Η αδειοδότηση της αντιγραφής αποτελεί μία ιδιαίτερα σημαντική διαδικασία, η οποία λαμβάνει χώρα στις θέσεις έναρξης της αντιγραφής με το σχηματισμό του προ-αντιγραφικού συμπλόκου, που περιλαμβάνει το ORC, το Cdc6, το Cdt1 καθώς και τις MCM 2-7. Η συγκεκριμένη διαδικασία, πραγματοποιείται μία φορά σε κάθε κυτταρικό κύκλο, κατά τη μετάβαση από την M φάση στη G1. Οι παράγοντες που συμμετέχουν υπόκεινται σε εκτεταμένη ρύθμιση προκειμένου να εξασφαλιστεί η απουσία επαναντιγραφής και γονιδιωματικής αστάθειας. Η πρωτεόλυση μορίων που συμμετέχουν στον κυτταρικό κύκλο αποτελεί έναν από τους μηχανισμούς που χρησιμοποιούν τα κύτταρα για τη ρύθμιση των επιπέδων διαφόρων παραγόντων. Το CRL4Cdt2 αποτελεί μία Ε3 λιγάση της ουβικουϊτίνης, η οποία είναι επιφορτισμένη με τη ρύθμιση των επιπέδων του αδειοδοτικού παράγοντα της αντιγραφής Cdt1 κατά την S φάση καθώς και μετά από βλάβες στο γενετικό υλικό. H συγκεκριμένη διαδικασία έχει διαπιστωθεί πως λαμβάνει χώρα σε όλα τα μετάζωα, καθώς και στον σχιζοσακχαρομύκητα. Μεταξύ των υποστρωμάτων του Cdt2 περιλαμβάνονται επίσης το Set8 και το p21. Στην παρούσα διπλωματική εργασία, πραγματοποιήθηκε μελέτη των περιοχών της πρωτεΐνης Cdt2 που είναι υπεύθυνες για τη στρατολόγηση της στην περιοχή της εντοπισμένης βλάβης στο γενετικό υλικό. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε καρκινικά κύτταρα MCF7 που υπέστησαν εντοπισμένη βλάβη στο γενετικό υλικό με UV-C ακτινοβόληση και χρήση ειδικών πολυκαρβονικών φίλτρων με μικροπόρους. Για τη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν φορείς που εκφράζουν το αμινο-τελικό (2-417αα) και το καρβοξυ-τελικό (390-730αα) άκρο της πρωτεΐνης, καθώς και ένα μετάλλαγμα ολόκληρης της πρωτεΐνης όπου 6 SQ θέσεις που εντοπίζονται καρβοξυ-τελικά έχουν μεταλλαχθεί σε αλανίνες και δεν μπορούν να φωσφορυλιωθούν από τις ATM/ATR κινάσες. Μετά τη διεξαγωγή των πειραμάτων συσσώρευσης, διαπιστώθηκε πως στην περιοχή της εντοπισμένης βλάβης στρατολογούνται μόνο το Cdt2 6A(SQ) και Cdt2 (390-730). Ωστόσο, η συσσώρευση τους παρουσιάζεται ελαφρώς ασθενέστερη σε σχέση με την πρωτεΐνη αγρίου τύπου. Η συγκεκριμένη παρατήρηση καταδεικνύει πως στην περίπτωση του Cdt2 6A(SQ) η φωσφορυλίωση στις συγκεκριμένες SQ θέσεις είναι σημαντική για τη συσσώρευση της πρωτεΐνης στην περιοχή της βλάβης. Η στρατολόγηση του Cdt2 (390-730) στην περιοχή της βλάβης, συνιστά μία σημαντική παρατήρηση, η οποία υποδεικνύει ότι η πρωτεΐνη Cdt2 διατηρεί την ικανότητα συσσώρευσης στην περιοχή της βλάβης, παρά την απουσία των αλληλουχιών που βρίσκονται στο αμινο-τελικό άκρο και συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση με τα υποστρώματα αλλά και στο σχηματισμό του συμπλόκου της λιγάσης. Προκειμένου να μελετηθεί η κινητική στην περιοχή της εντοπισμένης βλάβης των μεταλλαγμάτων που παρουσιάζουν συσσώρευση, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της επαναφοράς φθορισμού μετά από φωτολεύκανση (FRAP). Τα αποτελέσματα, κατέδειξαν πως τόσο στα κύτταρα χωρίς βλάβη, αλλά και σε αυτά με εντοπισμένη βλάβη υπάρχει παρόμοια κινητική μεταξύ της πρωτεΐνης αγρίου τύπου και των δύο μεταλλαγμάτων. Έτσι, η ύπαρξη μεταλλάξεων σε 6 SQ θέσεις στην περίπτωση του Cdt2 6A(SQ), αλλά και η απώλεια των αμινοτελικών αλληλουχιών στο Cdt2 (390-730) δεν μεταβάλλουν την κινητική στην περιοχή της βλάβης. Τέλος, έγινε μελέτη της συμβολής της φωσφορυλίωσης από τις ATM/ATR κινάσες, στη συσσώρευση στην περιοχή της βλάβης. Γι’ αυτό το λόγο έγινε χρήση της καφεΐνης, που αποτελεί αναστολέα των συγκεκριμένων κινασών. Τα αποτελέσματα, κατέδειξαν πως υπάρχει πολύ ασθενέστερη συσσώρευση στη συγκεκριμένη περίπτωση σε σχέση με την πρωτεΐνη αγρίου τύπου και το Cdt2 6A(SQ). Με αυτό τον τρόπο υποδεικνύεται πως η φωσφορυλίωση σε όλες τις SQ θέσεις του μορίου, είναι σημαντική για τη συσσώρευση του στην περιοχή της βλάβης. / Replication licensing is a crucial process which takes place at the origins of replication. It involves the formation of the pre-replicative complex consisting of ORC, Cdc6, Cdt1 and MCM 2-7. This process takes place during the late M to early G1 transition and happens only once per cell cycle. The tight regulation of the factors that participate in replication licensing prevents rereplication and genomic instability. Proteolysis is a central mechanism of the cell cycle which is important for the regulation of several factors. CRL4Cdt2 is an E3 ubiquitin ligase important for the regulation of the licensing factor Cdt1 during S phase and post DNA damage. It is known that the ubiquitination of Cdt1 by Cdt2 happens in all metazoans and in fission yeast. Set8 and p21 are also substrates of Cdt2. In this study, we investigated the domains of Cdt2 which are important for its recruitment at sites of localized DNA damage. To this end, we employed MCF7 cancer cells which were UV irradiated with polycarbonate filters with micropores. We used plasmids containing N-terminal (2-417aa) and C-terminal (390-730aa) constructs of the protein and a mutant of the entire protein containing alanine substitutions in 6 SQ sites located at the C-terminus of the protein which cannot be phosphorylated by the ATM/ATR kinases. The recruitment experiments indicated that only in the case of Cdt2 (390-730) and Cdt2 6A(SQ) there is recruitment at the site of localized DNA damage. However the recruitment in both cases was weaker compared to the wild type protein. In the case of Cdt2 6A(SQ) this observation indicates the importance of the phosphorylation of the six SQ sites for the recruitment of the protein at the site of damage. Cdt2 (390-730) recruitment indicates that Cdt2 can still get recruited at the site of damage even though it lacks motifs important for the recognition of the substrate and the formation of the ligase complex. In order to study the kinetics of the protein constructs that exhibit recruitment at the site of localized DNA damage we employed Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). The results showed that the kinetics of the constructs were similar to the wild type in undamaged cells and in cells with localized damage. This shows that the lack of phosphorylation of 6 SQ sites of Cdt2 6A(SQ) and the loss of the N-terminal motifs of Cdt2 (390-730) are not sufficient to cause any difference in the kinetics at the site of damage. Finally, we wanted to investigate the importance of the phosphorylation by the ATM/ATR kinases for the recruitment of Cdt2 at the sites of localized DNA damage. To this end, we employed the ATM/ATR inhibitor caffeine and we tracked the recruitment at the site of damage. The results showed that the recruitment was weaker compared to the wild type Cdt2 and the Cdt2 6A(SQ). This indicates the importance of the phosphorylation of the 9 SQ sites across the protein for the recruitment at the site of damage.

Η αδειοδότηση εξασφαλίζει τη χωροχρονική ρύθμιση της αντιγραφής του γενετικού υλικού. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, η πρωτεΐνη Cdt1 καθορίζει πότε θα λάβει χώρα η αδειοδότηση και η έκφρασή της είναι αυστηρώς ρυθμισμένη, διαμέσου πολλαπλών μονοπατιών. Διατάραξη της ισορροπίας της ρύθμισης της αντιγραφής οδηγεί σε γονιδιωματική αστάθεια, ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό ή σε κυτταρικό θάνατο. Γονιδιωματική αστάθεια σε ένα οργανισμό επίσης προκαλείται από βλάβες στο γενετικό υλικό, είτε εξαιτίας περιβαλλοντικών παραγόντων, είτε εξαιτίας τυχαίων αλλαγών που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια του μεταβολισμού του. Για την αντιμετώπιση των βλαβών έχουν εξελικτικά προκύψει επιδιορθωτικοί μηχανισμοί εξειδικευμένοι στην αντιμετώπιση κάθε τύπου βλάβης. Ο παράγοντας Cdt1 φαίνεται να διασυνδέει τα μονοπάτια της αδειοδότησης της αντιγραφής με αυτά της απόκρισης σε βλάβη στο DNA, γεγονός που τον καθιστά ενδιαφέροντα για περαιτέρω μελέτη. Στο πρώτο μέρος της μελέτης θα γίνει χαρακτηρισμός μια μεθόδου που προκαλεί ολική ή εντοπισμένη βλάβη στο γενετικό υλικό κυττάρων με χρήση υπεριώδους ακτινοβολίας. Με τη τεχνική αυτή θα μελετηθεί σε καρκινικές σειρές η πρωτεΐνη Cdt1 και η ταχύτητα πρωτεόλυσής της.Σε μικροσκόπιο φθορισμού θα μελετηθεί ο εντοπισμός και σε συνεστιακό μικροσκόπιο η κινητική της πρωτεΐνης αυτής, καθώς και η μεταλλαγμένη μορφή Cdt1 (Cdt1+4A), η οποία δεν αλληλεπιδρά με το πρωτεολυτικό μηχανισμό Cul4-DDB1Cdt2,. Η μελέτη της κινητικής γίνεται σε ζωντανά κύτταρα καρκινικών σειρών με σκοπό την κατανόηση της ιεράρχησης των γεγονότων που συμβαίνουν σε περιοχές στοχευμένης βλάβης από υπεριώδη ακτινοβολία στο γενετικό υλικό. Με την τεχνική επαναφοράς φθορισμού μετά από φωτολεύκανση (Fluoresent Recovery After Photobleaching) θα παρακολουθηθεί η επαναφορά του σήματος με σκοπό την ποσοτικοποίηση της δεσμευμένης πρωτεΐνης. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης θα αναπτυχθούν μέθοδοι κανονικοποίησης και ανάλυσης 6 πειραματικών δεδομένων λειτουργικής μικροσκοπίας με εργαλεία το οποία αναπτύχθηκαν ειδικά για την ανάλυση πειραμάτων FRAP (easyFRAP). Επίσης αναλύεται η δημιουργία κατάλληλου λογισμικού και η βελτιστοποίηση τεχνικών παρατήρησης της επαναφοράς του φθορισμού μετά από μεγάλα χρονικά διαστήματα, της τάξεως των ωρών έναντι της κλασικής μεθόδου όπου η παρατήρηση διαρκεί κάποια δευτερόλεπτα. Τέλος ακολουθεί σύγκριση της εφαρμογής easyFRAP με την εφαρμογή FRAPcalc, η οποία χρησιμοποιείται επίσης για την κανονικοποίηση και οπτικοποίηση δεδομένων FRAP. / The process of licensing of DNA replication ensures that the cell cycle proceeds to timely regulated replication. In metazoa, Cdt1 is the factor that ensures the regulation of licensing. Cdt1 is tightly regulated through various biological pathways and it is functionally conserved through evolution. If the regulation of Cdt1 is disturbed, genomic instability, uncontrolled replication and apoptosis may occur. Genomic instability may also occur in an organism after DNA damage, either due to environmental factors, or due to random mutations. Evolution has provided cells with various DNA damage response mechanisms for all kinds of damages. The cell cycle regulatory protein Cdt1 has been postulated to link the cell cycle and the DNA damage responses, therefore Cdt1 is a very interesting protein for further studying. At the first part of our study we introduced a method for total or localized DNA damage in live cells with the use of ultraviolet radiation. With this technique we showed that on different cancer cell lines the protein Cdt1, accumulate fast in the sites of damage. With a fluorescent microscope we studied the localization and with a confocal microscope we investigated the kinetics of wild type Cdt1 linked with a green fluorescent protein tag, along with the study of a Cdt1 mutant (Cdt1+4A) again linked with a green fluorescent protein tag. Cdt1+4A has lost the ability to associate with the proteolytic mechanism of Cul4-Ddb1Cdt2. In live cells, in order to investigate the spatiotemporal regulation of DNA damage response we used Fluorescent Recovery after Photobleaching (FRAP) technique and we studied the protein kinetics and we quantified the percentage of the bound protein on the chromatin. At the second part of our study, we present the normalization method we used for our raw experimental data. For the purpose of this analysis, tools and softwares were developed for accurate normalization. We also aimed to optimize a technique for the observation of fluorescent recovery after photobleaching during long periods of time, in contrast with the typical short FRAP experiments. Finally, we describe a brief comparison between the FRAP analysis tool we developed(easyFRAP) and another software commercially available (FRAPcalc) for that purpose.

Αντικείμενο της διατριβής είναι η ανάπτυξη νέας γενιάς ινωδών σύνθετων υλικών με αυξημένη ανοχή στη βλάβη, βελτιωμένα θραυστομηχανικά και μηχανικά χαρακτηριστικά. Αυτό θα επιτευχθεί με ενίσχυση (ντοπάρισμα) της πολυμερούς μήτρας που περιβάλλει την ινώδη ενίσχυση του σύνθετου υλικού με μικρή ποσότητα –μικρότερη ή ίση του 1% κατά βάρος- νανοσωληνίσκων άνθρακα ομοιόμορφα κατανεμημένων στη μήτρα. Οι νανοσωληνίσκοι άνθρακα προσφέρουν μια εξαιρετικά μεγάλη διεπιφάνεια μήτρας-ενίσχυσης η οποία και οδηγεί στη συνέχεια το φαινόμενο της θραύσης απαιτώντας την κατανάλωση μεγάλων ποσοτήτων ενέργειας για την αστοχία της διεπιφάνειας και τη διάδοση της βλάβης. Το κύριο κομμάτι της διατριβής αφορούσε τη μελέτη της επίδρασης των ΝΣΑ σε σύνθετα υλικά. Το πρώτο μέλημα ήταν εάν μπορούσαν να κατασκευαστούν νανοσύνθετα με τις κλασικές μεθόδους κατασκευής σύνθετων υλικών κάτι που πραγματοποιήθηκε με επιτυχία τόσο για τα σύνθετα με ενισχυτική φάση τις ίνες άνθρακα σε δύο διαφορετικές αλληλουχίες στρώσεων όσο και για τις ίνες κέβλαρ. Καταλήγοντας συμπεραίνουμε πως η κατασκευή νανοσύνθετων υλικών είναι εφικτή με τις ήδη υπάρχουσες κατασκευαστικές μεθόδους. Τα νανοσύνθετα έχουν να επιδείξουν ανώτερες μηχανικές ιδιότητες σε σχέση με τα απλά σύνθετα ιδιαίτερα στα φαινόμενα της θραύσης και της κόπωσης κάτι το ιδιαίτερα σημαντικό για την εφαρμογή τους σε δομικά τμήματα κατασκευών από σύνθετα υλικά. Επιπλέον είναι δυνατό να αποτελέσουν τη βάση για τα σύνθετα υλικά της επόμενης γενιάς μέσω των πολύπλευρων ιδιοτήτων που μπορούν να προσδώσουν (multifunctionality) όπως επισκόπηση της αναπτυσσόμενης βλάβης σε πραγματικό χρόνο μέσω της μέτρησης της ηλεκτρικής αγωγιμότητας, βελτιστοποίηση των ιδιοτήτων απόκρισης και αύξηση της θερμικής αγωγιμότητας. / The aim of the current PhD thesis was realised during 2004-2008 at University of Patras, Grece, in the Dept. of Mechanical & Aeronautical Engineering at the Applied Mechanics Laboratory under the supervision of Prof. V. Kostopoulos was to investigate and optimise the reinforcing effect of Multi Wall Carbon Nanotubes (MWCNTs) on a typical aerospace carbon reinforced epoxy composite. The main conclusions/findings of this PhD thesis are summarized below: • The dispersion protocol of MWCNTs onto a typical aerospace resin using a mechanical device was established. • Different techniques were investigated such as to improve the dispersion of the CNTs into the matrix material. • The reinforcing effect of MWCNTs onto a typical aerospace resin was investigated and optimized at 0.5 w.t. % using a high shear mixing device i.e. torus mill. • The CNT-enhanced aerospace resin was successfully used for the manufacturing of two CFRPs lay-ups (UD and Quasi). The nano-reinforced panels exhibited a higher tensile modulus, a 60% increased on fracture toughness, increased fatigue life and even though no significant increase was noted on the low velocity impact properties the effective compressive modulus after fatigue and the fatigue life after impact was also enhanced. The aforementioned reinforcement is attributed to the extra energy that the CNTs anticipate in order to be broken or pulled-out of the matrix material • The CNT-enhanced aerospace resin was successfully used for the manufacturing of Kevlar reinforced composite panels. The nano-reinforced panels exhibited a higher tensile modulus and a significant increase on the fracture toughness properties. • MWCNTs were successfully grafted on typical aerospace carbon fibres in order to manufacture a reinforcement incorporating two scales i.e. both micro and nano.

Παρστατίνη ονομάζεται το πεπτίδιο 41 αμινοξέων που αποκόπτεται από το αμινοτελικό άκρο του υποδοχέα PAR-1 κατά την ενεργοποίησή του από τη θρομβίνη. Προηγούμενες πειραματικές μελέτες κατέδειξαν ότι η Παρστατίνη δρα ώς καρδιοπροστατευτικός παράγων κατά την ισχαιμία-επαναιμάτωση του μυοκαρδίου. Σκοπός της παρούσης μελέτης ήταν η διερεύνηση της επίδρασης της Παρστατίνης στη νεφρική βλάβη εξ ισχαιμίας - επαναιμάτωσης. Μια πιθανή τέτοια δράση θα καθιστούσε την Παρστατίνη πολύτιμο εργαλείο σε μια σειρά κλινικών συνθηκών που σχετίζονται με το συγκεκριμένο φαινόμενο περιορισμού της νεφρικής λειτουργίας. Μέθοδος και αποτελέσματα: Σε μια πρώτη φάση του πειράματος Παρστατίνη διαφόρων συγκεντρώσεων χορηγήθηκε σε 77 αρσενικούς επίμυες οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργικά επαγόμενη νεφρική ισχαιμία 45 λεπτών και μετέπειτα 4ωρη επαναιμάτωση. Στο τέλος της περιόδου αυτής τα πειραματόζωα θανατώθηκαν και δείγματα αίματος, ούρων και νεφρών ελήφθησαν προς ανάλυση. Η Παρστατίνη βρέθηκε να παρουσιάζει στατιστικά σημαντική νεφροπροστατευτική δράση έναντι του σχετικού μάρτυρα, όπως αυτή καταδείχτηκε από τον περιορισμό της αύξησης της κρεατινίνης πλάσματος, του κλάσματος “franctional excretion of Na (FENa)” και των ιστολογικών βλαβών στο νεφρικό παρέγχυμα. Δεδομένης της αποτελεσματικότητας της Παρστατίνης στην πρώιμη φάση της μελέτης, ένα πεπτιδικό παράγωγο 26 αμινοξέων της Παρστατίνης (η ακολουθία των αμινοξέων της Παρστατίνης από τη θέση 1 έως και 26 - Π1-26) μελετήθηκε στο ίδιο πειραματικό μοντέλο σε 29 αρρουραίους, με σκοπό να καταδειχθεί αν το μικρότερο αυτό μόριο διατηρούσε τη δράση του μητρικού μορίου και ταυτόχρονα εμφάνιζε βελτιωμένη αποτελεσματικότητα. Στη δεύτερη φάση, το Π1-26 αναδείχτηκε εξίσου ισχυρός νεφροπροστατευτικός παράγων με το μητρικό μόριο. Συμπεράσματα: Η Παρστατίνη καθώς και το μόριο Π1-26 δρουν ως νεφροπροστατευτικοί παράγοντες κατά την ισχαιμία-επαναιμάτωση του νεφρού του αρουραίου. Μελέτες σε άλλα πειραματικά είδη καθώς και σε διαφορετικά μοντέλα νεφρικής ισχαιμίας κρίνονται σκόπιμες προκειμένου να επιβεβαιώσουν τα πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα της παρούσης μελέτης. Τα συγκεκριμένα αποτελέσματα έρχονται να προστεθούν στην προσφάτως αναγνωρισμένη καρδιοπροστατευτική δράση της Παρστατίνης. Αναδεικνύεται επομένως πως η νεφροπροστατευτική και καρδιοπροστατευτική ιδιότητα του μορίου αυτού πιθανώς να μην είναι ειδική για τα όργανα που έχουν μελετηθεί, αλλά η Παρστατίνη να δρα ενάντια στο φαινόμενο της βλάβης εξ’ ισχαιμίας επαναιμάτωσης εν γένει, ανεξάρτητα από τον ιστό στον οποίο αυτό συμβαίνει. Επέκταση της μελέτης και σε άλλους ιστούς κρίνεται αναγκαία. / Parstatin, is a 41 amino acid peptide that is cleaved from the proteinase-activated receptor-1 (PAR-1) during its activation by thrombin. Previous studies have demonstrated that parstatin as well as its hydrophobic N-terminal part (parstatin 1-26) demonstrate cardioprotective properties in in-vivo and in vitro experimental models of cardiovascular ischemia reperfusion injury. In this study we examine whether parstatin as well as parstatin1-26 attenuates renal ischemia reperfusion injury (RIRI) in a rat model. Methods In total 106 male Wistar rats were used for the purposes of this study. RIRI model included 45 minutes of bilateral renal ischemia, though clamping of both renal pedicles, followed by 4 hours of reperfusion. The effects of Parstatin on RIRI were initially examined in 77 animals divided into 8 groups including sham (vehicle/no ischemia), sham/parstatin (parstatin/no ischemia), control (vehicle pretreatment/ischemia), parstatin 3-100μg/Kg (pretreatment with 3, 10, 30 or 100μg/Kg parstatin/ischemia), scramble (pretreatment with a non-parstatin 41 aminoacid peptide/ischemia) and after (ischemia/administration of 30μg/Kg parstatin after ischemia). The effects of parstatin 1-26 were then examined in 29 animals divided into 5 groups, including control (veicle/ischemia), parstatin1-26 1-100 μg/Kg (pretreatment with 1, 10 or 100μg/Kg parstatin1-26/ischemia) and after (ischemia/administration of 10μg/Kg parstatin1-26 after ischemia). At the end of reperfusion period all animals were sacrificed and their kidneys, urine and blood samples were taken for histological and biochemical examination. Studied parameters were serum creatinine and BUN levels, Fractional Excretion of Sodium (FENa) and histological evaluation of renal specimens. Results Administration of 10 or 30μg/Kg of parstatin before or 30μg/Kg after renal ischemia attenuated RIRI. Dose response study revealed that at the higher examined dose (100μg/Kg parstatin effects were reversed. Pretreatment with 10μg/Kg of parstatin1-26 attenuated RIRI as well. Nevertheless, parstatin1-26 failed to induce statistically significant nephroprotection when administered after ischemia. Conclusions Parstatin as well its hydrophobic N-terminal segment, parstatin1-26, can preserve renal function and histological status in RIRI. The later reveals a potential role of this molecule in clinical entities related to the phenomenon of RIRI such as partial nephrectomy.

Combining good material properties and low weight, composites have become increasingly popular over the past decades among conventional, well-studied engineering materials. With their anisotropic nature and laminated structure allowing for enhanced design potential compared to metals, the widening use of composites in operating structures has turned the need for reliable inspection and condition assessment into an issue of great importance. Unlike metals, failing due to a propagating critical crack, the inhomogeneous and anisotropic nature of composites renders a more complicated behavior: composite structures bear the applied design loads during the entire service life, while damage accumulates. High damage tolerance is thus another important advantage over metals. The main source of damage in a composite is mechanical and/or environmental loading. Several failure mechanisms are encountered during service: matrix cracking, debonding of the fibre-matrix interface, delaminations and fibre breakage are common damage modes. Although this is their actual temporal sequence in general, propagation and coalescence of failure mechanisms are often simultaneous and therefore, damage in the composite can be regarded as the superposition of various failure modes. Damage accumulation, either localized or distributed throughout the volume of the composite, leads to degradation of the composite material mechanical properties. Matrix cracking is one of the major damage mechanisms encountered in FRP composites during service. Although seemingly less critical than delaminations and fibre breakage, propagation and coalescence of matrix cracks precede and promote more severe damage modes. Characteristic consequences of matrix-dominated failure are debondings at the trailing edge or between stiffening components and the skin, in wind turbine rotor blades, and also material degradation due to ingress of fluids, in composite pipes. However, since formation of matrix cracks begins at sub-critical loading stages, appropriate non-destructive tools should contribute to reliable damage assessment throughout service. Aiming to damage assessment in composite materials, non-destructive inspection (NDI) relished rapid and broad development. Acoustic emission and acousto-ultrasonics are listed among well-established NDI techniques. These acoustic methods are able to reflect the integrated damage state of a structure. The scope of this dissertation is NDI assessment of distributed damage in glass/epoxy (Gl/Ep) fibre-reinforced (FRP) composites, using acoustic emission and acousto-ultrasonics. Most research on the use of acoustic methods for non-destructive inspection is concentrated on the detection of localized defects, generated either during fabrication or in-service. A considerable amount of publications is also focused on the more complicated, distributed damage, e.g. due to fatigue. In most cases, however, acoustic emission and acousto-ultrasonics are not suggested as stand-alone tools, but are rather used to indicate qualitative trends or to complement other methods in the investigation of damage progression. Although a common outcome from this approach is that AE and AU signal parameters are, in general, correlated with damage accumulation, no robust models for remaining life or strength prediction have been proposed. Such NDI tools for the assessment of strength degradation, due to fatigue, in fibre-reinforced composites, exclusively via acoustic non-destructive measurements, are proposed in the present work. Reliable engineering models, based on acoustic emission and acousto-ultrasonic measurements, are established and validated in dedicated chapters. Residual strength prediction in composite specimens, featuring matrix cracking due to fatigue, is thus accomplished. This thesis is based on experimental work performed on an improved Gl/Ep composite, used in the manufacturing of new generation wind turbine rotor blades. The work included thorough material characterization as well as a dedicated experimental series aiming to understand, model and assess the axial, transverse and shear strength degradation of the unidirectional composite. Besides preliminary and benchmark testing, the exhaustive experimental schedule included 713 valid mechanical tests. From these 713 specimens, 222 were tested in tension/compression, 236 were subjected to constant-amplitude fatigue loading and 29 to spectrum loading. Another 217 specimens were used to investigate strength degradation due to constant-amplitude loading and 9 due to variable-amplitude loading. To execute this grand experimental plan, our 4-member team occupied 3 testing machines for 52 months. Although scrupulous indeed, the material characterization stage was just a prerequisite for the residual strength experimental task. In common practice, residual strength tests are a combination of a damaging process, e.g. fatigue loading, and a static test to failure. However, the aim of this dissertation was strength degradation assessment using non-destructive techniques. Residual strength tests were thus accompanied with acoustic emission monitoring, stiffness degradation measurements and acousto-ultrasonic scanning. This increased the duration of the experiments at least 4-fold, while rendering the procedure much more complicated. However, a unique database was formed, including data from all discrete steps. This extensive and combined information is a novel contribution in the field of non-destructive inspection. Acoustic emission monitoring and acousto-ultrasonic measurements were herein used to assess material strength degradation due to fatigue-induced matrix cracking. The goal was accomplished with remarkable success and reliable engineering AE and AU-based models were introduced. These validated schemes were based on the largest experimental database so far produced. Moreover, the proposed models were generalized, i.e. applicable in all damage states examined. As obvious this could seem for acousto-ultrasonics, this is not the case regarding acoustic emission measurements. Thus, from the acoustic emission side, this generalization renders an original contribution. AE-based models proved able to assess tensile and also compressive strength degradation. This is another novel achievement. In this thesis, the proposed AE models were superior to the respective descriptor-based AU schemes. However, although performance of the second, using novel descriptors, was more than adequate, wave propagation in the specimen under consideration was also studied. This area failed to produce new descriptors or schemes, however indicated damage-associated qualitative trends in the recorded signals. Several issues related to the acousto-ultrasonic experimental technique were underlined and the complexness of the problem depicted. The experiments presented herein were performed in the frame of EC research project "OPTIMAT BLADES: Reliable Optimal Use of Materials for Wind Turbine Rotor Blades", ENK6-CT-2001-00552. Partial funding was provided by the Greek Secretariat for Research and Technology, F.K. 6660. It is emphasized that no other partner of the OPTIMAT BLADES project, engaged in non-destructive condition assessment, managed to propose successful engineering NDT models. / Συνδυάζοντας καλές μηχανικές ιδιότητες με το χαμηλό τους βάρος, τα σύνθετα υλικά αποδεικνύονται εξαιρετικά δημοφιλή σε σχέση με τα συμβατικά, κατά κόρον χρησιμοποιούμενα υλικά. Με την ανισότροπη φύση και την πολύστρωτη δομή τους να προσδίδουν επιπλέον δυνατότητες στο σχεδιασμό σε σύγκριση με τα μέταλλα, η διευρυνόμενη χρήση συνθέτων υλικών σε κατασκευές καθιστά την αξιόπιστη επιθεώρηση και εκτίμηση της δομικής τους ακεραιότητας ένα θέμα καταλυτικής σημασίας. Σε αντίθεση με τα μεταλλικά υλικά, που αστοχούν εξ’ αιτίας της διάδοσης μιας κρίσιμης ρωγμής, η ανομοιογενής και ανισότροπη φύση των συνθέτων παρουσιάζει πολυπλοκότερη συμπεριφορά: οι κατασκευές από σύνθετα υλικά υπόκεινται στα επιβαλλόμενα φορτία καθ’ όλη την προβλεπόμενη διάρκεια λειτουργίας τους, οπότε και η βλάβη συσσωρεύεται. Η υψηλή ανοχή στη βλάβη αποτελεί ένα επιπλέον πλεονέκτημα σε σύγκριση με τα μέταλλα. Την κύρια αιτία δημιουργίας βλάβης σε ένα σύνθετο υλικό αποτελεί η μηχανική και/ή περιβαλλοντική φόρτιση. Διάφοροι μηχανισμοί αστοχίας απαντώνται κατά τη λειτουργία: η ρηγμάτωση της μήτρας, η αποκόλληση στη διαπιφάνεια ίνας-μήτρας, οι αποκολλήσεις διαδοχικών στρώσεων και η θραύση ινών αποτελούν συνήθεις τρόπους αστοχίας. Παρ’ όλο που αυτή είναι εν γένει και η χρονική τους ακολουθία, η διάδοση και η συνένωση τρόπων αστοχίας είναι συχνά ταυτόχρονες και επομένως η βλάβη σε ένα σύνθετο μπορεί να θεωρηθεί ως η συμβολή διαφόρων μηχανισμών αστοχίας. Η συσσώρευση της βλάβης, είτε τοπική είτε κατανεμημένη στον όγκο του συνθέτου, οδηγεί στην υποβάθμιση των μηχανικών ιδιοτήτων του υλικού. Η ρηγμάτωση της μήτρας αποτελεί έναν από τους κύριους μηχανισμούς αστοχίας που απαντώνται σε ινώδη σύνθετα υλικά κατά τη διάρκεια λειτουργίας τους. Αν και λιγότερο κρίσιμη φαινομενικά από τις αποκολλήσεις στρώσεων και τη θραύση ινών, η διάδοση και συνένωση ρωγμών στη μήτρα προηγείται και επισπεύδει σοβαρότερους τρόπους αστοχίας. Χαρακτηριστικά παραδείγματα συνεπειών της αστοχίας από ρηγμάτωση της μήτρας αποτελούν οι αποκολλήσεις των ενισχυτικών δοκίδων στα πτερύγια ανεμογεννητριών καθώς και η υποβάθμιση του υλικού λόγω εισροής υγρών, σε σωληνώσεις από σύνθετο υλικό. Ωστόσο, αφού η έναρξη δημιουργίας ρωγμών στη μήτρα παρατηρείται σε υποκρίσιμα επίπεδα φορτίου, κατάλληλα μη καταστροφικά εργαλεία αναμένονται να είναι αποτελεσματικά στην αξιόπιστη και έγκαιρη εκτίμηση της συσσώρευσης βλάβης κατά τη λειτουργία. Με σκοπό την εκτίμηση της βλάβης στα σύνθετα υλικά, η ανάπτυξη μη καταστροφικών μεθόδων ελέγχου (ΜΚΕ) ήταν ταχύτατη και ευρεία. Ανάμεσα στις συνήθεις μεθόδους ΜΚΕ συγκαταλέγονται και οι ακουστικές, όπως η ακουστική εκπομπή και οι ακουστο-υπέρηχοι. Οι μέθοδοι αυτές δύνανται να εκφράσουν τη γενικευμένη δομική ακεραιότητα της κατασκευής. Η διατριβή αυτή αποσκοπεί στην εκτίμηση, με μη καταστροφικούς τρόπους και συγκεκριμένα με τις παραπάνω ακουστικές μεθόδους, της κατανεμημένης βλάβης σε δοκίμια από εποξειδική ρητίνη ενισχυμένη με μακριές ίνες υάλου. Οι περισσότερες έρευνες πάνω στη χρήση ακουστικών μεθόδων ΜΚΕ εστιάζουν στον εντοπισμό τοπικών ατελειών, που δημιουργούνται είτε κατά την παραγωγική διαδικασία είτε κατά τη λειτουργία. Ένας σημαντικός αριθμός εργασιών επίσης αφορά την πολυπλοκότερη, κατανεμημένη βλάβη, παραδείγματος χάριν λόγω κόπωσης. Στις περισσότερες περιπτώσεις, όμως, η ακουστική εκπομπή και οι ακουστο-υπέρηχοι δεν συνιστώνται ως αυτόνομα εργαλεία, αλλά μάλλον χρησιμοποιούνται για να αναδείξουν ποιοτικές τάσεις ή να συμπληρώσουν άλλες μεθόδους στη διερεύνηση της συσσώρευσης της βλάβης. Αν και ένα σύνηθες συμπέρασμα της προσέγγισης αυτής είναι πως οι χαρακτηριστικές παράμετροι που προκύπτουν από τα σήματα ακουστικής εκπομπής και ακουστο-υπερήχων συσχετίζονται εν γένει με τη δομική ακεραιότητα, αξιόπιστα πρότυπα εκτίμησης εναπομένουσας αντοχής ή ζωής δεν έχουν προταθεί. Τέτοια εργαλεία ΜΚΕ για την πρόβλεψη της υποβάθμισης της αντοχής, λόγω κοπωτικής φόρτισης, σε ινώδη σύνθετα υλικά, χρησιμοποιώντας αποκλειστικά μετρήσεις από ακουστικές μεθόδους, προτείνονται στην παρούσα εργασία: αξιόπιστα μηχανιστικά πρότυπα, βασισμένα στις μετρήσεις ακουστικής εκπομπής και ακουστο-υπερήχων εμπεδώνονται και αξιολογούνται σε ειδικά αφιερωμένα κεφάλαια. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται εκτίμηση της εναπομένουσας αντοχής σε δοκίμια από σύνθετο υλικό με ρηγμάτωση της μήτρας λόγω κόπωσης. Το πειραματικό μέρος της εργασίας πραγματοποιήθηκε σε ένα βελτιωμένο σύνθετο από εποξειδική ρητίνη ενισχυμένη με μακριές ίνες υάλου, που χρησιμοποιείται στην παραγωγή πτερυγίων ανεμογεννητριών νέας γενιάς. Περιελάμβανε πλήρη χαρακτηρισμό του υλικού καθώς και μια στοχευμένη πειραματική σειρά με σκοπό την κατανόηση, προσομοίωση και εκτίμηση της υποβάθμισης της αξονικής, εγκάρσιας και διατμητικής αντοχής της μονοαξονικής στρώσης. Εκτός από τις προκαταρκτικές δοκιμές που απαιτήθηκαν, το εκτενές πειραματικό πρόγραμμα αποτελούταν από 713 πειράματα. Από αυτά, 222 ήταν σε στατικό εφελκυσμό/θλίψη, 236 σε κοπωτική φόρτιση σταθερού εύρους και 29 σε φασματική φόρτιση. Επιπλέον, 217 δοκίμια χρησιμοποιήθηκαν στη διερεύνηση της υποβάθμισης της αντοχής λόγω κοπωτικής φόρτισης σταθερού εύρους και 9 λόγω κοπωτικής φόρτισης μεταβαλλόμενου εύρους. Για την πραγματοποίηση των πειραμάτων, η τετραμελής ερευνητική μας ομάδα απασχόλησε 3 μηχανές δοκιμών για 52 μήνες. Η εκτεταμένη διαδικασία χαρακτηρισμού του υλικού ήταν απαραίτητη στο μετέπειτα έργο της διερεύνησης της εναπομένουσας αντοχής. Σύμφωνα με τη συνήθη πρακτική, τα πειράματα εναπομένουσας αντοχής αποτελούνται από μια διαδικασία εισαγωγής βλάβης, παραδείγματος χάριν μια κοπωτική φόρτιση, και μία στατική δοκιμή έως τη θραύση. Ωστόσο, ο σκοπός της συγκεκριμένης διατριβής ήταν η πρόβλεψη εναπομένουσας αντοχής με μη καταστροφικούς τρόπους. Τα πειράματα, λοιπόν, συνοδεύτηκαν από καταγραφή ακουστικής εκπομπής, μετρήσεις υποβάθμισης της δυσκαμψίας και δοκιμές ακουστο-υπερήχων. Αυτό οδήγησε σε αύξηση του πειραματικού χρόνου τουλάχιστον τετράκις, καθιστώντας ταυτόχρονα την ακολουθούμενη διαδικασία αρκετά πολυπλοκότερη. Δημιουργήθηκε όμως μια μοναδική στο είδος της βάση δεδομένων, περιλαμβάνοντας δεδομένα από όλα τα επιμέρους βήματα. Αυτή η ευρύτατη και συνδυασμένη πληροφορία αποτελεί καινοτόμο συνεισφορά στο πεδίο του μη καταστροφικού ελέγχου. Η ακουστική εκπομπή και οι ακουστο-υπέρηχοι χρησιμοποιήθηκαν, στην εργασία αυτή, στην εκτίμηση της υποβάθμισης της αντοχής του υλικού από ρηγμάτωση στη μήτρα λόγω κοπωτικής φόρτισης. Ο σκοπός επιτεύχθηκε με αξιοσημείωτη επιτυχία με την εισαγωγή αξιόπιστων εμπειρικών προτύπων βασισμένων σε μετρήσεις ακουστικής εκπομπής και ακουστο-υπερήχων. Επιπλέον, τα προτεινόμενα πρότυπα ήταν γενικευμένα, δηλαδή εφαρμόσιμα σε όλες τις επιμέρους περιπτώσεις βλάβης που εξετάστηκαν. Όσο προφανές αυτό φαίνεται στην περίπτωση των ακουστο-υπερήχων, για την ακουστική εκπομπή αποτελεί καινοτόμο συνεισφορά. Επιπρόσθετα, τα πρότυπα ακουστικής εκπομής αποδείχτηκαν ικανά να εκτιμήσουν τόσο την εφελκυστική όσο και τη θλιπτική εναπομένουσα αντοχή των δοκιμίων, πράγμα που επίσης αποτελεί καινοτομία. Στην παρούσα διατριβή, τα προτεινόμενα πρότυπα ακουστικής εκπομπής αποδείχτηκαν ανώτερα σε επίδοση από τα προερχόμενα από μετρήσεις ακουστο-υπερήχων. Ωστόσο, η επίδοση και των δεύτερων, χρησιμοποιώντας νέες χαρακτηριστικές παραμέτρους, ήταν πολύ ικανοποιητική. Στο πλαίσιο αυτό μελετήθηκε επίσης η κυματική διάδοση στο υπό εξέταση δοκίμιο. Από το πεδίο αυτό δεν προέκυψαν νέες παράμετροι ή πρότυπα, όμως από την ανάλυση των καταγεγραμμένων σημάτων διαπιστώθηκαν ποιοτικές τάσεις σχετικές με τη συσσωρευμένη βλάβη. Αρκετά θέματα υπογραμμίστηκαν αναφορικά με το πειραματικό σκέλος των δοκιμών ακουστο-υπερήχων και τονίστηκε η πολυπλοκότητα του προβλήματος. Οι δοκιμές που παρουσιάζονται εδώ πραγματοποιήθηκαν στο πλαίσιο του Ευρωπαϊκού ερευνητικού προγράμματος "OPTIMAT BLADES: Reliable Optimal Use of Materials for Wind Turbine Rotor Blades", ENK6-CT-2001-00552. Μερική χρηματοδότηση δόθηκε από τη Γενική Γραμματεία Έρευνας & Τεχνολογίας, Φ.Κ. 6660. Επισημαίνεται πως κανείς από τους συνεργάτες του προγράμματος οι οποίοι εφάρμοσαν τεχνικές ΜΚΕ, δεν κατόρθωσε να προτείνει οποιοδήποτε συναφές πρότυπο.

Η αθηροσκλήρυνση είναι μια παθολογική διαδικασία η οποία λαμβάνει χώρα στις μεγάλες αρτηρίες και αποτελεί την υποκείμενη αιτία καρδιαγγειακών συμβαμάτων, εγκεφαλικών επεισοδίων και περιφερικής αρτηριακής νόσου. Η τυπική αθηροσκληρυντική βλάβη αποτελείται από έναν λιπιδικό πυρήνα που καλύπτεται από ινώδες περίβλημα. Ορισμένοι «ευάλωτοι» ασθενείς εμφανίζουν σε μεγάλο ποσοστό τις λεγόμενες «ασταθείς» βλάβες. Αυτές είναι αλλοιώσεις που έχουν την τάση να ρήγνυνται με αποτέλεσμα το σχηματισμό θρόμβου ο οποίος μερικά ή ολικά αποφράσσει την κυκλοφορία. Στην εργασία αυτή μελετώνται η παθοφυσιολογία του φαινομένου και οι παράγοντες που σχετίζονται με την τοπική και συστηματική βιολογία και συμμετέχουν στην αστάθεια και ρήξη της πλάκας. / Atherosclerosis is a pathological process that takes place in the large arteries and constitutes the amenable cause of cardiovascular events, cerebrovascular accidents and peripheral arterial disease. The typical atherosclerotic lesion is constituted by ljpid core that is covered by fibrous cap. Certain \"sensitive\" patients have the predisposition to develop the so - called \"unstable\" lesions. These are alterations that have the tendency to rupture resulting to the formation of clot which occludes the vessel partially or totally. This work studies the pathophysiology of phenomenon and the factors that are related with the local and systematic biology and participate in the instability and rupture of plaque.

Η αδειοδότηση της αντιγραφή του DNA συνίσταται στη συγκρότηση προαντιγραφικών συμπλόκων στη χρωματίνη, στα οποία μετέχουν οι πρωτεΐνες ORC, Cdt1, Cdc6 και MCM2-7. Η πρωτεΐνη Cdt1 αποικοδομείται μετά από βλάβη στο DNA και ενδέχεται να συνδέει το σύστημα αδειοδότησης και το σύστημα απόκρισης σε βλάβη στο DNA. Στη διδακτορική αυτή διατριβή μελετήθηκε η αλληλεπίδραση των συστημάτων αδειοδότησης και απόκρισης σε βλάβη στο DNA με μεθόδους λειτουργικής μικροσκοπίας σε ανθρώπινα κύτταρα, εστιάζοντας στους παράγοντες αδειοδότησης Cdt1 και MCM4. Ο παράγοντας Cdt1 μελετήθηκε μετά από καθολική και εντοπισμένη έκθεση ανθρώπινων κυττάρων σε υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Δείχθηκε ότι ακτινοβόληση με UV οδηγεί στην αποικοδόμηση του παράγοντα Cdt1 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Ο χρόνος αποικοδόμησης της πρωτεΐνης Cdt1 όμως διαφοροποιείται σημαντικά ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο και συγκεκριμένα παρουσιάζει καθυστέρηση στην κυτταρική σειρά καρκινώματος μαστού MCF7 σε σχέση με άλλες καρκινικές σειρές (HeLa, U2OS) και φυσιολογικούς ανθρώπινους ινοβλάστες. Μελέτη της πρωτεΐνης Cdt1 στο χώρο μετά από εντοπισμένη ακτινοβόληση μιας μικρής υποπεριοχής του πυρήνα έδειξε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 συσσωρεύεται στην περιοχή της βλάβης από υπεριώδη ακτινοβολία πριν από την αποικοδόμηση της. Παράλληλα, παρατηρήθηκε συσσώρευση στην περιοχή της βλάβης από UV των πρωτεϊνών PCNA, Cdt2 (συστατικό του Cul4-DDB1Cdt2 συστήματος ουβικουιτίνωσης, που είναι υπεύθυνο για την αποικοδόμηση του παράγοντα Cdt1), καθώς και της πρωτεΐνης p21 που στοχεύεται από το ίδιο σύστημα. Πειράματα επαναφοράς φθορισμού σε ζωντανά κύτταρα (Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP) έδειξαν ότι στις περιοχές εντοπισμένης ακτινοβόλησης με UV οι πρωτεΐνες Cdt1, Cdt2, PCNA και p21 εμφανίζουν τροποποιημένη κινητική συμπεριφορά. Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 ανέδειξαν έναν ανασταλτικό ρόλο για το Cdt1 στο μονοπάτι επιδιόρθωσης διπλών θραύσεων με ομόλογο ανασυνδυασμό κατά τη διάρκεια της G1 φάσης. Στο δεύτερο μέρος αυτής της εργασίας, εισάγαμε μια νέα in vivo μέθοδο μελέτης της αδειοδότησης που στηρίζεται στην εφαρμογή της FRAP τεχνικής σε MCF7 κύτταρα σταθερά διαμολυσμένα με την πρωτεΐνη MCM4 σημασμένη με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη GFP (GFP-MCM4). Η μέθοδος αυτή επιτρέπει τη μελέτη της κινητικής συμπεριφοράς της πρωτεΐνης MCM4 σε ζωντανά κύτταρα και σε πραγματικό χρόνο. Δείχθηκε ότι το σύστημα αναπαράγει τη λειτουργία της ενδογενούς MCM4 πρωτεΐνης και μπορεί να διακρίνει επιτυχώς μεταξύ αδειοδοτημένης και μη κατάστασης. Ακολούθως, το σύστημα χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθεί η επίδραση της υπεριώδους ακτινοβολίας στην αδειοδότηση της χρωματίνης για αντιγραφή. Διαπιστώθηκε ότι επίδραση με υπεριώδη ακτινοβολία οδηγεί σε μείωση του κλάσματος της MCM4 που είναι προσδεδεμένο στη χρωματίνη. Περαιτέρω μέλετη έδειξε ότι η μείωση αυτή παρουσιάζεται στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και περιορίζεται στην περιοχή της βλάβης, δείχνοντας ότι αποτελεί εντοπισμένη απόκριση του κυττάρου στην ύπαρξη βλάβης. Συμπερασματικά, η συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή ανέδειξε την αλληλεπίδραση των συστημάτων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA και της κυτταρικής απόκρισης σε βλάβη στο DNA και εισήγαγε μια νέα μέθοδο μελέτης της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA. Μελετήθηκαν οι παράγοντες του συστήματος αδειοδότησης Cdt1 και MCM4, οι οποίοι αποκρίνονται στη βλάβη στο DNA, με το Cdt1 να παίζει ρόλο στην επιλογή επιδιορθωτικού μηχανισμού μετά από πρόκληση βλάβης διπλών θραύσεων του DNA και την πρωτεΐνη MCM4 να εμφανίζει μειωμένη πρόσδεση στη χρωματίνη στην περιοχή της βλάβης μετά από ακτινοβόληση με UV. / Licensing DNA for replication involves the formation of pre-replicative complexes on chromatin, consisting of the proteins ORC, Cdt1, Cdc6 and MCM2-7. Cdt1 is degraded following DNA damage and this suggests a regulatory crosstalk between DNA licensing and DNA damage response (DDR) systems. Here the molecular interplay between these two systems was studied in human cell cultures. The kinetics of Cdt1 degradation in response to UV irradiation was shown to differ in different human cell lines, exhibiting a delay in MCF7 cells in comparison to HeLa, U2OS and human fibroblasts, which implies a difference in the DDR sensitivity of these cells. By studying the spatial regulation of Cdt1 in response to localized DNA damage, the accumulation of Cdt1 in UV irradiated sites prior to its degradation was recorded. Proteins participating in the degradation of Cdt1 through ubiquitin dependent proteolysis (PCNA and Cdt2), as well as protein p21 which is targeted by the same ubiquitin ligase following DNA damage, were also shown to accumulate at UV irradiated sites. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) experiments showed that Cdt1, Cdt2, PCNA and p21 exhibit altered kinetics at UV irradiated sites. Silencing of Cdt1 expression revealed an inhibitory role of Cdt1 in the repair of double strand breaks through homologous recombination during the G1 phase of the cell cycle. In the second part of this thesis, we introduced an in vivo licensing assay based on FRAP in MCF7 cells stably expressing MCM4 tagged with the Green Fluorescent Protein (GFP). This assay allows the study of the kinetic behaviour of MCM4 in live cells and in real time. A plasmid expressing GFP-MCM4 was constructed and MCF7 cells stably expressing this plasmid were produced. The GFP-MCM4 cell line was further characterized to ensure a correct cell cycle profile, GFP-MCM4 levels, subcellular localization, interactions with other MCM proteins and binding to chromatin. FRAP experiments on the stable GFP-MCM4 cells verified that the assay could successfully distinguish between licensed and unlicensed state. Using this assay, the effect of UV irradiation on MCM4 kinetics was studied. UV irradiation led to a decrease in the fraction of MCM4 binding to chromatin. This effect was more profound in middle G1 phase and was restricted to the site of UV irradiation. In conclusion, this thesis addressed the interaction of DNA licensing and DNA damage response systems and introduced an in vivo DNA licensing assay. Licensing proteins Cdt1 and MCM4 were shown to respond to DNA damage, with Cdt1 affecting the double strand break repair choice pathway and MCM4 exhibiting reduced chromatin binding following UV irradiation.

Κίνητρο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η αποτίμηση της δομικής ακεραιότητας κελυφοειδών κατασκευών από σύνθετα υλικά που παρουσιάζουν ανοχή στη βλάβη, με τη χρήση ακουστικών τεχνικών μη καταστροφικού ελέγχου. Στόχος ήταν η πειραματική και θεωρητική μελέτη επίδρασης της αστοχίας, που αναπτύσσεται σε μια πολύστρωτη μετά από φόρτιση, σε μετρήσιμα χαρακτηριστικά της κυματικής διάδοσης. Χωρίζεται σε δύο τμήματα, στη μοντελοποίηση της βλάβης και στη μελέτη επίδρασης αυτής στην κυματική διάδοση. Η έρευνα εστιάστηκε σε μορφές αστοχίας που συναντώνται σε πολύστρωτες υπό επίπεδη εντατική κατάσταση και συσσωρεύεται κατά το πάχος τους στη διάρκεια φόρτισης. Για την προσομοίωση της δημιουργήθηκαν διαφορετικά μηχανικά μοντέλα. Έμφαση δόθηκε στην προσέγγιση της συμπεριφοράς του υλικού υπό μονότονη στατική φόρτιση. Γι’ αυτό αναπτύχθηκε ένα φαινομενολογικό πρότυπο προοδευτικής αστοχίας για gl/ep πολύστρωτες. Η δομή του στηρίχθηκε σε τέσσερις πυλώνες. Πρώτον στην πειραματική διαδικασία χαρακτηρισμού μηχανικών ιδιοτήτων της μονοαξονικής στρώσης, ως το βασικό δομικό υλικό μιας πολύστρωτης. Ο ενδελεχής χαρακτηρισμός του υλικού σπάνια συναντάται σε τέτοια έκταση. Δεύτερον από τις δοκιμές προέκυψαν οι καταστατικές εξισώσεις της στρώσης. Η προσέγγιση της ανισότροπης μη – γραμμικότητας του υλικού έγινε με βηματική, γραμμική ανά βήμα, τασική ανάλυση στο επίπεδο της στρώσης χρησιμοποιώντας εφαπτομενική ελαστικότητα. Ο τρίτος πυλώνας αφορά στον προσδιορισμό έναρξης αστοχίας. Υιοθετήθηκαν κριτήρια ευρείας αποδοχής στο σχεδιασμό με σύνθετα υλικά, όπως π.χ. του Puck, των Shokrieh και Lessard κ.α., προτείνοντας και έναν νέο συνδυασμό τους. Τέλος, στρατηγικές υποβάθμισης των μηχανικών ιδιοτήτων της στρώσης προσομοίωσαν το αποτέλεσμα της συσσώρευσης αστοχίας μετά την έναρξή της. Το πρότυπο προοδευτικής αστοχίας ενσωματώθηκε σε στοιχείο κελύφους εμπορικού κώδικα πεπερασμένων στοιχείων. Ακολούθησε αξιολόγηση του, συγκρίνοντας τα αριθμητικά αποτελέσματα με πλειάδα μονοαξονικών και πρωτότυπων διαξονικών πειραμάτων. Η διαδικασία αυτή οδήγησε αφενός στην σημαντική για τον σχεδιασμό παρατήρηση εξάρτησης του μέτρου διάτμησης από το υπάρχον επίπεδο εντατικό πεδίο και αφετέρου στην εξέλιξη του προτύπου ώστε παρά τον περιορισμό των καταστατικών εξισώσεων που το διέπουν να μπορεί να προσομοιώσει τη διαστρωματική αποκόλληση. Έχοντας αναπτύξει τα εργαλεία περιγραφής της βλάβης, η διατριβή ολοκληρώνεται με τη μελέτη δομικής ακεραιότητας, χρησιμοποιώντας τη μη – καταστροφική τεχνική των ακουστό - υπέρηχων. Παρουσιάζεται το πειραματικό και θεωρητικό υπόβαθρο της διάδοσης τασικών κυμάτων σε κελύφη. Πρότυπα πολύστρωτων που υπέστησαν αριθμητική βλάβη υποβλήθηκαν σε αριθμητικές μη – καταστροφικές δοκιμές, καταλήγοντας σε συμπεράσματα όπως π.χ. τη μείωση της φασικής ταχύτητας με τη συσσώρευση βλάβης. / The motivation for the present research was the integrity estimation of shell – like structures made of damage tolerant composite materials, using acoustic non destructive testing techniques. An experimental and theoretical study was held aiming to investigate the influence of the damage, accumulated in a loaded laminate, in measurable wave propagation characteristics. The thesis is separated in two major parts. One described with detail the damage simulation model and the other the damage effects on the wave propagation and the wave mechanics. The study was focused on damage modes developed in composite laminates under in – plane complex stress fields due to several loading conditions and various mechanical models were developed for simulation purposes. Emphasis was given in the description of the material performance under monotonic static loading. Thus, a phenomenological progressive damage model for gl/ep multiaxial laminates was developed. This was structured based on four pillars. Primarily, as the laminate basic building block, the unidirectional layer was mechanically characterized. Such an extended experimental procedure can hardly be found. Secondly, the test results defined the ply constitutive equation laws. The highly anisotropic material non – linearity was approximated with piece – wise linear incremental layer by layer stress analysis using tangential elasticity. The third pillar regarded the damage initiation conditions. Thus, well defined criteria widely accepted in composite design were implemented i.e. Puck, Shokrieh and Lessard, etc. Finally post failure strategies were deployed, simulating material mechanical properties degradation emerging during damage accumulation. The progressive damage model was incorporated in a shell element of a commercial finite element code. An extended validation procedure took place comparing numerical results with several uniaxial and innovative biaxial test data. During this procedure the G12 shear modulus dependence on the developed plane stress field was thoroughly studied, resulting in recommendations for the designer and the selection of the appropriate modulus value. Additionally, the material model was further enhanced, taking into account incompatible failures with its constitutive equations e.g. delamination. Having developed several tools that described damage existence or accumulation, this dissertation was finished with the structural integrity study, using the acousto – ultrasonics non destructive testing technique. The experimental and theoretical background for stress wave propagation in waveguides was presented. Numerically damaged material models were additionally inspected with numerical non – destructive tests, resulting in specific conclusions for damage effect on measurable wave propagation characteristics, e.g. phase velocity reduction with damage growth.