Η χρονική και χωρική ρύθμιση της έναρξης της αντιγραφής του DNA συντονίζεται από τη διαδικασία της «αδειοδότησης της αντιγραφής», η οποία εξασφαλίζει ότι η αντιγραφή θα λάβει χώρα μόνο μία φορά ανά κυτταρικό κύκλο. Η αδειοδότηση της αντιγραφής περιλαμβάνει την κατά βήμα συγκρότηση ενός συμπλόκου πρωτεϊνών, του προαντιγραφικού συμπλόκου, στις περιοχές έναρξης της αντιγραφής. Μείζον συστατικό του συμπλόκου αυτού είναι η πρωτεΐνη Cdt1, η οποία επίσης αποτελεί πρωτεολυτικό στόχο των σημείων ελέγχου κυττάρων που φέρουν βλάβες στο DNA. Στα μετάζωα, υπάρχει μια μικρή πρωτεΐνη καλούμενη Geminin, η οποία προσδένεται στην πρωτεΐνη Cdt1, αναστέλλοντας την αδειοδότηση της αντιγραφής. Η πρωτεΐνη Geminin αλληλεπιδρά με ομοιοτικούς μεταγραφικούς παράγοντες και πρωτεΐνες που αναδιαμορφώνουν τη χρωματίνη και πιστεύεται ότι αποτελεί πιθανό κρίκο που συνδέει τις διαδικασίες του κυτταρικού κύκλου και της διαφοροποίησης. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε πως η πρωτεΐνη Geminin κατατμείται σε πρωτογενή κύτταρα και καρκινικές κυτταρικές σειρές που οδηγούνται προς απόπτωση. Η κατάτμηση της πρωτεΐνης Geminin διαμεσολαβείται από την κασπάση- 3 τόσο in vivo όσο και in vitro. Δύο περιοχές στο καρβοξυτελικό τμήμα της Geminin (Κ1 και Κ2), στοχεύονται κατά την απόπτωση προκαλώντας τη δημιουργία θρυσμάτων της πρωτεΐνης Geminin. Δείξαμε ότι η κατάτμηση της πρωτεΐνης Geminin στη θέση Κ1 προάγει τον αποπτωτικό φαινότυπο και ρυθμίζεται μέσω φωσφορυλίωσης από την κινάση Casein Kinase II. Αντίθετα, μετά από κατάτμηση στη θέση Κ2, η πρωτεΐνη Geminin χάνει την ικανότητα αλληλεπίδρασης με την πρωτεΐνη Brm, καταλυτική υπομονάδα του συμπλόκου αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης SWI/SNF, ενώ διατηρεί την ικανότητα να προσδένεται στην πρωτεΐνη Cdt1, υποδεικνύοντας πως η στόχευση της πρωτεΐνης Geminin κατά την απόπτωση, επηρεάζει διαφορικά τη λειτουργία του μορίου. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας διερευνήσαμε τη ρύθμιση της πρωτεΐνης Cdt1 στο χώρο και στο χρόνο σε κύτταρα με βλάβες στο DNA. Για το σκοπό αυτό, χαρακτηρίσαμε μια μέθοδο που προκαλεί εντοπισμένες βλάβες στο DNA των κυττάρων, βασιζόμενη στη χρήση ενός παλμικού UVA laser. Με τη χρήση της μεθόδου αυτής, δείξαμε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 συσσωρεύεται στην περιοχή της βλάβης τόσο σε καρκινικά όσο και πρωτογενή κύτταρα, παράλληλα με πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην κυτταρική απόκριση στη βλάβη (γH2AX, BRCA1, MRE11, Ku70, pATM κ.ά.). Η συσσώρευση της πρωτεΐνης Cdt1 λαμβάνει χώρα ταχύτατα και προηγείται της αποικοδόμησής της. Με τη δημιουργία μεταλλαγμένων μορφών της πρωτεΐνης Cdt1 και την καταστολή της έκφρασης πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη Cdt1 με τη χρήση siRNA, δείξαμε πως η στρατολόγηση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή της βλάβης απαιτεί αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη PCNA. Βρέθηκε πως η πρωτεΐνη Cdt2, που αποτελεί μέλος του συμπλόκου της λιγάσης της ουβικουϊτίνης Cul4-DDB1Cdt2 επίσης στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης. Ποσοτικοποίηση της κινητικής συσσώρευσης πρωτεϊνών στην περιοχή της βλάβης έδειξε ότι η συσσώρευση της πρωτεΐνης Cdt1 υφίσταται κορεσμό νωρίτερα από τις πρωτεΐνες PCNA και Cdt2, ενώ αποσιώπηση της πρωτεΐνης Cdt1 δεν επηρεάζει τη στρατολόγηση των πρωτεϊνών PCNA και Cdt2. Πειράματα προσδιορισμού κινητικών αλληλεπιδράσεων με τη μέθοδο FRAP, έδειξαν ότι η πρωτεΐνη PCNA παραμένει σταθερά προσδεδεμένη στην περιοχή της βλάβης, ενώ η πρωτεΐνη Cdt1 εμφανίζει ιδιαίτερα γρήγορη κινητική. Οι μελέτες αυτές οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η πρόκληση εντοπισμένης βλάβης στο DNA οδηγεί σε εντοπισμένη κυτταρική απόκριση και στη στρατολόγηση της πρωτεΐνης PCNA στην περιοχή της βλάβης η οποία δρά ως ικρίωμα για τη δυναμική αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Cdt1. Συμπερασματικά, στο πρώτο μέρος της διδακτορική διατριβής περιγράφεται για πρώτη φορά ότι η πρωτεϊνη Geminin στοχεύεται για κατάτμηση κατά την απόπτωση, διαλευκάνονται τα μοριακά μονοπάτια που ρυθμίζουν το φαινόμενο αυτό και διερευνάται η φυσιολογική του σημασία. Προτείνεται ότι η στόχευση της Geminin από την κασπάση 3 επηρεάζει τη φυσιολογική ισορροπία μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης. Στο δεύτερο μέρος της διδακτορικής διατριβής δείχνεται ότι η πρωτεϊνη Cdt1 στρατολογείται σε περιοχές της χρωματίνης που φέρους βλάβες στο DNA. Η στρατολόγηση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή της βλάβης, παράλληλα με πρωτεϊνες απόκρισης στη βλάβη όπως οι BRCA1, pATM και Ku70, οδηγεί σε μία νέα υπόθεση για πιθανή εμπλοκή της πρωτεϊνης Cdt1 στην κυτταρική απόκριση σε βλάβες στο DNA. / The timely initiation of DNA replication is achieved through a process called licensing, which ensures that only after passage through mitosis the chromatin becomes competent for a new round of DNA replication. Licensing involves the stepwise formation of a multiprotein complex at the origins of replication, called prereplicative complex. A major component of this complex is Cdt1, which is also a critical and evolutionarily conserved proteolytic target of the DNA damage checkpoint. In metazoans, a small protein called Geminin binds to Cdt1, inhibiting replication licensing. Geminin has been proposed to coordinate cell cycle and differentiation events through balanced interactions with the cell cycle regulator Cdt1 and with homeobox transcription factors and chromatin remodeling activities implicated in cell fate decisions. Here we show that Geminin is cleaved in primary cells and cancer cell lines induced to undergo apoptosis by a variety of stimuli. Geminin targeting is mediated by caspase-3 both in vivo and in vitro. Two sites at the carboxyl terminus of Geminin are cleaved by the caspase (termed K1 and K2), producing truncated forms of Geminin. We provide evidence that Geminin cleavage is regulated by phosphorylation by Casein kinase II. Geminin cleaved at site K1 has a proapoptotic effect. Geminin cleaved at the site K2 has lost the ability to interact with Brahma (Brm), a catalytic subunit of the SWI/SNF chromatin remodeling complex, while binding efficiently to Cdt1, indicating that targeting of Geminin during apoptosis differentially affects interactions with its binding partners. In the second part of this thesis, we investigated the spatiotemporal regulation of Cdt1 in DNA-damaged cells. We introduced and characterized a method of inducing localized DNA damage, based on a UVA-pulsed laser. Using this method, we show that Cdt1 is recruited at the site of damage in parallel to the recruitment of known response factors, such as γH2AX, BRCA1, MRE11, Ku70 etc. Cdt1 recruitment at the site of damage precedes its degradation in both cancer cell lines and primary cells. Mutated forms of Cdt1 and siRNA for Cdt1-interacting proteins show that Cdt1 accumulation at the site of damage requires interactions with the protein PCNA. In addition, we found that Cdt2, a member of the Cul4-DDB1Cdt2 complex that ubiquitinates Cdt1 after DNA damage, is recruited at the site of damage. Experiments of knocking down the protein expression using siRNA and quantification of the recruitment kinetics address the molecular interplay of these proteins for the recruitment at the site of damage, while FRAP experiments revealed their dynamics. Taken together our results suggest that following DNA damage, PCNA is recruited to the site of damage, and acts as a scaffold for the dynamic interaction of Cdt1 with the damaged sites. The accumulation of Cdt1 at the site of damage suggest a possible involvement this cell cycle regulator in the DNA damage response.

Ο σκοπός της παρούσης διδακτορικής διατριβής ήταν η θεωρητική και πειραματική μελέτη της επίδρασης της αναπτυσσόμενης βλάβης που προέρχεται από διαφορετικές αιτίες στην μηχανική συμπεριφορά συνθέτων υλικών. Οι πηγές βλάβης που μελετήθηκαν ήταν: 1.Υγροθερμική Κόπωση 2. Θερμική Κόπωση 3. Ύπαρξη κεντρικής κυκλικής οπής διαφορετικών διαμέτρων ή εγκοπής διαφορετικών μηκών 4. Διαφορετικοί ρυθμοί παραμόρφωσης 5. Ερπυσμός και επανάταξη, και 6. Συνδυασμός των παραπάνω, όπως: ερπυσμός μετά από υγροθερμική ή θερμική κόπωση, ερπυσμό σε διαφορετικές θερμοκρασίες και χρονικές διάρκειες. Τα σύνθετα υλικά που μελετήθηκαν ήταν κοκκώδη, ινώδη και τύπου σάντουιτς σύνθετα υλικά. Για την καλύτερη μελέτη της μηχανικής και βισκοελαστικής συμπεριφοράς των συνθέτων υλικών, εφαρμόστηκε ένας σημαντικός αριθμός θεωρητικών μοντέλων, όπως είναι: 1. Το μοντέλο των τεσσάρων παραμέτρων. 2. Το μοντέλο των τριών παραμέτρων. 3. Το μοντέλο εναπομένουσων ιδιοτήτων, RPM. 4. Το θεωρητικό μοντέλο ανάλυσης των διεπιφανειακών ιδιοτήτων σε σάντουιτς υλικά. 5. Το μοντέλο πρόβλεψης βισκοελαστικής συμπεριφοράς στη μη γραμμική περιοχή. Τα συμπεράσματα που προέκυψαν από την παραπάνω μελέτη ήταν ιδιαίτερα ενδιαφέροντα. / The aim of the present investigation is to study not only experimentally but also theoretically the effect of damage due to different damage sources, which analytically are: a) hygrothermal fatigue, b) thermal fatigue, c) the existence of central hole (with different diameters) or notch (with different lengths), d) creep and relaxation, e) different stain rates and f) combination of the previous such as creep after hygrothermal or thermal fatigue and creep on different temperatures and time, on the mechanical and viscoelastic behavior of composites materials (reinforced with fibers and grains ), sandwich structures and different types of resin. For the better observation of the mechanical and viscoelastic behavior of composites materials, it was applied several theoretical models, which are: a) The four parameter model, b) the three parameter model, c) the RPM model (Residual Property Model) for the prediction of the residual mechanical properties of materials after damage from different sources, d) the theoretical model for the analysis of interfacial properties of sandwich structures and e) the viscoelastic model for the determination of the non elastic properties of composites material in function of the applied stress. From the present investigation useful conclusions were conducted for the determination of the mechanical behavior of composites materials (reinforced with fibres and grains or sandwich structures). In addition, the experimental results of this study were in great deal with those results of the application of the already mentioned theoretical models.

Mέσα στα πλαίσια της διπλωματικής αυτής προσεγγίστηκε μια νεα τεχνική για τη διάγνωση σφαλμάτων τετράχρονης μηχανής. Αυτή η τεχνική βασίζεται πάνω σε πιεζοηλεκτρικά υλικά και αισθητήρες και υλοποιεί την ικανότητά τους να μετατρέπουν μηχανική τάση ή πίεση σε ηλεκτρική τάση. Αυτοί οι αισθητήρες τοποθετούνται πάνω στη μηχανή και το παραγόμενο σήμα δειγματοληπτείται και περνά απο μια επεξεργασία με σκοπό την αποκόμιση μιας διάγνωσης για την κατάσταση στην οποία βρίσκεται η μηχανή αλλά και για τη συνεχή παρακολούθηση αυτής. Κατα την εκπόνηση της διπλωματικής, διαφορετικές τεχνικές για την εύρεση σφαλμάτων μηχανής χρησιμοποιούνται και προσεγγίζονται διαφορετικοί αλγόριθμοι δειγματοληψίας και επεξεργασίας με σκοπό να εξασφαλισθεί ο πιο αποδοτικός για την εφαρμογή αυτή. Ακόμα, η χρήση και οι ικανότητες των σύγχρονων ενσωματωμένων συστημάτων ερευνώνται και πιο συγκεκριμμένα του μικροεπεξεργαστή της Analog, τον ADuC7020, πάνω στον οποίο βασίζεται και η διπλωματική αυτή, για την υλοποίηση της συσκευής εντοπισμού σφαλμάτων και τον προγραμματισμό αυτής. Κατα την φάση της εξομοίωσης, ένα ημιτονοειδές σήμα χρησιμοποιήθηκε για την προσέγγιση του ήχου της μηχανής. Στο στάδιο της επεξεργασίας του σήματος χρησιμοποιήθηκε ψηφιακό φίλτρο πεπερασμένης κρουστικής απόκρισης (FIR) και τροποποιημένος αλγόριθμος DFT για τη δειγματοληψία και την επεξεργασία του ψηφικοποιημένου σήματος αλλά και για την αναγνώριση της συχνότητας. Πιο συγκεκριμένα, υλοποιήθηκε ο βελτιστοποιημένος αλγόριθμος Goertzel ο οποίος προτιμήθηκε για την επίτευξη μεγαλύτερων ταχυτήτων. Τέλος, υλοποιήθηκε και η τεχνική της υπερδειγματοληψίας για την επίτευξη μεγαλύτερης ακρίβειας. Ο προγραμματισμός έγινε σε γλώσσα C και το λογισμικό που χρησιμοποιήθηκε ήταν το μVision4 της Keil. / At the present thesis we examine the automatic fault detection in petrol engines using piezoelectric sensors in embedded systems.

Μηχανισμοί οι οποίοι εξασφαλίζουν τη σωστή διαδοχή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου συμβάλλουν στη διασφάλιση της γονιδιωματικής σταθερότητας των κυττάρων. Η αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA, η συγκρότηση επί των αφετηριών της αντιγραφής του DNA του προ-ανιγραφικού συμπλόκου, καθορίζει τη σωστή χρονικά και τοπικά έναρξη της αντιγραφής. Βασικό συστατικό αυτού του συμπλόκου είναι ο παράγοντας Cdt1. Η Geminin προσδένεται στο Cdt1, αναστέλοντας τη δράση του από την S μέχρι και την Μ φάση, παρεμποδίζοντας, έτσι, την αδειοδότηση της αντιγραφής. Παρά το οτι φυσική αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών έχει δειχθεί τόσο in vitro όσο και in vivo, προηγούμενες μελέτες δείχνουν οτι έκφραση των Cdt1 και Geminin εντοπίζεται σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Τα φυσιολογικά κύτταρα, ανάλογα με τα μηνύματα που δέχονται, είτε παραμένουν σε μιτωτικό κύκλο, είτε εξέρχονται από αυτόν προς φάση ηρεμίας (ή G0), διαφοροποίηση ή γήρανση. Αυστηρός συντονισμός των παραπάνω διαδικασιών είναι απαραίτητος προκειμένου να διασφαλιστεί η ομοιόσταση των πολύπλοκων δομών των ιστών των μεταζώων. Προηγούμενες μελέτες προτείνουν το σύστημα της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA ως έναν βασικό ρυθμιστή της εξόδου από τον κυτταρικό κύκλο και της επανεισόδου στη G1. Οι παράγοντες Cdt1 και Geminin ρυθμίζονται αρνητικά κατά την έξοδο των κυττάρων σε G0, ενώ έκφρασή τους χαρακτηρίζει διαιρούμενα κύτταρα. Σε αντίθεση με τις άλλες καταστάσεις εκτός κυτταρικού κύκλου, λίγα είναι γνωστά αναφορικά με τη ρύθμιση των Cdt1 και Geminin κατά την κυτταρική γήρανση. Στο πρώτο μέρος της διατριβής εστιαστήκαμε στη μελέτη του προτύπου έκφρασης των Cdt1 και Geminin κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου πρωτογενών ανθρώπινων ινοβλαστών, και στη σύγκρισή του με εκείνο των καρκινικών κυττάρων. Διαπιστώσαμε οτι τόσο η ενδοκυτταρική εντόπιση όσο και η ικανότητα των Cdt1 και Geminin να εκφράζονται σε συγκεκριμένες φάσεις του κυτταρικού κύκλου, δεν διαφοροποιούνται στους πρωτογενείς φυσιολογικούς ινοβλάστες σε σχέση με κύτταρα που προέρχονται από καρκινικό ιστό. Επιπλέον, δείξαμε οτι ο παράγοντας Cdt1 εκφράζεται αποκλειστικά σε BrdU-αρνητικά κύτταρα, σε αντίθεση με την Geminin, η οποία δείχνει να συσσωρεύεται σταδιακά μετά την έναρξη της S φάσης, ενώ δεν εντοπίστηκε συνέκφραση των δύο πρωτεϊνών στο χρονικό παράθυρο της G1/S μετάβασης. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας εστιαστήκαμε στη μελέτη της έκφρασης του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1 και του αρνητικού ρυθμιστή αυτού, Geminin, κατά την είσοδο των κυττάρων σε κυτταρική γήρανση και εξετάσαμε την πιθανή λειτουργική εμπλοκή τους στην εξέλιξη του φαινομένου. Δείξαμε οτι, ενώ οι παράγοντες Cdt1 και Geminin διατηρούν τη σωστή ενδοκυτταρική εντόπιση και το σωστό πρότυπο έκφρασης κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, υφίστανται αρνητική ρύθμιση σε κύτταρα που εισέρχονται σε κυτταρική γήρανση, τόσο αναπαραγωγική όσο και πρόωρη, επαγόμενη από οξειδωτικό στρες. Το γεγονός οτι η μείωση της έκφρασης της Geminin προηγήθηκε της εμφάνισης του γηρασμένου φαινοτύπου, μας ώθησε στην περαιτέρω διερεύνιση του λειτουργικού ρόλου της Geminin στην επαγωγή της κυτταρικής γήρανσης. Για το σκοπό αυτό, απορρυθμίσαμε τα επίπεδα έκφρασης της Geminin σε πρωτογενή φυσιολογικά κύτταρα ανθρώπου και ποντικού, αξιοποιώντας την τεχνολογία του RNAi και ρετροϊικά συστήματα υπερέκφρασης γονιδίων αντίστοιχα. Δείξαμε οτι η μείωση της έκφρασης της Geminin σε ανθρώπινους ινοβλάστες (χρησιμοποιώντας siRNAs αλλά και pSUPER πλασμιδιακούς φορείς αποσιώπησης γονιδίων που κατασκευάστηκαν ειδικά για την Geminin) επάγει αύξηση της κυτταρικής γήρανσης της καλλιέργειας. Επιπλέον, κύτταρα που στερούνταν της έκφρασης της Geminin ήταν πιο επιρρεπή σε γήρανση επαγόμενη από οξειδωτικό στρες, σε σχέση με τα κύτταρα-μάρτυρες. Ετεροζυγώτες για το γονίδιο της Geminin εμβρυικοί ινοβλάστες ποντικού εμφάνιζαν μεγαλύτερα ποσοστά κυτταρικής γήρανσης σε σχέση με τους αντίστοιχους ινοβλάστες αγρίου τύπου. Αντίθετα, αύξηση των επιπέδων της Geminin σε αγρίου τύπου εμβρυικούς ινοβλάστες ποντικού προκάλεσε μείωση της εμφανιζόμενης γήρανσης. Τέλος, η μείωση των επιπέδων έκφρασης του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1 σε ανθρώπινα κύτταρα ήταν, επίσης, σε θέση να επάγει ισχυρό φαινότυπο κυτταρικής γήρανσης. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματα μας αναδεικνύουν την κρισιμότητα του ισοζυγίου Cdt1:Geminin στα κύτταρα, και προτείνουμε οτι η διατάραξη της ισορροπίας αυτής είναι ικανή να επάγει κυτταρική γήρανση, μέσω διαδικασιών όπως η υπεραδειοδότηση ή η υποαδειοδότηση της αντιγραφής του DNA. / Genome integrity relies on the strict alternation of S and M phases of the cell cycle, so that one and only round of DNA replication takes place per cell cycle. This is achieved through replication licensing, which involves the formation of a multi-protein complex, the pre-replicative complex, onto origins of replication. Cdt1 is a crucial component of this complex and Geminin, a small protein shown to tightly bind Cdt1, inhibits its licensing function from S to M phase, when licensing is illegitimate. Although previous experimental evidence shows that Cdt1 and Geminin are expressed in different phases of the cell cycle, physical interaction between these two proteins has been demonstrated in vitro as well as in vivo. The fate of a normal cell is not perpetual division. Cells may exit the mitotic cell cycle to enter quiescence, to terminally differentiate or to senesce. These “out-of-cycle-states” must be strictly regulated in order to establish and maintain the hierarchical organization of complex tissues in metazoa. Replication licensing has been proposed to coordinate cell-cycle exit and re-entry in vitro and in metazoan tissues. Cdt1 and Geminin down-regulation during exit to quiescence supports the idea that their expression correlates with cell proliferation. In contrast to other out-of-cycle states, little is known about the regulation of Cdt1 and Geminin expression during cellular senescence. Senescence refers to the irreversible resting state of cells grown for succeeding passages in culture, as a response to DNA damage caused by telomeres erosion. Other stimuli, such as oxidative or oncogenic stress, may force mitotically competent cells to respond similarly, a phenomenon termed as Stress Induced Premature Senescence (SIPS). The first part of this work focused on the study of the expression patterns of Cdt1 and Geminin during the unperturbed cell cycle of primary human fibroblasts and compared to that of tumor-derived cell lines. The cell cycle specific expression and the intracellular localization of both proteins, as assessed at a single-cell level using indirect immunofluorescence and a new monoclonal antibody against Geminin, appear similar in primary fibroblasts compared to the cancer cells examined. Cdt1 is strictly expressed in BrdU-negative cells, whereas Geminin starts accumulating after S phase onset. The two proteins are, therefore, not co-expressed at the ”time-window” of G1/S transition of the cell cycle. We showed that Cdt1 levels, but not those of Geminin, are mainly regulated in a proteasome-dependent way during normal cell cycle of human primary and cancer cells. The second part of this work focused on the investigation of Cdt1 and Geminin during cellular senescence and their possible role in the establishment of the senescence phenotype. To this end, primary human fibroblasts were maintained in culture for succeeding passages in order to induce them to undergo replicative senescence. Alternatively, an H202-induced senescence protocol was applied to force cells to undergo premature senescence (Stress-Induced Premature Senescence/SIPS). We show that, although Cdt1 and Geminin retain their nuclear localization and are correctly expressed during specific phases of the cell cycle during both replicative and Η202-induced premature senescence, their expression levels are down-regulated. In SIPS-experiments, Geminin down-regulation is an early event during the establishment of the senescent-phenotype, as assessed by senescence-associated β-Galactosidase and BrdU incorporation assays. This prompted us to further examine Geminin’s functional significance in the establishment of cellular senescence. To achieve this, we interfered with Geminin expression levels in human and mouse cells. Using RNA interference techniques, we were able to show that Geminin depletion from human cells is able to induce a senescent-phenotype in a fraction of the treated culture. Similarly, Geminin-depleted human cells were more susceptible to Η202-induced premature senescence, compared to control cells. Heterozygotes for Geminin mouse embryonic fibroblasts were more prone to senescence compared to their control counterparts. In contrast, when Geminin was over-expressed in control mouse embryonic fibroblasts cultures, senescent phenotype was reduced. Finally, a strong senescent-phenotype was induced when the licensing regulator, Cdt1, was silenced within human cells. Taken together, we conclude that Cdt1:Geminin balance within cells is crucial, and when disturbed, is able to promote a senescent phenotype, possibly through a mechanism that involves over- or under-licensing of DNA replication.

Ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης είναι η τέταρτη συχνότερη κακοήθεια στους άνδρες και η δέκατη στις γυναίκες και η ετήσια επίπτωσή του αυξάνει συνεχώς στις ανεπτυγμένες χώρες. Oι προγνωστικοί παράγοντες που χρησιμοποιούνται σήμερα δεν μπορούν να προβλέψουν με βεβαιότητα την μακροπρόθεσμη έκβαση του ουροθηλιακού καρκίνου και έτσι προκύπτει η ανάγκη αναγνώρισης δεικτών με δυνατότητα πρόγνωσης της συμπεριφοράς των καρκινωμάτων. Επιπλέον, δεδομένων των περιορισμένων δυνατοτήτων των σημερινών θεραπευτικών επιλογών (χειρουργική αντιμετώπιση, χημειοθεραπεία ή ανοσοθεραπεία και ακτινοθεραπεία), απαιτούνται νέες θεραπευτικές στρατηγικές. Μία τέτοια στρατηγική είναι η στόχευση σε μεταγραφικούς παράγοντες όπως οι πυρηνικοί υποδοχείς και οι upstream ενεργοποιητές τους. Η διαταραχή αυτών των μεταγραφικών παραγόντων είναι κομβικό σημείο της έναρξης και διατήρησης του κακοήθους φαινοτύπου. O πυρηνικός υποδοχέας PPARγ εμπλέκεται στον έλεγχο του μεταβολισμού, την κυτταρική ανάπτυξη, την αγγειογένεση και την ανοσολογική και φλεγμονώδη απάντηση. Επιπρόσθετα, υπάρχουν ενδείξεις ότι ρυθμίζει τους μηχανισμούς καταστολής αλλά και προαγωγής της καρκινογένεσης. Ο RXRα είναι επίσης μέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων και ετεροδιμερίζεται με τον PPARγ προς σχηματισμό του συμπλόκου που αλληλεπιδρά με το DNA. Οι προσδέτες των RXR υποδοχέων έχουν ήδη χρησιμοποιηθεί στη χημειοπρόληψη διαφόρων μορφών καρκίνου. Ο μεταγραφικός παράγoντας AP-1, απαρτίζεται από διμερή των Fos και Jun πρωτεϊνών και η δράση του σχετίζεται με την πρόοδο της καρκινογένεσης. Υπάρχουν πάντως και ενδείξεις για προ-αποπτωτική δράση του. Η CBP είναι ένας απ’ τους σημαντικότερους ολοκληρωτές σημάτων της μεταγραφής. Ο ανταγωνισμός μεταξύ των PPARγ και AP-1 για τη CBP είναι ένας απ’ τους μηχανισμούς που εξηγούν την αρνητική «συνομιλία» (cross-talk) μεταξύ των PPARγ και AP-1. Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε τόσο ξεχωριστά όσο και σε συνδυασμό μεταξύ τους, την έκφραση των πέντε μοριακών παραγόντων (PPARγ, RXRα, p-c-Jun, c-Fos, CBP) στο φυσιολογικό ουροθήλιο, τις προκαρκινικές αλλοιώσεις και τα ουροθηλιακά καρκινώματα (ΟΚ). Τα ιστικά δείγματα προήλθαν από 88 ασθενείς οι οποίοι υπέστησαν διαγνωστική βιοψία ή θεραπευτική κυστεκτομή, νεφρεκτομή ή ουρητηρεκτομή. Εφαρμόστηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος σε τομές παραφίνης και εκτιμήθηκε η σχετική έκφραση των μελετώμενων παραγόντων στα ενδοκυττάρια διαμερίσματα, τις ενδοεπιθηλιακές στιβάδες και τις φυσιολογικές ή παθολογικές ιστολογικές βαθμίδες. Όλοι οι παράγοντες παρουσίασαν κυρίως πυρηνική εντόπιση. Η έκφραση του p-c-Jun ελαττώνεται στους ασθενείς άνω των 70 ετών σε σχέση με τους νεώτερους, ενώ κανένα άλλο απ’ τα μελετώμενα μόρια δε φαίνεται να επηρεάζεται από την ηλικία. Η έκφραση των PPARγ, CBP, p-c-Jun και c-Fos σημειώνει αύξηση κατά την πορεία προς τον καρκίνο. Όσο αφορά στα ΟΚ, οι PPARγ και CBP παρουσιάζουν αρνητική συσχέτιση με την αποδιαφοροποίηση. Επιπλέον ο PPARγ συσχετίζεται αρνητικά με την απόκτηση χαρακτήρων διήθησης στα ΟΚ. Αντιθέτως, η έκφραση του RXRα δεν διακυμαίνεται στατιστικώς σημαντικά σε όλη την πορεία της καρκινογένεσης. Η ανάλυση της συνδυασμένης έκφρασης των πέντε παραγόντων έγινε με σκοπό την αποκάλυψη ενδεχόμενων αλληλεπιδράσεων μεταξύ τους. Η προστατευτική δράση του PPARγ στο ουροθήλιο συνοδεύεται από ταυτόχρονη μέτρια ή ισχυρή έκφραση των RXRα, p-c-Jun και c-Fos. Αναλυτικά, η αυξανόμενη έκφραση του p-c-Jun συμπίπτει με ενίσχυση της θετικής συσχέτισης του PPARγ με καλύτερα διαφοροποιημένους, λιγότερο διηθητικούς όγκους, ενώ ο c-Fos φαίνεται να εξασθενίζει ήπια την ευνοϊκή δράση του PPARγ στη διαφοροποίηση του ουροθηλίου. Η αυξανόμενη έκφραση της CBP έδειξε να εξασθενίζει και τελικά να εκμηδενίζει τη στατιστικά σημαντική αύξηση του PPARγ στην πορεία προς τον καρκίνο και την επαγωγή του στους μη διηθητικούς όγκους σε σύγκριση με τους διηθητικούς. Ταυτόχρονα, η αρνητική σχέση της CBP με την αποδιαφοροποίηση και την αύξηση της κακοήθειας των ΟΚ επηρεάζεται από την παρουσία των PPARγ και AP-1, επιβεβαιώνοντας την υπόθεση της συνομιλίας αυτών των μοριακών παραγόντων. Ενδιαφέρουσα είναι η παρατήρηση ότι οι περισσότερες από τις αναφερθείσες πιο πάνω συσχτίσεις μεταξύ των μοριακών παραγόντων ίσχυαν για μεγαλύτερους των 70 ετών αλλά όχι πάντα για τους νεώτερους ασθενείς. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης μπορούν πιθανόν να οδηγήσουν σε συμπεράσματα με εφαρμογή σε χημειοπροληπτικές και θεραπευτικές στρατηγικές για τον ουροθηλιακό καρκίνο. / Bladder cancer is the fourth and tenth most common malignancy in men and women, respectively, and its incidence is increasing annually in the developed countries. Current prognostic parameters cannot predict with certainty the long-term outcome of bladder cancer and as a result there is a need to identify markers that may predict tumor behavior. Furthermore, given the limitations of current therapeutic options (surgery, chemotherapy or immunotherapy and radiotherapy), novel treatment strategies are very much needed. One such strategy targets transcription factors such as nuclear receptors and their upstream activators. Disruption of these transcription factors is a key element in the initiation and maintenance of a malignant phenotype. The nuclear receptor PPARγ is involved in controlling metabolism, cell growth, angiogenesis, and immune and inflammatory responses. In addition, it has also been suggested that it regulates tumor suppression as well as tumor promotion. RXRα is another member of the nuclear receptor superfamily, that partners PPARγ to form the DNA-binding complex. RXR ligands are already being used as chemopreventive agents in various types of cancer. The transcription factor AP-1 is formed by dimerization of Jun and Fos proteins and its activity is often associated with tumor progression. On the other hand, there is also evidence that AP-1 may enhance apoptosis. CBP is one of the most important transcriptional integrators. The competition of PPARγ and AP-1 for CBP is one of the multiple mechanisms that explain the negative PPARγ/AP-1 cross-talk. In the present study, we assessed separate and concurrent expression of the five factors (PPARγ, RXRα, p-c-Jun, c-Fos, CBP) in normal urothelium, precancerous lesions and urothelial carcinomas (UC). Clinical samples were derived from 88 patients who had undergone diagnostic biopsy or therapeutic excision of the bladder, the kidney or the ureter. Parafin section immunohistochemistry was utilized and relative expression was estimated in intracellular compartments, intraepithelial layers and histologic categories of urothelium. All five factors had mainly nuclear pattern of expression. P-c-jun was downregulated in patients older than 70 years old compared to younger ones, whereas age did not affect the expression of the rest four factors. PPARγ, CBP, p-c-Jun and c-Fos were upregulated towards tumorigenesis. PPARγ and CBP showed an inverse relationship with carcinoma level of differentiation. Moreover, PPARγ expression downregulated significantly in invasive tumors compared to non-invasive ones. On the contrary, RXRα expression did not vary significantly along the carcinogenesis course. The following correlations were based on coexpression analysis to reveal molecular interactions between the five factors. The established protective effect of PPARγ on urothelium was accompanied by concomitant RXRα, p-c-Jun and c-Fos moderate or strong expression. In detail, p-c-Jun’s increasing expression strengthened the positive relation of PPARγ with better differentiated, less invasive tumors, whereas c-Fos seemed to mildly lessen PPARγ’s favourable effect in urothelium differentiation. Statistically significant PPARγ upregulation in malignant tissues compared to normal urothelium and in non-invasive tumors compared to invasive ones is suppressed and finally cancelled by CBP’s increasing expression. PPARγ and AP-1 seemed to influence the negative relation of CBP with loss of differentiation and increase of malignant potential in UC, an observation that denotes a cross-talk between these molecular factors. Interestingly, most of the aforementioned correlations were noticed in patients older than 70 years old, but not all of them were plausible in younger patients. The results from the present study could lead to conclusions possibly applicable in chemoprevention and therapy strategies for urothelial carcinomas.