Der Wirkung von Östrogenen fällt bei vielen physiologischen und pathophysiologischen Vorgängen im menschlichen Körper eine entscheidende Rolle zu. Daraus wiederum ergibt sich ein Ansatzpunkt für Therapien von Erkrankungen. Für viele Wirkungen der Östrogene sind die Östrogenrezeptoren verantwortlich, welche diese vermitteln. Damit in bestimmten Geweben die Östrogene eine bestimmte Wirkung hervorrufen können, muss die Expression von Östrogenrezeptoren unterschiedlich reguliert werden. Mit der Entdeckung der untranslatierten Exons wurde ein möglicher Regulationsmechanismus für die Expression von Östrogenrezeptoren gefunden. Über die gewebespezifische Verwendung von untranslatierten Exons ist bisher nur wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Verwendung von untranslatierten Exons in humanen fetalen Osteoblasten (hFOB), Neuroblastomzellen (SK-N-SH), mesenchymalen Stammzellen (MSC) und Chondrozyten (T/C28a2) untersucht. Des Weiteren wurde die quantitative Expression von Östrogenrezeptor β während der Differenzierung von MSC zu Osteoblasten und Adipozyten untersucht. Zu diesem Zweck wurde aus Zellkulturen gewonnenen Zellen RNA isoliert, mit deren Hilfe eine cDNA synthetisiert wurde. Diese wurde mittels PCR amplifiziert und die gewonnenen Produkte durch Gelelektrophorese aufgetrennt und sichtbar gemacht. Zur Identifikation der PCR Produkte wurde sie einer Sequenzanalyse unterzogen. Die Versuche konnten belegen, dass in den einzelnen Zelllinien untranslatierte Exons verwendet werden. Erstmalig konnten untranslatierte Exons in fetalen Osteoblasten und mesenchymalen Stammzellen nachgewiesen werden. Tabelle 8 zeigt eine Übersicht über die bei den einzelnen Zelllinien gefundenen Exons. Zudem konnte eine Splicevariante des Exons 1 bei fetalen Osteoblasten nachgewiesen werden. Der Nachweis eines zusätzlichen untranslatierten Exons bei Osteoblasten im Vergleich zu mesenchymalen Stammzellen zeigt, dass während Differenzierungsvorgängen zusätzliche Promotorregionen zur Expression des Östrogenrezeptor β genutzt werden. Die Untersuchung der Expression des Östrogenrezeptor β während der Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen konnte keine quantitativen Unterschiede aufzeigen. Die Verwendung von sensitiveren Analysemethoden könnte hier genauere Aussagen ermöglichen. / The effects of estrogens play a crucial role in many physiological and pathophysiological processes in the human body. This has been used to develop targets for therapies for many diseases. Many effects of estrogens are mediated by estrogen receptors. To induce these effects in certain tissues, the expression of estrogen receptors must be regulated in a tissue specific manner. With the discovery of the system of the untranslated exons a possible additional mechanism of this regulation has been found. The tissue specific use of untranslated exons is not well understood. In this study the use of untranslated exons in human fetal osteoblasts (hFOB), neuroblastoma (SK-N-SH), mesenchymal stem cells (MSCs) and chondrocytes (T/C28a2) was examined. Furthermore, the quantitative expression of estrogen receptor β in the differentiation process of MSCs into osteoblasts and adipocytes was examined. For this reason RNA was isolated from cell cultures to synthesize cDNA. The cDNA was amplified by PCR and the products were separated by gel electrophoresis. To identify the PCR products they were subjected to sequence analysis. The examinations have proven that in certain cells untranslated exons are used. For the first time untranslated exons in fetal osteoblasts and mesenchymal stem cells were detected. Moreover, a splice variant of exon 1 in fetal osteoblasts has been discovered. The detection of an additional untranslated exon in osteoblasts, in comparison to mesenchymal stem cells, shows that during differentiation processes additional promoter regions for the expression of estrogen receptor β are used. The examination of the expression of estrogen receptor β in the differentiation process of mesenchymal stem cells did not show quantitative differences. The use of more sensitive analytical methods could allow more precise statements.

Östrogen bewirkt in physiologischer Konzentration in Kardiomyozyten eine schnelle Induktion des Egr-1-Promotors. Dieser Effekt wird über die Östrogenrezeptoren ER alpha und ER beta vermittelt. Überraschenderweise erfolgt die östrogenabhängige Genregulation von Egr-1 aber nicht über den klassischen Signalweg mittels Bindung des Östrogenrezeptors an östrogenresponsive Elemente (ERE), sondern findet unter Bindung von Serumfaktor an serumresponsive Elemente (SRE) des Egr-1-Promotors unter Mitbeteiligung des ERK1/2-Signalweges statt. Am Beispiel der Egr-1-Induktion durch Östrogen ließ sich die Bedeutung serumresponsiver Elemente (SRE) für die Genregulation durch Östrogen aufzeigen. In der vorliegenden Arbeit konnte damit ein neuartiger Signalweg bei der östrogenabhängigen schnellen Genaktivierung in Kardiomyozyten gezeigt werden. / The myocardium is a target tissue for estrogen. Here, we have identified rapid non-nuclear estrogen effects on the expression of the early growth response gene-1 (Egr-1) in cardiomyocytes. Egr-1 mRNA and protein were rapidly and strongly induced by estrogen in an estrogen receptor-dependent manner via the extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2. A promoter analysis study of a 1.2-kilobase Egr-1 promoter fragment revealed that the serum response elements (SREs) but not the estrogen response elements or AP-1 sites are responsible for Egr-1 induction by estrogen, identifying a novel mechanism of estrogen receptor-dependent gene activation in the myocardium. Both estrogen receptor-alpha and -beta induced the Egr-1 promoter via the SREs. These results identify SREs as important promoter control elements for an estrogen receptor-dependent mechanism of gene activation in the myocardium.

Die Behandlung menopausaler und postmenopausaler Beschwerden ist mit einem erhöhten Risiko verbunden, an Mamma- und Endometriumskarzinomen zu erkranken. Darüber hinaus zeigen epidemiologische Studien, dass in ostasiatischen Ländern postmenopausale Beschwerden, osteoporotische Frakturen und Herz-Kreislauferkrankungen seltener auftreten als in westlichen Ländern. Vor diesem Hintergrund war es Ziel der Untersuchungen dieser Arbeit, in dem Tiermodell der ovarektomierten Ratte die mögliche Bedeutung von estrogenrezeptorsubtypspezifischen Einflüssen für hormonell bedingte Erkrankungen und Beschwerden zu untersuchen. Hierbei sollten gewebespezifische Wirkungen estrogenrezeptorsubtypspezifischer Liganden untersucht und explizit die Bedeutung der Estrogenrezeptorsubtypen ERα und ERβ bei der Gewebehomöostase in Knochen und Darm analysiert werden. Darüber hinaus sollten vor dem Hintergrund estrogenrezeptorsubtypspezifischer Wirkungsweisen gewebespezifische Einflüsse des Phytoestrogens Genistein (Gen) näher charakterisiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass nach einer subkutanen Applikation der knochenprotektive Einfluss von Gen mit dem von Estradiol (E2) vergleichbar ist, durch die Kombination mit Bewegung verstärkt wird und über den ERα vermittelt zu sein scheint. Es zeigte sich außerdem, dass der stimulierende Einfluss von E2 auf den motorischen Antrieb ERα-vermittelt ist und ERβ-spezifische Liganden ebenso wie Gen diesen Effekt antagonisieren. Des Weiteren wurde deutlich, dass E2, nicht aber Gen über den ERα Einfluss auf die Körperfettverteilung nimmt. Mit einer phytoestrogenreichen Diät konnten in adulten Ratten physiologisch relevante Gen/Dai-Plasmaspiegel erreicht werden, allerdings blieben hierbei die nach einer subkutanen Applikation beobachteten knochenprotektiven Effekte dieser Phytoestrogene aus. Bei der näheren Betrachtung der Gewebehomöostase im Dünndarm zeigte sich, dass über den im Darm verstärkt exprimierten ERβ antiproliferative und proapoptotische Effekte vermittelt werden und Gen in diesem Gewebe wie ein ERβ-spezifischer Agonist wirkt. Bezogen auf eine hormonell bedingte Osteoporose, wie sie bei einem Großteil postmenopausaler Frauen auftritt, scheint das Phytoestrogen Genistein eine mögliche Alternative zur Hormonersatztherapie darzustellen. Außerdem zeigt sich, dass Genistein gewebe- und estrogenrezeptorsubtypspezifische antagonistische und agonistische Einflüsse hat und somit die Charakterisierung als „Phyto-SERMs“ (pflanzlicher selektiver Estrogenrezeptormodulator) zutreffend ist. Sollten sich in weiterführenden Studien die beobachteten Effekte im Dünndarm auch für die Gewebehomöostase im Kolon beschreiben lassen, können vor diesem Hintergrund Genistein und ERβ-spezifische Liganden für die Darmkrebsprävention diskutiert werden…

Hintergrund: Die Gustafsson sche Yin-Yang-Theorie sagt dem stimulierten Östrogenrezeptors β hemmende oder modulierende Funktionen nach. Diese Studie untersuchte die Wirkungen der Kombination aus dem selektiven Östrogenrezeptoragonisten α (16α-LE2) und β (8β-VE2) sowie der Kombination aus Östradiol und dem ERβ-Agonist an 3 Monate alten ovarektomierten Sprague-Dawley-Ratten. Die subkutane Verabreichung erfolgte für insgesamt vier Wochen in kontinuierlich simultaner und zeitversetzt zweiwöchiger, simultaner Kombination. Eine Östradiolgruppe diente als Positivkontrolle. Als physiologischer Vergleichsparameter galt eine intakte sham-ovx Gruppe. Anhand von histologischen Schnitten und Hämatoxylin-Eosin-Färbung wurden der Uterus und die Vagina auf proliferative Effekte und histomorphologisch untersucht. Zusätzlich wurden das Uterusgewicht, die Futteraufnahme, das Körpergewicht und mittels RIA der Hormonhaushalt (Östradiol, LH, TSH, fT3 und fT4) beurteilt. Die kontinuierlich verabreichten Kombinationen aus E2 bzw. dem ERα-Agonisten und dem ERβ-Agonisten präsentierten in keinem der genannten Organ- bzw. Hormonsysteme nennenswerte Unterschiede zur Wirkung von Östradiol. Die kontinuierliche Verabreichung zeigte keine bedeutenden Unterschiede zur zeitversetzten Kombination. Verglichen mit der sham-ovx Referenzgruppe präsentierten sich die Futteraufnahme, das Körpergewicht und das Hormonsystem (außer Östradiol) im physiologischen Bereich. Der Serumöstradiolwert, die uterine Schichtdicke des Myometriums und Epithels sowie die vaginale Epitheldicke wiesen supraphysiologische Werte auf. Die gewonnenen Resultate widersprechen somit der Gustafsson schen Yin-Yang-Theorie , nach welcher es durch die Stimulation des Östrogenrezeptors β zu einer hemmenden oder modulierenden Antwort der östrogenen Wirkung von Östradiol und dem selektiven ERα-Agonisten kommen sollte.

Estrogens greatly affect the activity and connectivity of serotonergic neural cell populations, which extend from clusters of nuclei in the brainstem, termed the raphe nuclei, where estrogen receptor β is the most abundantly expressed estrogen receptor subtype. Estrogenic effects on the raphe nuclei are primarily important for influencing various neuropsychological behaviors, including depression, mood swings and anxiety behaviors. Because of this connection, phases of intense hormone fluctuations for instance during menopause are often associated with several mood disturbances that often reduce the quality of life of menopausal women. Accordingly, long-term use of hormone replacement therapy appeared to be the method of choice for many menopausal women to help alleviate vasomotor symptoms, which may include neuropsychological changes such as depression. However, given the limitations and number of serious health risks attributed to hormone replacement therapy, natural compounds such as phytoestrogens are receiving widespread awareness due to their occurrence in medicinal plant extracts and a wide variety of food items including dietary supplements with respective health claims. Flavonoids, particularly the isoflavones and the naringenin-type flavanones, belong to a group of polyphenolic plant-derived secondary metabolites known to possess estrogen-like bioactivities. Nevertheless, little is known about their transactivational activity and their potential to regulate endogenous gene expression of estrogen responsive genes in the raphe nuclei due to the lack of suitable cellular models expressing sufficient amounts of functional estrogen receptor β. Hence, a raphe nuclei-derived cell line that expresses a functional estrogen receptor β was sought as a model to investigate effects of flavonoids in vitro. In this regard, RN46A-B14 cells derived from embryonic day 13 rat medullary raphe nuclei were primarily used in this study as the main cellular model. Nonetheless, expression of endogenous estrogen receptor β in these cells was not sufficient to pursue downstream investigations of estrogen-dependent activities. To overcome this deficit, a rat raphe nuclei-derived in vitro model that overexpresses a functional estrogen receptor β was initially established (herein termed RNDA cells) by stably transducing its parent cell line, RN46A-B14 cells, with a suitable lentiviral expression vector encoding a human estrogen receptor β gene. The stable expression and the functional characterization of the transgenic receptor was confirmed by Western blot analysis and luciferase reporter gene assays, respectively. The same reporter gene assay was used to scrutinize the transactivational activity of the flavonoids in RNDA cells. Key results revealed that Genistein, Daidzein, Equol, Naringenin and 8-Prenylnaringenin demonstrated high transactivational activity in a concentration-dependent manner by stimulating luciferase expression from an estrogen responsive element-regulated reporter gene construct transiently transfected in RNDA cells. Low transactivational activity was observed in RNDA cells in response to increasing concentrations of 7-(O-prenyl)naringenin-4'-acetate. However, no transactivational activity was noticed in response to 6-(1,1-Dimethylallyl)naringenin in the studied cell model. All effects elicited by the flavonoids were antagonized by the pure estrogen receptor antagonist, Fulvestrant, indicating that all substances act by binding to and activating the transgenic ERβ. Additional effects were observed in RNDA cells in response to a co-treatment of 1 µM of either Genistein or Daidzein, but not Equol, with 10 nM 17β-Estradiol. Slight antagonistic effects were observed in the same studied cell line when either 8-Prenylnaringenin or 7-(O-prenyl)naringenin-4'-acetate, but not Naringenin or 6-(1,1-Dimethylallyl)naringenin, were co-added with 17β-Estradiol. Results from the reporter gene assays were validated on the basis of regulation of mRNA expression of estrogen responsive genes following the global assessment of 17β-Estradiol-induced gene expression in this cell line using a DNA microarray technique. Out of 212 estrogen-regulated genes with at least two-fold change of expression, six were selected according to specific features of estrogenic regulation of expression. The expression of the six selected 17β-Estradiol-regulated genes was validated using quantitative real-time PCR analysis. The regulation of mRNA expression of the selected genes in response to the tested flavonoids was then investigated in RNDA cells. Additionally, because RNDA cells encode a temperature-sensitive mutant of the Simian Virus 40 large T-antigen, their neuronal differentiation is constitutive upon shifting them from conditions promoting proliferation (permissive temperature) to differentiation (non permissive temperature). Hence, the regulation of mRNA expression of the selected genes in response to the tested flavonoids was additionally investigated as RNDA cells differentiate. In RNDA cells grown under proliferative conditions, 17β-Estradiol up-regulated mRNA expression of camello-like 5, sex determining region Y-box 18 and keratin type I cytoskeletal 19. Similar effects were observed in response to 8-Prenylnaringenin, Genistein, Daidzein and Equol. In addition, 17β-Estradiol down-regulated mRNA expression of neurofilament medium polypeptide and zinc finger DHHC-type containing 2. Similar effects were observed in response to 8-Prenylnaringenin, Naringenin, Genistein, Daidzein and Equol. Yet, no effect was observed on the regulation of mRNA expression of solute carrier family 6 member 4 in response to 17β-Estradiol or the flavonoids in RNDA cells grown under proliferative conditions. When RNDA cells were shifted to conditions promoting differentiation, changes in cell morphology, in mRNA expression levels and in responsiveness towards 17β-Estradiol or the flavonoids were observed. These expression studies additionally highlighted some of the genes as indicator genes for RNDA cellular differentiation. The newly established RNDA cell line should prove useful to elucidate basic physiological properties of estrogen receptor β in the raphe nuclei. The present study should serve as the basis to help shed light on molecular and cellular mechanisms following the action of phytoestrogens, endocrine disruptors or other exogenous estrogen receptor ligands in neural cell populations, particularly the raphe nuclei, for further applications within the brain.

Das Ziel dieser Arbeit war zunächst in der Methodenoptimierung eines bereits grundlegend etablierten Protokolls zur Isolierung und Kultur equiner endometrialer Epithel (EEZ) und Stromazellen (ESZ) (BUSCHATZ 2007) zu sehen. Zudem wurde die Entwicklung weiterer Möglichkeiten des Handlings angestrebt (Passagierung, Kryokonservierung). So sollten den Zellen optimierte Rahmenbedingungen in vitro geboten werden, welche den Verhältnissen im Organismus weitgehend nahe kommen. Im Anschluss daran wurden die Zellen in vitro hinsichtlich ihrer morphologisch-funktionellen Charakteristika untersucht und die Befunde vergleichend zu den Gegebenheiten in situ betrachtet. Besonderes Augenmerk galt dabei der Expression von Progesteron- (PR) und Östrogenrezeptor-α (ERα) und von Inhibin-α. Wären vergleichbare Konstellationen in vitro und in vivo anzutreffen, könnte ein solches Kultursystem als Modell zum Studium interzellulärer Wechselwirkungen oder pathogenetischer Abläufe am Endometrium dienen. Voraussetzung hierfür wäre jedoch eine fortgeschrittene zelluläre Differenzierung, wie sie beispielsweise durch die Expression von Inhibin-α und der Steroidhormonrezeptoren angezeigt wird. Es wurden transzervikale Uterusbioptate und vollständige Uteri euthanasierter Stuten für die Zellaufreinigung sowie die vergleichende histologische Untersuchung gewonnen. Einer mechanischen und enzymatischen Dissoziation des Gewebes folgte die Separation beider Zellarten durch Filtration, Dichtegradientenzentrifugation und Differenzialadhärenz. Die Kultur erfolgte in wasserdampfgesättigter Raumluft bei 37 °C in 5 % CO2-Atmosphäre. Als Kulturmedium diente DMEM/Ham´s F-12 unter Zusatz von 2,5 % fötalem Kälberserums und diverser Additive. Es wurde eine morphologische Charakterisierung der Zellen während der Kultur vorgenommen und zudem ERα, PR und Inhibin-α an allen Kulturen und Gewebeproben immunhistologisch bestimmt. Das Ablösen der Zellen zur Passagierung erfolgte mit Trypsin-EDTA (ESZ) bzw. Alfazyme® (EEZ). Entsprechend abgelöste Zellen wurden zudem in DMSO-haltigem Nährmedium kryokonserviert. Die Kultivierung von EEZ und ESZ gelang sowohl bei Verwendung transzervikaler Uterusbioptate als auch bei Uteri euthanasierter Pferde. Zudem konnten alle physiologischerweise bei der Stute auftretenden Zyklusstände (Anöstrus, Interöstrus, Östrus) sowie ein gravider Uterus kultiviert werden. Die Konfluenz wird von EEZ nach 4 bis 16 d und von ESZ innerhalb von 7 bis 18 d erreicht, wobei Zellen aus ursprünglich proliferativen endometrialen Funktionszuständen tendenziell eher konfluent sind als sekretorisch aktive. Während der Kultur kann eine eindeutige morphologische Unterscheidung beider Zellarten voneinander erfolgen. ESZ besitzen eine spindelige, teils sternförmige, insgesamt „fibroblastenartige“ Gestalt. EEZ sind in zwei morphologischen Subtypen anzutreffen. Der monomorphe Zelltyp „A“ stellt kleine, polygonale Zellen mit regulären und regelmäßigen Zellgrenzen dar. Zelltyp „B“ ist größer, pleomorph, ebenfalls polygonal, mehrkernig und besitzt unregelmäßige, schlecht erkennbare Zellgrenzen. Subkultivierungen waren bis zu 20 (ESZ) bzw. 24 mal (EEZ) möglich. Zudem konnten beide Zellarten in flüssigem Stickstoff gelagert (kryokonserviert) und danach erfolgreich kultiviert werden. Weiterhin gelang der Nachweis von Inhibin-α im Uterus des Pferdes. Hierbei wurde eine zyklische Dynamik in der Expression festgestellt (stärkere Expression während der sekretorischen Phase), welche als Hinweis für eine sekretorische Differenzierung der EEZ anzusehen ist. Ebenfalls konnte dieses Protein in kultivierten EEZ und in viel geringerem Maße auch in den ESZ gefunden werden. Darüber hinaus war erstmalig der Nachweis von PR und ERα in beiden Zellarten in vitro möglich. Insgesamt ist die Expression dieser drei für uterines Gewebe essentiellen Rezeptoren/Proteine in kultivierten EEZ und ESZ als Hinweis für eine fortgeschrittene Differenzierung anzusehen, welche mit der vorgestellten Methode der Isolierung und Kultur auch erreicht werden konnte. Im Hinblick auf die Wachstumsgeschwindigkeit in vitro fanden sich zudem Hinweise auf eine Beibehaltung der ursprünglich im Gewebeverband erlangten zellulären Differenzierung, welche sich bei der Expression von ERα, PR bzw. Inhibin-α allerdings nicht nachvollziehen ließ. Abschließend betrachtet, deuten die vorliegenden Ergebnisse somit auf eine partielle Beibehaltung in situ erlangter endometrialer Funktionen und Spezifika hin, welche als Grundlage für weitere Arbeiten an endometrialen Zellkulturen des Pferdes anzusehen sind.

Die Behandlung menopausaler und postmenopausaler Beschwerden ist mit einem erhöhten Risiko verbunden, an Mamma- und Endometriumskarzinomen zu erkranken. Darüber hinaus zeigen epidemiologische Studien, dass in ostasiatischen Ländern postmenopausale Beschwerden, osteoporotische Frakturen und Herz-Kreislauferkrankungen seltener auftreten als in westlichen Ländern. Vor diesem Hintergrund war es Ziel der Untersuchungen dieser Arbeit, in dem Tiermodell der ovarektomierten Ratte die mögliche Bedeutung von estrogenrezeptorsubtypspezifischen Einflüssen für hormonell bedingte Erkrankungen und Beschwerden zu untersuchen. Hierbei sollten gewebespezifische Wirkungen estrogenrezeptorsubtypspezifischer Liganden untersucht und explizit die Bedeutung der Estrogenrezeptorsubtypen ERα und ERβ bei der Gewebehomöostase in Knochen und Darm analysiert werden. Darüber hinaus sollten vor dem Hintergrund estrogenrezeptorsubtypspezifischer Wirkungsweisen gewebespezifische Einflüsse des Phytoestrogens Genistein (Gen) näher charakterisiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass nach einer subkutanen Applikation der knochenprotektive Einfluss von Gen mit dem von Estradiol (E2) vergleichbar ist, durch die Kombination mit Bewegung verstärkt wird und über den ERα vermittelt zu sein scheint. Es zeigte sich außerdem, dass der stimulierende Einfluss von E2 auf den motorischen Antrieb ERα-vermittelt ist und ERβ-spezifische Liganden ebenso wie Gen diesen Effekt antagonisieren. Des Weiteren wurde deutlich, dass E2, nicht aber Gen über den ERα Einfluss auf die Körperfettverteilung nimmt. Mit einer phytoestrogenreichen Diät konnten in adulten Ratten physiologisch relevante Gen/Dai-Plasmaspiegel erreicht werden, allerdings blieben hierbei die nach einer subkutanen Applikation beobachteten knochenprotektiven Effekte dieser Phytoestrogene aus. Bei der näheren Betrachtung der Gewebehomöostase im Dünndarm zeigte sich, dass über den im Darm verstärkt exprimierten ERβ antiproliferative und proapoptotische Effekte vermittelt werden und Gen in diesem Gewebe wie ein ERβ-spezifischer Agonist wirkt. Bezogen auf eine hormonell bedingte Osteoporose, wie sie bei einem Großteil postmenopausaler Frauen auftritt, scheint das Phytoestrogen Genistein eine mögliche Alternative zur Hormonersatztherapie darzustellen. Außerdem zeigt sich, dass Genistein gewebe- und estrogenrezeptorsubtypspezifische antagonistische und agonistische Einflüsse hat und somit die Charakterisierung als „Phyto-SERMs“ (pflanzlicher selektiver Estrogenrezeptormodulator) zutreffend ist. Sollten sich in weiterführenden Studien die beobachteten Effekte im Dünndarm auch für die Gewebehomöostase im Kolon beschreiben lassen, können vor diesem Hintergrund Genistein und ERβ-spezifische Liganden für die Darmkrebsprävention diskutiert werden…

Estrogens greatly affect the activity and connectivity of serotonergic neural cell populations, which extend from clusters of nuclei in the brainstem, termed the raphe nuclei, where estrogen receptor β is the most abundantly expressed estrogen receptor subtype. Estrogenic effects on the raphe nuclei are primarily important for influencing various neuropsychological behaviors, including depression, mood swings and anxiety behaviors. Because of this connection, phases of intense hormone fluctuations for instance during menopause are often associated with several mood disturbances that often reduce the quality of life of menopausal women. Accordingly, long-term use of hormone replacement therapy appeared to be the method of choice for many menopausal women to help alleviate vasomotor symptoms, which may include neuropsychological changes such as depression. However, given the limitations and number of serious health risks attributed to hormone replacement therapy, natural compounds such as phytoestrogens are receiving widespread awareness due to their occurrence in medicinal plant extracts and a wide variety of food items including dietary supplements with respective health claims. Flavonoids, particularly the isoflavones and the naringenin-type flavanones, belong to a group of polyphenolic plant-derived secondary metabolites known to possess estrogen-like bioactivities. Nevertheless, little is known about their transactivational activity and their potential to regulate endogenous gene expression of estrogen responsive genes in the raphe nuclei due to the lack of suitable cellular models expressing sufficient amounts of functional estrogen receptor β. Hence, a raphe nuclei-derived cell line that expresses a functional estrogen receptor β was sought as a model to investigate effects of flavonoids in vitro. In this regard, RN46A-B14 cells derived from embryonic day 13 rat medullary raphe nuclei were primarily used in this study as the main cellular model. Nonetheless, expression of endogenous estrogen receptor β in these cells was not sufficient to pursue downstream investigations of estrogen-dependent activities. To overcome this deficit, a rat raphe nuclei-derived in vitro model that overexpresses a functional estrogen receptor β was initially established (herein termed RNDA cells) by stably transducing its parent cell line, RN46A-B14 cells, with a suitable lentiviral expression vector encoding a human estrogen receptor β gene. The stable expression and the functional characterization of the transgenic receptor was confirmed by Western blot analysis and luciferase reporter gene assays, respectively. The same reporter gene assay was used to scrutinize the transactivational activity of the flavonoids in RNDA cells. Key results revealed that Genistein, Daidzein, Equol, Naringenin and 8-Prenylnaringenin demonstrated high transactivational activity in a concentration-dependent manner by stimulating luciferase expression from an estrogen responsive element-regulated reporter gene construct transiently transfected in RNDA cells. Low transactivational activity was observed in RNDA cells in response to increasing concentrations of 7-(O-prenyl)naringenin-4'-acetate. However, no transactivational activity was noticed in response to 6-(1,1-Dimethylallyl)naringenin in the studied cell model. All effects elicited by the flavonoids were antagonized by the pure estrogen receptor antagonist, Fulvestrant, indicating that all substances act by binding to and activating the transgenic ERβ. Additional effects were observed in RNDA cells in response to a co-treatment of 1 µM of either Genistein or Daidzein, but not Equol, with 10 nM 17β-Estradiol. Slight antagonistic effects were observed in the same studied cell line when either 8-Prenylnaringenin or 7-(O-prenyl)naringenin-4'-acetate, but not Naringenin or 6-(1,1-Dimethylallyl)naringenin, were co-added with 17β-Estradiol. Results from the reporter gene assays were validated on the basis of regulation of mRNA expression of estrogen responsive genes following the global assessment of 17β-Estradiol-induced gene expression in this cell line using a DNA microarray technique. Out of 212 estrogen-regulated genes with at least two-fold change of expression, six were selected according to specific features of estrogenic regulation of expression. The expression of the six selected 17β-Estradiol-regulated genes was validated using quantitative real-time PCR analysis. The regulation of mRNA expression of the selected genes in response to the tested flavonoids was then investigated in RNDA cells. Additionally, because RNDA cells encode a temperature-sensitive mutant of the Simian Virus 40 large T-antigen, their neuronal differentiation is constitutive upon shifting them from conditions promoting proliferation (permissive temperature) to differentiation (non permissive temperature). Hence, the regulation of mRNA expression of the selected genes in response to the tested flavonoids was additionally investigated as RNDA cells differentiate. In RNDA cells grown under proliferative conditions, 17β-Estradiol up-regulated mRNA expression of camello-like 5, sex determining region Y-box 18 and keratin type I cytoskeletal 19. Similar effects were observed in response to 8-Prenylnaringenin, Genistein, Daidzein and Equol. In addition, 17β-Estradiol down-regulated mRNA expression of neurofilament medium polypeptide and zinc finger DHHC-type containing 2. Similar effects were observed in response to 8-Prenylnaringenin, Naringenin, Genistein, Daidzein and Equol. Yet, no effect was observed on the regulation of mRNA expression of solute carrier family 6 member 4 in response to 17β-Estradiol or the flavonoids in RNDA cells grown under proliferative conditions. When RNDA cells were shifted to conditions promoting differentiation, changes in cell morphology, in mRNA expression levels and in responsiveness towards 17β-Estradiol or the flavonoids were observed. These expression studies additionally highlighted some of the genes as indicator genes for RNDA cellular differentiation. The newly established RNDA cell line should prove useful to elucidate basic physiological properties of estrogen receptor β in the raphe nuclei. The present study should serve as the basis to help shed light on molecular and cellular mechanisms following the action of phytoestrogens, endocrine disruptors or other exogenous estrogen receptor ligands in neural cell populations, particularly the raphe nuclei, for further applications within the brain.

Das Ziel dieser Arbeit war zunächst in der Methodenoptimierung eines bereits grundlegend etablierten Protokolls zur Isolierung und Kultur equiner endometrialer Epithel (EEZ) und Stromazellen (ESZ) (BUSCHATZ 2007) zu sehen. Zudem wurde die Entwicklung weiterer Möglichkeiten des Handlings angestrebt (Passagierung, Kryokonservierung). So sollten den Zellen optimierte Rahmenbedingungen in vitro geboten werden, welche den Verhältnissen im Organismus weitgehend nahe kommen. Im Anschluss daran wurden die Zellen in vitro hinsichtlich ihrer morphologisch-funktionellen Charakteristika untersucht und die Befunde vergleichend zu den Gegebenheiten in situ betrachtet. Besonderes Augenmerk galt dabei der Expression von Progesteron- (PR) und Östrogenrezeptor-α (ERα) und von Inhibin-α. Wären vergleichbare Konstellationen in vitro und in vivo anzutreffen, könnte ein solches Kultursystem als Modell zum Studium interzellulärer Wechselwirkungen oder pathogenetischer Abläufe am Endometrium dienen. Voraussetzung hierfür wäre jedoch eine fortgeschrittene zelluläre Differenzierung, wie sie beispielsweise durch die Expression von Inhibin-α und der Steroidhormonrezeptoren angezeigt wird. Es wurden transzervikale Uterusbioptate und vollständige Uteri euthanasierter Stuten für die Zellaufreinigung sowie die vergleichende histologische Untersuchung gewonnen. Einer mechanischen und enzymatischen Dissoziation des Gewebes folgte die Separation beider Zellarten durch Filtration, Dichtegradientenzentrifugation und Differenzialadhärenz. Die Kultur erfolgte in wasserdampfgesättigter Raumluft bei 37 °C in 5 % CO2-Atmosphäre. Als Kulturmedium diente DMEM/Ham´s F-12 unter Zusatz von 2,5 % fötalem Kälberserums und diverser Additive. Es wurde eine morphologische Charakterisierung der Zellen während der Kultur vorgenommen und zudem ERα, PR und Inhibin-α an allen Kulturen und Gewebeproben immunhistologisch bestimmt. Das Ablösen der Zellen zur Passagierung erfolgte mit Trypsin-EDTA (ESZ) bzw. Alfazyme® (EEZ). Entsprechend abgelöste Zellen wurden zudem in DMSO-haltigem Nährmedium kryokonserviert. Die Kultivierung von EEZ und ESZ gelang sowohl bei Verwendung transzervikaler Uterusbioptate als auch bei Uteri euthanasierter Pferde. Zudem konnten alle physiologischerweise bei der Stute auftretenden Zyklusstände (Anöstrus, Interöstrus, Östrus) sowie ein gravider Uterus kultiviert werden. Die Konfluenz wird von EEZ nach 4 bis 16 d und von ESZ innerhalb von 7 bis 18 d erreicht, wobei Zellen aus ursprünglich proliferativen endometrialen Funktionszuständen tendenziell eher konfluent sind als sekretorisch aktive. Während der Kultur kann eine eindeutige morphologische Unterscheidung beider Zellarten voneinander erfolgen. ESZ besitzen eine spindelige, teils sternförmige, insgesamt „fibroblastenartige“ Gestalt. EEZ sind in zwei morphologischen Subtypen anzutreffen. Der monomorphe Zelltyp „A“ stellt kleine, polygonale Zellen mit regulären und regelmäßigen Zellgrenzen dar. Zelltyp „B“ ist größer, pleomorph, ebenfalls polygonal, mehrkernig und besitzt unregelmäßige, schlecht erkennbare Zellgrenzen. Subkultivierungen waren bis zu 20 (ESZ) bzw. 24 mal (EEZ) möglich. Zudem konnten beide Zellarten in flüssigem Stickstoff gelagert (kryokonserviert) und danach erfolgreich kultiviert werden. Weiterhin gelang der Nachweis von Inhibin-α im Uterus des Pferdes. Hierbei wurde eine zyklische Dynamik in der Expression festgestellt (stärkere Expression während der sekretorischen Phase), welche als Hinweis für eine sekretorische Differenzierung der EEZ anzusehen ist. Ebenfalls konnte dieses Protein in kultivierten EEZ und in viel geringerem Maße auch in den ESZ gefunden werden. Darüber hinaus war erstmalig der Nachweis von PR und ERα in beiden Zellarten in vitro möglich. Insgesamt ist die Expression dieser drei für uterines Gewebe essentiellen Rezeptoren/Proteine in kultivierten EEZ und ESZ als Hinweis für eine fortgeschrittene Differenzierung anzusehen, welche mit der vorgestellten Methode der Isolierung und Kultur auch erreicht werden konnte. Im Hinblick auf die Wachstumsgeschwindigkeit in vitro fanden sich zudem Hinweise auf eine Beibehaltung der ursprünglich im Gewebeverband erlangten zellulären Differenzierung, welche sich bei der Expression von ERα, PR bzw. Inhibin-α allerdings nicht nachvollziehen ließ. Abschließend betrachtet, deuten die vorliegenden Ergebnisse somit auf eine partielle Beibehaltung in situ erlangter endometrialer Funktionen und Spezifika hin, welche als Grundlage für weitere Arbeiten an endometrialen Zellkulturen des Pferdes anzusehen sind.

Die niedrige Inzidenz chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen (CED) in ostasiatischen Ländern im Vergleich zu Westeuropa und den USA könnte auf unterschiedliche Lebensstile und Ernährungsgewohnheiten zurückzuführen sein. Asiaten nehmen mit der Nahrung viel höhere Mengen an Isoflavonen zu sich als Europäer und US-Amerikaner. Diese sind in der Lage, wie natürliche Östrogene an Östrogenrezeptoren (ER) zu binden. Für das Östrogen 17β-Östradiol (E2) sowie selektive Liganden des ERβ sind antiinflammatorische Wirkungen im Darm bereits nachgewiesen worden. Diese Arbeit untersuchte in Modellsystemen für CED die antiinflammatorischen Eigenschaften von Isoflavonen, speziell von Genistein, und stellte einen Vergleich mit synthetischen ER-selektiven Liganden sowie E2 her, um die Involvierung der beiden ER-Subtypen zu evaluieren. In tierexperimentellen Studien wurde der Einfluss der Testsubstanzen auf Ausprägung und Verlauf einer Kolitis in zwei Nagermodellen (HLA-B27 transgene Ratte und TNBS-induzierte Kolitis) analysiert. Ein Ernährungsexperiment, in dem eine Gruppe der Tiere bereits in utero sowie postnatal über Muttermilch und Futter hohen Phytoöstrogenspiegeln ausgesetzt war, zeigte wider Erwarten keine antiinflammatorischen Effekte auf die akute Ausprägung der induzierten Kolitis. Stattdessen waren die untersuchten Parameter bei dieser Ernährungsform gegenüber prä- und postnatal normal ernährten Tieren verstärkt. Dagegen bewirkte oral verabreichtes Genistein in der chronischen Phase der TNBS-induzierten Kolitis eine Unterdrückung der Entzündungsparameter im Darm. Die subkutane Verabreichung von Genistein, eines steroidalen ERβ-selektiven Agonisten, oder von E2 führte hingegen zu keiner signifikanten Einflussnahme auf die untersuchten Parameter in der akuten Phase der Inflammation. Zur Charakterisierung der molekularen Grundlagen einer antiinflammatorischen Wirkung von E2, synthetischen ER-selektiven Agonisten und Genistein wurden in vitro Studien mit Kolonkarzinomzelllinien (HT-29 und Caco-2) durchgeführt. Hierzu wurden die Zellen mit Interleukin-1β (IL-1β) stimuliert, was eine Induktion der inflammationsassoziierten Gene Cyclooxygenase-2 und Interleukin-6 auf mRNA Ebene bewirkte. Bis auf Genistein konnten für die getesteten Substanzen keine antiinflammatorischen Effekte auf die mRNA-Expression der induzierten Markergene beobachtet werden. Genistein bewirkte in Caco-2 Zellen eine Hemmung der untersuchten Gene. Weitere Analysen ergaben, dass die beiden Zelllinien ER nur schwach bzw. gar nicht exprimieren. Eine Transfektion von HT-29 Zellen mit ERα führte zu einer deutlichen Hemmung der Expression der Markergene durch E2, während eine Transfektion mit ERβ lediglich einen schwach hemmenden Effekt bewirkte. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass die niedrigen CED-Inzidenzraten in Ostasien wohl nicht allein auf dem dortigen hohen Isoflavonkonsum beruhen, sondern auch anderen Komponenten des Lebensstils zuzuschreiben sind. Dennoch deutet sich an, dass das Genistein, bei oraler Administration, die Regeneration des geschädigten Darmgewebes im chronischen Erkrankungsverlauf unterstützen und damit auch zur Prävention von Kolonkarzinomen beitragen könnte. Bei antiinflammatorischen Effekten von ER-Liganden spielt die Transaktivierung von ER eine entscheidende Rolle. Die Wirkung von Genistein in untransfizierten Caco-2 Zellen legt jedoch auch die Teilnahme weiterer Mechanismen nahe, die noch zu untersuchen sind. Vor diesem Hintergrund erscheinen weiterführende Untersuchungen zum Einsatz von steroidalen ER-Agonisten und Genistein bei CED und den zugrunde liegenden Mechanismen als sinnvoll.