolvimento de mecanismos GABAérgicos nas convulsões induzidas pelo MMA, e que a inibição da GAD depende da ativação de receptores NMDA ou da proteção da enzima pela piridoxina. Por fim, o presente estudo propôs, de forma inovadora, o envolvimento do sistema GABAérgico nas convulsões induzidas pelo MMA e o envolvimento dos receptores NMDA na falha da transmissão GABAérgica. / Methylmalonic acid (MMA) is an endogenous convulsing compound that accumulates in methylmalonic acidemia, an inborn error of the metabolism characterized by severe neurological dysfunction, including seizures. The mechanisms by which MMA causes seizures involves the activation of the NMDA receptors, but whether GABAergic mechanisms are involved in the convulsions induced by MMA is not known. Therefore, in the current study we investigated the involvement of GABAergic mechanisms in the convulsions induced by MMA. Adult rats were injected (i.c.v.) with muscimol (46 pmol/1 ml), baclofen (0.03, 0.1 and 0.3 mmol/1 ml), MK-801 (6 nmol/1 ml), pyridoxine (2 mmol/ 4 ml) or physiological saline (0.15 mmol/1 ml). After thirty minutes, MMA (0.3, 0.1 and 3 mmol/1 ml) or NaCl (6 mmol/1 ml, i.c.v.) was injected. The animals were immediately transferred to an open field and observed for the appearance of convulsions. After behavioral evaluation, glutamate decarboxylase (GAD) activity was determined in cerebral cortex homogenates by measuring the 14CO2 released from L-[14C]-glutamic acid. Convulsions were confirmed by electroencephalographic recording in a subset of animals. MMA caused the appearance of clonic convulsions in a dose-dependent manner and decreased GAD activity in the cerebral cortex ex vivo. GAD activity negatively correlated with duration of MMA-induced convulsions (r=-0.873, P<0.01), in an individual basis. Muscimol, baclofen, MK-801 and pyridoxine prevented MMA-induced convulsions, but only MK-801 and pyridoxine prevented MMA-induced GAD inhibition. These data suggest GABAergic mechanisms are involved in the convulsive action of MMA, and that GAD inhibition by MMA depends on the activation of NMDA receptors or enzyme protection by pyridoxine. While in this study we present novel data about the role of the GABAergic system in MMAinduced convulsions, the central role of NMDA receptors in the neurochemical actions of MMA is further reinforced since they seem to trigger GABAergic failure.

O ácido metilmalônico (MMA) é um agente convulsivante endógeno que se acumula na acidemia metilmalônica, um erro inato no metabolismo caracterizado por disfunções neurológicas severas, predispondo ao aparecimento de convulsão. O mecanismo responsável pelas convulsões induzidas pelo MMA envolve a ativação do receptor NMDA. O envolvimento GABAérgico nas convulsões induzidas pelo MMA ainda não foi demonstrado. Desta forma, no presente estudo objetivou investigar o envolvimento de macanismos GABAérgicos nas convulsões induzidas pelo MMA. Ratos adultos foram injetados (i.c.v.) com muscimol (46 pmol/1 ml), baclofen (0.03, 0.1 and 0.3 mmol/1 ml), MK- 801 (6 nmol/1 ml), piridoxine (2 mmol/ 4 ml) ou salina (0.15 mmol/1 ml). Após trinta minutos, MMA (0.3, 0.1 and 3 mmol/1 ml) ou NaCl (6 mmol/1 ml, i.c.v.) eram injetados. Após estas injeções, os animais eram transferidos imediatamente para um campo aberto, sendo observado o aparecimento de convulsões. Após a avaliação comportamental, foi dosada a atividade glutamato descarboxilase (GAD) em homogeneizado de córtex cerebral, mensurando a quantidade de 14CO2 liberado do L-[14C]-glutamato. As convulsões foram confirmadas pelo estudo eletrencefalográfico. O MMA induziu convulsões do tipo crônicas de forma dose-dependente e reduziu a atividade da GAD no córtex cerebral ex vivo. A atividade da GAD correlacionou-se negativamente com a duração das convulsões (r=- 0.873, P<0.01), mas somente o MK-801 e a piridoxina reverteram à inibição da GAD pelo MMA. Estes resultados sugerem o envolvimento de mecanismos GABAérgicos nas convulsões induzidas pelo MMA, e que a inibição da GAD depende da ativação de receptores NMDA ou da proteção da enzima pela piridoxina. Por fim, o presente estudo propôs, de forma inovadora, o envolvimento do sistema GABAérgico nas convulsões induzidas pelo MMA e o envolvimento dos receptores NMDA na falha da transmissão GABAérgica. / Methylmalonic acid (MMA) is an endogenous convulsing compound that accumulates in methylmalonic acidemia, an inborn error of the metabolism characterized by severe neurological dysfunction, including seizures. The mechanisms by which MMA causes seizures involves the activation of the NMDA receptors, but whether GABAergic mechanisms are involved in the convulsions induced by MMA is not known. Therefore, in the current study we investigated the involvement of GABAergic mechanisms in the convulsions induced by MMA. Adult rats were injected (i.c.v.) with muscimol (46 pmol/1 ml), baclofen (0.03, 0.1 and 0.3 mmol/1 ml), MK-801 (6 nmol/1 ml), pyridoxine (2 mmol/ 4 ml) or physiological saline (0.15 mmol/1 ml). After thirty minutes, MMA (0.3, 0.1 and 3 mmol/1 ml) or NaCl (6 mmol/1 ml, i.c.v.) was injected. The animals were immediately transferred to an open field and observed for the appearance of convulsions. After behavioral evaluation, glutamate decarboxylase (GAD) activity was determined in cerebral cortex homogenates by measuring the 14CO2 released from L-[14C]-glutamic acid. Convulsions were confirmed by electroencephalographic recording in a subset of animals. MMA caused the appearance of clonic convulsions in a dose-dependent manner and decreased GAD activity in the cerebral cortex ex vivo. GAD activity negatively correlated with duration of MMA-induced convulsions (r=-0.873, P<0.01), in an individual basis. Muscimol, baclofen, MK-801 and pyridoxine prevented MMA-induced convulsions, but only MK-801 and pyridoxine prevented MMA-induced GAD inhibition. These data suggest GABAergic mechanisms are involved in the convulsive action of MMA, and that GAD inhibition by MMA depends on the activation of NMDA receptors or enzyme protection by pyridoxine. While in this study we present novel data about the role of the GABAergic system in MMAinduced convulsions, the central role of NMDA receptors in the neurochemical actions of MMA is further reinforced since they seem to trigger GABAergic failure.

Orientador: Roger Frigério Castilho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T07:07:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melo_DanielaRodriguesde_D.pdf: 21069496 bytes, checksum: f3406a56ba7ffca25021b4803fc73a92 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A acidemia metilmalônica é uma desordem metabólica hereditária envolvendo uma deficiência na atividade da enzima metilmalonil-CoA mutase, com resultante acúmulo de ácido metilmalônico (MMA) no organismo dos pacientes. Há evidências de comprometimento do metabolismo energético mitocondrial por MMA levando à neurodegeneração. Neste estudo avaliou-se o efeito in vitro de MMA no consumo de oxigênio por mitocôndrias isoladas de cérebro de rato na presença de diferentes substratos para a cadeia respiratória. MMA (1-10 mM) inibiu fortemente a respiração mantida por glutamato ou succinato. Nós confirmamos, por meio de experimentos sobre o transporte mitocondrial de succinato, que o efeito inibitório do MMA na respiração mantida por succinato deve-se à inibição do transportador mitocondrial de dicarboxilatos, impedindo a captação de succinato pela mitocôndria. Medidas do transporte mitocondrial de glutamato revelaram que o efeito do MMA na respiração mitocondrial mantida por glutamato não está relacionado à inibição da captação deste substrato pela mitocôndria. Enquanto o MMA mostrou um fraco efeito inibitório sobre a atividade das enzimas glutamato desidrogenase e aspartato transaminase, a atividade da 'alfa'-cetoglutarato desidrogenase foi significativamente inibida por MMA (Ki = 3,65 mM). Medidas do transporte mitocondrial de 'alfa'-cetoglutarato mostraram que o MMA extramitocondrial pode ser trocado pelo 'alfa'-cetoglutarato intramitocondrial, depletando este substrato da matriz mitocondrial, com consequente inibição da respiração mantida por glutamato. Nós observamos que organelas isoladas de cérebro podem acumular aproximadamente o triplo da concentração de MMA presente no meio extramitocondrial. Em adição, a inibição pelo MMA do consumo de oxigênio por fragmentos de cérebro de rato foi parcialmente prevenida pela presença de malato. Os efeitos in vivo do MMA foram estudados por meio das medidas de respiração e produção de espécies reativas de oxigênio em mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos jovens cronicamente tratados (ip, 15 d) com MMA. Nenhuma diferença foi observada entre as amostras controle e tratadas com MMA, indicando que o tratamento in vivo com MMA não leva à disfunção mitocondrial permanente. Ainda, estudos sobre o efeito do MMA na viabilidade e metabolismo de células neuronais e gliais foram realizados. Na linhagem neuronal tumoral PC12, o MMA diminuiu a viabilidade celular após 24h de tratamento. Os parâmetros de potencial de membrana mitocondrial e respiração foram avaliados após 7h de tratamento com MMA. MMA inibiu a respiração nas células intactas, porém, não alterou a respiração nas células permeabilizadas, nas quais não há restrição de substratos. A viabilidade de células de glioblastoma humano, U-87MG, não foi afetada pelo tratamento com MMA. Já em astrócitos de cérebro de rato em cultura primária exposta ao MMA, a viabilidade e área celular foram reduzidas significativamente e alterações morfológicas também foram notadas. Tais observações nas células gliais primárias sugerem que as células tumorais sejam mais resistentes aos efeitos deletérios do MMA. Em conjunto, estes resultados indicam que o efeito inibitório de MMA no metabolismo oxidativo mitocondrial pode ser atribuído à inibição concomitante de enzimas específicas e transportadores, limitando a disponibilidade de substratos para as vias metabólicas mitocondriais / Abstract: Methylmalonic acidemia is an inherited metabolic disorder involving a deficiency in the activity of the enzyme methylmalonyl-CoA mutase or its cofactor 5'-deoxyadenosylcobalamin that results in an accumulation of methylmalonate (MMA) in the body. There is evidence that MMA impairs mitochondrial oxidative metabolism, leading to neurodegeneration. In this study we evaluated the in vitro effect of MMA on oxygen consumption by isolated rat brain mitochondria in the presence of different respiratory chain substrates. MMA (1-10 mM) strongly inhibited glutamate-supported and succinatesupported respiration. We confirmed that the inhibitory effect of MMA on succinatesupported respiration is due to inhibition of the mitochondrial dicarboxylate transporter by MMA, blocking succinate uptake by mitochondria. Glutamate transport measurements revealed that the MMA effect on glutamate-supported respiration is not due to inhibition of mitochondrial uptake of this substrate. While MMA showed a weak inhibitory effect on glutamate dehydrogenase and aspartate transaminase, _'alfa'-ketoglutarate dehydrogenase activity was significantly inhibited by MMA (Ki = 3.65 mM). 'alfa'-ketoglutarate transport measurements showed that an exchange can take place between extramitochondrial MMA and intramitochondrial 'alfa'-ketoglutarate, depleting this substrate and consequently causing inhibition of glutamate-supported respiration. We observed that isolated brain organelles can accumulate nearly three times the concentration of extramitochondrial MMA. In addition, MMA inhibition of respiration by diced rat brain tissue was partially prevented by malate. MMA effects in vivo were studied by measuring respiration and reactive oxygen species generation in isolated brain mitochondria from young rats chronically injected (ip, 15 d) with MMA. No differences were observed between control and MMA-treated samples, indicating that in vivo MMA treatment does not lead to permanent mitochondrial dysfunction. In addition, a study into the effect of MMA on the viability and metabolism of neuronal and glial cells was carried out. In the PC12 neuronal tumor cell line, MMA decreased cell viability after 24 hours of treatment. Mitochondrial membrane potential and respiration were evaluated after 7 hours of MMA treatment. MMA inhibited respiration in intact cells but did not alter respiration in permeabilized cells, where there is no substrate deprivation. Cell viability of U-87MG human glioblastoma cells was not affected by MMA treatment. However, in cells from a primary culture of rat cerebral astrocytes, viability and cell area were significantly reduced and morphological alterations were also noted. The most evident effects of MMA were observed in primary cells, suggesting that tumor cells are more resistant to the deleterious effects of MMA. Taken together, these results indicate that the inhibitory effect of MMA on mitochondrial oxidative metabolism can be ascribed to the concurrent inhibition of specific enzymes and transporters, limiting the availability of substrates for mitochondrial metabolic pathways / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Ciências

Orientador: Roger Frigerio Castilho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T10:41:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mirandola_SandraRegina_D.pdf: 3705031 bytes, checksum: e1e34dd5e1b3949d9c308b3c20a19787 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A acidemia metilmalônica (MMAemia) é uma desordem metabólica hereditária do metabolismo de aminoácidos com cadeia ramificada e de ácidos graxos com cadeia ímpar, envolvendo um defeito na conversão de metilmalonil-CoA a succinil-CoA. Manifestações sistêmicas e neurológicas nesta doença são relacionadas com o acúmulo de metilmalonato (MMA) em tecidos e fluidos biológicos e com o comprometimento do metabolismo energético. Neste trabalho, verificou-se que o MMA inibiu com grande intensidade a conversão de lactato a piruvato catalisada pela enzima lactato desidrogenase (LDH) em homogenatos de fígado e cérebro de rato. A conversão de piruvato a lactato, catalisada pela LDH, foi menos sensível à inibição por MMA. Estudos de cinética enzimática sobre a inibição da LDH de cérebro, utilizando-se lactato como substrato, indicaram que o MMA inibe esta enzima competitivamente (Ki = 3,02 ± 0,59 mM). Propôs-se que a inibição da conversão lactato/piruvato por MMA contribui para a fisiopatologia da MMAemia, resultando, dentre outras alterações, em acúmulo de lactato e acidemia metabólica. Mostrou-se que, em mitocôndrias isoladas de cérebro e músculo de rato, concentrações milimolares de MMA inibiram o consumo de O2 mantido por succinato, enquanto nenhum efeito inibitório foi observado quando substratos para os complexos I ou IV foram utilizados. Notadamente, o efeito inibitório de MMA, mas não de malonato, no consumo mitocondrial de O2 mantido por succinato foi minimizado quando uma permeabilização não-seletiva das mitocôndrias foi induzida por alameticina. Em adição, o MMA apresentou apenas um pequeno efeito inibitório no consumo de O2 por partículas submitocondriais invertidas na presença de succinato. Não se obteve evidência de produção de malonato nas mitocôndrias tratadas com MMA. Conclui-se que o MMA inibe o consumo mitocondrial de O2 na presença de succinato por interferir na captação deste substrato pela mitocôndria. A inibição do transporte mitocondrial de substratos, induzida pelo MMA, através do carreador de dicarboxilatos, pode ter importantes implicações fisiopatológicas na MMAemia. Comparou-se a suscetibilidade de mitocôndrias isoladas de fígado, rim e coração de rato, assim como de diferentes subregiões cerebrais quanto à transição de permeabilidade mitocondrial (MPT) induzida por 3-nitropropionato (3-NP) e Ca2+. A MPT foi estimada pela queda do potencial elétrico transmembrana e inchamento mitocondrial sensíveis à ciclosporina A. Mitocôndrias de cérebro e coração foram mais suscetíveis à MPT induzida por 3-NP e Ca2+ que organelas isoladas de fígado e rim. A comparação de mitocôndrias de diferentes regiões cerebrais indicou que uma inibição parcial da respiração por 3-NP resultou em MPT mais rapidamente em organelas estriatais que corticais ou cerebelares. Em ratos tratados sistemicamente com 3-NP, verificou-se uma inibição de mesma magnitude da succinato desidrogenase em todos os tecidos estudados. Notadamente, mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos tratados sistemicamente com 3-NP apresentaram uma maior suscetibilidade à MPT induzida por Ca2+ quanto comparadas a controles. Propôs-se que a maior suscetibilidade do estriado à neurodegeneração induzida por 3-NP pode ser, pelo menos em parte, explicada por uma maior vulnerabilidade desta região cerebral à MPT, juntamente com a vulnerabilidade desta região ao influxo de Ca2+ citosólico mediado pelo estímulo de receptores de glutamato / Abstract: Methylmalonic acidemia (MMAemia) is an inherited metabolic disorder of branched amino acid and odd-chain fatty acid metabolism, involving a defect in the conversion of methylmalonyl-coenzyme A to succinyl-coenzyme A. Systemic and neurological manifestations in this disease are thought to be associated with the accumulation of methylmalonate (MMA) in tissues and biological fluids with consequent impairment of energy metabolism. In the present work it was observed that MMA potently inhibited lactate dehydrogenase (LDH)-catalyzed conversion of lactate to pyruvate in liver and brain homogenates. LDH was about one order of magnitude less sensitive to inhibition by MMA when catalyzing the conversion of pyruvate to lactate. Kinetic studies on the inhibition of brain LDH indicated that MMA inhibits this enzyme competitively with lactate as a substrate (Ki = 3.02 ± ?0.59 mM). We proposed that inhibition of the lactate/pyruvate conversion by MMA contributes to the MMAemia physiophatology, leading to lactate accumulation and metabolic acidemia. While millimolar concentrations of MMA inhibit succinate-supported O2 consumption by isolated rat brain or muscle mitochondria, there is no effect when either a pool of NADH-linked substrates or N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylendiamine (TMPD)/ascorbate were used as electron donors. Interestingly, the inhibitory effect of MMA, but not of malonate, on succinate-supported brain mitochondrial O2 consumption was minimized when nonselective permeabilization of mitochondrial membranes was induced by alamethicin. In addition, only a slight inhibitory effect of MMA was observed on succinate-supported O2 consumption by inside-out submitochondrial particles. Under our experimental conditions, there was no evidence of malonate production in MMA-treated mitochondria. We conclude that MMA inhibits succinate-supported mitochondrial O2 consumption by interfering with the uptake of this substrate. MMA-induced inhibition of substrate transport by the mitochondrial dicarboxylate carrier may have important physiopatological implications. The susceptibility of isolated mitochondria from liver, kidney and heart and different rat brain regions (striatum, cortex and cerebellum) was compared regarding to mitochondrial permeability transition (MPT) evoked by 3-nitropropionate (3-NP) and Ca2+ ions. In general, isolated brain mitochondria from different regions were more sensitive to 3-NP and Ca2+ toxicity than mitochondria from liver and kidney as estimated by decrease in the transmembrane electrical potential and mitochondrial swelling. The comparision of different brain regions revealed that the inhibition of 50% of the mitochondrial succinate-supported respiration elicited by 3-NP resulted in a Ca2+-induced MPT pore opening, inhibited by cyclosporin A, faster in striatal than in cortical and cerebellar mitochondria. It was verified an inhibition of succinate dehydrogenase activity from the same magnitude in all tissues studied after a 3-NP systemic treatment. Interestingly, isolated forebrain mitochondria obtained from rats systemically treated with 3-NP showed a more pronounced susceptibility to Ca2+-induced MPT pore opening when compared to control rats. We proposed that the increased susceptibility of rat striatum to 3-NP-induced neurodegeneration could be in part explain by a region-specific susceptibility to MPT together with increase vulnerability of this brain region to glutamate receptors-mediated cytosolic Ca2+ influx / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica