- / -

- / -

Οι διαφορετικοί τρόποι ανταπόκρισης στα φάρμακα που παρατηρούνται από άτομο σε άτομο, οι οποίοι βασίζονται στις γενετικές διαφορές μεταξύ διαφόρων πληθυσμών παρουσιάζουν ένα σημαντικό κλινικό πρόβλημα όχι μόνο στην Ελλάδα αλλά και σε άλλες χώρες. Επάνω στο θέμα αυτό έχει αναπτυχθεί ένας καινούργιος κλάδος επιστήμης και υπηρεσιών στην ελληνική αγορά, οι υπηρεσίες γενετικής και φαρμακογενετικής ανάλυσης, οι οποίες μελετούν τις γενετικές διαφορές στα ένζυμα που επηρεάζουν το μεταβολισμό και τη δράση των φαρμάκων στους ασθενείς. Στόχος της εργασίας ήταν η κατανόηση του ρόλου των υπηρεσιών γενετικής και φαρμακογενετικής ανάλυσης στην ελληνική αγορά πραγματοποιώντας μία έρευνα απόψεων ασθενών και του κοινού για την υπηρεσίες γενετικής και φαρμακογενετικής ανάλυσης σε δύο μεγάλες πόλεις (Αθήνα, Πάτρα) και σε μία κωμόπολη (Αίγιο). Για τις ανάγκες της παρούσας εργασίας, ρωτήθηκαν συνολικά 688 άτομα τα οποία χωρίστηκαν σε 3 ηλικιακές ομάδες (<35 ετών, 35-60 ετών και >60 ετών). Το ερωτηματολόγιο αποτελείτο από 9 συνολικά ερωτήσεις με σκοπό να διερευνηθεί (α) το κατά πόσο το ευρύ κοινό είναι ενημερωμένο για το σκοπό των γενετικών και φαρμακογενετικών αναλύσεων, (β) το κατά πόσο το ευρύ κοινό είναι διατεθειμένο να υποβληθεί σε γενετικές/φαρμακογενετικές αναλύσεις, (γ) αν η επιλογή των ατόμων επηρεάζεται από την κάλυψη της ασφάλειας τους, (δ) αν πιστεύουν ότι οι αναλύσεις πρέπει να διενεργούνται κατευθείαν από τους ενδιαφερόμενους ή κατόπιν υπόδειξης από ειδικό. Τα ευρήματα έδειξαν ότι οι περισσότεροι ερωτηθέντες ήταν ενημερωμένοι για τις γενετικές αναλύσεις γνωρίζοντας ότι οι γενετικές αναλύσεις γίνονται με πολύ απλούς τρόπους. Παρατηρήθηκε ότι το μεγαλύτερο ποσοστό των ατόμων ήταν διατεθειμένοι να προβούν σε μια γενετική εξέταση όταν γνώριζαν ότι οι γενετικές αναλύσεις μπορούν να παρέχουν πληροφορίες για την πιθανότητα εμφάνισης μιας κληρονομικής νόσου. Επιπλέον, οι άνθρωποι που ήταν διατεθειμένοι να προβούν στις γενετικές αναλύσεις ήταν περισσότεροι από αυτούς που ήταν διατεθειμένοι να προβούν στις φαρμακογενετικές αναλύσεις. Ωστόσο, οι περισσότεροι πίστευαν ότι οι γενετικές/φαρμακογενετικές αναλύσεις πρέπει να γίνονται από τους ενδιαφερόμενους κατόπιν υπόδειξης από κάποιον ειδικό. Πιο συγκεκριμένα, η μεγάλη πλειοψηφία των ερωτηθέντων πίστευαν ότι οι γενετικές/φαρμακογενετικές αναλύσεις πρέπει να γίνονται κατόπιν υπόδειξης από κάποιον γιατρό και σημαντικά λιγότεροι κατόπιν υπόδειξης από κάποιον φαρμακοποιό. Στις μικρές πόλεις οι πληροφορίες που αφορούν τις γενετικές/φαρμακογενετικές αναλύσεις δεν είναι τόσο διαδεδομένες συγκριτικά με τις μεγάλες πόλεις. Οι περισσότεροι ασθενείς δεν είχαν την ευκαιρία να υποβληθούν σε κάποια γενετική/φαρμακογενετική εξέταση, εφόσον κανείς ποτέ δεν τους παρότρυνε σχετικά. Όμως, αν οι ειδικοί (ειδικά οι γιατροί) μπορούν να παροτρύνουν περισσότερο τους ασθενείς ώστε να υποβληθούν σε τέτοιες εξετάσεις, οι γιατροί θα μπορέσουν να χρησιμοποιούν τα αποτελέσματα των εξετάσεων προκειμένου να καθορίσουν την καλύτερη θεραπευτική επιλογή για τους ασθενείς. Επιπλέον, οι επιλογές των ασθενών επηρεάζονται πολύ από το αν οι αναλύσεις μπορεί να καλύπτονται από ασφαλιστικούς φορείς. Όταν οι δαπάνες των υπηρεσιών καλύπτονται από το δημόσιο ταμείο υγείας ή κάποιους ασφαλιστικούς φορείς, οι ασθενείς θα είναι πιο διατεθειμένοι να υποβληθούν στις εξετάσεις. / Individual difference in drug response is common among patients and it appears to be due to the interactions of genetic factors. Therefore, knowledge about individual genetic variability in drug response is clinically and economically important. Genetic and pharmacogenetic testing which have been developed recently in Greece, study people’s genetic difference in order to predict their response to medicines. Objectives: The purpose of this thesis is to explore patients’ views about genetic and pharmacogenetic testing services and their future development in the Greek market. Methods: 688 questionnaires were distributed to people, originating from 2 major cities (Athens, Patras) and a smaller city (Egio), who were divided into three age groups (<35 years, 35-60 years and >60 years) in Greece. The questionnaires consisted of 9 questions which were designed to explore people’s opinion on (a) how well informed the general public is about the objectives of genetic and pharmacogenetic analysis (b) whether the general public is willing to undertake these tests (c) if their choices will be influenced by reimbursement of testing costs, and (d) if they believe that the tests should be carried out with or without specialists’ (doctor or pharmacist) advice. Results: The views of 688 individuals showed that most responders were aware of genetic tests. They also knew that genetic tests could be easily carried. In addition, the largest percentage of people was willing to order a genetic test when they knew that genetic analysis can inform them on the possibility to develop a hereditary disease. In addition, the number of people who were willing to take genetic tests was more than those who were willing to take pharmacogenetic tests. However, most people believed that genetic / pharmacogenetic tests should only be carried out following the advice of a specialist. In particular, most responders believed that genetic / pharmacogenetic tests should be carried out following the advice of a doctor rather than the advice of a pharmacist. In smaller towns, information about genetic/pharmacogenetic tests is not so much widespread compared to large cities. Conclusion: Most patients have not had the opportunity to take a genetic / pharmacogenetic test as no one has ever suggested them to do so. But if the experts (especially the doctors) could give specific advices to their patients on such tests, the test results could used to determine the best treatment for the patients. Therefore the consequences of side effects or lack of effectiveness of certain drugs could be avoided and drug therapy could be improved. Apart from that, the choices of patients are mostly influenced by their insurance. If the cost of the tests could be reimbursed by some health insurances, patients would be more willing to take the tests.

Molecular genetics use molecular methods that amplify specific fragments of DNA. Today, the molecular techniques which were developed for amplification and detection of specific sequences of nucleic acids helped in a great deal to understand the structure of many diseases. Polymerase chain reaction or PCR is a technique that is used for isolation and amplification of a specific sequence of DNA. PCR is an in vitro method that exploits the in vivo procedure of replication of DNA. DNA polymerase is used to amplify a piece of DNA by in vitro enzymatic replication. As PCR progresses, the DNA thus generated is itself used as a template for replication. This sets in motion a chain reaction in which the DNA template is exponentially amplified. With PCR it is possible to amplify a single or few copies of a piece of DNA across several orders of magnitude, generating millions or more copies of the DNA piece. PCR was designed and presented by Dr Kary Mullis (1983).Today PCR has a great range of implementations related to 1) the cloning and the study of gene’s expression 2) the detection of mutations that are responsible for hereditary diseases 3) Criminology, Toxicology and Forensics. / H Μοριακή Γενετική χρησιμοποιεί μοριακές μεθόδους οι οποίες ενισχύουν συγκεκριμένα τμήματα DNA. Σήμερα, οι μοριακές τεχνικές οι οποίες αναπτύχθηκαν για ενίσχυση και ανίχνευση συγκεκριμένων ακολουθιών νουκλεϊνικών οξέων βοήθησαν σε μεγάλο βαθμό στην κατανόηση της δομής πολλών ασθενειών. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μια τεχνική η οποία χρησιμοποιείται για απομόνωση και ενίσχυση μιας συγκεκριμένης ακολουθίας DNA. Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης είναι μια διαδικασία που πραγματοποιείται σε ελεγχόμενες συνθήκες έξω απο ζωντανούς οργανισμούς, η οποία εκμεταλλεύεται την αντιγραφή του DNA που πραγματοποιείται μεσα στον ζωντανό οργανισμό. Όσο η PCR εξελίσσεται δημιουργούνται αντίγραφα DNA χρησιμοποιώντας ως πρότυπο το αρχικό DNA. Αυτό ενεργοποιεί μια διαδικασία αλυσιδωτής αντίδρασης ώπου το DNA αναπαράγεται εκθετικά. Με την PCR μπορείς να δημιουργήσεις εκατομμύρια αντίγραφα DNA από μία συγκεκριμένη ακολουθία. Η PCR σχεδιάστηκε και παρουσιάστηκε απο τον Dr Kary Mullis. Σήμερα η PCR έχει μέγαλο εύρος εφαρμογής σε πεδία σχετικά με τη μελέτη της γενετικής έκφρασης την ανίχνευση μεταλλάξεων οι οποίες είναι υπεύθυνες για κληρονομικές ασθένειες, Εγκληματολογία, Τοξικολογία και Ιατροδικαστική.

Στην παρούσα εργασία αξιολογήθηκε η χρήση των μικροδορυφορικών δεικτών για τη μελέτη της γενετικής δομής και των φυλογενετικών σχέσεων των φυσικών πληθυσμών της Atherina boyeri που προέρχονταν τόσο από θαλάσσιες όσο και λιμναίες/λιμνοθαλάσσιες περιοχές της Ελλάδας. Προηγούμενες μελέτες βασιζόμενες κυρίως σε μιτοχονδριακούς και RAPD δείκτες έχουν υποδείξει την πιθανή παρουσία τριών ομάδων πληθυσμών στην Atherina boyeri με τόσο υψηλές γενετικές αποστάσεις μεταξύ τους που θα μπορούσαν να τις καθιστούν ακόμα και διαφορετικά είδη. Οι ομάδες αυτές είναι: οι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου Ι (μη εστιγμένοι),οι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου ΙΙ (εστιγμένοι) και οι λιμναίοι/λιμνοθαλάσσιοι πληθυσμοί. Η ανάλυση στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε με χρήση 11 μικροδορυφορικών δεικτών που σχεδιάστηκαν από τους Milana et al. (2009). Οι μικροδορυφορικοί δείκτες θεωρούνται εξαιρετικό εργαλείο μελέτης των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ πρόσφατα διαχωρισμένων ειδών δεδομένου ότι είναι άφθονοι, πυρηνικοί, διάσπαρτοι στο γονιδίωμα, υψηλά πολυμορφικοί και ταχέως εξελισσόμενοι. Τα αποτελέσματα έδειξαν πολύ υψηλό βαθμό πολυμορφισμού στους υπό ανάλυση πληθυσμούς και μεγάλη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των ελληνικών πληθυσμών του είδους όπως αυτή εκφράζεται από τις διαφορές στις συχνότητες των αλληλομόρφων των μικροδορυφορικών δεικτών. Φαίνεται επίσης να επιβεβαιώνεται η διάκριση μεταξύ των δυο θαλάσσιων τύπων της Atherina boyeri, ωστόσο οι λιμναίοι/λιμνοθαλάσσιοι πληθυσμοί παρουσιάζουν τόσο διαφορετικό γενετικό πρότυπο που θεωρείται εξαιρετικά δύσκολο να συνιστούν μια ενιαία ομάδα πληθυσμών. Οι δείκτες αυτοί δεν ήταν δυνατό να χρησιμοποιηθούν στην ανάλυση όλων των διαθέσιμων πληθυσμών, κυρίως λόγω της παρουσίας μη ενισχυόμενων (null) αλληλομόρφων, καθώς επίσης και πολλαπλών ή/και ασθενών ζωνών, γεγονός που επίσης υποδεικνύει την ύπαρξη μεγάλων γενετικών διαφοροποιήσεων, που πιθανώς ξεπερνούν τα όρια του είδους. Προκείμενου να ξεπεραστούν τα ανωτέρω προβλήματα απαιτείται η βελτιστοποίησή τους ανά ομάδα πληθυσμών, μέσω α) αλλαγών στις συνθήκες των PCR αντιδράσεων και β) κλωνοποίησης και αλληλούχισης των δεικτών αυτών από άτομα των πληθυσμών στα οποία ήταν λειτουργικοί, ώστε να επιτευχθεί ο σχεδιασμός νέων ζευγών εκκινητών, ειδικών για επιμέρους ομάδες πληθυσμών. / The present study aims at the measure of the genetic differentiation and the resolution of the phylogenetic relationships among A.boyeri populations originating from lakes/lagoons and marine sites of Greece. Previously studies based on RAPD and mitochondrial markers suggest the existence of three forms of populations of A.boyeri which could represent three different species. These three types are: marine type I, which includes almost all marine populations (non-punctuated), excluding specimens collected from Preveza, Evoia and Kos, which form the marine type II (punctuated) and the “lagoon” type which consists of all the lagoon/lake populations. In the present study, eleven microsatellite markers designed by Milana et al. (2009), were used. Microsatellite markers are supposed to be great tools in phylogenetic studies among recently separated species because they are abundant, nuclear, dispersed around the genome, highly polymorphic and rapidly evolving. Our results showed very high degree of polymorphism in the analyzed populations and extended genetic differentiation among Greek populations of the species as expressed by differences in allele frequencies of the microsatellite markers. They also seems to confirm the distinction between the two marine types of A.boyeri, but the lagoon/lake populations present different allele paterns, pointing to the possible existence of differentiated groups among them. Some of the markers could not be used in the analysis of all the available populations. This is mainly attributed to the presence of null alleles for some of the populations and to scoring difficulties raising from the presence of multiple and/or weak amplicons. This also indicates the existence of great genetic variations, which possibly exceed species limit. To overcome the above difficulties, optimization per marker is required, including a) optimization of PCR conditions and b) cloning and sequencing of these markers from individuals of the population that were functional to achieve the design of new prime pairs, specific for each group of populations .

- / -

- / -

- / -

- / -

Το γένος Trachelipus περιλαμβάνει οργανισμούς σχετικά στενόοικους οι οποίοι ζουν είτε στην παρόχθια βλάστηση ρεμάτων και ποταμών είτε σε υγρά δάση. Στη χώρα μας έχουν καταγραφεί 8 από τα 50 είδη του γένους, 4 από τα οποία είναι ενδημικά της Ελλάδας. Το ένα από αυτά εξαπλώνεται από την Κρήτη μέχρι την Ήπειρο, ένα στα νησιά του κεντρικού Αιγαίου, ένα στην Κρήτη και ένα στο νότιο Ευβοϊκό. Η κατανομή κάθε είδους είναι ασυνεχής, είτε λόγω γεωγραφικών (νησιωτικοί πληθυσμοί κλπ) είτε λόγω ενδιαιτηματικών παραγόντων. Η διάκριση μεταξύ των ειδών έχει γίνει βάσει περιορισμένου αριθμού μορφολογικών χαρακτήρων και δεν είναι βέβαιο ότι αντανακλά τις πραγματικές φυλογενετικές σχέσεις τους. Από τα αποτελέσματα προηγούμενης μελέτης διαπιστώθηκε έντονη απόκλιση μεταξύ των προτύπων της γενετικής ποικιλότητας και εκείνης της τρέχουσας ταξινόμησης σε ορισμένες ομάδες πληθυσμών του γένους αυτού. Επιπλέον, φάνηκε σημαντικός βαθμός γενετικής απομόνωσης μεταξύ των πληθυσμών ενός είδους, ενισχύοντας την άποψη περί ισχυρής μεταπληθυσμιακής συγκρότησής τους. Στην παρούσα μελέτη, συλλέχθηκαν 47 πληθυσμοί στην ηπειρωτική Ελλάδα, οι οποίοι στη μεγάλη τους πλειοψηφία ανήκαν στο είδος Trachelipus kytherensis (σύμφωνα με την ισχύουσα ταξινόμηση). Σε αυτούς προστέθηκαν και τα δεδομένα των Parmakelis et al 2008 (16 πληθυσμοί) έτσι ώστε να είναι πιο ολοκληρωμένη η μελέτη και η εξαγωγή συμπερασμάτων για το γένος Trachelipus. Συνολικά μελετήθηκαν γενετικά 63 πληθυσμοί του γένους, χρησιμοποιώντας ως μοριακούς δείκτες τα μιτοχονδριακά γονίδια 16S rRNA και COI. Έπειτα από απομόνωση του DNA και τον πολλαπλασιασμό των συγκεκριμένων τμημάτων με PCR προσδιορίστηκε η αλληλουχία των βάσεων, και υπολογίστηκε η γενετική διαφοροποίηση εντός και μεταξύ των πληθυσμών. Για την ανάλυση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των πληθυσμών ή/και των ειδών χρησιμοποιήθηκαν οι μέθοδοι της Σύνδεσης Γειτόνων (Neighbor Joining-NJ), της Μέγιστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony-MP) και της Μπεϊεσιανής Συμπερασματολογίας (Bayesian Inference-BI). Το τελικό μήκος των αλληλουχιών μετά την επεξεργασία ήταν 386 θέσεις για το γενετικό τόπο 16S rRNA και 512 θέσεις για το γενετικό τόπο COI. Με τα δεδομένα αυτά δεδομένα πραγματοποιήθηκε τόσο ανεξάρτητη όσο και συνδυασμένη ανάλυση. Από τα αποτελέσματα φαίνονται πληθυσμοί οι οποίοι παρα το ότι είναι πολύ κοντινοί γεωγραφικά, και μέχρι σήμερα θεωρείται πως ανήκουν στο ίδιο είδος (Trachelipus kytherensis), εμφανίζουν μεγάλες γενετικές αποστάσεις μεταξύ τους και ομαδοποιούνται σε διαφορετικούς και αρκετά απομακρυσμένους κλάδους των δένδρων σε όλες τις αναλύσεις (NJ, MP, BI). Η τοπολογία των κλάδων, καθώς και η απουσία σαφούς γεωγραφικού προτύπου στην ομαδοποίηση των πληθυσμών του T. kytherensis, καταδεικνύει ότι πιθανότατα δεν έχουμε να κάνουμε με ένα μόνο είδος, αλλά με περισσότερα που είναι δύσκολο να διακριθούν μορφολογικά, τουλάχιστον με τους μέχρι σήμερα χρησιμοποιούμενους ταξινομικούς διαγνωστικούς χαρακτήρες. Αυτό ενισχύεται και από τις γενετικές αποστάσεις που καταγράφηκαν στην παρούσα μελέτη και εμφανίζονται ιδιαίτερα αυξημένες (μέγιστες παρατηρηθείσες γενετικές απόστασεις: 27,3% COI, 17,6% 16S rRNA) ακόμα και σε σχέση με αυτές που έχουν αναφερθεί σε άλλες έρευνες για τη διάκριση ειδών ισοπόδων. Επισημαίνεται η ιδιαίτερα μεγάλη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των αντιπροσώπων του γένους. Επιπλέον καταδεικνύεται πως η Πελοπόννησος φιλοξενεί τα είδη Trachelipus ‘kytherensis’ και T. aegaeus (τουλάχιστον στη χερσόνησο της Αργολίδας) αλλά και πιθανόν μια τρίτη μορφή στα βόρεια (νέο είδος;) η οποία εμφανίζεται ευρύτερα στην ηπειρωτική Ελλάδα. Θα είχε ιδιαίτερο ενδιαφέρον λοιπόν να μελετηθούν αυτές οι πιθανές «ζώνες επαφής» ως προς τη γονιδιακή τους ροή, ώστε να εκτιμηθεί το ποσοστό απομόνωσης των πληθυσμών και, κατ’ επέκταση, του κάθε είδους. / The phylogenetic relationships among terrestrial isopod species are still largely unknown because robust analyses have started to appear only relatively recently. Species-level taxonomy has been based mainly on a few secondary sexual characters of males, although recent analyses based on molecular markers have indicated that species definitions based on morphology may underestimate the true levels of divergence among populations. Furthermore, within several genera or species groups, morphological characters do not provide clear-cut taxonomic resolution, so that many changes in the interpretation of nominal species have appeared in the literature. The genus Trachelipus comprises of relatively stenoecious animals living in habitats generally threatened by human activities, such as humid forest sites and riparian habitats. It includes some 50 species distributed around the Palaearctic, with 8 species recorded from Greece, 4 endemic to the country. The distribution of species is discontinuous due to the increasing fragmentation of its habitats and the expansion of agricultural land and dry woodland. Projected climatic change will restrict further gene flow between Trachelipus populations, as dry habitats are expected to expand in Greece. Species–level taxonomy has been based on a few morphological characters, mainly the secondary sexual characters of males, exhibiting significant variation, and is controversial. Very high intraspecific genetic divergence among several populations has been documented. In this study we attempt a phylogeographic analysis among the Greek endemic species of the genus. We sampled 47 populations from several sites in mainland Greece. In our analyses we incorporated data from previous work (16 populations) in order to better estimate possible geographic structure in the patterns of divergence among populations, and to throw new light in the systematics of the species. Overall, 63 populations were considered. After total DNA extraction, we sequenced the two PCR amplified mtDNA gene fragments, namely 16S rRNA and cytochrome oxidase subunit I (COI), and calculated the genetic divergence within and among the populations studied, as well as their phylogenetic relationships. The methods for phylogenetic reconstruction used were Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) and Bayesian Inference (BI) for each mtDNA sequence data and the concatenated dataset. The phylogenetic trees obtained from the molecular data – from all three phylogenetic methods (NJ, MP, BI) - produced trees with quite congruent topologies. Some populations that are considered conspecific exhibit large genetic distances and cluster in different clades. The highly-structured phylogenetic tree and the lack of an overall geographic pattern in the clustering of Trachelipus populations indicates that very probably we are not dealing with a single species, but rather with a number of cryptic species, hardly distinguished by means of currently used morphological characters. This is further corroborated by the genetic distances separating the clades hosting nominal T. kytherensis populations (max_dCOI=27.3% and max_d16S rRNA=17.6%). In general, it can be argued that the genetic distances recorded in the present study are quite large compared with those reported for different species and even genera in other studies of terrestrial isopods. Furthermore, it is evident than there are two species present in the Peloponnese, i.e. Trachelipus ‘kytherensis’ and T. aegaeus (in Argolis peninsula). In northern Peloponnese, a third form is also present (new species?) that occurs throughout the central and northern part of mainland Greece. These ‘contact zones’ should be further investigated in terms of genetic flow and isolation of the populations and/or species. Both the phylogeny presented here and the genetic distances separating populations appear to justify the necessity of further investigation into the phylogeny of the Greek Trachelipus species using a population by population approach. It is likely that morphology inadequately describes real variation inside and among species; hence, diagnoses based on the morphological characters used so far for the delineation of Trachelipus species should be reconsidered under the light of more extensive molecular phylogenetic analyses.